JP2023507277A - 多特異性抗体 - Google Patents

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Abstract

多特異性抗体である。本開示は、ａ）式（Ｉ）：ＶＨ－ＣＨ１－（ＣＨ２）－（ＣＨ３）－（Ｘ）－（ＶＩ）のポリペプチド鎖；及びｂ）式（ＩＩ）：（Ｖ３）－（Ｚ）－ＶＬ－ＣＬ－（Ｙ）－（Ｖ２）のポリペプチド鎖を含むか又はこれらからなる多特異性抗体であって、式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、少なくとも１つのｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、又はＶＨＨを含み；式（Ｉ）のポリペプチド鎖が、プロテインＡ結合ドメインを含み；式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、プロテインＡに結合しない、多特異性抗体に関する。本開示は、前記多特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列、ポリヌクレオチドを含むベクター、並びに前記ベクター及び／又はポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞も提供する。本開示は、例えば処置での使用のための、それを含む医薬組成物も提供する。宿主細胞から本開示の多特異性抗体を発現する方法も提供する。

Description

本開示は、多特異性抗体、それを含む製剤、前記抗体をコードするポリヌクレオチド配列、前記ポリヌクレオチド配列を含むベクター並びに前記ベクター及び／又はポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞に関する。本開示は、多特異性抗体及び製剤の治療における使用にも関する。本開示は、例えば宿主細胞において、多特異性抗体を発現する方法に及び、多特異性抗体を精製する方法であって、プロテインＡ精製ステップを含む方法にも及ぶ。
多特異性、特に二重特異性抗体を生成するための多くの手法がある。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ（Ｃｏｌｏｍａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ １９９７，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１５９－１６３）は、完全抗体、例えばＩｇＧへの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合を記載する。Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６５，７０５０－７０５７は、抗体Ｆａｂ断片へのｓｃＦｖの融合を記載する。国際公開第２０１５／１９７７７２号は、ジスルフィド安定化ｓｃＦｖ（ｄｓｓｃＦｖ）のＦａｂ断片への融合を記載する。
先行技術に記載された標準的な手法は、それぞれが完全抗体若しくはその抗原結合断片、例えばＦａｂの重鎖（ＨＣ）又は軽鎖（ＬＣ）をコードする少なくとも２つのポリペプチドの宿主細胞での発現を含み、これに追加の抗体の抗原結合断片を重鎖及び／又は軽鎖のＮ及び／又はＣ末端位置で融合することができる。２つ（付加Ｆａｂを形成する１つの軽鎖及び１つの重鎖）又は４つ（付加ＩｇＧを形成する２つの軽鎖及び２つの重鎖）のポリペプチドを発現することによってそのような多特異性抗体を組換えにより産生しようとする場合、通常、対応する軽鎖とのアセンブリーの際に、重鎖の正確なフォールディングを確実にするために、過剰な重鎖中に軽鎖を発現する必要がある。特に、ＣＨ１（重鎖定常領域のドメイン１）は、対応するＬＣによって置き換えられ得る、ＢＩＰタンパク質によって自身のフォールディングが妨げられ；したがって、ＣＨ１／ＨＣの正確なフォールディングは、対応するＬＣの利用可能性による（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１０，２２０９－２２１９）。
本発明者らは、多特異性抗体を発現するそれらの方法は、重鎖より軽鎖の過剰な産生をもたらし得、これが宿主細胞回収物中に残ることを観察し、この過剰な軽鎖は二量体複合体（又は「ＬＣ二量体」）を形成する傾向があり、所望の多特異性抗体、特に単量体と共に、産生方法の副産物として存在し、したがって精製して除く必要がある。
重要なことは、さらなる抗原結合断片（単数及び複数）にＮ及び／又はＣ末端で融合する場合、軽鎖の二量体の形成と関連する技術的な問題は、これまでのところ同定されておらず、一般に使用される解析方法は、産生方法の異種産物の中でそれらの付加ＬＣ二量体の検出及び定量が可能ではなかった。これは、標準的な解析方法を使用して産物の量を推定する場合、重大なバイアスを生じ得る。
したがって、多特異性抗体及びその産生方法を改善する必要があり、それは産生方法の初期のステップで容易に及び効率的に付加ＬＣ二量体の単離及び除去を可能にし、したがって、多特異性抗体であり、特にその単量体形態である、治療での使用のための目的のタンパク質の収量を改善する。
本発明者らは、精製後、特にプロテインＡアフィニティクトマトグラフィーを含むワンステップ精製後に得られた「多特異性抗体」物質、特に単量体の収量を増加しながら同等の機能性及び安定性を有する改善された多特異性抗体を提供するように関係する多特異性抗体を工学的に再作成した。
したがって、一態様では：
式（Ｉ）：
ＶＨ－ＣＨ１－（ＣＨ２）ｓ－（ＣＨ３）ｔ－Ｘ－（Ｖ１）ｐ
のポリペプチド鎖；及び
式（ＩＩ）：
（Ｖ３）ｒ－Ｚ－ＶＬ－ＣＬ－Ｙ－（Ｖ２）ｑ
のポリペプチド鎖
を含むか又はそれらからなる多特異性抗体であって、
式中：
ＶＨは重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン１を表し；
ＣＨ２は重鎖定常領域のドメイン２を表し；
ＣＨ３は重鎖定常領域のドメイン３を表し；
Ｘは結合又はリンカーを表し；
Ｖ１はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
Ｖ３はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
Ｚは結合又はリンカーを表し；
ＶＬは軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬはＣカッパなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し；
Ｙは結合又はリンカーを表し；
Ｖ２はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
ｐは０又は１を表し；
ｑは０又は１を表し；
ｒは０又は１を表し；
ｓは０又は１を表し；
ｔは０又は１を表し；
ｐが０である場合、Ｘは存在せず、ｑが０である場合、Ｙは存在せず、ｒが０である場合、Ｚは存在せず；
ｑが０である場合、ｒは１であり、ｒが０である場合、ｑは１であり；
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、少なくとも１つのｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、又はＶＨＨを含み；
式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、プロテインＡ結合ドメインを含み；
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、プロテインＡに結合しない、多特異性抗体を提供する。
有利には、本開示の多特異性抗体は、当技術分野で一般に使用される方法を改善した精製方法によってより効果的に精製され得、特に、改善された方法は、工程が少なく、工業規模で費用及び時間効果を有する。特に、本開示の多特異性抗体は、プロテインＡアフィニティクトマトグラフィーを含むワンステップ精製方法後に得られた目的のタンパク質（すなわち、正しい多特異性抗体フォーマット）の量を最大にし、それにより目的の多特異性抗体の精製及び付加ＬＣ二量体の除去が同時に起こる。有利には、本開示の多特異性抗体の産生及び精製の方法は、過剰な遊離の、未結合の軽鎖、特に付加ＬＣ二量体を捕獲するためのさらなる精製ステップを必要としない。
抗アルブミン６４５抗体の配列を示す図である。 最終精製したＴｒＹｂｅ０３の解析を示す図である。ＢＨＥ２００ ＳＥＣ－ＵＰＬＣ（縦軸；ＥＵ（発光ユニット）、横軸；時間（分））を示す。 最終精製したＴｒＹｂｅ０３の解析を示す図である。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（レーンＭ：Ｍａｒｋ１２（商標）；レーン１：非還元状態；レーン２：還元状態）を示す。 Ｗｉｔｔｒｕｐ（Ｗｉｔｔｒｕｐ０１及びＷｉｔｔｒｕｐ０２）及びＴｒＹｂｅ抗体（ＴｒＹｂｅ０３～ＴｒＹｂｅ０６）及び対応するＬＣ二量体の模式図である。全てのＷｉｔｔｒｕｐ分子は、共通のｈｇ１ＦＬ及びＦａｂ領域を有する。全てのＴｒＹｂｅ分子は、共通のＦａｂ領域を有する。 Ｗｉｔｔｒｕｐ０１及びＷｉｔｔｒｕｐ０２分子のローディング物質、溶出液及びフロースルーを含む、プロテインＡ及びプロテインＬクロマトグラフィーの還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す図である。試料は以下のようにローディングした：レーンＭ：Ｍａｒｋ１２（商標）；レーン１Ａ～１Ｅ：Ｗｉｔｔｒｕｐ０１（１Ａ：プロテインＡローディング（上清）；１Ｂ：プロテインＡ溶出液；１Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；１Ｄ：プロテインＬ溶出液；１Ｅ：プロテインＬフロースルー）；レーン２Ａ～２Ｅ：Ｗｉｔｔｒｕｐ０２（２Ａ：プロテインＡローディング（上清）；２Ｂ：プロテインＡ溶出液；２Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；２Ｄ：プロテインＬ溶出液；２Ｅ：プロテインＬフロースルー）。 Ｗｉｔｔｒｕｐ０１及びＷｉｔｔｒｕｐ０２分子のローディング物質、溶出液及びフロースルーを含む、プロテインＡ及びプロテインＬクロマトグラフィーの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す図である。試料は以下のようにローディングした：レーンＭ：Ｍａｒｋ１２（商標）；レーン１Ａ～１Ｅ：Ｗｉｔｔｒｕｐ０１（１Ａ：プロテインＡローディング（上清）；１Ｂ：プロテインＡ溶出液；１Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；１Ｄ：プロテインＬ溶出液；１Ｅ：プロテインＬフロースルー）；レーン２Ａ～２Ｅ：Ｗｉｔｔｒｕｐ０２（２Ａ：プロテインＡローディング（上清）；２Ｂ：プロテインＡ溶出液；２Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；２Ｄ：プロテインＬ溶出液；２Ｅ：プロテインＬフロースルー）。 ＴｒＹｂｅ０３及びＴｒＹｂｅ０４分子のローディング物質、溶出液及びフロースルーを含む、プロテインＡ及びプロテインＬクロマトグラフィーの還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す図である。試料は以下のようにローディングした：レーンＭ：Ｍａｒｋ１２（商標）；レーン３Ａ～３Ｅ：ＴｒＹｂｅ０３（３Ａ：プロテインＡローディング（上清）；３Ｂ：プロテインＡ溶出液；３Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；３Ｄ：プロテインＬ溶出液；３Ｅ：プロテインＬフロースルー）；レーン４Ａ～４Ｅ：ＴｒＹｂｅ０４（４Ａ：プロテインＡローディング（上清）；４Ｂ：プロテインＡ溶出液：４Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；４Ｄ：プロテインＬ溶出液；４Ｅ：プロテインＬフロースルー）。 ＴｒＹｂｅ０３及びＴｒＹｂｅ０４分子のローディング物質、溶出液及びフロースルーを含む、プロテインＡ及びプロテインＬクロマトグラフィーの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す図である。試料は以下のようにローディングした：レーンＭ：Ｍａｒｋ１２（商標）；レーン３Ａ～３Ｅ：ＴｒＹｂｅ０３（３Ａ：プロテインＡローディング（上清）；３Ｂ：プロテインＡ溶出液；３Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；３Ｄ：プロテインＬ溶出液；３Ｅ：プロテインＬフロースルー）；レーン４Ａ～４Ｅ：ＴｒＹｂｅ０４（４Ａ：プロテインＡローディング（上清）；４Ｂ：プロテインＡ溶出液：４Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；４Ｄ：プロテインＬ溶出液；４Ｅ：プロテインＬフロースルー）。 還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの濃度測定解析を示す図である。試料は、ＴｒＹｂｅ０３及びＴｒＹｂｅ０４（横軸）のプロテインＡ溶出液を含む。解析は、縦軸に、重鎖バンドの密度に対するパーセンテージとして示される。 ＴｒＹｂｅ０３及びＴｒＹｂｅ０５分子のローディング物質、溶出液及びフロースルーを含む、プロテインＡ及びプロテインＬクロマトグラフィーの還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す図である。試料は以下のようにローディングした：レーンＭ：Ｍａｒｋ１２（商標）；レーン３Ａ～３Ｅ：ＴｒＹｂｅ０３（３Ａ：プロテインＡローディング（上清）；３Ｂ：プロテインＡ溶出液；３Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；３Ｄ：プロテインＬ溶出液；３Ｅ：プロテインＬフロースルー）；レーン５Ａ～５Ｅ：ＴｒＹｂｅ０５（５Ａ：プロテインＡローディング（上清）；５Ｂ：プロテインＡ溶出液：５Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；５Ｄ：プロテインＬ溶出液；５Ｅ：プロテインＬフロースルー）。 ＴｒＹｂｅ０３及びＴｒＹｂｅ０５分子のローディング物質、溶出液及びフロースルーを含む、プロテインＡ及びプロテインＬクロマトグラフィーの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す図である。試料は以下のようにローディングした：レーンＭ：Ｍａｒｋ１２（商標）；レーン３Ａ～３Ｅ：ＴｒＹｂｅ０３（３Ａ：プロテインＡローディング（上清）；３Ｂ：プロテインＡ溶出液；３Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；３Ｄ：プロテインＬ溶出液；３Ｅ：プロテインＬフロースルー）；レーン５Ａ～５Ｅ：ＴｒＹｂｅ０５（５Ａ：プロテインＡローディング（上清）；５Ｂ：プロテインＡ溶出液：５Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；５Ｄ：プロテインＬ溶出液；５Ｅ：プロテインＬフロースルー）。 還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの濃度測定解析を示す図である。試料は、ＴｒＹｂｅ０３及びＴｒＹｂｅ０５（横軸）のプロテインＡ溶出液を含む。解析は、縦軸に、重鎖バンドの密度に対するパーセンテージとして示される。 ＴｒＹｂｅ０４及びＴｒＹｂｅ０６分子のローディング物質、溶出液及びフロースルーを含む、プロテインＡ及びプロテインＬクロマトグラフィーの還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す図である。試料は以下のようにローディングした：レーンＭ：Ｍａｒｋ１２（商標）；レーン４Ａ～４Ｅ：ＴｒＹｂｅ０４（４Ａ：プロテインＡローディング（上清）；４Ｂ：プロテインＡ溶出液；４Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；４Ｄ：プロテインＬ溶出液；４Ｅ：プロテインＬフロースルー）；レーン６Ａ～６Ｅ：ＴｒＹｂｅ０６（６Ａ：プロテインＡローディング（上清）；６Ｂ：プロテインＡ溶出液：６Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；６Ｄ：プロテインＬ溶出液；６Ｅ：プロテインＬフロースルー）。 ＴｒＹｂｅ０４及びＴｒＹｂｅ０６分子のローディング物質、溶出液及びフロースルーを含む、プロテインＡ及びプロテインＬクロマトグラフィーの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析を示す図である。試料は以下のようにローディングした：レーンＭ：Ｍａｒｋ１２（商標）；レーン４Ａ～４Ｅ：ＴｒＹｂｅ０４（４Ａ：プロテインＡローディング（上清）；４Ｂ：プロテインＡ溶出液；４Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；４Ｄ：プロテインＬ溶出液；４Ｅ：プロテインＬフロースルー）；レーン６Ａ～６Ｅ：ＴｒＹｂｅ０６（６Ａ：プロテインＡローディング（上清）；６Ｂ：プロテインＡ溶出液：６Ｃ：プロテインＬローディング（プロテインＡフロースルー）；６Ｄ：プロテインＬ溶出液；６Ｅ：プロテインＬフロースルー）。 還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの濃度測定解析を示す図である。試料は、ＴｒＹｂｅ０４及びＴｒＹｂｅ０６（横軸）のプロテインＡ溶出液を含む。解析は、縦軸に、重鎖バンドの密度に対するパーセンテージとして示される。 市販の精製プロテインＡヘの試験分子及び対照の各濃度（横軸）での結合応答（応答単位又は共鳴単位のＲＵ；縦軸）を示す図である。 精製した組換えプロテインＡヘの試験分子及び対照の各濃度（横軸）での結合応答（応答単位又は共鳴単位のＲＵ；縦軸）を示す図である。
本開示の文脈での使用のための抗体は、完全抗体及びその機能的活性断片（すなわち、抗原結合断片とも呼ばれる、抗原を特異的に結合する抗原結合ドメインを含有する分子）を含む。抗体に関する本明細書に記載される特徴は、文脈が他に示さない限り、抗体断片にも適用される。抗体は、モノクローナル、多価、多特異性、二重特異性、完全ヒト、ヒト化又はキメラであってもよい（か又はこれらに由来してもよい）。
「免疫グロブリン（Ｉｇ）」としても公知の完全抗体は、通常、無傷の又は完全長抗体に関し、すなわちアセンブルして特徴的なＹ型三次元構造を画定する、ジスルフィド結合によって相互接続される２つの重鎖及び２つの軽鎖のエレメントを含む。古典的な天然の完全抗体は、それらが１つの抗原型に結合する単一特異性、及びそれらが２つの独立した抗原結合ドメインを有する二価である。用語「無傷な抗体」、「完全長抗体」及び「完全抗体」は、交換可能に使用され、本明細書で規定されるＦｃ領域を含む、天然の抗体構造と類似した構造を有する単一特異性二価抗体を指す。
各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略）及びＩｇクラスによって３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３又は４つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４で構成される重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。Ｉｇ又は抗体の「クラス」は、定常領域の型を指し、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭを含み、それらのいくつかは、サブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４にさらに分けられ得る。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
本発明による抗体又はその抗原結合断片のＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と名付けられる、より構造的に保存される領域と共に点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と名付けられる抗原の認識を決定する超可変性の領域（又は「超可変領域」）にさらに細分割され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＣＤＲ及びＦＲは共に可変領域を形成する。慣例では、抗体又はその抗原結合断片の重鎖可変領域のＣＤＲは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３と呼ばれ、軽鎖可変領域のＣＤＲは、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と呼ばれる。それらは、各鎖のＮ末端からＣ末端の方向で順に番号付けられる。
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って慣例的に番号付される。このシステムは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，「免疫学的に関心のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ（以降「Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記）」)に記載される。この番号付けシステムは、他に指定される場合を除き、本明細書で使用される。Ｋａｂａｔの残基命名は、アミノ酸残基の直線状の番号付けにいつも直接対応するわけではない。実際の直線状のアミノ酸配列は、基本の可変ドメイン構造の、フレームワークか相補性決定領域（ＣＤＲ）のいずれにせよ構造成分の短縮、又はそれへの挿入に対応する、厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも、少ない又は追加のアミノ酸を含有し得る。残基の正確なＫａｂａｔ番号付けは、「標準の」Ｋａｂａｔ番号付け配列との抗体の配列における相同性の残基のアライメントによって所与の抗体について決定され得る。
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより、残基３１～３５（ＣＤＲ－Ｈ１）、残基５０～６５（ＣＤＲ－Ｈ２）及び残基９５～１０２（ＣＤＲ－Ｈ３）に位置する。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．J．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６,９０１－９１７(１９８７)）により、ＣＤＲ－Ｈ１にあたるループは、残基２６～残基３２に拡大する。したがって、他に指定されない限り、本明細書で用いられる「ＣＤＲ－Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムとＣｈｏｔｈｉａの形態学的ループ定義の組合せによって記載されるように、残基２６～３５を指すことを意図する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより、残基２４～３４（ＣＤＲ－Ｌ１）、残基５０～５６（ＣＤＲ－Ｌ２）及び残基８９～９７（ＣＤＲ－Ｌ３）に位置する。免疫グロブリンファミリーの異なるメンバーの配列のアライメントに基づき、番号付けスキームが提示されており、例えばＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ａｎｄ Ｄｏｎｄｅｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ９，ａｒｔｉｃｌｅ ２２７８に記載される。
ヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子座は、ヌクレオチド配列に基づいて分けられ得る６個の主なファミリーを表す。ファミリー及びそれら由来のＶＨドメインは、通常、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６を指す。
用語「定常ドメイン（単数又は複数）」、「定常領域」は、本明細書で使用する場合、交換可能に使用され、可変領域の外側である抗体のドメイン（単数又は複数）を指す。定常ドメインは、同じアイソタイプの全ての抗体で同一であるが、１つのアイソタイプと別のアイソタイプで異なる。典型的には、重鎖の定常領域が、３つ又は４つの定常ドメインを含む、ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－場合によりＣＨ４により、Ｎ末端からＣ末端まで形成される。
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案した機能、特に必要とされ得るエフェクター機能に関して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４ドメインであり得る。特に、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン、特に抗体分子が治療使用を意図され、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、ＩｇＧ１アイソタイプの定常領域ドメインが使用され得る。或いは、抗体分子が治療目的を意図され、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプが使用され得る。これらの定常領域ドメインの配列バリアントも使用され得ることが理解されるであろう。例えば、２４１位（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる番号付け）のセリンが、Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３．「単一アミノ酸置換は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析中に観察されたようにキメラマウス／ヒト（ＩｇＧ４）抗体の異種性を消失させる（Ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ａｂｏｌｉｓｈｅｓ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ（ＩｇＧ４）ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０，１０５－１０８）に記載されるようにプロリンへと交換され、本明細書ではＩｇＧ４Ｐと呼ばれるＩｇＧ４分子が使用され得る。
「Ｆｃ」、「Ｆｃ断片」、「Ｆｃ領域」は、交換可能に使用され、第１の定常領域ドメインを除く抗体の定常領域を含む抗体のＣ末端領域を指す。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後２つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３、又はＩｇＥ及びＩｇＭの最後３つの定常ドメイン、及びこれらのドメインへの可動性ヒンジＮ末端を指す。ヒトＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域は、本明細書では、番号付けはＫａｂａｔのようにＥＵ指標に従い、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６を含むことを定義される。ヒトＩｇＧ１の文脈では、ＫａｂａｔのようにＥＵ指標に従って、下位（lower）ヒンジは２２６～２３６位を指し、ＣＨ２ドメインは２３７～３４０位を指し、ＣＨ３ドメインは３４１～４４７位を指す。他の免疫グロブリンの対応するＦｃ領域は、配列アライメントによって同定され得る。
本明細書に記載される抗体は単離される。「単離された」抗体は、その自然環境の成分から（例えば、精製手段によって）分離されたものである。
「多特異性抗体」は、本明細書で用いられる場合、少なくとも２つの抗原結合ドメイン、すなわち２つ以上の抗原結合ドメイン、例えば２つ又は３つの抗原結合ドメインを有し、少なくとも２つの抗原結合ドメインが、独立して２つの異なる抗原又は同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合する本明細書に記載される抗体を指す。多特異性抗体は、各特異性（抗原）に対して一価であり得る。本明細書に記載される多特異性抗体は、一価又は多価、例えば二価、三価、四価の多特異性抗体、並びに異なるエピトープに対して異なる結合価を有する多特異性抗体（例えば、第１の抗原特異性に対して一価、第１のものとは異なる第２の抗原特異性に対して二価である多価特異性抗体）を包含する。
一実施形態では、多価特異性抗体は、二重特異性抗体である。
「二重特異性（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ又はＢｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体」は、本明細書で用いられる場合、２つの抗原特異性を有する抗体を指す。一実施形態では、抗体は、２つの抗原結合ドメインを含み、１つの結合ドメインはＡＮＴＩＧＥＮ１に結合し、もう１つの結合ドメインはＡＮＴＩＧＥＮ２に結合する、すなわち各結合ドメインは各抗原に対して一価である。一実施形態では、抗体は、四価の二重特異性抗体であり、すなわち抗体は４つの抗原結合ドメインを含み、例えば２つの結合ドメインはＡＮＴＩＧＥＮ１に結合し、その他の２つの結合ドメインはＡＮＴＩＧＥＮ２に結合する。一実施形態では、抗体は、三価の二重特異性抗体である。
一実施形態では、多価特異性抗体は、三重特異性抗体である。
「三重特異性抗体」は、本明細書で用いられる場合、３つの抗原結合特異性を有する抗体を指す。例えば、抗体は、３つの異なる抗原又は同じ抗原の３つの異なるエピトープに独立して結合する３つの抗原結合ドメイン（三価）を有する、すなわち、各結合ドメインは各抗原に対して一価である抗体である。一実施形態では、３つの結合ドメインがあり、３つの結合ドメインのそれぞれは異なる（別の）抗原に結合する。
一実施形態では、３つの結合ドメインがあり、２つの結合ドメインは、同じ抗原の同じエピトープ又は異なるエピトープへの結合を含む、同じ抗原に結合し、第３の結合ドメインは、異なる（別の）抗原に結合する。
本発明の抗体は、マルチパラトピック抗体であり得る。
「マルチパラトピック抗体」は、本明細書で用いられる場合、２つ以上の異なるパラトープを含み、同じ抗原由来か又は２つの異なる抗原由来の異なるエピトープと相互作用する、本明細書に記載される抗体を指す。本明細書に記載されるマルチパラトピック抗体は、バイパラトピック、トリパラトピック、テトラパラトピックであり得る。
「抗原結合ドメイン」は、本明細書で用いられる場合、標的抗原と特異的に相互作用する、１つ又はそれ以上の可変ドメイン、例えば可変ドメインＶＨ及びＶＬの対の一部又は全体を含む、抗体の部分を指す。抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含み得る。一実施形態では、各抗原結合ドメインは、一価である。好ましくは、各抗原結合ドメインは、１つ以下のＶＨ及び１つ以下のＶＬを含む。
「特異的な」は、本明細書で用いられる場合、それに対して特異的である抗原だけを認識する結合ドメイン又はそれに対して非特異的な抗原に対する親和性と比較してそれに対して特異的である抗原に対する著しく高い結合親和性を有する結合ドメインを指すことを意図する。
結合親和性は、標準的なアッセイ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅのような表面プラズモン共鳴によって測定され得る。
「プロテインＡ結合ドメイン」は、本明細書で用いられる場合、プロテインＡに特異的に結合する結合ドメインを指すことを意図する。プロテインＡ結合ドメインは、プロテインＡを結合する、すなわちプロテインＡ結合界面を含むＶＨ３ドメイン又はＶＨ３ドメインの部分を指し得る。プロテインＡを結合するＶＨ３ドメインの部分は、ＶＨ３ドメインのＣＤＲを含まず、すなわちＶＨ３のプロテインＡ結合界面はＣＤＲを含まず；結果として、プロテインＡ結合ドメインは本明細書に開示されるように抗原結合ドメインと競合しないことが理解されるであろう。
一実施形態では、ｓが０であり、ｔが０である場合、本開示による多特異性抗体は：
ＶＨ－ＣＨ１部分がＶＬ－ＣＬ部分と一緒に機能性Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を形成する、それぞれ式（Ｉ）及び（ＩＩ）
の重鎖及び軽鎖の二量体として提供される。
一実施形態では、ｓが１であり、ｔが１である場合、本開示による多特異性抗体は：
２つの重鎖が鎖間相互作用によって、特にＣＨ２－ＣＨ３のレベルで接続され、各重鎖のＶＨ－ＣＨ１部分が各軽鎖のＶＬ－ＣＬ部分と一緒に機能性Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を形成する、それぞれ式（Ｉ）及び（ＩＩ）
の２つの重鎖及び２つの軽鎖の二量体として提供される。そのような実施形態では、２つのＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３部分は２つのＶＬ－ＣＬ部分と一緒に機能性完全長抗体を形成する。そのような実施形態では、完全長抗体は、機能性Ｆｃ領域を含み得る。
ＶＨは、重鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、ＶＨは、ヒト化される。一実施形態では、ＶＨは、完全にヒトである。
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、ＶＬは、ヒト化される。一実施形態では、ＶＬは、完全にヒトである。
通常、ＶＨとＶＬの対は、共に、例えばＦａｂ断片中で抗原結合ドメインを形成する。一実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、同族対を形成する。
「同族対」は、本明細書で用いられる場合、インビボで生成された、単一抗体からの可変ドメインの対、すなわち宿主から単離された可変ドメインの自然発生の対合を指す。同族対は、したがって、ＶＨとＶＬの対である。一例では、同族対は、協力して抗原に結合する。
いくつかの例では、例えばＶ１及び／又はＶ２、及び／又はＶ３に含まれる場合、ＶＨは、それ自体で抗原結合ドメインを形成し得る、すなわちそれ自体で目的の抗原に結合する単一ドメイン抗体を表し得る。
ＶＨＨは、重鎖可変ドメインからなる単一ドメイン抗体を表す。一実施形態では、ＶＨＨはラクダ類である。一実施形態では、ＶＨＨは、ヒト化される。一実施形態では、ＶＨＨは、完全にヒトである。
いくつかの例では、例えばＶ１及び／又はＶ２、及び／又はＶ３に含まれる場合、ＶＬはそれ自体で抗原結合ドメインを形成し得る、すなわちそれ自体で目的の抗原に結合する単一ドメイン抗体を表し得る。
「可変領域」又は「可変ドメイン」は、本明細書で用いられる場合、ＣＤＲ及びフレームワーク、特に好適なフレームワークを含む抗体鎖中の領域を指す。
本開示での使用のための可変領域は、通常、抗体由来であり、当技術分野で公知の任意の方法によって生成され得る。
「由来する」は、本明細書で用いられる場合、用いられる配列又は用いられる配列と非常に類似した配列が、オリジナルの遺伝物質、例えば抗体の軽鎖又は重鎖から得られた事実を指す。
「非常に類似した」は、本明細書で用いられる場合、その完全長にわたるアミノ酸配列が、９５％以上類似、例えば９６、９７、９８又は９９％類似していることを指すことを意図する。
本発明での使用のための可変領域は、ＶＨ及びＶＬについて本明細書に上述したように、任意の好適な供給源由来であってもよく、例えば完全にヒトであるか又はヒト化されてもよい。
一実施形態では、ＶＨ及びＶＬによって形成された結合ドメインは、第１の抗原に特異的である。
一実施形態では、Ｖ１の結合ドメインは、第２の抗原に特異的である。
一実施形態では、Ｖ２の結合ドメインは、第２又は第３の抗原に特異的である。
一実施形態では、Ｖ３の結合ドメインは、第３又は第４の抗原に特異的である。
一実施形態では、ＶＨ－ＶＬ、Ｖ１、Ｖ２及びＶ３の各１個が、示したように、そのそれぞれの抗原を別々に結合する。
一実施形態では、ＣＨ１ドメインは、抗体重鎖又はその誘導体由来の自然発生のドメイン１である。一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、抗体重鎖又はその誘導体由来の自然発生のドメイン２である。一実施形態では、ＣＨ３ドメインは、抗体重鎖又はその誘導体由来の自然発生のドメイン３である。
一実施形態では、軽鎖のＣＬ断片は、定常カッパ配列又はその誘導体である。一実施形態では、軽鎖のＣＬ断片は、定常ラムダ配列又はその誘導体である。
本明細書で用いられる場合、自然発生ドメインの誘導体は、自然発生配列中の少なくとも１個のアミノ酸が置き換え又は欠失され、例えば望ましくない特性を除去することによるなどドメインの特性を最適化するが、ドメインを特徴付けている特性（単数又は複数）は保持されることを指すことを意図する。一実施形態では、自然発生ドメインの誘導体は、自然発生配列と比較して、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、１１個又は１２個のアミノ酸置換又は欠失を含む。
一実施形態では、１つ又はそれ以上の天然の又は工学的に作成した鎖間（すなわち、軽鎖と重鎖の間）ジスルフィド結合は、機能性Ｆａｂ又はＦａｂ’断片に存在する。
一実施形態では、「天然の」ジスルフィド結合は、式（Ｉ）及び（ＩＩ）のポリペプチド鎖中のＣＨ１とＣＬの間に存在する。
ＣＬドメインが、カッパ又はラムダ由来である場合、結合形成システインの天然の位置は、ヒトｃカッパ及びｃラムダの２１４である（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ １９８７）。
ＣＨ１のジスルフィド結合形成システインの正確な位置は、実際に用いられる特定のドメインに依存する。したがって、例えば、ヒトガンマ－１では、ジスルフィド結合の天然の位置は２３３位に位置する（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ １９８７）。ガンマ２、３、４、ＩｇＭ及びＩｇＤのような他のヒトアイソタイプの結合形成システインの位置は公知であり、例えば、ヒトＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の１２７位並びにヒトＩｇＤ及びＩｇＡ２Ｂの重鎖の１２８位である。
場合により、式Ｉ及びＩＩのポリペプチドのＶＨとＶＬの間にジスルフィド結合があり得る。
一実施形態では、本開示による多特異性抗体は、自然発生のＣＨ１とＣＬの間と等価な又はそれに対応する位置にジスルフィド結合を有する。
一実施形態では、ＣＨ１を含む定常領域及びＣＬなどの定常領域は、非自然発生の位置にあるジスルフィド結合を有する。これは、必要とされる位置（単数又は複数）のアミノ酸鎖にシステイン（単数又は複数）を導入することによって分子に工学的に作成され得る。この非天然のジスルフィド結合は、天然のジスルフィド結合に加えて又はその代替えとして、ＣＨ１とＣＬの間に存在する。天然の位置のシステイン（単数又は複数）は、ジスルフィド架橋を形成することができないセリンなどのアミノ酸によって置き換えられ得る。
工学的に作成したシステインの導入は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施され得る。これらの方法は、限定はされないが、ＰＣＲ伸長オーバーラップ変異導入、部位特異的変異導入又はカセット変異導入を含む（通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ，１９８９；Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌs ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＆ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９３参照）。部位特異的変異導入キットは市販されており、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬＡ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）である。カセット変異導入は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ，３４：３１５－３２３に基づいて実施され得る。或いは、変異体は、アニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅による全遺伝子合成並びにオーバーラップオリゴヌクレオチドのクローニングによって作成され得る。
一実施形態では、ＣＨ１とＣＬの間のジスルフィド結合は完全に不在であり、例えば、鎖間システインは、セリンなどの別のアミノ酸によって置き換えられ得る。したがって、一実施形態では、分子の機能性Ｆａｂ断片に鎖間ジスルフィド結合は存在しない。参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／００３１７０号などの開示は、鎖間ジスルフィド結合の無いＦａｂ断片を提供する方法を記載する。
本発明での使用のための好ましい抗体フォーマットは、付加ＩｇＧ及び付加Ｆａｂを含み、これらにおいては、完全ＩｇＧ又はＦａｂ断片が、それぞれ、例えば、全て参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／０４０５６２号、国際公開第２０１０／０３５０１２号、国際公開第２０１１／０３０１０７号、国際公開第２０１１／０６１４９２号、国際公開第２０１１／０６１２４６号及び国際公開第２０１１／０８６０９１号に記載されるように、少なくとも１つの追加の抗原結合ドメイン（例えば、１個、２個、３個又は４個の追加の抗原結合ドメイン）、例えば、単一ドメイン抗体（例えばＶＨ若しくはＶＬ、又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖを、前記ＩｇＧ又はＦａｂの軽鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に、場合により前記ＩｇＧ又はＦａｂの重鎖に付加することによって工学的に処理される。特に、Ｆａｂ－Ｆｖフォーマットは、国際公開２００９／０４０５６２号に初めて開示され、そのジスルフィド安定化バージョン、Ｆａｂ－ｄｓＦｖは、国際公開第２０１０／０３５０１２号に初めて開示された。ｄｓＦｖがＦｖのＶＬ又はＶＨドメインのいずれかとＦａｂのＬＣのＣ末端との間の単一リンカーを介してＦａｂに接続される、単一リンカーＦａｂ－ｄｓＦｖは、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／０９６３９０号に初めて開示された。ｄｓＦｖをＩｇＧの軽鎖（及び場合により重鎖）のＣ末端に付加することにより工学的に作成した完全長ＩｇＧを含む付加ＩｇＧは、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１９７７８９号に初めて開示された。
本発明での使用のための別の好ましい抗体フォーマットは、２つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結したＦａｂを含み、各ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｂは同じ又は異なる標的に結合する（例えば、１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは治療標的に結合し、１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは例えばアルブミンを結合することによって半減期を増加させる）。そのような抗体断片は、その全体及び特に抗体断片の説明に関してが参照によって本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２０１５／１９７７７２号に記載される。本発明での使用のための別の好ましい抗体は、断片が、例えば参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０６８５７１号及びＤａｖｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｍａｂｓ，８（７）１３１９－１３３５に記載されるｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖの１つのみに連結するＦａｂを含む。
Ｖ１は、存在する場合、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨ、例えばｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖを表す。
Ｖ２は、存在する場合、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨ、例えばｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖを表す。
Ｖ３は、存在する場合、ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨ、例えばｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖを表す。
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、少なくとも１つのｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、又はＶＨＨを含む。
「単鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、本明細書で用いられる場合、ＶＨ可変ドメインとＶＬ可変ドメインの間のペプチドリンカーによって安定化される、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むか、又はそれらからなる単鎖可変断片を指す。ＶＨ及びＶＬ可変ドメインは、任意の好適な方向であってもよく、例えば、ＶＨのＣ末端は、ＶＬのＮ末端に連結されてもよく、又はＶＬのＣ末端は、ＶＨのＮ末端に連結されてもよい。
「ジスルフィド安定化単鎖可変断片」又は「ｄｓｓｃＦｖ」は、本明細書で用いられる場合、ＶＨ可変ドメインとＶＬ可変ドメインの間のペプチドリンカーによって安定化され、ＶＨとＶＬの間にドメイン間ジスルフィド結合も含む単鎖可変断片を指す。
「ジスルフィド安定化可変断片」又は「ｄｓＦｖ」は、本明細書で用いられる場合、ＶＨ可変ドメインとＶＬ可変ドメインの間にペプチドリンカーを含まず、ＶＨとＶＬの間のドメイン間ジスルフィド結合によって代わりに安定化される単鎖可変断片を指す。
一実施形態では、Ｖ１及び／又はＶ２及び／又はＶ３がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１及び／又はＶ２及び／又はＶ３の可変ドメインＶＨ及び可変ドメインＶＬの間のジスルフィド結合は、以下に列挙した２つの残基間である（文脈が他に示さない限り、Ｋａｂａｔの番号付けが以下のリストに用いられる）。Ｋａｂａｔ番号付けを参照する場合、関連参照はＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１（５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）「免疫学的関心のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡである。
一実施形態では、ジスルフィド結合は：
・ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ 例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）参照；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００ 例えば、Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５(３２１－３２９)，２０１２参照；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５ 例えばＪ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８，８２５－８３１ Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ（１９９５）参照；
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７ 例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ(１９９７)参照；
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１ 例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５－１３９ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９５）参照；
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０ 例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ １３６２－１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９０）参照；
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９；例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ １３６２－１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ(１９９０)参照；
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６；例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）参照；
・ＶＨ１０１＋ＶＬ４６；例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ(１９９７)参照；
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３ 例えば；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９０ ｐｐ．７５３８－７５４２ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）；又はＰｒｏｔｅｉｎｓ １９，３５－４７ Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９４）参照、
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７ 例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５－１３９ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ(１９９５)参照
を含む群から選択される位置、及び分子に位置する可変領域対のこれらの対応する位置にある。
一実施形態では、ジスフィルド結合はＶＨ４４とＶＬ１００の位置の間に形成される。
上記に列挙したアミノ酸対は、ジスルフィド結合が形成され得るように、システインによる置き換えを助ける位置にある。システインは、公知の技術によってこれらの所望の位置に工学的に作成され得る。一実施形態では、したがって、本開示による工学的に作成したシステインは、所与のアミノ酸位置の自然発生の残基がシステイン残基によって置き換えられる場所を指す。
工学的に作成したシステインの導入は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施され得る。これらの方法は、限定はされないが、ＰＣＲ伸長オーバーラップ変異導入、部位特異的変異導入又はカセット変異導入を含む（通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ，１９８９；Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌs ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＆ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９９３参照）。部位特異的変異導入キットは市販されており、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）である。カセット変異導入は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ，３４：３１５－３２３に基づいて実施され得る。或いは、変異体は、アニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅による全遺伝子合成並びにオーバーラップオリゴヌクレオチドのクローニングによって作成され得る。
したがって、一実施形態では、Ｖ１及び／又はＶ２及び／又はＶ３がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨ及びＶＬ及び／又はＶ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬ、及び／又はＶ３の可変ドメインＶＨ及びＶＬは、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されてもよく、システイン残基の対の位置は：ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。
一実施形態では、Ｖ１及び／又はＶ２及び／又はＶ３がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨ及びＶＬ及び／又はＶ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬ及び／又はＶ３の可変ドメインＶＨ及びＶＬは、ＣＤＲの外側である、１つはＶＨ及び１つはＶＬの２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されてもよく、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。
一実施形態では、Ｖ１がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨ及びＶＬは、２つの工学的に作成したシステイン残基間、一方の位置はＶＨ４４であり他方はＶＬ１００のジスルフィド結合によって連結される。一実施形態では、Ｖ２がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬは、２つの工学的に作成したシステイン残基間、一方の位置はＶＨ４４であり他方はＶＬ１００のジスルフィド結合によって連結される。一実施形態では、Ｖ３がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ３の可変ドメインＶＨ及びＶＬは、２つの工学的に作成したシステイン残基間、一方の位置はＶＨ４４であり他方はＶＬ１００のジスルフィド結合によって連結される。
一実施形態では、Ｖ１がｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖである場合、Ｖ１のＶＨドメインはＸに接着される。
一実施形態では、Ｖ１がｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖである場合、Ｖ１のＶＬドメインはＸに接着される。
一実施形態では、Ｖ２がｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖである場合、Ｖ２のＶＨドメインはＹに接着される。
一実施形態では、Ｖ２がｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖである場合、Ｖ２のＶＬドメインはＹに接着される。
一実施形態では、Ｖ３がｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖである場合、Ｖ３のＶＨドメインはＺに接着される。
一実施形態では、Ｖ３がｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、又はｓｃＦｖである場合、Ｖ３のＶＬドメインはＺに接着される。
当業者は、Ｖ１及び／又はＶ２及び／又はＶ３がｄｓＦｖを表す場合、多特異性抗体は、Ｘ又はＹ又はＺに接着しない対応する遊離のＶＨ又はＶＬドメインをコードする第３のポリペプチドを含むことを理解するであろう。Ｖ１及びＶ２、Ｖ２及びＶ３、又はＶ１及びＶ２及びＶ３がｄｓＦｖである場合、次いで「遊離の可変ドメイン」（すなわち、ジスルフィド結合を介して残りのポリペプチドに連結するドメイン）は、両鎖に共通しているであろう。したがって、Ｘ又はＹ又はＺを介してポリペプチドに融合又は連結された実際の可変ドメインは、各ポリペプチド鎖で異なってもよいが、それと対をなす遊離の可変ドメインは、通常、互いに同一であろう。
一実施形態では、Ｖ１はＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨであり、抗原結合ドメインを形成する。一実施形態では、Ｖ１は、相補的なＶＬと協力して目的の抗原に結合するＶＨである。一実施形態では、Ｖ１は、相補的なＶＨと協力して目的の抗原に結合するＶＬである。
一実施形態では、Ｖ２はＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨであり、抗原結合ドメインを形成する。一実施形態では、Ｖ２は、相補的なＶＬと協力して目的の抗原に結合するＶＨである。一実施形態では、Ｖ２は、相補的なＶＨと協力して目的の抗原に結合するＶＬである。
一実施形態では、Ｖ３はＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨであり、抗原結合ドメインを形成する。一実施形態では、Ｖ３は、相補的なＶＬと協力して目的の抗原に結合するＶＨである。一実施形態では、Ｖ３は、相補的なＶＨと協力して目的の抗原に結合するＶＬである。
一実施形態では、Ｖ１はＶＨであり、Ｖ２はＶ１のＶＨと相補的であるＶＬであり、ＶＨ／ＶＬ、すなわちＶ１／Ｖ２は、対合し、抗原結合ドメインを形成する、すなわちＶ１のＶＨは、Ｖ２の相補的なＶＬと協力して目的の抗原に結合する。
一実施形態では、Ｖ１はＶＬであり、Ｖ２はＶ１のＶＬと相補的であるＶＨであり、ＶＬ／ＶＨ、すなわちＶ１／Ｖ２は、対合し、抗原結合ドメインを形成する、すなわちＶ１のＶＬは、Ｖ２の相補的なＶＨと協力して目的の抗原に結合する。
一実施形態では、Ｖ１がＶＨであり、Ｖ２が相補的なＶＬである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨ及びＶ２のＶＬは、２つの工学的に作成したシステイン残基間、一方の位置はＶ１のＶＨ４４であり他方はＶ２のＶＬ１００のジスルフィド結合によって連結され得る。一実施形態では、Ｖ１がＶＬであり、Ｖ２が相補的なＶＨである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＬ及びＶ２のＶＨは、２つの工学的に作成したシステイン残基間、一方の位置はＶ１のＶＬ１００であり他方の位置はＶ２のＶＨ４４のジスルフィド結合によって連結され得る。
本開示の式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、プロテインＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、１つ、２つ、又は３つのプロテインＡ結合ドメインを含む。
プロテインＡは、元々、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の細胞壁で見出された４２ｋＤａの表面タンパク質である。プロテインＡは、免疫グロブリンの検出、定量及び精製に広く使用されてきた。プロテインＡは、ＶＨ３ファミリー抗体由来のＦａｂ部分、及びＩｇＧの定常領域部分（ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間）のＦｃガンマ領域に結合することが報告されている。プロテインＡとＦａｂによって形成された複合体の結晶構造は、例えば、Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＰＮＡＳ，９７（１０）：５３９９－５４０４に記載されている。
本開示の文脈では、プロテインＡは、プロテインＡバリアント又は誘導体が、ＶＨ３ドメインに結合するその能力を維持する程度まで、天然のプロテインＡ及びその任意のバリアント又は誘導体を包含する。
一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、ＶＨ及び／又はＣＨ２－ＣＨ３及び／又はＶ１に存在するプロテインＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、ＶＨ及び／又はＣＨ２－ＣＨ３及び／又はＶ１に存在する１つ、２つ又は３つのプロテインＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、ＶＨ又はＶ１に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。一実施形態では、ｓは０であり、ｔは０であり、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、ＶＨ又はＶ１に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、ＶＨに存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。一実施形態では、ｓは０であり、ｔは０であり、ｐは０であり、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、ＶＨに存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、Ｖ１に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。一実施形態では、ｓは０であり、ｔは０であり、ｐは１であり、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、Ｖ１に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む。
一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶＨ及びＣＨ２－ＣＨ３に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。別の実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶＨ及びＶ１に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。別の実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、それぞれＣＨ２－ＣＨ３及びＶ１に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。
一実施形態では、式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶＨ、ＣＨ２－ＣＨ３及びＶ１に存在する、３つのプロテインＡ結合ドメインを含む。
天然のプロテインＡは、特に、ＩｇＧの定常領域部分のＦｃガンマ領域と相互作用することができる。より特には、プロテインＡは、ＣＨ２とＣＨ３の間の結合ドメインと相互作用することができる。一実施形態では、ｓが１であり、ｔが１である場合、ＣＨ２とＣＨ３の両方が、ＩｇＧクラスの自然発生ドメインである。
一部の実施形態では、プロテインＡ結合ドメイン（単数又は複数）は、プロテインＡに結合するＶＨ３ドメイン又はそのバリアントを含むか又はそれらからなる。一部の実施形態では、プロテインＡ結合ドメイン（単数又は複数）は、自然発生のＶＨ３ドメインを含むか又はそれらからなる。一部の実施形態では、プロテインＡに結合するＶＨ３ドメインのバリアントは、自然発生のＶＨ３ドメインのバリアントであり、前記自然発生のＶＨ３ドメインは、プロテインＡに結合することができない。
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、少なくとも１つのｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、又はＶＨＨを含む。一実施形態では、式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、１つのみのｄｓｓｃＦｖを含む。一実施形態では、式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、１つのみのｄｓＦｖを含む。一実施形態では、式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、１つのみのｓｃＦｖを含む。一実施形態では、式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、１つのみのＶＨを含む。一実施形態では、式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は。１つのＶＨＨのみを含む。
本開示の式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、プロテインＡに結合しない。一実施形態では、Ｖ２の結合ドメインは、プロテインＡに結合しない。一実施形態では、Ｖ３の結合ドメインは、プロテインＡに結合しない。一実施形態では、Ｖ２とＶ３の両方が、プロテインＡに結合しない。一部の実施形態では、Ｖ２及び／又はＶ３は、ＶＨ１及び／又はＶＨ２及び／又はＶＨ４及び／又はＶＨ５及び／又はＶＨ６を含むか、又はそれらからなり、ＶＨ３ドメインを含まない。一部の実施形態では、Ｖ２及び／又はＶ３は、プロテインＡに結合しないＶＨ３ドメイン又はそのバリアントを含むか、又はそれらからなる。一部の実施形態では、Ｖ２及び／又はＶ３は、プロテインＡに結合することができない自然発生のＶＨ３ドメインを含むか、又はそれらからなる。一部の実施形態では、プロテインＡに結合しないＶＨ３ドメインのバリアントは、自然発生のＶＨ３のバリアントであり、前記自然発生のＶＨ３ドメインはプロテインＡに結合することができる。
ヒトＶＨ３生殖系列遺伝子及びＶＨ３ドメイン（又はフレームワーク）は、よく特徴付けられている。多くの自然発生のＶＨ３ドメインは、プロテインＡに結合する能力を有するが、ある特定の自然発生のＶＨ３ドメインは、プロテインＡに結合する能力を有さない（Ｒｏｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．；１５４（１２）：６４３７－６４４５）。
本開示での使用のためのＶＨ３ドメインは、いくつかの方法によって得ることができる。一実施形態では、本開示での使用のためのＶＨ３ドメインは自然発生のＶＨ３ドメインであり、本開示のポリペプチド（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）内のその位置によって、プロテインＡに結合することができるか又はできないかで選択される。例えば、抗体のパネルは、非ヒト動物の免疫化によって目的の抗原に対して生成され、次いでヒト化され、ヒト化抗体は、例えばプロテインＡアフィニティーカラムに対して、ヒト化ＶＨ３ドメインを介してプロテインＡに結合することができるか又はできないかに基づき、スクリーニング又は選択され得る。或いは、ディスプレイ技術（例えば、ファージディスプレイ、イーストディスプレイ、リボソームディスプレイ、バクテリアディスプレイ、哺乳動物細胞表面ディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイ）が使用され、抗体ライブラリーをスクリーニングし、特に、ＣＤＲを含まないプロテインＡ結合界面を介して結合する、又はプロテインＡに結合しないＶＨ３ドメインを含む抗体を選択することができる。
或いは、本開示での使用のためのＶＨ３ドメインは、自然発生のＶＨ３のバリアントである。一実施形態では、ＶＨ３バリアントは、プロテインＡに結合することができる自然発生のＶＨ３の配列を含み、プロテインＡに結合するその能力を消失させる少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含む。一実施形態では、プロテインＡに結合するＶＨ３バリアントは、プロテインＡに結合することができない自然発生のＶＨ３の配列を含み、少なくとも１つのアミノ酸変異をさらに含む。そのような実施形態では、変異（単数又は複数）は、ＶＨ３ドメインのプロテインＡに結合する能力を得ることを担い、すなわち、変異（単数又は複数）は、天然には存在しないプロテインＡ結合ドメインの生成に寄与する。
一実施形態では、ＶＨ３バリアントは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個のアミノ酸変異を含む。一実施形態では、ＶＨ３バリアントは、Ｋａｂａｔに従って番号付けられ、例えば、Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＰＮＡＳ，９７（１０）：５３９９－５４０４に記載されるように、ＶＨ３の位置１５、１７、１９、５７、５９、６４、６５、６６、６８、７０、８１又は８２に変異を含む。より特には、ＶＨ３バリアントは、Ｋａｂａｔに従って番号付けられ、例えば、Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＰＮＡＳ，９７（１０）：５３９９－５４０４に記載されるように、ＶＨ３の位置８２ａ又は８２ｂに変異を含み得る。変異は、置換、欠失、又は挿入であってもよい。一実施形態では、ＶＨ３バリアントは、Ｋａｂａｔに従って番号付けられ、ＶＨ３の位置１５、１７、１９、５７、５９、６４、６５、６６、６８、７０、８１又は８２に置換を含む。より特には、ＶＨ３バリアントは、Ｋａｂａｔに従って番号付けられ、例えば、Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＰＮＡＳ，９７（１０）：５３９９－５４０４に記載されるように、ＶＨ３の位置８２ａ又は８２ｂに置換を含み得る。
自然発生のＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ４、ＶＨ５及びＶＨ６はプロテインＡに結合しない。一実施形態では、プロテインＡに結合しないＶＨドメインは、ＶＨ１である。一実施形態では、プロテインＡに結合しないＶＨドメインは、ＶＨ２である。一実施形態では、プロテインＡに結合しないＶＨドメインは、ＶＨ４である。一実施形態では、プロテインＡに結合しないＶＨドメインは、ＶＨ５である。一実施形態では、プロテインＡに結合しないＶＨドメインは、ＶＨ６である。
本発明の文脈では、新しい方法が開発されており、本発明によるポリペプチド又は結合ドメインのプロテインＡへの結合を評価するために使用され得る。プロテインＡ相互作用アッセイは、プロテインＡへの結合を定性的に評価するために開発された。したがって、一態様では、本発明は、本発明によるポリペプチド又は結合ドメインを選択するための方法であって、プロテインＡ相互作用アッセイの使用を含む方法を提供する。実施例に記載されるように、プロテインＡ相互作用アッセイが使用され得る。
一態様では、本発明は、本発明によるポリペプチド（ＩＩ）での使用のための、すなわちプロテインＡに結合しないｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、又はＶＨＨを選択するための方法であって：
ａ）ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、又はＶＨＨを付加した、プロテインＡに結合しないＦａｂを含む試験分子を産生するステップ；及び
ｂ）ステップａ）で得られた試験分子をプロテインＡクロマトグラフィーカラムにローディングするステップ；及び
ｃ）ステップｂ）から得られたフロースルーを回収するステップ；及び
ｄ）ステップｂ）のカラムをランニングバッファーで洗浄するステップ；及び
ｅ）酸性ステップ溶出を実施するステップ；及び、
ｆ）フロースルーから回収された試験分子中に含まれるｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、又はＶＨＨを選択するステップ
を含む方法を提供する。
一実施形態では、プロテインＡに結合しないＦａｂは、マウスＦａｂである。一実施形態では、プロテインＡクロマトグラフィーカラムは、ＰＯＲＯＳ（商標）Ａ ２０μｍカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。一実施形態では、ランニングバッファーは、ＰＢＳ ｐＨ７．４である。一実施形態では、ステップｄ）では、カラムは、３０分間６０カラム容積で洗浄した。一実施形態では、ステップｅ）での酸性ステップ溶出は、２分間、２．０ｍｌ／分で、０．１Ｍ グリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．７によって実施した。
さらに、Ｂｉａｃｏｒｅを使用する表面プラズモン共鳴アッセイは、プロテインＡヘの結合を定量的に評価するために開発された。したがって、一態様では、本発明は、本発明によるポリペプチド又は結合ドメインを選択するための方法であって、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイの使用を含む方法を提供する。実施例に記載されるように、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイが使用され得る。
一態様では、本発明は、本発明によるポリペプチド（ＩＩ）での使用のための、すなわちプロテインＡに結合しないｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、又はＶＨＨを選択するための方法であって：
ａ）ｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、又はＶＨＨを付加した、プロテインＡに結合しないＦａｂを含む試験分子を産生するステップ；及び
ｂ）例えばＢｉａｃｏｒｅを使用して、表面プラズモン共鳴により、ステップａ）で得られた試験分子の結合を測定するステップ；及び
ｃ）非結合陰性対照を滴定するステップ；及び
ｄ）非結合陰性対照で観察された応答よりも２倍以下の結合応答を示す試験分子に含まれるｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、又はＶＨＨを選択するステップ
を含む方法を提供する。
一実施形態では、プロテインＡに結合しないＦａｂは、マウスＦａｂである。
実施例に記載されるように、本発明者らは、式（Ｉ）のポリペプチド鎖はプロテインＡに結合するが、抗体軽鎖、すなわち式（ＩＩ）のポリペプチド鎖の本発明の文脈でプロテインＡに結合する能力を完全に消失させることの重要性を示した。したがって、この方法は、ポリペプチド（Ｉ）の一部として選択及び使用され得る、プロテインＡへの強い結合を示すポリペプチド又はプロテインＡ結合ドメイン、及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖に含まれてはならないプロテインＡへの弱い結合を示すポリペプチド又はプロテインＡ結合ドメインの同定を可能にする。
一部の実施形態では、ｐは１である。一部の実施形態では、ｐは０である。一部の実施形態では、ｑは１である。一部の実施形態では、ｑは０であり、ｒは１である。一部の実施形態では、ｒは１である。一部の実施形態では、ｑは１であり、ｒは０である。一部の実施形態では、ｑは１であり、ｒは１である。一部の実施形態では、ｓは１である。一部の実施形態では、ｓは０である。一部の実施形態では、ｔは１である。一部の実施形態では、ｔは０である。一部の実施形態では、ｓは１であり、ｔは１である。一部の実施形態では、ｓは０であり、ｔは０である。
一実施形態では、ｐは１であり、ｑは１であり、ｒは０であり、ｓは０であり、ｔは０であり、Ｖ１とＶ２の両方はｄｓｓｃＦｖを表す。したがって、一態様では：
ａ）式（Ｉａ）：
ＶＨ－ＣＨ１－Ｘ－Ｖ１
のポリペプチド鎖；及び
ｂ）式（ＩＩａ）：
ＶＬ－ＣＬ－Ｙ－Ｖ２
のポリペプチド鎖
を含むか又はこれらからなる多特異性抗体であって、
式中：
ＶＨは重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン１を表し；
Ｘは結合又はリンカーを表し；
Ｙは結合又はリンカーを表し；
Ｖ１はｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬはＣカッパなどの、軽鎖定常領域由来のドメインを表し；
Ｖ２はｄｓｓｃＦｖを表し；
式（Ｉａ）のポリペプチド鎖はプロテインＡ結合ドメインを含み；
式（ＩＩａ）のポリペプチド鎖はプロテインＡに結合しない、多特異性抗体を提供する。
そのような実施形態では、Ｖ２はプロテインＡに結合せず、すなわちＶ２のｄｓｓｃＦｖはプロテインＡ結合ドメインを含まない。一実施形態では、Ｖ２、すなわちＶ２のｄｓｓｃＦｖは、ＶＨ１ドメインを含む。別の実施形態では、Ｖ２、すなわちＶ２のｄｓｓｃＦｖは、プロテインＡに結合しないＶＨ３ドメインを含む。一実施形態では、Ｖ２、すなわちＶ２のｄｓｓｃＦｖは、ＶＨ２ドメインを含む。一実施形態では、Ｖ２、すなわちＶ２のｄｓｓｃＦｖは、ＶＨ４ドメインを含む。一実施形態では、Ｖ２、すなわちＶ２のｄｓｓｃＦｖは、ＶＨ５ドメインを含む。一実施形態では、Ｖ２、すなわちＶ２のｄｓｓｃＦｖは、ＶＨ６ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉａ）のポリペプチド鎖は、ＶＨ又はＶ１に存在する１つだけのプロテインＡ結合ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉａ）のポリペプチド鎖は、Ｖ１に存在する１つのみのプロテインＡ結合ドメインを含む。別の実施形態では、式（Ｉａ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶＨ又はＶ１に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。
別の実施形態では、ｐは０であり、ｑは１であり、ｒは０であり、ｓは１であり、ｔは１であり、Ｖ２はｄｓｓｃＦｖである。したがって、一態様では：
ａ）式（Ｉｂ）：
ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３
のポリペプチド鎖；及び
ｂ）式（ＩＩｂ）：
ＶＬ－ＣＬ－Ｙ－Ｖ２
のポリペプチド鎖
を含むか又はこれらからなる多特異性抗体であって、
式中：
ＶＨは重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン１を表し；
ＣＨ２は重鎖定常領域のドメイン２を表し；
ＣＨ３は重鎖定常領域のドメイン３を表し；
Ｙは結合又はリンカーを表し；
ＶＬは軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬはＣカッパのような、軽鎖定常領域由来のドメインを表し；
Ｖ２はｄｓｓｃＦｖを表し；
式（Ｉｂ）のポリペプチド鎖はプロテインＡ結合ドメインを含み；
式（ＩＩｂ）のポリペプチド鎖はプロテインＡに結合しない、多特異性抗体を提供する。
そのような実施形態では、Ｖ２はプロテインＡに結合せず、すなわちＶ２のｄｓｓｃＦｖはプロテインＡ結合ドメインを含まない。一実施形態では、Ｖ２、すなわちＶ２のｄｓｓｃＦｖ、ＶＨ１ドメインを含む。別の実施形態では、Ｖ２、すなわちＶ２のｄｓｓｃＦｖは、プロテインＡに結合しないＶＨ３ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉｂ）のポリペプチド鎖は、ＶＨ又はＣＨ２－ＣＨ３に存在する１つのみのプロテインＡ結合ドメインを含む。別の実施形態では、式（Ｉｂ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶＨ及びＣＨ２－ＣＨ３に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。
別の実施形態では、ｐは０であり、ｑは１であり、ｒは０であり、ｓは１であり、ｔは１であり、Ｖ２はｄｓＦｖである。したがって、一態様では：
ａ）式（Ｉｃ）：
ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３
のポリペプチド鎖；及び
ｂ）式（ＩＩｃ）：
ＶＬ－ＣＬ－Ｙ－Ｖ２
のポリペプチド鎖
を含むか又はこれらからなる多特異性抗体であって、
式中：
ＶＨは重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン１を表し；
ＣＨ２は重鎖定常領域のドメイン２を表し；
ＣＨ３は重鎖定常領域のドメイン３を表し；
Ｙは結合又はリンカーを表し；
ＶＬは軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬはＣカッパのような、軽鎖定常領域由来のドメインを表し；
Ｖ２はｄｓＦｖを表し；
式（Ｉｃ）のポリペプチド鎖はプロテインＡ結合ドメインを含み；
式（ＩＩｃ）のポリペプチド鎖はプロテインＡに結合しない、多特異性抗体を提供する。
そのような実施形態では、Ｖ２、すなわちＶ２のｄｓＦｖは、プロテインＡに結合しない。一実施形態では、Ｖ２、すなわちＶ２のｄｓＦｖは、ＶＨ１ドメインを含む。別の実施形態では、Ｖ２、すなわちＶ２のｄｓＦｖは、プロテインＡに結合しないＶＨ３ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉｃ）のポリペプチド鎖は、ＶＨ又はＣＨ２－ＣＨ３に存在する１つのみのプロテインＡ結合ドメインを含む。別の実施形態では、式（Ｉｃ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶＨ及びＣＨ２－ＣＨ３に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。
別の実施形態では、ｐは０であり、ｑは０であり、ｒは１であり、ｓは１であり、ｔは１であり、Ｖ３はｄｓｓｃＦｖである。したがって、一態様では：
ａ）式（Ｉｄ）：
ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３
のポリペプチド鎖；及び
ｂ）式（ＩＩｄ）：
Ｖ３－Ｚ－ＶＬ－ＣＬ；
のポリペプチド鎖
を含むか又はこれらからなる多特異性抗体であって、
式中：
ＶＨは重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン１を表し；
ＣＨ２は重鎖定常領域のドメイン２を表し；
ＣＨ３は重鎖定常領域のドメイン３を表し；
Ｚは結合又はリンカーを表し；
ＶＬは軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬはＣカッパのような、軽鎖定常領域由来のドメインを表し；
Ｖ３はｄｓｓｃＦｖを表し；
式（Ｉｄ）のポリペプチド鎖はプロテインＡ結合ドメインを含み；
式（ＩＩｄ）のポリペプチド鎖はプロテインＡに結合しない、多特異性抗体を提供する。
そのような実施形態では、Ｖ３、すなわちＶ３のｄｓｓｃＦｖは、プロテインＡに結合しない。一実施形態では、Ｖ３、すなわちＶ３のｄｓｓｃＦｖは、ＶＨ１ドメインを含む。別の実施形態では、Ｖ３、すなわちＶ３のｄｓｓｃＦｖは、プロテインＡに結合しないＶＨ３ドメインを含む。一実施形態では、式（Ｉｄ）のポリペプチド鎖は、ＶＨ又はＣＨ２－ＣＨ３に存在する１つのみのプロテインＡ結合ドメインを含む。別の実施形態では、式（Ｉｄ）のポリペプチド鎖は、それぞれＶＨ及びＣＨ２－ＣＨ３に存在する２つのプロテインＡ結合ドメインを含む。
一実施形態では、Ｘは結合である。
一実施形態では、Ｙは結合である。
一実施形態では、Ｚは結合である。
一実施形態では、ＸとＹの両方が結合である。一実施形態では、ＸとＺの両方が結合である。一実施形態では、ＹとＺの両方が結合である。一実施形態では、Ｘ、Ｙ及びＺが結合である。
一実施形態では、Ｘはリンカー、好ましくはペプチドリンカー、例えばｓが０であり、ｔが０である場合、部分ＣＨ１とＶ１を接続するために好適なペプチド、又は例えばｔが１である場合、部分ＣＨ３とＶ１を接続するために好適なペプチドである。
一実施形態では、Ｙはリンカー、好ましくはペプチドリンカー、例えば部分ＣＬとＶ２を接続するために好適なペプチドである。
一実施形態では、Ｚはリンカー、好ましくはペプチドリンカー、例えば部分ＶＬとＶ３を接続するために好適なペプチドである。
一実施形態では、ＸとＹの両方がリンカーである。一実施形態では、ＸとＹの両方がペプチドリンカーである。一実施形態では、ＸとＺの両方がリンカーである。一実施形態では、ＸとＺの両方がペプチドリンカーである。一実施形態では、ＹとＺの両方がリンカーである。一実施形態では、ＹとＺの両方がペプチドリンカーである。一実施形態では、Ｘ、Ｙ及びＺがリンカーである。一実施形態では、Ｘ、Ｙ及びＺがペプチドリンカーである。
用語「ペプチドリンカー」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸を含むペプチドを指す。好適なペプチドリンカーの範囲は、当業者には公知であろう。
一実施形態では、ペプチドリンカーは、５０アミノ酸長又はそれ未満、例えば２５アミノ酸又はそれ未満、例えば２０アミノ酸又はそれ未満、例えば１５アミノ酸又はそれ未満、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４アミノ酸長である。
一実施形態では、リンカーは、配列１～６７に示す配列から選択される。
一実施形態では、リンカーは、配列番号１又は配列番号２に示す配列から選択される。
一実施形態では、Ｘは、配列ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号１）を有する。一実施形態では、Ｙは、配列ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号１）を有する。一実施形態では、Ｚは、配列ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号１）を有する。一実施形態では、Ｘは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）を有する。一実施形態では、Ｙは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）を有する。一実施形態では、Ｚは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）を有する。一実施形態では、ｐが１であり、ｑが１であり、ｒが０であり、Ｚがない場合、Ｘは配列番号１に示す配列を有し、Ｙは配列番号２に示す配列を有する。
一実施形態では、Ｘは、配列番号６９又は７０に示す配列を有する。一実施形態では、Ｙは、配列番号６９又は７０に示す配列を有する。一実施形態では、Ｚは、配列番号６９又は７０に示す配列を有する。一実施形態では、ｐが１であり、ｑが１であり、ｒが０であり、Ｚがない場合、Ｘは配列番号６９に示す配列を有し、Ｙは配列番号７０に示す配列を有する。
Figure 2023507277000001
Figure 2023507277000002
Figure 2023507277000003
（Ｓ）は、配列１４～１８において場合による。
剛性リンカーの例は、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号５２）、ＰＰＰＰ（配列番号５３）及びＰＰＰを含む。
一実施形態では、ペプチドリンカーは、アルブミン結合ペプチドである。
アルブミン結合ペプチドの例は、国際公開第２００７／１０６１２０号に提供され、
Figure 2023507277000004
を含む。
有利には、リンカーとしてのアルブミン結合ペプチドの使用は、多特異性抗体の半減期を増加させることができる。
一実施形態では、Ｖ１がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、リンカー、例えばＶ１の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するための好適なペプチドリンカーがある。
一実施形態では、Ｖ２がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、リンカー、例えばＶ２の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するための好適なペプチドリンカーがある。
一実施形態では、Ｖ３がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、リンカー、例えばＶ３の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するための好適なペプチドリンカーがある。
一実施形態では、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖのペプチドリンカーは、１５～２０アミノ酸など、１２～２５アミノ酸長の範囲である。一実施形態では、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖのペプチドリンカーは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５アミノ酸である。
一実施形態では、Ｖ１がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するリンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）を有する。一実施形態では、Ｖ２がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するリンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）を有する。一実施形態では、Ｖ３がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ３の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するリンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）を有する。
一実施形態では、Ｖ１がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９）を有する。一実施形態では、Ｖ２がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９）を有する。一実施形態では、Ｖ３がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ３の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９）を有する。
一実施形態では、Ｖ１がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を有する。一実施形態では、Ｖ２がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を有する。一実施形態では、Ｖ３がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ３の可変ドメインＶＨとＶＬを接続するリンカーは、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を有する。
本開示は、本明細書に開示される配列と８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似している配列も提供する。
「同一性」は、本明細書で使用される場合、アラインした配列の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。
「類似性」は、本明細書で使用される場合、アラインした配列の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似の型であることを示す。例えば、ロイシンは、ロイシンはイソロイシン又はバリンに置換される。互いに置換されることが多い他のアミノ酸としては、限定はされないが：
－フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
－リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
－アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
－アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
－システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
を含む。
同一性及び類似性の程度は、容易に算出され得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，ＡＭ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，ＡＭ，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ.,Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、ＮＣＢＩから利用できるＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア(Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６，）。
本発明の多特異性抗体は、当技術分野で公知の任意の好適な方法によって生成され得る。
抗原ポリペプチドに対して生成した抗体を得ることができ、周知の及び慣例のプロトコールを使用して、動物、好ましくは非ヒト動物にポリペプチドを投与することによる、動物の免疫化が必要である（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（ｅｄ．），Ｖｏｌ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６を参照）。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタのような多くの温血動物が免疫され得る。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが通常最も好適である。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ １９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２）及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ７７－９６，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）のような、当技術分野で公知の任意の方法によって調製され得る。
抗体は、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ １９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（１５）：７８４３－７８４８l；国際公開第９２／０２５５１号；国際公開第２００４／０５１２６８号及び国際公開第２００４／１０６３７７号によって記載された方法による特定の抗体の産生のために選択した単一のリンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニング及び発現することにより、単一リンパ球抗体法を使用しても生成することができる。
本開示での使用のための抗体は、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用しても生成することができ、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２：４１－５０）、Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４：１７７－１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９４，２４：９５２－９５８）、Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ，１９９７ １８７ ９－１８），Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１－２８０）及び国際公開第９０／０２８０９号；国際公開第９１／１０７３７号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９２／１８６１９号；国際公開第９３／１１２３６号；国際公開第９５／１５９８２号；国際公開第９５／２０４０１号；及び米国特許第５６９８４２６号；同第５２２３４０９号；同第５４０３４８４号；同第５５８０７１７号；同第５４２７９０８号；同第５７５０７５３号；同第５８２１０４７号；同第５５７１６９８号；同第５４２７９０８号；同第５５１６６３７号；同第５７８０２２５号；同第５６５８７２７号；同第５７３３７４３号；同第５９６９１０８号、及び国際公開第２０１１／３０３０５号に開示されるものを含む。
一実施形態では、本開示による多特異性抗体はヒト化される。
ヒト化（ＣＤＲ移植抗体を含む）は、本明細書で用いられる場合、非ヒト種由来の１つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する分子を指す（例えば、米国特許第５５８５０８９号；国際公開第９１／０９９６７号参照）。ＣＤＲ全体よりもＣＤＲの特異性決定残基を移行することだけが必要であり得ることが理解されるであろう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５－３４参照）。ヒト化抗体は、場合により、ＣＤＲが由来する非ヒト種由来の１つ又はそれ以上のフレームワーク残基をさらに含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「ヒト化抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えばヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークへと移植されたドナー抗体（例えばマウスモノクローナル抗体）由来の１つ又はそれ以上のＣＤＲ（所望であれば、１つ又はそれ以上の改変ＣＤＲを含む）を含有する抗体を指す。検討のため、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５－５３９，１９９８参照。一実施形態では、ＣＤＲ全体が移行されるよりも、本明細書に記載されるいずれか１つのＣＤＲ由来の１つ又はそれ以上の特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移行される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５－３４参照）。一実施形態では、本明細書に記載の１つ又はそれ以上のＣＤＲ由来の特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移行される。別の実施形態では、本明細書に記載の各ＣＤＲ由来の特異性決定残基のみが、ヒト抗体フレームワークに移行される。
ＣＤＲ又は特異性決定残基が移植される場合、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列は、マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含む、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／型を鑑みて使用され得る。好適には、本発明によるヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域並びに本明細書で提供される１つ又はそれ以上のＣＤＲを含む可変ドメインを有する。
本開示で使用され得るヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭ（上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ）である。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖のために使用することができ、ＲＥＩは軽鎖のために使用することができ、並びにＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖と軽鎖の両方のために使用することができる。或いは、ヒト生殖系列配列が使用されてもよい；これらはhttp://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.phpで利用可能である。
本開示のヒト化抗体では、アクセプター重鎖及び軽鎖は必ずしも同じ抗体由来である必要はなく、所望であれば、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含む。
フレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと正確に同じ配列を持つ必要はない。例えば、異常な残基が、そのアクセプター鎖クラス又は型のためのより頻繁に生じる残基に変更され得る。或いは、ドナー抗体の同じ位置に見出される残基に対応するように、アクセプターフレームワーク領域中の選択された残基は変更され得る（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ １９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３－３２４参照）。そのような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要な最小限に維持するべきである。変更される必要があり得る、アクセプターフレームワーク領域中の残基を選択するためのプロトコールは、国際公開第９１／０９９６７号に記載される。
フレームワークの誘導体は、代替えのアミノ酸、例えばドナー残基と置き換えられる１個、２個、３個又は４個のアミノ酸を有し得る。
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち元々ＣＤＲが由来する抗体由来の残基である。ドナー残基は、ヒト受容体フレームワーク由来の好適な残基（アクセプター残基）によって置き換えられ得る。
一実施形態では、本開示の多特異性抗体は、完全にヒトであり、特に１つ又はそれ以上の可変ドメインは完全にヒトである。
完全ヒト抗体は、重鎖と軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が全てヒト起源であるか、又はヒト起源の配列と実質的に同一であり、必ずしも同じ抗体由来ではないものである。完全ヒト抗体の例は、例えば、欧州特許第０５４６０７３号、米国特許第５５４５８０６号、米国特許第５５６９８２５号、米国特許第５６２５１２６号、米国特許第５６３３４２５号、米国特許５６６１０１６号、米国特許第５７７０４２９号、欧州特許第０４３８４７４号及び欧州特許第０４６３１５１号の一般項に記載されるように、例えば、上記のファージディスプレイ法によって産生された抗体、及びマウス免疫グロブリン可変領域及び場合により定常領域遺伝子がそれらのヒトの相対物によって置き換えられたマウスによって産生された抗体を含み得る。
一実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２個、３個又はそれより多くの目的の異なる抗原に選択的に結合することができる。一実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２個、３個又はそれより多くの目的の異なる抗原に同時に結合することができる。
一実施形態では、ＶＨ／ＶＬ、又はＶ１又はＶ２又はＶ３によって形成された抗原結合ドメインによって結合された目的の抗原は、独立して、細胞会合タンパク質、例えば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞のような細胞の細胞表面タンパク質、及び可溶性タンパク質から選択される。
目的の抗原は、疾患又は感染の間に上方制御されるタンパク質、例えば受容体及び／又はそれらの対応するリガンドのような、任意の医学的な関連タンパク質であってもよい。抗原の特定の例は、Ｔ細胞又はＢ細胞シグナル伝達受容体のような細胞表面受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害剤、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、増殖因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異的抗原、がん抗原、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体又は、サイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、増殖因子、ホルモン若しくは酵素のような可溶性分子、又はイオンチャネル、エピトープ、断片及びそれらの翻訳後改変形態を含む。
一実施形態では、本開示の多特異性抗体は、目的の抗原（単数又は複数）の活性を機能的に変更するために使用され得る。例えば、抗体融合タンパク質は、直接又は間接的に、前記抗原の活性を中和、アンタゴナイズ又はアゴナイズしてもよい。
一実施形態では、Ｖ１、Ｖ２及びＶ３は同じ抗原に特異的であり、例えばその同じ又は異なるエピトープに結合する。一実施形態では、Ｖ３は存在せず、Ｖ１及びＶ２は同じ抗原、例えば同じ抗原の同じ又は異なるエピトープに特異的である。一実施形態では、Ｖ３は存在せず、Ｖ１及びＶ２は２つの異なる抗原に特異的である。
一実施形態では、ＶＨ／ＶＬ又はＶ１又はＶ３によって結合される目的の抗原は、補体経路活性化及び／又はエフェクター細胞動員のようなエフェクター機能を動員する能力を提供する。
エフェクター機能の動員は、細胞と関連するエフェクター機能に直接であってもよく、前記細胞は、その表面に動員分子を担持している。間接的な動員は、本開示による多特異性抗体の抗原結合ドメイン（例えばＶ１又はＶ２又はＶ３）に抗原が結合する場合に生じてもよく、動員ポリペプチドは、例えば、次いで直接又は間接的にエフェクター機能を動員し得るか、又はシグナル伝達経路の活性化を介し得る因子の放出を引き起こす。例としては、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＦＮγ、ヒスタミン、Ｃ１ｑ、オプソニン並びに古典的な及び代替えの補体活性化カスケードの他のメンバー、例えばＣ２、Ｃ４、Ｃ３転換酵素、及びＣ５～Ｃ９が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「動員ポリペプチド」は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩのようなＦｃγＲ、限定はされないが、Ｃ１ｑ及びＣ３のような補体経路タンパク質、ＣＤマーカータンパク質（分化抗原群マーカー）又は直接的又は間接的に細胞媒介性のエフェクター機能を動員する能力を維持しているその断片を含む。動員ポリペプチドは、エフェクター機能を保持する、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ及びＩｇＡなどの免疫グロブリン抗体も含む。
一実施形態では、本開示による多特異性抗体の抗原結合ドメイン（例えばＶ１又はＶ２又はＶ３又はＶＨ／ＶＬ）は、Ｃ１ｑが特に好まれる、補体経路タンパク質に特異性を有する。
さらに、本開示の多特異性抗体を使用して、核種キレータータンパク質に結合する単一ドメイン抗体によって、放射性核種をキレートすることができる。そのような融合タンパク質は、治療への画像化又は放射線核種標的化手法で使用される。
一実施形態では、本開示による多特異性抗体内の抗原結合ドメイン（例えばＶ１又はＶ２又はＶ３又はＶＨ／ＶＬ）は、血清キャリアタンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に特異性を有し、例えば前記血清キャリアタンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に結合することによって目的の前記抗原に特異性を有する抗体断片に半減期の延長を提供する。
本明細書で使用する場合、「血清キャリアタンパク質」は、チロキシン結合タンパク質、トランスチレチン、α１－酸性糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン及びアルブミン、又は任意のそれらの断片を含む。
本明細書で使用する場合、「循環する免疫グロブリン分子」は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＤ、又は任意のそれらの断片を含む。
ＣＤ３５／ＣＲ１は、赤血球に存在し、３６日の半減期を有するタンパク質である（正常範囲２８～４７日；Ｌａｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９７１，Ｃａｎｃｅｒ，２８(３)：６５８－６６１）。
一実施形態では、ＶＨ／ＶＬが特異性を有する目的の抗原は、血清キャリアタンパク質、例えばヒト血清キャリア、例えばヒト血清アルブミンである。
一実施形態では、Ｖ１が特異性を有する目的の抗原は、血清キャリアタンパク質、例えばヒト血清キャリア、例えばヒト血清アルブミンである。したがって、一実施形態では、Ｖ１はアルブミン結合ドメインを含む。
一実施形態では、Ｖ２が特異性を有する目的の抗原は、血清キャリアタンパク質、例えばヒト血清キャリア、例えばヒト血清アルブミンである。したがって、一実施形態では、Ｖ２はアルブミン結合ドメインを含む。
一実施形態では、Ｖ３が特異性を有する目的の抗原は、血清キャリアタンパク質、例えばヒト血清キャリア、例えばヒト血清アルブミンである。したがって、一実施形態では、Ｖ３はアルブミン結合ドメインを含む。
一実施形態では、ＶＨ／ＶＬ、Ｖ１又はＶ２又はＶ３の１つだけが、血清キャリアタンパク質、例えばヒト血清キャリア、例えばヒト血清アルブミンである。したがって、一実施形態では、ＶＨ／ＶＬ、Ｖ１又はＶ２又はＶ３の１つだけがアルブミン結合ドメインを含む。
一実施形態では、アルブミン結合ドメインは、プロテインＡにさらに結合する。一実施形態では、アルブミン結合ドメインは、６個のＣＤＲ、例えばＣＤＲＨ１の配列番号７１、ＣＤＲＨ２の配列番号７２、ＣＤＲＨ３の配列番号７３、ＣＤＲＬ１の配列番号７４、ＣＤＲＬ２の配列番号７５及びＣＤＲＬ３の配列番号７６を含む。一実施形態では、前記６個のＣＤＲ、配列番号７１～７６は、本開示の構築物のＶＨ／ＶＬに位置する。一実施形態では、前記６個のＣＤＲ、配列番号７１～７６は、本開示の構築物のＶ１に位置する。一実施形態では、前記６個のＣＤＲ、配列番号７１～７６は、本開示の構築物のＶＨ／ＶＬ及びＶ１に位置する。
一実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号７７及び配列番号７８から選択される重鎖可変ドメイン並びに配列番号７９及び配列番号８０から選択される軽鎖可変ドメイン、特に、それぞれ重鎖及び軽鎖の配列番号７７及び７９又は配列番号７８及び８０を含む。一実施形態では、アルブミン結合ドメインは、配列番号８１の配列のｓｃＦｖである。一実施形態では、アルブミン結合ドメインは、以下に示すように配列番号８２の配列のｄｓｓｃＦｖである：
６４５ｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（配列番号８１）：
Figure 2023507277000005
６４５ｄｓｓｃＦｖ（ＶＨ／ＶＬ）（ジスルフィド結合のために工学的に作成したシステインを有する、下線）（配列番号８２）：
Figure 2023507277000006
一実施形態では、これらのドメインは、本開示の構築物のＶＨ／ＶＬに位置する。一実施形態では、これらの可変ドメインは、Ｖ１に位置する。一実施形態では、これらの可変ドメインは、本開示の構築物のＶＨ／ＶＬ及びＶ１に位置する。可変ドメインが本開示の構築物の２つの場所に位置ある場合、可変ドメインの同じ対は各場所にあってよく、又は可変ドメインの２つの異なる対が用いられ得る。
一実施形態では、本開示の多特異性抗体は、標的抗原（単数又は複数）への親和性を改善するように処理される。そのようなバリアントは、ＣＤＲに変異導入（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２－４０３，１９９５）、ｃｈａｉｎシャッフリング（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９－７８３，１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発株の使用（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９－３６８，１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４－７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７７－８８，１９９６）及びｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８－２９１，１９９８）を含む、多くの親和性成熟プロトコールによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ（上記）は、親和性成熟のこれらの方法を議論する。
本明細書で用いられる親和性の改善は、この文脈では、開始分子を超える改善を指す。
所望であれば、本開示での使用のための多特異性抗体構築物は、１つ又はそれ以上のエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートされ得る。エフェクター分子が、単一のエフェクター分子又は本発明の抗体に接着することができる単一部分を形成するように連結される２つ以上のそのような分子を含み得ることは理解されるであろう。エフェクター分子に連結する抗体断片を得ることが望まれる場合、これは、抗体断片が直接又は結合材を介してエフェクター分子に連結される標準的な化学又は組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートするための技術は、当技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ ｅｄｓ．，１９８７，ｐｐ．６２３－５３；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ １９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９－５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ １９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７－１２３参照）。特定の化学手順は、例えば、国際公開第９３／０６２３１号、国際公開第９２／２２５８３号、国際公開第８９／００１９５号、国際公開第８９／０１４７６号及び国際公開第０３０３１５８１に記載されるものを含む。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は、例えば国際公開第８６／０１５３３号及び欧州特許第０３９２７４５号に記載される、組換えＤＮＡ手順を使用して達成され得る。
用語「エフェクター分子」は、本明細書で使用される場合、例えば生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は自然発生のポリマー、核酸及びその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射線核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子及びレポーター群、例えば蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物を含む。
他のエフェクター分子は、キレート化放射性核種、例えば１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８；又は薬物、例えば、限定はされないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンを含み得る。
他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放射断層撮影法での使用のため）、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。
別の実施形態では、エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を増加させる、及び／又は抗体の免疫原性を低減する及び／又は上皮性関門を通過する免疫系への抗体の送達を増強することができる。この型の好適なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又は国際公開第０５／１１７９８４号に記載のもののような、アルブミン結合化合物が挙げられる。
エフェクター分子がポリマーである場合、それは、通常、合成又は自然発生のポリマー、例えば場合により、置換直鎖若しくは分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー又は分岐鎖若しくは非分岐鎖多糖類、例えば、ホモ又はヘテロ多糖類であり得る。
上記の合成ポリマーに存在し得る特定の場合による置換は、１つ又はそれ以上のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基を含む。
「誘導体」は、本明細書で使用される場合、反応性の誘導体、例えばマレイミドなどのようなチオール選択性反応基を含むことを意図する。反応基は、直接又はリンカーセグメントを介してポリマーに連結され得る。そのような基の残基が、一部の例では、抗体断片とポリマーの間の連結基として、産物の一部を形成することは理解されるであろう。
ポリマーの大きさは、所望のように変わり得るが、通常、平均分子量が５００Ｄａ～５００００Ｄａの範囲であり、例えば、２００００～４００００Ｄａのような５０００～４００００Ｄａであろう。ポリマーの大きさは、特に、産物の使用意図、例えば、腫瘍のような特定の組織に局在するか又は循環の半減期を延長する能力に基づいて選択され得る（検討のため、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，高度な薬物送達概説（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ），５４，５３１－５４５参照）。
好適なポリマーは、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）又は、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体を含み、特に、約１５０００Ｄａ～約４００００Ｄａの範囲の分子量を有する。
一実施形態では、本開示での使用のための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に接着される。特定の一例では、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基に局在する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基を介して接着され得る。そのようなアミノ酸は、抗体断片に自然に生じるか、又は組換えＤＮＡ法を使用して断片に工学的に作成され得る（例えば、米国特許第５２１９９９６号；米国特許第５６６７４２５号；国際公開第９８／２５９７１号、国際公開第２００８／０３８０２４号参照）。一実施形態では、本発明の抗体分子は、改変Ｆａｂ断片を含み、改変はその重鎖のＣ末端への１つ又はそれ以上のアミノ酸の追加であり、エフェクター分子の接着を可能にする。好適には、追加アミノ酸は、エフェクター分子が接着され得る１つ又はそれ以上のシステイン残基を含有する改変ヒンジ領域を形成する。複数部位が、２つ以上のＰＥＧ分子の接着に使用され得る。
好適には、ＰＥＧ分子は、抗体断片に局在する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合される。改変抗体断片に接着した各ポリマー分子は、断片に局在するシステイン残基の硫黄原子に共有結合され得る。共有結合は、通常、ジスルフィド結合か、又は特に、硫黄－炭素結合であろう。チオール基が接着点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばマレイミドのようなチオール選択性誘導体及びシステイン誘導体が使用され得る。活性化ポリマーは、上記のようにポリマー改変抗体断片の調製において開始物質として使用され得る。活性化ポリマーは、例えばα－ハロカルボキシル酸又はエステルのようなチオール反応基、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドを含有する任意のポリマーであリ得る。そのような開始物質は、市販されている（例えば、Ｎｅｋｔａｒ，ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）か、又は従来の化学手順を使用して市販の開始物質から調製されてもよい。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋ メトキシ－ＰＥＧ－アミン（Ｎｅｋｔａｒ，ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ－ＰＥＧ－ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ，ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）を含む。
一実施形態では、分子中のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ又はＦａｂ’はペグ化され、すなわち、例えば、欧州特許第０９４８５４４号又は欧州特許第１０９００３７号に開示される方法により、それに共有結合したＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する［「ポリ（エチレングリコール）化学、生物工学及び生物医学応用（Ｐｏｌｙ(ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ) Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」,１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＥＷ Ｙｏｒｋ，「ポリ（エチレングリコール）化学及び生物学応用（Ｐｏｌｙ(ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ)Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，１９９７，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ及び「生物医学科学のための生体共役反応タンパク質カップリング技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」,１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ ａｎｄ Ａ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｂｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ;Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００２，５４：５３１－５４５も参照］。一実施形態では、ＰＥＧは、ヒンジ領域のシステインに接着される。一例では、ＰＥＧ改変Ｆａｂ断片は、改変ヒンジ領域中の単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合され、リシン残基の各アミノ基は、およそ２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーを接着し得る。Ｆａｂ断片に接着したＰＥＧの総分子量は、したがって、およそ４０，０００Ｄａであり得る。
特定のＰＥＧ分子は、Ｎ，Ｎ’－ビス（メトキシポリ（エチレングリコール） ＭＷ２０，０００）改変リシンの２－［３－（Ｎ－マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドを含み、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋとしても公知である（Ｎｅｋｔａｒ，ｆｏｒｍｅｒｌｙ Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）。
ＰＥＧリンカーの代替の供給源は、ＧＬ２－４００ＭＡ２（構造中のｍは５未満である）及びＧＬ２－４００ＭＡ（ｍは２である）を供給するＮＯＦを含み、ｎはおよそ４５０である：
Figure 2023507277000007
すなわち、各ＰＥＧは約２０，０００Ｄａである。
以下の型のさらなる代替えのＰＥＧエフェクター分子：
Figure 2023507277000008
は、Ｄｒ．Ｒｅｄｄｕ，ＮＯＦ及びＪｅｎｋｅｍから利用可能である。
一実施形態では、鎖中アミノ酸２２６の又は約アミノ酸２２６のシステインアミノ酸残基、例えば重鎖のアミノ酸２２６（配列による番号付により）を介して接着される、ペグ化される（例えば本明細書に記載のＰＥＧを有する）抗体分子を提供する。
一実施形態では、ＤＮＡ配列のような、本開示の多特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
一実施形態では、本開示の多特異性抗体の１つ又はそれ以上、例えば２つ以上、又は３つ以上のポリペプチド成分、例えば：
式（Ｉ）：
ＶＨ－ＣＨ１－（ＣＨ２）ｓ－（ＣＨ３）ｔ－Ｘ－（Ｖ１）ｐ
のポリペプチド鎖；及び
式（ＩＩ）：
（Ｖ３）ｒ－Ｚ－ＶＬ－ＣＬ－Ｙ－（Ｖ２）ｑ
のポリペプチド鎖
（式中：
ＶＨは重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン１を表し；
ＣＨ２は重鎖定常領域のドメイン２を表し；
ＣＨ３は重鎖定常領域のドメイン３を表し；
Ｘは結合又はリンカーを表し；
Ｖ１はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
Ｖ３はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
Ｚは結合又はリンカーを表し；
ＶＬは軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬはＣカッパなどの、軽鎖定常領域由来のドメインを表し；
Ｙは結合又はリンカーを表し；
Ｖ２はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
ｐは０又は１を表し；
ｑは０又は１を表し；
ｒは０又は１を表し；
ｓは０又は１を表し；
ｔは０又は１を表し；
ｐが０である場合、Ｘは存在せず、ｑが０である場合、Ｙは存在せず、ｒが０である場合、Ｚは存在せず；
ｑが０である場合、ｒは１であり、ｒが０である場合、ｑは１であり、
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、少なくとも１つのｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ又はＶＨＨを含み；
式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、プロテインＡ結合ドメインを含み；
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、プロテインＡに結合しない）、
をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。
一実施形態では、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡは、ベクターに含まれる。
当業者は、Ｖ１及び／又はＶ２及び／又はＶ３がｄｓＦｖを表す場合、多特異性抗体が、Ｘ又はＹ又はＺに接着しない、対応する遊離のＶＨ又はＶＬドメインをコードする第３のポリペプチドを含むことを理解するであろう。したがって、本発明の多特異性抗体は、１つ又はそれ以上、２つ以上、又は３つ以上のポリヌクレオチドによってコードされてもよく、これらは、１つ又はそれ以上のベクターに組み込まれてもよい。
ベクターが構築され得る一般的な方法は、トランスフェクション法及び培養法が当業者に周知である。この点において、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照する。
また、本発明の多特異性タンパク質をコードする１つ又はそれ以上のＤＮＡ配列を含む１つ又はそれ以上のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。任意の好適な宿主細胞／ベクター系が、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用され得る。細菌、例えば大腸菌、及び他の微生物系が使用されてもよく、又は真核生物、例えば哺乳動物の宿主細胞発現系が使用されてもよい。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ＨＥＫ、例えばＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、骨髄腫、ＮＳＯ骨髄腫細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。
本開示は、本発明の多特異性抗体をコードするＤＮＡからタンパク質の発現をもたらし、及び多特異性抗体を単離するために好適な条件下で、本発明のベクターを含有する宿主細胞を培養するステップを含む、本開示による多特異性抗体の産生のための方法も提供する。
重鎖と軽鎖の両方を含む産物の産生のため、細胞系は２つのベクターによってトランスフェクトされてもよく、第１のベクターは軽鎖ポリペプチドをコードし、第２のベクターは重鎖ポリペプチドをコードする。或いは、単一のベクターが使用されてもよく、ベクターは軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。一例では、細胞系は、２つのベクターによってトランスフェクトされてもよく、それぞれ本発明の抗体のポリペプチド鎖をコードする。Ｖ１及び／又はＶ２及び／又はＶ３がｄｓＦｖである場合、細胞系は、３つのベクターによってトランスフェクトされてもよく、それぞれ本発明の多特異性抗体のポリペプチド鎖をコードする。
一実施形態では、細胞系は２つのベクターによってトランスフェクトされ、それぞれ：
式（Ｉ）：
ＶＨ－ＣＨ１－（ＣＨ２）ｓ－（ＣＨ３）ｔ－Ｘ－（Ｖ１）ｐ
のポリペプチド鎖；及び
式（ＩＩ）：
（Ｖ３）ｒ－Ｚ－ＶＬ－ＣＬ－Ｙ－（Ｖ２）ｑ
のポリペプチド鎖
（式中：
ＶＨは重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン１を表し；
ＣＨ２は重鎖定常領域のドメイン２を表し；
ＣＨ３は重鎖定常領域のドメイン３を表し；
Ｘは結合又はリンカーを表し；
Ｖ１はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
Ｖ３はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
Ｚは結合又はリンカーを表し；
ＶＬは軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬはＣカッパなどの、軽鎖定常領域由来のドメインを表し；
Ｙは結合又はリンカーを表し；
Ｖ２はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
ｐは０又は１を表し；
ｑは０又は１を表し；
ｒは０又は１を表し；
ｓは０又は１を表し；
ｔは０又は１を表し；
ｐが０である場合、Ｘは存在せず、ｑが０である場合、Ｙは存在せず、ｒが０である場合、Ｚは存在せず；
ｑが０である場合、ｒは１であり、ｒが０である場合、ｑが１であり、
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、少なくとも１つのｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ又はＶＨＨを含み；
式（Ｉ）のポリペプチド鎖は、プロテインＡ結合ドメインを含み；
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖は、プロテインＡに結合しない）、
から選択される異なるポリペプチドをコードする。
一実施形態では、Ｖ１がｄｓＦｖであり、Ｖ１のＶＨドメインがＸに接着される場合、細胞系は、Ｖ１のＶＬドメインをコードする第３のベクターによってトランスフェクトされてもよい。
一実施形態では、Ｖ１がｄｓＦｖであり、Ｖ１のＶＬドメインがＸに接着される場合、細胞系は、Ｖ１のＨドメインをコードする第３のベクターによってトランスフェクトされてもよい。
一実施形態では、Ｖ２がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＨドメインがＹに接着される場合、細胞系は、Ｖ２のＶＬドメインをコードする第３のベクターによってトランスフェクトされてもよい。
一実施形態では、Ｖ２がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＬドメインがＹに接着される場合、細胞系は、Ｖ２のＶＨドメインをコードする第３のベクターによってトランスフェクトされてもよい。
一実施形態では、Ｖ３がｄｓＦｖであり、Ｖ３のＶＨドメインがＹに接着される場合、細胞系は、Ｖ３のＶＬドメインをコードする第３のベクターによってトランスフェクトされてもよい。
一実施形態では、Ｖ３がｄｓＦｖであり、Ｖ３のＶＬドメインがＹに接着される場合、細胞系は、Ｖ３のＶＨドメインをコードする第３のベクターによってトランスフェクトされてもよい。
一実施形態では、Ｖ３が存在しない場合及びＶ１とＶ２の両方がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＬドメインがＹに接着され、Ｖ１のＶＬドメインがＸに接着される場合、細胞系は、Ｖ１とＶ２両方の共通のＶＨドメインをコードする第３のベクターによってトランスフェクトされてもよい。
一実施形態では、Ｖ３が存在しない場合及びＶ１とＶ２の両方がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＨドメインがＹに接着され、Ｖ１のＶＨドメインがＸに接着される場合、細胞系は、Ｖ１とＶ２両方の共通のＶＬドメインをコードする第３のベクターによってトランスフェクトされてもよい。
宿主細胞にトランスフェクトされる各ベクターの比が、多特異性抗体産物の発現を最適化するために変わり得ることは理解されるであろう。一実施形態では、２つのベクターが使用され、１つは式（Ｉ）のポリペプチド鎖、すなわち重鎖をコードし、別の１つは式（ＩＩ）のポリペプチド鎖、すなわち軽鎖をコードし、ベクターの比（ＬＣ含有ベクター）：（ＨＣ含有ベクター）は、１：１と５：１の間、好ましくは１．５：１と５：１の間を含んでもよく、例えば比は、２：１、３：１、４：１、５：１であってもよい。一実施形態では、３つのベクターが使用され、ベクターの比（ＬＣ含有ベクター）：（ＨＣ含有ベクター）：遊離ドメイン含有ベクターは、１：１：１と５：１：１の間を含む。当業者が、トランスフェクション後のタンパク質発現レベルの通常の試験によって最適な比を見出すことができることは、理解されるであろう。或いは、又はさらに、各ベクターからの多特異性構築物の各ポリペプチド鎖の発現のレベルは、同じ又は異なるプロモーターを使用することによって制御され得る。
２つ以上又は存在する場合、３つのポリペプチド成分が、単一ベクターのポリヌクレオチドによってコードされ得ることは理解されるであろう。２つ以上、特に３つ以上のポリペプチド成分が、単一ベクターのポリヌクレオチドによってコードされ、各ポリペプチド成分の相対発現が、本開示のポリペプチド成分をコードする各ポリヌクレオチドにつき異なるプロモーターを利用することによって変わり得ることも理解されるであろう。
一実施形態では、ベクターは、単一のプロモーターの制御下の本発明の多特異性抗体の２つ又は存在する場合、３つのポリペプチド鎖をコードする単一のポリヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ベクターは、各ポリペプチド鎖をコードする各ポリヌクレオチド配列が異なるプロモーターの制御下にある、本開示の多特異性抗体の２つ又は存在する場合、３つのポリペプチド鎖をコードする単一のポリヌクレオチド配列を含む。
一態様では、本発明は、上に規定される式（Ｉ）のポリペプチド鎖及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含む多特異性抗体を産生するための方法であって：
ａ）宿主細胞において、上に規定される式（Ｉ）のポリペプチド鎖及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を発現させるステップであって、式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、式（Ｉ）のポリペプチド鎖より過剰である、ステップ；及び
ｂ）ステップａ）で発現されたポリペプチドの組成物を回収するステップであって、前記組成物が多特異性抗体及び式（ＩＩ－ＩＩ）のＬＣ二量体を含む、ステップ；及び
ｃ）多特異性抗体を精製するステップであって、ｓが１であり、ｔが１である場合、前記多特異性抗体が、式（Ｉ）の２つの重鎖及び式（ＩＩ）の２つの会合した軽鎖を有する二量体として精製され、ｓが０であり、ｔが０である場合、前記多特異性抗体が、式（Ｉ）の１つの重鎖及び式（ＩＩ）の１つの会合した軽鎖を有する二量体として精製される、ステップ
を含み、
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、少なくとも１つのｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ又はＶＨＨを含み；
式（Ｉ）のポリペプチド鎖が、プロテインＡ結合ドメインを含み；
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、プロテインＡに結合せず；
ステップｃ）が、ステップｂ）で回収したポリペプチドの組成物を、場合により少なくとも１つの精製ステップ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにかけるステップを含む、方法を提供する。
重鎖より過剰な軽鎖を発現するための手段は当技術分野で周知であり、例えば上記のように宿主細胞のトランスフェクションのために使用されるベクターの比を変えることを含む。一実施形態では、２つのベクターが使用され、１つは式（Ｉ）のポリペプチド鎖、すなわち重鎖をコードし、別の１つは式（ＩＩ）のポリペプチド鎖、すなわち軽鎖をコードし、ベクターの比（ＬＣ含有ベクター）：（ＨＣ含有ベクター）は、１，５：１と５：１の間、例えば１，５：１、２：１、３：１、４：１、５：１である。別の実施形態では、ユニークな発現ベクターが使用され、ＨＣをコードする転写単位より過剰なＬＣをコードする転写単位を含む。別の実施形態では、同じ量のベクター又は転写単位が使用されるが、前記ベクター又は転写単位は、ＨＣコード単位が無く、ＬＣの過剰発現を促進するＬＣコード単位中に改変転写又は翻訳制御エレメント（例えばプロモーター）を含む。
一実施形態では、ステップｃ）は清澄ステップを含む。清澄のための手段は、当技術分野で周知であり、細胞成分及び他のデブリを含む不純物を除去するための遠心分離、濾過、凝集、及びｐＨ調整を含む。一実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）で回収したポリペプチドの組成物を、その後の清澄ステップ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにかけるステップを含む。そのような実施形態では、ステップｂ）で回収されるポリペプチドの組成物は、まず清澄され、次いでプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにローディングされる。別の実施形態では、ステップｃ）は、１つだけの精製ステップ、すなわちプロテインＡ精製ステップを含む。
一実施形態では、本発明の多特異性抗体を産生するための方法は、プロテインＬアフィニティークロマトグラフィーを含まない。
有利には、本発明者らは、先行技術に開示された多特異性抗体を工学的に再操作し、いずれのさらなる精製ステップも必要とせずに、プロテインＡ精製ステップを使用して容易に及び効果的に精製され得る改善された多特異性抗体を提供する。本発明の抗体の式（ＩＩ）のポリペプチドは、プロテインＡに結合せず、多特異性抗体のみが、その重鎖を介してプロテインＡに結合し、ＬＣ二量体は、未結合の画分中で維持される。
一実施形態では、５％未満、好ましくは４％未満、又は３％未満、又は２％未満、及びより好ましくは１％未満の式（ＩＩ－ＩＩ）のＬＣ二量体が多特異性抗体と同時精製され、前記多特異性抗体は、ｓが１であり、ｔが１である場合、式（Ｉ）の２つの重鎖及び式（ＩＩ）の２つの会合する軽鎖を有する二量体として、並びにｓが０であり、ｔが０である場合、式（Ｉ）の１つの重鎖及び式（ＩＩ）の１つの会合する軽鎖を有する二量体として精製される。
別の態様では、上に規定される式（Ｉ）のポリペプチド鎖及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含む多特異性抗体を精製するための方法であって：
ａ）上に規定される式（Ｉ）のポリペプチド鎖及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖の組成物を得るステップであって、前記組成物が多特異性抗体を含み、ｓが１であり、ｔが１である場合、多特異性抗体が、式（Ｉ）の２つの重鎖及び式（ＩＩ）の２つの会合する軽鎖を有する二量体であり；ｓが０であり、ｔが０である場合、多特異性抗体が式（Ｉ）の１つの重鎖及び式（ＩＩ）の１つの会合する軽鎖を有する二量体であり；式（ＩＩ－ＩＩ）の２つの軽鎖が共に会合した二量体（ＬＣ二量体）であり；
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が少なくとも１つのｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ又はＶＨＨを含み；
式（Ｉ）のポリペプチド鎖がプロテインＡ結合ドメインを含み；
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖がプロテインＡに結合しない、ステップ；及び
ｂ）ＬＣ二量体はカラムに結合しないが、多特異性抗体はカラムに保持されるように、ステップａ）で得られた組成物を、プロテインＡアフィニティーカラムにローディングするステップ；及び
ｃ）プロテインＡアフィニティーカラムを洗浄するステップ；及び
ｄ）多特異性抗体を溶出するステップ；及び
ｅ）多特異性抗体を回収するステップ
を含む方法を提供する。
一実施形態では、プロテインＡカラムにローディングした組成物は、清澄された。いくつかのプロテインＡカラム、特に天然のプロテインＡカラム、例えばカラムＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が使用され得る。一実施形態では、プロテインＡアフィニティーカラムは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムである。一実施形態では、プロテインＡは、自然発生のプロテインＡのバリアントであり、前記プロテインＡバリアントは、ＶＨ３ドメインに結合するその能力を維持する。ローディングする（又は結合する）ステップは、ｐＨ７～８、例えば７．４で実施されてもよい。ステップａ）で得られた組成物は、５、１０又は１５分の接触時間の間、プロテインＡアフィニティーカラムにローディングされ得る。一実施形態では、ローディングするステップｂ）は、２００ｍＭ グリシンを含む、ｐＨ７．５の結合バッファーによって実施される。
一実施形態では、溶出ステップｄ）は、酸性条件下で実施される。一実施形態では、溶出ステップｄ）は、２と４．５の間を含むｐＨ、好ましくは３と４の間を含むｐＨで実施される。一実施形態では、ステップｄ）は、０．１Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．１溶出ステップである。一実施形態では、ステップｄ）は、０．１Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２溶出ステップである。一実施形態では、ステップｄ）は、０．１Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．２による第１の溶出ステップ、及び０．１Ｍ クエン酸 ｐＨ２．１による第２の溶出ステップを含む。或いは、ステップｄ）での溶出は、カオトロピック条件下又は優しい溶出を含む、結合した多特異性抗体の溶出を促進する任意の他の条件下で実施され得る。
一実施形態では、多特異性抗体を精製するための方法は、ステップｄ）の前又は後に、少なくとも１つのさらなる精製ステップを含む。
例えば、方法は追加のクロマトグラフィーステップ（単数又は複数）をさらに含んでもよく、産物及び方法に関連する不純物が産物ストリームから適切に除去されるのを確実にし、イオン（陽イオン又は陰イオン）交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びミックスモードクロマトグラフィーを含む。精製方法は、１つ又はそれ以上の限外濾過ステップ、例えば濃縮及び透析濾過ステップも含んでもよい。
上記で使用したように、精製形態は、少なくとも９０％の純度、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれより高い純度を指すことを意図する。
エンドトキシンを実質的に含まないことは、通常、ｍｇ抗体産物当たり１ＥＵ又はそれ以下、例えばｍｇ産物当たり０．５又は０．１ＥＵのエンドトキシン含量を指すことを意図する。
宿主細胞タンパク質又はＤＮＡを実質的に含まないことは、通常、ｍｇの抗体産物当たり宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含量４００μｇ以下、例えばｍｇ当たり１００μｇ以下、特に、必要に応じてｍｇ当たり２０μｇを指すことを意図する。
本開示による多特異性タンパク質は、宿主細胞から良好なレベルで発現される。したがって、抗体及び／又は断片の特性は、商業用処理に最適化され、その助けとなるようである。
有利には、本開示の多特異性抗体は、精製後に見られる凝集の量を最小にし、医薬品濃度での構築物の製剤中の単量体の量を最大にし、例えば単量体は、５０％、６０％、７０％若しくは７５％又はそれより多くの、例えば８０％若しくは９０％又はそれより多くの、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８若しくは９９％又はそれより多くの総タンパク質として存在し得る。一例では、本開示の多特異性抗体の精製試料は、４℃で２８日間保存後、９８％若しくは９９％より多くが単量体を維持する。一例では、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中５ｍｇ／ｍｌの本開示の多特異性抗体の精製試料は、４℃で２８日間保存後、９８％より多くが単量体を維持する。単量体収量は、任意の好適な方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィーを使用して決定され得る。
本開示の抗体及びそれを含む組成物は、処置、例えば病態の処置及び／又は予防において有用である。
本開示は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて、本開示の抗体を含む医薬又は診断用組成物も提供する。したがって、処置での使用のための、及び医薬品の製造のための、特に本明細書に開示する適応症のための本開示の抗体の使用を提供する。
組成物は、通常薬学的に許容される担体を含む、滅菌の医薬組成物の一部として通常供給されるであろう。本開示の医薬組成物は、さらに、薬学的に許容されるアジュバントを含み得る。
本開示は、本開示の抗体を、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に付加及び混合するステップを含む、医薬又は診断用組成物の調整のための方法も提供する。
抗体は、医薬又は診断用組成物中の単独の活性成分であってもよく、又は他の活性成分を伴ってもよい。
さらなる実施形態では、本開示による抗体、断片又は組成物は、さらなる薬学的活性剤と組み合わせて用いられる。
医薬組成物は、好適には、治療有効量の本発明の抗体を含む。用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、標的疾患又は症状を処置、改善又は防止する、又は検出可能な治療若しくは予防効果を示すのに必要な治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、最初に細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかにおいて見積もることができる。動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与の経路を決定するためにも使用され得る。そのような情報は、次いで、ヒトでの投与のための有用な用量及び経路を決定するために使用され得る。
ヒト対象のための正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の健康全般、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、合剤（単数又は複数）、反応感度及び治療への耐性及び応答によるであろう。この量は、通常の実験によって決定することができ、臨床医の判断内である。
組成物は、個々に患者に投与されてもよく、又は他の薬剤、薬物若しくはホルモンと組み合わせて（例えば同時に、順に又は別々に）投与されてもよい。
本開示の抗体が投与される用量は、処置される状態の性質、炎症の程度及び抗体が予防的に使用されるか又は既存の状態を処置するために使用されるかによる。
投与の頻度は、抗体の半減期及びその効果の期間によるであろう。
薬学的に許容される担体は、それ自体、組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生を誘導してはならず、毒性であってもならない。薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知である。
薬学的に許容される塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩が使用され得る。
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有してもよい。さらに、湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助剤が、そのような組成物中に存在し得る。そのような担体は医薬組成物を、患者による摂取のための、錠剤、ピル剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁剤として製剤化することができる。
投与の好適な形態は、例えば注射又は注入による、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与の好適な形態を含む。産物が注射又は注入用である場合、油性又は水性ビヒクル中で懸濁液、溶液又は乳状液の形態をとってもよく、懸濁剤、保存剤、安定剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有してもよい。或いは、抗体は、適切な滅菌液による使用前の再構成のための乾燥形態であってもよい。
製剤化されると、本発明の組成物は、対象に直接投与され得る。処置される対象は動物であり得る。しかしながら、１つ又はそれ以上の実施形態では、組成物はヒト対象への投与に適当である。
本開示の医薬組成物は、限定はされないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、脳室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮的(ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ)、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸的、局所的、舌下、膣内又は直腸経路を含むいくつかの経路によって投与され得る。典型的には、治療組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射可能に調整され得る。注射前の液体ビヒクル中の溶液、又は懸濁液に好適な固体形態も調製され得る。
組成物の直接送達は、通常、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内の注射によって達成されるか、又は組織の間質腔に送達される。組成物は、目的の特定の組織にも投与され得る。投薬処置は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであってもよい。
組成物中の活性成分が抗体であることは、理解されるであろう。そのため、胃腸管での分解に感受性であろう。したがって、組成物が、胃腸管を使用する経路によって投与される場合、組成物は有利には、分解から抗体を保護するが、胃腸管から一度吸収された抗体を放出する薬剤を含有するであろう。
病態又は障害は、例えば、感染症（ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫）、感染症と関連するエンドトキシンショック、間接リウマチなどの関節炎、重症喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペイロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣洞、腹膜炎、乾癬、血管炎、術後癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ループス（例えば全身性エリテマトーデス）及びギランバレー症候群などの中枢神経系又は末梢神経系の免疫介在性炎症性障害、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、突発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェグナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵炎、外傷（外科手術）、移植片対宿主病、移植片拒絶、心筋梗塞などの虚血性疾患を含む心臓病並びにアテローム性動脈硬化、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節症、歯周炎及び低塩酸症からなる群から選択され得る。
本開示は、痛み、特に炎症と関連する痛みの処置又は予防における使用のための本発明による多特異性抗体も提供する。
したがって、処置での使用のための本開示による多特異性抗体及びそれを用いる処置の方法を提供する。
特定の状態の予防又は処置のために必要な本発明の抗体の量は、抗体及び処置される状態によって変わるであろう。本発明の抗体は、診断、例えばインビボ診断及び疾患状態の画像化でも使用され得る。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書の文脈では、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味することが意図される。技術的に適切な場合、本発明の実施形態は、組み合わされ得る。実施形態は、特定の特徴／エレメントを含むように、本明細書に記載される。本開示は、前記特徴／エレメントからなる又はそれらから基本的になる別々の実施形態にまで及ぶ。
特許及び明細書などの技術的な参照は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で特に及び明白に列挙される任意の実施形態は、単独で又は１つ又はそれ以上のさらなる実施形態と組み合わせて、放棄条項の基本を形成し得る。
本開示は、以下の実施例において例示のためにのみさらに記載され、添付の図面を参照する。
（例１）本発明の改善された多特異性抗体フォーマットの産生、Ｆａｂ－２ｘｄｓｓｃＦｖ（ＴｒＹｂｅ）の例
遺伝子設計及びＣＨＯ－Ｓ ＸＥ細胞系での発現
ＴｒＹｂｅ抗体は、Ｆａｂ位置に固定された抗Ａｎｔｉｇｅｎ＃１（又は「Ａｇ＃１」）Ｖ領域によって設計され；抗アルブミン（Ａｎｔｉｇｅｎ＃２、又は以下の例では「Ａｇ＃２」）Ｖ領域（６４５ｇＬ４ｇＨ５）及びＡｎｔｉｇｅｎ＃３（又は「Ａｇ＃３」）Ｖ領域（ＶＨ１）は、ＨＬ方向（ｄｓＨＬ）でジスルフィド安定化ｓｃＦｖへと再フォーマットされ、１１アミノ酸のグリシン－セリンリッチリンカーを介してそれぞれ重鎖及び軽鎖定常領域のＣ末端に連結される。生じる抗体は、Ｔｒｙｂｅ０３と呼ばれる。抗アルブミン６４５抗体の配列は、図１に示す。
軽鎖及び重鎖遺伝子は、ｈＣＭＶプロモーターの制御下で一過性発現のための所有の哺乳動物発現ベクターに独立してクローニングした。等しい比の両プラスミドは、市販のＥｘｐｉＣＨＯエクスピフェクタミン一過性発現キット（Ｔｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＣＨＯ－Ｓ ＸＥ細胞系（ＵＣＢ）にトランスフェクトした。培養物は、Ｃｏｒｎｉｎｇのベントキャップを有するローラーボトル中、３７℃、８．０％ＣＯ２、１９０ｒｐｍでインキュベートした。１８～２２時間後、培養物は、製造業者によって提供されるように、適切な容積のＣＨＯエンハンサー及びＨｉＴｉｔｅｒ法のフィードを供給した。培養物は、さらに１０～１２日間、３２℃、８．０％ＣＯ２、１９０ｒｐｍで再インキュベートした。上清は、０．４５μｍ、続いて０．２μｍフィルターを通す、フィルター滅菌の前に、４℃で１時間、４０００ｒｐｍでの遠心分離によって回収した。発現力価は、１ｍｌ ＧＥ ＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び社内で作成したＦａｂ標準を使用して、プロテインＧ ＨＰＬＣによって定量した。発現力価は、１６０ｍｇ／Ｌであった。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用するＴｒＹｂｅ０３の精製
ＴｒＹｂｅ０３は、天然プロテインＡ捕捉ステップの後、分取サイズ排除研磨ステップによって精製した。標準的な一過性ＣＨＯ発現から清澄した上清を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにローディングし、接触時間を５分与え、結合バッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄した。結合した物質は、０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ３．１溶出ステップによって溶出し、２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．５で中和し、２８０ｎｍでの吸光度によって定量した。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）を使用して、溶出した産物の純度状態を決定した。抗体（～２μｇ）を、ＢＥＨ２００、２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ）にローディングし、０．３５ｍＬ／分での０．２Ｍリン酸 ｐＨ７の均一濃度勾配によって展開した。連続検出は、２８０ｎｍでの吸光度及び多チャンネル蛍光（ＦＬＲ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ）によった。溶出したＴｒＹｂｅ０３抗体は、７２％単量体であることが見出された。
中和試料は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５濃縮機（１０ｋＤａ分画分子量メンブレン）及びスイングアウトローター中４０００×ｇでの遠心分離を使用して濃縮した。濃縮試料は、ＰＢＳ、ｐｈ７．４中で平衡化したＸＫ１６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、１ｍｌ／分でのＰＢＳ、ｐＨ７．４の均一濃度勾配によって展開した。画分を回収し、ＢＥＨ２００、２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍカラム（Ａｑｕｉｔｙ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって解析し、０．３５ｍＬ／分での０．２Ｍリン酸、ｐＨ７の均一濃度勾配によって展開し、２８０ｎｍでの吸光度及び多チャンネル蛍光（ＦＬＲ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ）によって検出した。選択された単量体画分をプールし、０．２２μｍで滅菌濾過し、最終試料は、Ａ２８０Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｏｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６（Ｔｒｉｎｅａｎ）による濃縮をアッセイした。エンドトキシンレベルは、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）試験カートリッジを備えたＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｂｅｒ’ｓ ＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｔｅｓｔ Ｓｙｓｔｅｍによって評価した場合、１．０ＥＵ．ｍｇ以下であった。
サイズ排除クロマトグラフィーによる解析
最終ＴｒＹｂｅ０３の単量体状態は、ＢＥＨ２００、２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍカラム（Ａｑｕｉｔｙ）でのサイズ排除クロマトグラフィーによって決定し、０．３５ｍＬ／分での０．２Ｍリン酸、ｐＨ７の均一濃度勾配によって展開し、２８０ｎｍでの吸光度及び多チャンネル蛍光（ＦＬＲ）検出器（Ｗａｔｅｒｓ）によって検出した。最終ＴｒＹｂｅ０３抗体は、＞９９％単量体であることが見出された（図２Ａ）。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析
ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による解析のため、試料は、４×Ｎｏｖｅｘ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料バッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１０×ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は１００ｍＭ Ｎ－エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかを～５μｇの精製タンパク質に添加することによって調製し、３分間１００℃に加熱した。試料は、１０ウェルのＮｏｖｅｘ４～２０％ Ｔｒｉｓ－グリシン１．０ｍｍ ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にローディングし、Ｔｒｉｓ－グリシンＳＤＳランニングバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中４０分間、２２５Ｖの定常電圧で分離した。Ｎｏｖｅｘ Ｍａｋ１２広範囲タンパク質標準（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を標準として使用した。ゲルは、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｉｎ（Ｇｅｎｅｒｏｎ）によって染色し、蒸留水中で脱染した。
非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、理論分子量～１００ｋＤａのＴｒＹｂｅ（レーン１）は、～１２０ｋＤａに移動した（図２Ｂ）。ＴｒＹｂｅタンパク質が還元された場合（レーン２）、両鎖は、それらのそれぞれの理論ＭＷ、重鎖（ＨＣ）～５２ｋＤａ及び軽鎖（ＬＣ）～５１ｋＤａに達する移動速度で移動した。非還元ゲル（レーン１）の～４５～５０ｋＤａのさらなるバンドは、分子のＦａｂ部分でジスルフィド結合を消失した「遊離の」ＬＣ及びＨＣであり、それらは完全には還元されていないため、レーン２のＬＣ及びＨＣと同じ位置には移動しない。
本発明者らは、ＴｒＹｂｅ０３が先行技術の多特異性抗体よりも改善された特性を有する、特に、プロテインＡクロマトグラフィーカラムでの一段階精製後に得られる目的のタンパク質（すなわち回収した多特異性抗体）の量を最大にすることを観察した。実際、以前には、本発明者らは、それらの対応する重鎖と対形成しない付着した軽鎖を検出し、目的の及び付着軽鎖の二量体（付着ＬＣ二量体）を形成する性質を有する多特性抗体によって共精製され、さらなる捕捉ステップによって精製される必要がある。予想外に、プロテインＡ精製ステップ後、ＴｒＹｂｅ０３の産生方法の副産物として軽鎖又はＬＣ二量体は検出されず、所望の多特異性抗体のみがプロテインＡカラムから溶出された。さらに、多特異性抗体は高度に単量体であった。
本発明者らは、付着ＬＣ二量体の単離及び除去は、ＴｒＹｂｅ０３の精製と同時に生じたと仮説を立てた。
この仮説を確かめるため、代替えの多特異性抗体フォーマットによるさらなる実験を実施し、以下の実施例に記載する。
（例２）例３～６でのさらなる解析のための代替えの抗体フォーマットの産生
図３に示す構築物は、表１及び以下に記載するように産生した。全てのＷｉｔｔｒｕｐ分子は、共通の重鎖（ｈｇ１ＦＬ）及びＦａｂ領域を有する。全てのＴｒＹｂｅ分子は、共通のＦａｂ領域を有する。
Figure 2023507277000009
以下の実施例では、６４５ ｇＨ５ｇＬ４ ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）、すなわちＡｇ＃２ ｄｓｓｃＦｖ ＨＬは、ｄｓｓｃＦｖ１と呼ばれる。
ＶＨ１ドメインを含むＡｇ＃３ ｄｓｓｃＦｖ ＨＬ（ＶＨ１）は、ｄｓｓｃＦｖ３Ｂと呼ばれる。
ＶＨ３ドメインを含むＡｇ＃３ ｄｓｓｃＦｖ ＨＬ（ＶＨ３）は、ｄｓｓｃＦｖ３Ａと呼ばれる。
Ａｇ＃４ ｄｓｓｃＦｖ ＨＬは、ｄｓｓｃＦｖ２と呼ばれる。
一過性発現
重鎖及び軽鎖抗体遺伝子は、ｈＣＭＶ－ｍｉｅプロモーターの制御下で一過性発現のための所有の哺乳動物発現ベクターに独立してクローニングした。プラスミドは、市販のＥｘｐｉＣＨＯエクスピフェクタミン一過性発現キット（Ｔｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、所有のＣＨＯ－ＳＸＥ細胞系にトランスフェクトした。培養物は、Ｃｏｒｎｉｎｇのベントキャップを有するローラーボトル中、３７℃、８．０％ＣＯ２、１９０ｒｐｍでインキュベートした。１８～２２時間後、培養物は、製造業者によって提供されるように、適切な容積のＣＨＯエンハンサー及びＨｉＴｉｔｅｒ法のフィードを供給した。次いで培養物は、さらに１０～１２日間、３２℃、８．０％ＣＯ２、１９０ｒｐｍで再インキュベートした。上清は、０．４５μｍ、続いて０．２μｍフィルターを通す、フィルター滅菌の前に、４℃で１時間、４０００ｒｐｍでの遠心分離によって回収された。
発現力価は、１ｍｌ ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム又は１ｍｌ ＨｉＴｒａｐプロテインＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかを使用して、プロテインＡ ＨＰＬＣ及びプロテインＬ ＨＰＬＣによって定量した。カラムは、リン酸緩衝液で平衡化し、１００μｌの試料を注入し、カラムを洗浄し、酸性ステップ溶出を使用して抗体を溶出した。濃度は、適当なモル吸光係数コレクションを有する社内で精製したＦａｂ標準を使用して作成した標準曲線と比較して、各試料の溶出ピーク面積を使用して算出した。
プロテインＬリガンドは、ＶＬドメイン、すなわち抗体の軽鎖を介して結合する。プロテインＡは、ＦｃのＣＨ２／ＣＨ３界面に結合し、ヒトＶＨドメインの選択はプロテインＡ結合ドメインを含む。
軽鎖プラスミドのみの発現
ジスルフィド安定化単鎖Ｆｖを付着した軽鎖（ＬＣ－ｄｓｓｃＦｖ）の発現のため、軽鎖プラスミドのみが、上記の方法によってトランスフェクト、発現及び定量された。表１ａは、プロテインＡとプロテインＬ ＨＰＬＣアッセイの両方によって定量した、これらの発現された軽鎖二量体の力価を列挙する。
ＬＣ－ｄｓｓｃＦｖ－１の上清の定量は、プロテインＬアッセイとプロテインＡアッセイで等しい結果を示した。対照的に、ＬＣ－ｄｓｓｃＦｖ－２及びＬＣ－ｄｓｓｃＦｖ－３Ｂの上清は、プロテインＬアッセイによって定量可能であったが、プロテインＡアッセイは定量のレベル未満であった。ＬＣ－ｄｓｓｃＦｖ－３Ａ発現の定量は、プロテインＬアッセイの約３分の１のプロテインＡアッセイの値を示した。
Figure 2023507277000010
Figure 2023507277000011
表１ｂに示すように、ＬＣ－ｄｓｓｃＦｖ－１は、プロテインＡに結合するｄｓｓｃＦｖを含有し、算出されたプロテインＬ及びプロテインＡ力価が同等である理由を説明している（表２ａ）。反対に、ＬＣ－ｄｓｓｃＦｖ－２及びＬＣ－ｄｓｓｃＦｖ－３Ｂは、プロテインＬアッセイによってのみ定量可能であり、プロテインＡアッセイでは定量できず、それらがプロテインＡ結合ドメインを含まないことが確認された。ＬＣ－ｄｓｓｃＦｖ－３Ａは、プロテインＡに弱く結合するｄｓｓｃＦｖを含有し、したがって算出された濃度は、プロテインＬアッセイからの濃度の３分の１だけであったことが観察された。
したがって、結果は、ｄｓｓｃＦｖ－１及びｄｓｓｃＦｖ－３ＡがプロテインＡ結合ドメインを含むことを示す。特に、ｄｓｓｃＦｖ－３Ａは、プロテインＡに結合することができるＶＨ３ドメインを含む。
反対に、ｄｓｓｃＦｖ－２及びｄｓｓｃＦｖ－３ＡはプロテインＡに結合しない。特に、ｄｓｓｃＦｖ－３Ｂは、プロテインＡに結合することができないＶＨ１ドメインを含む。
重鎖及び軽鎖プラスミドの共発現
抗体構築物の発現のため、等しい比の重鎖及び軽鎖プラスミドがコトランスフェクトされ、上記の方法によって発現された。これらの抗体は、同じＦａｂ領域及びアイソタイプを共有する。
以下の例（３、４、５及び６）で試験した試験上清が過剰な軽鎖を含有することを確かめるため、対応する軽鎖のみの上清を抗体上清に添加した。生じる試験上清は、プロテインＡ及びプロテインＬ ＨＰＬＣアッセイによって定量した（表２ａ）。
Ｗｉｔｔｒｕｐ０１、ＴｒＹｂｅ０５及びＴｒＹｂｅ０６の試験上清の定量は、プロテインＡアッセイとプロテインＬアッセイの両方で同等の結果を示した。Ｗｉｔｔｒｕｐ０２、ＴｒＹｂｅ０３及びＴｒＹｂｅ０４は、プロテインＡアッセイによって決定された濃度が、プロテインＬアッセイによって決定されたもののおよそ半分であった。
Ｗｉｔｔｒｕｐ０１、ＴｒＹｂｅ０５及びＴｒＹｂｅ０６は、表１ｂ及び表２ｂに記載されるように、同じ軽鎖を共有し、この軽鎖はプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有し、そのため算出したプロテインＬ及びプロテインＡ力価は、両アッセイで結合することができる抗体と軽鎖二量体の両方と同等であった。抗体がプロテインＡに結合することができるため、プロテインＡアッセイを使用して、Ｗｉｔｔｒｕｐ０２とＴｒＹｂｅ０３の濃度を決定することができるが、両方とも軽鎖にプロテインＡを結合しないｄｓｓｃＦｖを有し、それぞれの軽鎖二量体が、プロテインＬアッセイによってのみ定量することができることを意味し、したがって、２つのアッセイ間の２倍の差を説明する。ＴｒＹｂｅ０４は、軽鎖に弱いプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有し、したがって、軽鎖二量体の一部のみが結合し、算出された濃度は、プロテインＬアッセイからの濃度の半分のみであった。
Figure 2023507277000012
Figure 2023507277000013
（例３）Ｗｉｔｔｒｕｐ抗体フォーマットのプロテインＡ精製：適切なプロテインＡ結合特性を有するｄｓｓｃＦｖ可変領域を選択する
両Ｗｉｔｔｒｕｐ分子の試験上清は、例２に記載のように調製し、抗体と軽鎖二量体の両方を含有する。これらのＷｉｔｔｒｕｐ抗体は、同じＩｇＧ成分（Ｆｃ及びＦａｂ）を共有するが、それぞれ異なるｄｓｓｃＦｖが軽鎖に付着している。Ｗｉｔｔｒｕｐ０１は、軽鎖に付着したプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有するが、Ｗｉｔｔｒｕｐ０２は、軽鎖に付着した非プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有する。
例２に示すように、Ｗｉｔｔｒｕｐ０１とＷｉｔｔｒｕｐ０２の試験上清は、プロテインＡ及びプロテインＬ ＨＰＬＣアッセイによって定量された（表３ａ）。Ｗｉｔｔｒｕｐ０１は、両アッセイでほぼ同等な結果を示したが、Ｗｉｔｔｒｕｐ０２については、プロテインＡアッセイはプロテインＬアッセイの半分のみであった。Ｗｉｔｔｒｕｐ０１は、軽鎖に付着したプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｂを有し（表３ｂ）、プロテインＬ及びプロテインＡによって算出された力価は、両リガンドが軽鎖二量体を検出できるため、同等であった。軽鎖に付着した非プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有するＷｉｔｔｒｕｐ０２のプロテインＡアッセイの結果は（表３ｂ）、抗体のみがプロテインＡに結合できるが、両Ｗｉｔｔｒｕｐ抗体及び軽鎖二量体がプロテインＬに結合できるため、プロテインＬアッセイよりも著しく低い。
Figure 2023507277000014
Figure 2023507277000015
プロテインＡ精製
試験上清を、接触時間１５分でＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにローディングし、結合バッファー（２００ｍＭ グリシン ｐＨ７．５）で洗浄した。フロースルーを回収し、０．２２μｍで滅菌濾過した。結合した物質は、０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ３．２溶出ステップによって溶出し、溶出ピークを回収し、２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５で中和し、精製タンパク質を２８０ｎｍでの吸光度によって定量した。タンパク質が、カラムから完全に溶出されたか確かめるため、０．１Ｍクエン酸ｐＨ２．１による第２の溶出を実施した。
プロテインＬ精製
プロテインＡ精製からのフロースルーを、接触時間１０分でプロテインＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムにローディングし、結合バッファー（２００ｍＭ グリシン ｐＨ７．５）で洗浄した。フロースルーを回収し、０．２２μｍで滅菌濾過した。結合した物質は、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７溶出ステップによって溶出し、溶出ピークを回収し、２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５で中和し、精製タンパク質を２８０ｎｍでの吸光度によって定量した。タンパク質が、カラムから完全に溶出されたか確かめるため、０．１Ｍクエン酸ｐＨ２．１による第２の溶出を実施した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による解析のため、試料は、４×Ｎｏｖｅｘ ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料バッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び１０×ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は１００ｍＭ Ｎ－エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかを添加することによって調製し、３分間１００℃に加熱した。試料は、１５ウェルのＮｏｖｅｘ４～２０％ Ｔｒｉｓ－グリシン１．０ｍｍ ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にローディングし、Ｔｒｉｓ－グリシンＳＤＳランニングバッファー（社内で作成）中４０分間、２２５Ｖの定常電圧で分離した。Ｎｏｖｅｘ Ｍａｋ１２広範囲タンパク質標準（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を分子量マーカーとして使用した。ゲルは、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｉｎ（Ｇｅｎｅｒｏｎ）によって染色し、蒸留水中で脱染した。
結果
連続的なプロテインＡ及びプロテインＬ精製を評価するため、還元（図４Ａ）及び非還元（図４Ｂ）試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析のために調製した。これらの試料は、プロテインＡローディング物質、プロテインＡ溶出物、プロテインＬローディング物質（プロテインＡフロースルー）、プロテインＬ溶出物及びプロテインＬフロースルーを含んだ。
Ｗｉｔｔｒｕｐ０１は、軽鎖に付着したプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有する。還元プロテインＡ溶出物（レーン１Ｂ）では、サイズが似ており、したがって同じ位置に共移動した重鎖及び軽鎖として１つのバンドがある。プロテインＬ溶出物（レーン１Ｄ）では、検出可能なバンドはない。これは、軽鎖二量体が、プロテインＡ精製中にＷｉｔｔｒｕｐ０１抗体によって共精製されたことを示す。対照的に、Ｗｉｔｔｒｕｐ０２は、軽鎖に付着した非プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有する。プロテインＡ溶出物（レーン２Ｂ）は、Ｗｉｔｔｒｕｐ０１プロテインＡ溶出物に匹敵するように見えるが、プロテインＬ溶出物では、軽鎖バンドが存在し、軽鎖二量体がプロテインＡ精製では捕捉されないが、カラムを通り抜け、続いてプロテインＬ精製で捕捉されたことを示す。
Ｗｉｔｔｒｕｐ０１の非還元ゲルでは、プロテインＡ溶出物中にＷｉｔｔｒｕｐ抗体と軽鎖二量体のバンドがある（レーン１Ｂ）。このレーンには、さらなるバンドも存在し、分子の一部のＣＨ１とＣκの間の天然の鎖間ジスルフィド（ｄｓ）結合の不完全な形成による。プロテインＬ溶出物（レーン１Ｄ）は、プロテインＡ精製においてＷｉｔｔｒｕｐ０１によって共精製された軽鎖二量体を再び示す検出可能なバンドはなかった。Ｗｉｔｔｒｕｐ０２については、プロテインＡ溶出物中にＷｉｔｔｒｕｐバンド（レーン２Ｂ）、並びに不完全なジスルフィド形成によるさらなるバンドがある。軽鎖二量体バンドは、プロテインＬローディングとプロテインＬ溶出物の両方で見ることができるが（レーン２Ｃ、レーン２Ｄ）、プロテインＡ溶出物中では見られなかった。これは、プロテインＡ精製ではＷｉｔｔｒｕｐ０２抗体のみが捕捉され、軽鎖二量体はカラムを通り抜け、続いてプロテインＬ精製で捕捉されたことをさらに示す。
要約すると、Ｗｉｔｔｒｕｐ抗体の軽鎖に付着したプロテインＡに結合することができるｄｓｓｃＦｖの存在は、軽鎖二量体の共精製をもたらし、Ｗｉｔｔｒｕｐフォーマットの軽鎖に付着したプロテインＡに結合できないｄｓｓｃＦｖを選択することによって避けることができる。したがって、本発明者らは、軽鎖が非プロテインＡ結合剤であるように選択又は工学的に作成され得る、改善された多特異性抗体を提供する。
（例４）異なる可変領域移植を有するＴｒＹｂｅ抗体フォーマットのプロテインＡ精製；軽鎖に付着したｄｓｓｃＦｖの適切なプロテインＡ結合特性のためのフレームワーク選択
ＴｒＹｂｅ０３分子とＴｒＹｂｅ０４分子の両方の試験上清は、例２に記載されるように調製し、抗体と軽鎖二量体の両方を含有する。これらのＴｒＹｂｅが同じＦａｂ及び重鎖に付着した同じプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを共有する。軽鎖に付着したｄｓｓｃＦｖは、同じ親可変領域に由来するが、ＴｒＹｂｅ０３では、ＣＤＲが非プロテインＡ結合フレームワーク（ＶＨ１ドメイン）に移植されたが、ＴｒＹｂｅ０４では、ＣＤＲはプロテインＡ結合フレームワーク（ＣＨ３ドメイン）に移植された。
ＴｒＹｂｅ０３及びＴｒＹｂｅ０４の試験上清は、プロテインＡ及びプロテインＬ ＨＰＬＣアッセイ（表４ａ）によって定量され、両方の場合で、プロテインＡアッセイは、プロテインＬアッセイより低い。
このＴｒＹｂｅは、軽鎖に非プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有し（表４ｂ）、ＴｒＹｂｅ抗体のみがプロテインＡに結合できるが、ＴｒＹｂｅ０３と軽鎖二量体の両方がプロテインＬアッセイによって定量され得るため、プロテインＡアッセイによって決定されたＴｒＹｂｅ０３の濃度は、プロテインＬアッセイの約半分である。ＴｒＹｂｅ０４は、軽鎖に弱いプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有し（表４ｂ）、全てのＴｒＹｂｅ及び軽鎖二量体がプロテインＬアッセイに結合できるが、プロテインＡアッセイは全てのＴｒＹｂｅ及び一部の軽鎖二量体のみ結合する。したがって、この状況で、プロテインＡにより全ての軽鎖二量体及びＴｒＹｂｅを正確に定量することは不可能である。
Figure 2023507277000016
Figure 2023507277000017
プロテインＡ及びプロテインＬ精製ステップ、及びＳＤＳ ＰＡＧＥ解析は、例３に上記したように実施した。
濃度測定
濃度測定解析は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ画像解析ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥで実施した。解析は、重鎖バンドの密度と比較したパーセンテージとして示す。
結果
連続的なプロテインＡ及びプロテインＬ精製を評価するため、還元（図５Ａ）及び非還元（図５Ｂ）試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析のために調製した。これらの試料は、プロテインＡローディング物質、プロテインＡ溶出物、プロテインＬローディング物質（プロテインＡフロースルー）、プロテインＬ溶出物及びプロテインＬフロースルーを含んだ。さらに、還元プロテインＡ溶出物で濃度測定解析を実施し、重鎖と軽鎖の存在の割合を比較した（図５Ｃ）。
ＴｒＹｂｅ０３は、軽鎖に付着した非プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有する。還元ゲルのプロテインＡ溶出物（レーン３Ｂ）では、重鎖及び軽鎖に対応する２つのバンドがあり；プロテインＬ溶出物（レーン３Ｄ）では、軽鎖のバンドのみが存在する。濃度測定解析は、プロテインＡ溶出物中に存在する重鎖と軽鎖の比が等しいことを示した。したがって、ＴｒＹｂｅ０３のみが、プロテインＡ精製によって捕捉され、軽鎖二量体はカラムを通り抜け、続いてプロテインＬ精製によって捕捉された。対照的に、ＴｒＹｂｅ０４は、軽鎖に付着したプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有する。還元ゲルのプロテインＡ溶出物（レーン４Ｂ）では、より強い軽鎖及び弱い重鎖がある。濃度測定（図５Ｃ）は、重鎖よりも軽鎖が３倍多いことを示した。プロテインＬ溶出物（レーン４Ｄ）では、バンドがない。これは、軽鎖二量体が、プロテインＡ精製中にＴｒＹｂｅ０４と共精製されたことを示している。表４ｂでは、ＴｒＹｂｅ０４は軽鎖に付着した弱いプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有すると記載され、これはプロテインＡ ＨＰＬＣアッセイによる定量を難しくしている。しかしながら、分取プロテインＡクロマトグラフィーで使用した条件下では、結合強度は十分であり、プロテインＡに十分結合することができる。
非還元ゲルでは、ＴｒＹｂｅ０３については、プロテインＡ溶出物（レーン３Ｂ）中にＴｒＹｂｅのバンドがあり、プロテインＬ溶出物（レーン３Ｄ）中に軽鎖二量体のバンドがあり、それらはサイズが似ているため、バンドは同じ位置に移動する。また、プロテインＡ溶出物中には重鎖と軽鎖のバンド、及びプロテインＬ溶出物中には軽鎖のバンドもあり、これは、わずか一部の分子のＣＨ１とＣκの間の天然の鎖間ジスルフィド（ｄｓ）結合の不完全な形成による。これは、非ｄｓ結合した軽鎖が存在するため、プロテインＬ溶出物（レーン３Ｅ）でも明らかである。また、これらの観察は、ＴｒＹｂｅ０３抗体のみがプロテインＡ精製によって捕捉され、軽鎖二量体はカラムを通り抜け、続いてプロテインＬ精製によって捕捉されたことを示している。ＴｒＹｂｅ０４については、プロテインＡ溶出物（レーン４Ｂ）中に、ＴｒＹｂｅ及び軽鎖二量体バンドが、サイズが似ているため、同じ位置に共移動する。不完全な鎖間ｄｓ結合形成により、重鎖及び軽鎖のバンドも存在し、２つのＣＫ間のｄｓ結合形成がＣＨ１／Ｃｋ対形成よりも効率が悪いため、より非ｄｓ結合の軽鎖がある。また、プロテインＬ溶出物（レーン４Ｄ）中にはバンドがなく、軽鎖二量体がプロテインＡ精製中にＴｒＹｂｅ０４によって共精製されたことを示している。
要約すると、軽鎖のこのｄｓｓｃＦｖのプロテインＡ結合移植片の存在は、ＴｒＹｂｅによる軽鎖二量体の共精製を生じる。同じｄｓｓｃＦｖは、非プロテインＡ結合フレームワークに移植され、次いで軽鎖二量体は捕捉されず、ＴｒＹｂｅのみがプロテインＡクロマトグラフィーによって精製された。
したがって、本発明者らは改善された多特異性抗体を提供し、軽鎖に付着したｄｓｓｃＦｖのＶＨフレームワークが非プロテインＡ結合剤であるように選択された。本場合では、ＶＨ１は、プロテインＡに結合できないその能力のために選択された。同じ結果が、プロテインＡに結合しないフレームワーク、例えばＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、プロテインＡに結合できない自然発生のＶＨ３、又はプロテインＡに結合するその能力を廃止する少なくとも１つの変異を含む、プロテインＡに結合できる自然発生のＶＨ３のバリアントを選択することによっても得られることは当業者にも理解されるであろう。
（例５）軽鎖に付着したｄｓｓｃＦｖの適切なプロテインＡ結合特性のためにｄｓｓｃＦｖの位置が変更した、ＴｒＹｂｅ抗体フォーマットのプロテインＡ精製
ＴｒＹｂｅ０３分子とＴｒＹｂｅ０５分子の両方の試験上清は、例２に記載されるように調製し、抗体と軽鎖二量体の両方を含有する。これらのＴｒＹｂｅは、同じＦａｂ及びｄｓｓｃＦｖの同じ対を共有するが、ｄｓｓｃＦｖは反対のＦａｂ鎖に付着された。ＴｒＹｂｅ０３では、プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖは重鎖に付着され、非プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖは軽鎖に付着される。或いは、ＴｒＹｂｅ０５では、プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖは軽鎖に付着され、非プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖは重鎖に付着される。
ＴｒＹｂｅ０３とＴｒＹｂｅ０５の試験上清は、プロテインＡ及びプロテインＬ ＨＰＬＣによって定量した（表５ａ）。ＴｒＹｂｅ０３については、プロテインＡアッセイは、プロテインＬアッセイよりも著しく低かったが、ＴｒＹｂｅ０５は両アッセイで同等の結果を示した。
このＴｒＹｂｅは、軽鎖に非プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有し（表５ｂ）、ＴｒＹｂｅ抗体のみがプロテインＡに結合できることを意味するが、ＴｒＹｂｅと軽鎖二量体の両方がプロテインＬアッセイに結合できるため、ＴｒＹｂｅ０３のプロテインＡアッセイの結果は、プロテインＬアッセイよりも著しく低い。ＴｒＹｂｅ０５は、軽鎖に付着したプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有する（表５ｂ）ため、算出したプロテインＬ及びプロテインＡの力価は、両アッセイがＴｒＹｂｅ及び軽鎖二量体に結合できるため、同等である。
Figure 2023507277000018
Figure 2023507277000019
プロテインＡ及びプロテインＬ精製ステップは、上記のように実施した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ及び濃度測定解析も上記のように実施した。
結果
連続的なプロテインＡ及びプロテインＬ精製を評価するため、還元（図６Ａ）及び非還元（図６Ｂ）試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析のために調製した。これらの試料は、プロテインＡローディング物質、プロテインＡ溶出物、プロテインＬローディング物質（プロテインＡフロースルー）、プロテインＬ溶出物及びプロテインＬフロースルーを含んだ。さらに、還元プロテインＡ溶出物で濃度測定解析を実施し、重鎖と軽鎖の存在の割合を比較した（図６Ｃ）。
ＴｒＹｂｅ０３は、軽鎖に付着した非プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有する。還元ゲルのプロテインＡ溶出物（レーン３Ｂ）では、重鎖及び軽鎖に対応する２つのバンドがあり；プロテインＬ溶出物（レーン３Ｄ）では、軽鎖のバンドのみが存在する。濃度測定解析は、プロテインＡ溶出物中に存在する重鎖と軽鎖の比が等しいことを示す。したがって、ＴｒＹｂｅ０３のみが、プロテインＡ精製によって捕捉され、軽鎖二量体はカラムを通り抜け、続いてプロテインＬ精製によって捕捉された。対照的に、ＴｒＹｂｅ０５は、軽鎖に付着したプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有する。還元プロテインＡ溶出物（レーン５Ｂ）では、重鎖よりも４０％多い軽鎖が存在し、プロテインＬ溶出物（レーン５Ｄ）では、検出可能なバンドがない。これは、軽鎖二量体が、プロテインＡ精製中にＴｒＹｂｅ０５と共精製されたことを示している。
非還元ゲルでは、ＴｒＹｂｅ０３については、プロテインＡ溶出物（レーン３Ｂ）中にＴｒＹｂｅのバンドがあり、プロテインＬ溶出物（レーン３Ｄ）中に軽鎖二量体のバンドがあり、それらはサイズが似ているため、バンドは同じ位置に移動する。また、プロテインＡ溶出物中には重鎖と軽鎖のバンド、及びプロテインＬ溶出物中には軽鎖のバンドもある。これらは、わずか一部の分子のＣＨ１とＣκの間の天然の鎖間ジスルフィド（ｄｓ）結合の不完全な形成又は軽鎖二量体中の対応するＣκ／Ｃκ鎖間ジスルフィドによる。また、これらの結果は、ＴｒＹｂｅのみがプロテインＡ精製によって捕捉され、軽鎖二量体はカラムを通り抜け、続いてプロテインＬ精製によって捕捉されたことを示している。ＴｒＹｂｅ０５では、プロテインＡ溶出物（レーン５Ｂ）中に、ＴｒＹｂｅ及び軽鎖二量体バンドが、サイズが非常に似ているため、同じ位置に共移動する。また、鎖間ジスルフィド結合の非形成による重鎖及び軽鎖が、レーン３Ｂに存在する。さらに、プロテインＬ溶出物（レーン５Ｄ）中には検出可能なバンドがなく、軽鎖二量体がプロテインＡ精製中にＴｒＹｂｅによって共精製されたことをさらに示している。
要約すると、プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖが軽鎖に付着され、非プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖが重鎖に付着されるようなＴｒＹｂｅ分子の配置は、軽鎖二量体とＴｒＹｂｅの両方の共精製を生じた。プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖが重鎖にあり、非プロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖが軽鎖にあるように、この設計を逆転し、２つのｄｓｓｃＦｖをスワッピングすることにより、本発明者らは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、軽鎖二量体はカラムを通り抜け、ＴｒＹｂｅのみを精製することが可能であることを示した。
（例６）軽鎖に付着したｓｃＦｖのプロテインＡ結合特性のための不適切なｓｃＦｖ選択による、ＴｒＹｂｅ抗体フォーマットのプロテインＡ精製
両ＴｒＹｂｅ分子の試験上清は、例１に記載のように調製され、抗体と軽鎖二量体の両方を含有する。これらのＴｒＹｂｅは、同じＦａｂ及びｄｓｓｃＦｖの同じ対を共有するが、ｄｓｓｃＦｖは、反対のＦａｂ鎖に付着された。両方のｄｓｓｃＦｖがプロテインＡに結合するが、強度は異なる。ＴｒＹｂｅ０４では、弱いプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖが軽鎖に付着され、強いプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖが重鎖に付着される。或いは、ＴｒＹｂｅ０６では、弱いプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖが重鎖に付着され、強いプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖが軽鎖に付着される。
ＴｒＹｂｅ０４及びＴｒＹｂｅ０６の試験上清は、プロテインＡ及びプロテインＬ ＨＰＬＣアッセイ（表６ａ）によって定量された。ＴｒＹｂｅ０６については、プロテインＡ及びプロテインＬアッセイは同等の結果を示したが、ＴｒＹｂｅ０４については、プロテインＡアッセイは、プロテインＬアッセイより低い。
ＴｒＹｂｅ０６は、軽鎖に付着した強いプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有し（表７ｂ）、プロテインＬアッセイとプロテインＡアッセイの両方で算出された濃度は、ＴｒＹｂｅと軽鎖二量体の両方が両アッセイに結合できるため、同等である。ＴｒＹｂｅ０４は、軽鎖に弱いプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有し（表６ｂ）、したがって、全てのＴｒＹｂｅ及び軽鎖二量体の一部のみがプロテインＡアッセイに結合するであろう。対照的に、ＴｒＹｂｅと軽鎖二量体の両方が、プロテインＬアッセイに完全に結合する。したがって、プロテインＡアッセイを使用して、この試験上清中に存在する全ての軽鎖二量体を完全に定量することは不可能である。
Figure 2023507277000020
Figure 2023507277000021
プロテインＡ及びプロテインＬ精製ステップは、上記のように実施した。ＳＤＳ ＰＡＧＥ及び濃度測定解析も上記のように実施した。
結果
連続的なプロテインＡ及びプロテインＬ精製を評価するため、還元（図７Ａ）及び非還元（図７Ｂ）試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析のために調製した。これらの試料は、プロテインＡローディング物質、プロテインＡ溶出物、プロテインＬローディング物質（プロテインＡフロースルー）、プロテインＬ溶出物及びプロテインＬフロースルーを含んだ。さらに、還元プロテインＡ溶出物で濃度測定解析を実施し、重鎖と軽鎖の存在の割合を比較した（図７Ｃ）。
ＴｒＹｂｅ０４は、軽鎖に付着した弱いプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有する。還元ゲルのプロテインＡ溶出物（レーン４Ｂ）では、より強い軽鎖及び弱い重鎖がある。濃度測定は、重鎖よりも軽鎖が３倍多いことを示した。プロテインＬ溶出物（レーン４Ｄ）では、バンドがない。これは、軽鎖二量体が、プロテインＡ精製中にＴｒＹｂｅ０４によって共精製されたことを示している。ＴｒＹｂｅ０６は、軽鎖に付着した強いプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖを有する。還元プロテインＡ溶出物（レーン６Ｂ）では、この例ではバンドが共移動するため、重鎖と軽鎖の両方の１つのバンドがある。プロテインＬ溶出物（レーン６Ｄ）には、検出可能なバンドがない。ＴｒＹｂｅ０６に関する限りでは、これは、軽鎖二量体が、プロテインＡ精製中にＴｒＹｂｅによって共精製されたことを示している。
ＴｒＹｂｅ０４については、非還元のプロテインＡ溶出物（レーン４Ｂ）では、ＴｒＹｂｅと軽鎖二量体のバンドは、サイズが似ているため、同じ位置に共移動する。不完全な鎖間ｄｓ結合形成による重鎖及び軽鎖のバンドもある。軽鎖二量体の存在により、及び２つのＣκ間の鎖間ジスルフィド結合形成がＣＨ１／Ｃκ対合よりも効率が悪いため、より軽鎖がある。
ＴｒＹｂｅ０４のように、非還元ゲルのＴｒＹｂｅ０６のプロテインＡ溶出物（レーン６Ｂ）は、ＴｒＹｂｅ及び軽鎖二量体を含有するが、この場合、それらがわずかに異なって移動するため、２つのバンドがある。重鎖及び軽鎖のバンドもあるが、還元ゲルとは対照的に、それらは共移動するため１つのバンドのみが明らかである。前の通りに、ＴｒＹｂｅ０４又はＴｒＹｂｅ０６（レーン４Ｄ、レーン６Ｄ）のいずれについてもプロテインＬ溶出物中にバンドはなく、軽鎖二量体が、プロテインＡ精製中に、ＴｒＹｂｅによって共精製されたことを示している。
要約すると、軽鎖に付着されたプロテインＡ結合ｄｓｓｃＦｖの存在が、ＴｒＹｂｅによる軽鎖二量体の共精製をもたらす。この共精製は、軽鎖に付着したｄｓｓＦｖがプロテインＡの弱い結合剤であった場合でさえも起こる。したがって、本発明者らは、抗体ＬＣのプロテインＡヘの結合を完全に排除することが重要であることを示した。
（例７）プロテインＡ相互作用アッセイ
新しい方法が開発され、相互作用アッセイを通してプロテインＡ結合のための抗体断片を定性的に試験した。
アッセイは４つの重要な段階からなる：ローディング、洗浄、溶出、再平衡化。１００μｌ ２．１×３０ｍｍ ＰＯＲＯＳ（商標）Ａ ２０μｍカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）は、ランニングバッファー（ＰＢＳ ｐＨ７．４）中で平衡化した。５０μｌの１ｍｇ／ｍｌの試験分子又は対照分子を、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して０．２ｍｌ／分でカラムにローディングした。次いで、カラムは、任意の残存する強い結合剤を除去するため、２分間、２．０ｍｌ／分での０．１Ｍ グリシン－ＨＣｌ ｐＨ２．７による酸性ステップ溶出を適用する前に３０分間、ＰＢＳ ｐＨ７．４などのランニングバッファーにより６０カラム容積以上ゆっくりと洗浄した。最終的に、カラムは、次の注入のための調製において、ランニングバッファー（例えば流速２．０ｍｌ／分で５０ＣＶ ＰＢＳ ｐＨ７．４及びさらに０．２ｍｌ／分で１０ＣＶ）中で再平衡化した。吸光度は、２８０ｎｍ（Ａ２８０）で読み取った。
試験分子：
試験分子は、一価及び単量体でなければならず、この場合、マウスＦａｂ（プロテインＡに結合しない）を有する精製ＢＹｂｅ（Ｆａｂ－ｄｓｓｃＦｖ）分子及び重鎖（ＨＣ）に付着したｄｓｓｃＦｖ試験Ｖ領域を使用した。ｄｓｓｃＦｖ－１、ｄｓｓｃＦｖ－２、ｄｓｓｃＦｖ－３Ａ、ｄｓｓｃＦｖ－３Ｂは、先の例で使用したｄｓｓｃＦｖ分子に対応する。さらに、強い結合剤であることが公知のｈＦａｂ－４結合断片のものに対応するＶＨ及びＶＬ領域を含むｄｓｓｃＦｖ－４を使用した。
対照分子：
対照分子を使用して、結果が正確であるか確かめた。ｈＦａｖ－１は、中程度の結合剤であることが公知のヒトＦａｂである。ｈＦａｂ－４は、強い結合剤であることが公知のヒトＦａｂである。ｍｕＦａｂは、マウスＦａｂであり、プロテインＡに結合しない。ＩｇＧはプロテインＡに強く結合するため、不適切なＩｇＧを対照として使用した。最終的に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を陰性対照として使用した。
結果
保持時間は表７に示す。このプロテインＡ相互作用アッセイでは、プロテインＡ非結合剤は、主要ピークがフロースルー中に溶出し、したがって保持時間が０．９分以下であると定義することができる。弱いから強いプロテインＡ結合剤のピーク保持時間は、それぞれ１～３０分の範囲であろう。強い結合剤では、分子がカラムを転がり落ちるため、ピーク形状は幅広であろう。強い結合剤は、酸性溶出ステップまで結合を維持したままであり、３１分でのピークが観察され得る。
ＩｇＧはプロテインＡに強く結合し、そのためＩｇＧ対照は、アッセイの酸性ステップの間にのみカラムから溶出され、主要ピーク保持時間は３１分であった。対照的に、ＨＳＡ陰性対照は、カラムを真っ直ぐに通り抜け、したがって主要ピークは０．７分の保持時間を有する。Ｆａｂ－ｄｓｓｃＦｖ試験分子中で使用するｍｕＦａｂは、主要ピーク保持時間＜０．９分を有し、したがって、プロテインＡへの試験分子の結合は、Ｆａｂの重鎖に付着したｄｓｓｃＦｖを介してのみ起こることを確認した。
全てのプロテインＡ結合Ｖ領域について、主要ピークの保持時間は＞１分であった。ｄｓｓｃＦｖ－３Ａは、弱いプロテインＡ結合剤であり、１．８分だけの最短の保持時間を有するとして先に記載された。
他のプロテインＡ結合Ｖ領域（ｄｓｓｃＦｖ－１、ｄｓｓｃＦｖ－４）は、より遅い保持時間を有し、それらがｄｓｓｃＦｖ３よりも強い結合剤であることを示している。
プロテインＡ非結合Ｖ領域（ｄｓｓｃＦｖ－２、ｄｓｓｃＦｖ－３Ｂ、ｄｓｓｃＦｖ－ｍｕ１）については、Ｆａｂ－ｄｓｓｃＦｖはカラムを真っ直ぐに通り抜け、主要ピークの保持時間は＜０．９分である。
Figure 2023507277000022
（例８）Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ
天然又は工学的に作成した可変領域のいずれかを含む抗体構築物のプロテインＡに結合する能力を確かめるため、結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、特にＢｉａｃｏｒｅを使用して測定され得る。
ＳＰＲは、タンパク質－タンパク質相互作用の詳細及び定性的な研究のための一般的に使用される技術である。それらの平衡及び動的パラメーターを決定するために使用されることが多い（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，２０００）。Ｂｉａｃｏｒｅ法は、抗体試験分子（ＢＹｂｅｓなど）のプロテインＡヘの結合を定性的に評価するために確立された。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＰＲ実験を行った。
天然のプロテインＡの２つの形態への結合を評価した：黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）から精製した市販のプロテインＡ、及び組換え精製形態（社内で調製した）。それぞれ、標準的なアミンカップリング化学によってＣＭ５センサーチップ表面（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へとおよそ４００ＲＵのレベルまで固定化した。その後、試験分子の結合を、３０μｌ／分での６０秒注入を使用して、チップ表面でそれぞれ滴定することにより評価した。ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％ポリソルベート２０）を試料希釈とランニングバッファーの両方として使用した。各注入の間、表面は、１０ｍＭグリシン ｐＨ１．７の６０秒注入（１０μｌ／分）を使用して、再生成した。各試料は、ストック濃度（９０、３０又は１０μＭ）に応じて達成可能な最高濃度から３倍希釈で１０点濃度シリーズにわたり力価測定し、０ｎＭブランク注入は、装置ノイズ及びドリフトを差し引くため、各試料に含めた。
ｄｓｓｃＦｖ配列に融合したマウスＦａｂ試料は、先の例に記載したように選択された。さらに、Ｍｕ Ｆａｂ、ｄｓｓｃＦｖ－ｍｕ１を、プロテインＡに結合しないことが公知の陰性対照マウス配列を含む陰性対照として使用した。
結果
表８ａ及び８ｂ、並びに図８は、市販の精製プロテインＡ（表８ａ及び図８Ａ）及び精製組換えプロテインＡ（表８ｂ及び図８Ｂ）の各濃度について、試料注入の終わり（ブランクを引いた後）の結合応答を表す。このアッセイフォーマットを使用して、固定化したプロテインＡへの結合を評価することができる（およそ４００ＲＵの固定化レベルで）。滴定可能な結合応答（ブランクを引いた後）は、公知のプロテインＡ結合陽性のヒトＶＨ３ドメインを持つ全ての構築物について見られた。完全な結合応答は、固定化プロテインＡの質及び観察されたバックグラウンドシグナルのレベルによる。非結合陰性対照の力価測定は、最小であるが１０μＭの濃度まで測定可能な結合応答を示す。
試験分子の非結合は、１０μＭの陰性対照について観察された応答よりも２倍以下の結合応答（１０μＭで）により、１０μＭの濃度までの滴定可能な結合応答の欠如を実証することにより確かめることができる。
Figure 2023507277000023
Figure 2023507277000024
配列番号１～２：＜２２３＞ペプチドリンカー
配列番号３～１１：＜２２３＞ヒンジリンカー
配列番号１２～１９：＜２２３＞可動性リンカー
配列番号２０：＜２２３＞可動性リンカー＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生のアミノ酸であり得る
配列番号２１：＜２２３＞可動性リンカー＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生のアミノ酸であり得る＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生のアミノ酸であり得る
配列番号２２：＜２２３＞可動性リンカー＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生のアミノ酸であり得る＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生のアミノ酸であり得る＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生のアミノ酸であり得る
配列番号２３：＜２２３＞可動性リンカー＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生のアミノ酸であり得る＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生のアミノ酸であり得る＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生のアミノ酸であり得る＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生のアミノ酸であり得る
配列番号２４：＜２２３＞可動性リンカー＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生のアミノ酸であり得る
配列番号２５～５１：＜２２３＞可動性リンカー
配列番号５２～５３：＜２２３＞剛性リンカー
配列番号５４～６７：＜２２３＞アルブミン結合ペプチド
配列番号６８～７０：＜２２３＞リンカー
配列番号７１：＜２２３＞抗体６４５ ＣＤＲＨ１
配列番号７２：＜２２３＞抗体６４５ ＣＤＲＨ２
配列番号７３：＜２２３＞抗体６４５ ＣＤＲＨ３
配列番号７４：＜２２３＞抗体６４５ ＣＤＲＬ１
配列番号７５：＜２２３＞抗体６４５ ＣＤＲＬ２
配列番号７６：＜２２３＞抗体６４５ ＣＤＲＬ３
配列番号７７：＜２２３＞抗体６４５重鎖可変ドメイン
配列番号７８：＜２２３＞抗体６４５重鎖可変ドメイン、変異
配列番号７９：＜２２３＞抗体６４５軽鎖可変ドメイン
配列番号８０：＜２２３＞抗体６４５軽鎖可変ドメイン、変異
配列番号８１：＜２２３＞６４５ ｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬ）
配列番号８２：＜２２３＞６４５ ｄｓｓｃＦｖ

Claims (27)

  1. 式（Ｉ）：
    ＶＨ－ＣＨ１－（ＣＨ２）ｓ－（ＣＨ３）ｔ－Ｘ－（Ｖ１）ｐ
    のポリペプチド鎖；及び
    式（ＩＩ）：
    （Ｖ３）ｒ－Ｚ－ＶＬ－ＣＬ－Ｙ－（Ｖ２）ｑ
    のポリペプチド鎖
    を含む多特異性抗体であって、
    式中：
    ＶＨは重鎖可変ドメインを表し；
    ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン１を表し；
    ＣＨ２は重鎖定常領域のドメイン２を表し；
    ＣＨ３は重鎖定常領域のドメイン３を表し；
    Ｘは結合又はリンカーを表し；
    Ｖ１はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
    Ｖ３はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
    Ｚは結合又はリンカーを表し；
    ＶＬは軽鎖可変ドメインを表し；
    ＣＬはＣカッパなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し；
    Ｙは結合又はリンカーを表し；
    Ｖ２はｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ又はＶＨＨを表し；
    ｐは０又は１を表し；
    ｑは０又は１を表し；
    ｒは０又は１を表し；
    ｓは０又は１を表し；
    ｔは０又は１を表し；
    ｐが０である場合、Ｘは存在せず、ｑが０である場合、Ｙは存在せず、ｒが０である場合、Ｚは存在せず；
    ｑが０である場合、ｒは１であり、ｒが０である場合、ｑは１であり；
    該式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、少なくとも１つのｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ、又はＶＨＨを含み；
    該式（Ｉ）のポリペプチド鎖が、プロテインＡ結合ドメインを含み；
    該式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、プロテインＡに結合しない、多特異性抗体。
  2. 前記式（Ｉ）のポリペプチド鎖が、１つ、２つ又は３つのプロテインＡ結合ドメインを含む、請求項１に記載の多特異性抗体。
  3. プロテインＡ結合ドメインが、ＶＨ及び／又はＣＨ２－ＣＨ３及び／又はＶ１に存在する、請求項１又は２に記載の多特異性抗体。
  4. 前記式（Ｉ）のポリペプチド鎖が、ＶＨ又はＶ１に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  5. 前記式（Ｉ）のポリペプチド鎖が、ＶＨに存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む、請求項４に記載の多特異性抗体。
  6. 前記式（Ｉ）のポリペプチド鎖が、Ｖ１に存在する１つのプロテインＡ結合ドメインのみを含む、請求項４に記載の多特異性抗体。
  7. 前記プロテインＡ結合ドメイン（単数又は複数）が、プロテインＡに結合するＶＨ３ドメイン又はそのバリアントを含むか又はそれらからなる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  8. Ｖ２及び／又はＶ３がＶＨ３ドメインを含まない、請求項１から７までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  9. Ｖ２及び／又はＶ３が、プロテインＡに結合しないＶＨ３ドメイン又はそのバリアントを含むか又はそれらからなる、請求項１から７までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  10. ｐが１である、請求項１から９までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  11. ｑが１である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  12. ｒが１である、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  13. ｑが０であり、ｒが１である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  14. ｓが１であり、ｔが１であり、ｐが０であり、ｑが１であり、ｒが０であり、Ｖ２がｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖである、請求項１から９までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  15. ｓが０であり、ｔが０であり、ｐが１であり、ｑが１であり、ｒが０であり、Ｖ１とＶ２の両方がｄｓｓｃＦｖを表す、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  16. Ｖ１がアルブミンに結合し、配列番号７８の配列のＶＨ３を含む、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  17. Ｘ及び／又はＹ及び／又はＺがペプチドリンカー、例えば配列番号１、２、６９及び７０である、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  18. Ｖ１及び／又はＶ２及び／又はＶ３が、ｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであり、Ｖ１の軽鎖及び重鎖可変ドメイン及び／又はＶ２の軽鎖及び重鎖可変ドメイン及び／又はＶ３の軽鎖及び重鎖可変ドメインが、２つの遺伝子工学的に作成されたシステイン残基の間のジスルフィド結合によって連結され、システイン残基の対の位置が、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５７（Ｋａｂａｔによる番号付け）を含むかこれらからなる群から選択され、ＶＨ及びＶＬの価(Values)が独立して所与のＶ１又はＶ２又はＶ３、例えばＶＨ４４及びＶＬ１００内である、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の多特異性抗体。
  19. 請求項１から１８までのいずれか一項に規定される多特異性抗体をコードするポリヌクレオチド。
  20. 請求項１９に規定されるポリヌクレオチドを含むベクター。
  21. それぞれ請求項１９又は２０のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞。
  22. 少なくとも２つのベクターを含む宿主細胞であって、各ベクターが、請求項１から１８までのいずれか一項に規定される多特異性抗体の異なるポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
  23. 請求項１から１８までのいずれか一項に記載の多特異性抗体と、少なくとも１つの賦形剤とを含む、医薬組成物。
  24. 処置での使用のための、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の多特異性抗体又は請求項２３に記載の医薬組成物。
  25. 治療有効量の請求項１から１８までのいずれか一項に記載の多特異性抗体又は請求項２３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、それを必要とする患者を処置する方法。
  26. 請求項１に規定される式（Ｉ）のポリペプチド鎖及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含む多特異性抗体を産生する方法であって：
    ａ）宿主細胞において、上記で規定される式（Ｉ）のポリペプチド鎖及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を発現させるステップであって、該式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、該式（Ｉ）のポリペプチド鎖より過剰である、ステップ；及び
    ｂ）ステップａ）で発現されたポリペプチドの組成物を回収するステップであって、該組成物が多特異性抗体及び式（ＩＩ－ＩＩ）のＬＣ二量体を含む、ステップ；及び
    ｃ）該多特異性抗体を精製するステップであって、ｓが１であり、ｔが１である場合、該多特異性抗体が、式（Ｉ）の２つの重鎖及び式（ＩＩ）の２つの会合した軽鎖を有する二量体として精製され、ｓが０であり、ｔが０である場合、該多特異性抗体が、式（Ｉ）の１つの重鎖及び式（ＩＩ）の１つの会合した軽鎖を有する二量体として精製される、ステップ
    を含み、
    該式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、少なくとも１つのｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ又はＶＨＨを含み；
    該式（Ｉ）のポリペプチド鎖が、プロテインＡ結合ドメインを含み；
    該式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、プロテインＡに結合せず；
    ステップｃ）が、ステップｂ）、場合により続く少なくとも１つの精製ステップで回収したポリペプチドの該組成物を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにかける、方法。
  27. 請求項１に規定される式（Ｉ）のポリペプチド鎖及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含む多特異性抗体を精製する方法であって：
    ａ）上記で規定される式（Ｉ）のポリペプチド鎖及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖の組成物を得るステップであって、該組成物が多特異性抗体と、式（ＩＩ－ＩＩ）の２つの軽鎖が共に会合した二量体（ＬＣ二量体）とを含み、
    ｓが１であり、ｔが１である場合、多特異性抗体が、式（Ｉ）の２つの重鎖及び式（ＩＩ）の２つの会合する軽鎖を有する二量体であり；ｓが０であり、ｔが０である場合、多特異性抗体が、式（Ｉ）の１つの重鎖及び式（ＩＩ）の１つの会合する軽鎖を有する二量体であり；
    該式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、少なくとも１つのｄｓｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨ又はＶＨＨを含み；
    該式（Ｉ）のポリペプチド鎖がプロテインＡ結合ドメインを含み；
    該式（ＩＩ）のポリペプチド鎖がプロテインＡに結合しない、ステップ；及び
    ｂ）該ＬＣ二量体はカラムに結合しないが、該多特異性抗体はカラムに保持されるように、ステップａ）で得られた該組成物を、プロテインＡアフィニティーカラムにローディングするステップ；及び
    ｃ）該プロテインＡアフィニティーカラムを洗浄するステップ；及び
    ｄ）該多特異性抗体を溶出するステップ；及び
    ｅ）該多特異性抗体を回収するステップ
    を含む、方法。
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Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
DK336987D0 (da) 1987-07-01 1987-07-01 Novo Industri As Immobiliseringsmetode
GB8719042D0 (en) 1987-08-12 1987-09-16 Parker D Conjugate compounds
GB8720833D0 (en) 1987-09-04 1987-10-14 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
JP3771253B2 (ja) 1988-09-02 2006-04-26 ダイアックス コープ． 新規な結合タンパク質の生成と選択
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8907617D0 (en) 1989-04-05 1989-05-17 Celltech Ltd Drug delivery system
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0542810A1 (en) 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
EP0580737B1 (en) 1991-04-10 2004-06-16 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
GB9112536D0 (en) 1991-06-11 1991-07-31 Celltech Ltd Chemical compounds
GB9120467D0 (en) 1991-09-26 1991-11-06 Celltech Ltd Anti-hmfg antibodies and process for their production
ES2227512T3 (es) 1991-12-02 2005-04-01 Medical Research Council Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1995015982A2 (en) 1993-12-08 1995-06-15 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
PT1231268E (pt) 1994-01-31 2005-11-30 Univ Boston Bancos de anticorpos policlonais
FR2716640B1 (fr) 1994-02-28 1996-05-03 Procedes Machines Speciales Dispositif de centrage et de blocage d'une pièce en vue de son rodage à l'aide d'un rodoir à expansion.
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6387981B1 (en) 1999-10-28 2002-05-14 3M Innovative Properties Company Radiopaque dental materials with nano-sized particles
US20060228364A1 (en) 1999-12-24 2006-10-12 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
EP1570267B1 (en) 2002-12-03 2011-10-12 UCB Pharma, S.A. Assay for identifying antibody producing cells
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
GB0315450D0 (en) 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0412181D0 (en) 2004-06-01 2004-06-30 Celltech R&D Ltd Biological products
GB0619291D0 (en) 2006-09-29 2006-11-08 Ucb Sa Altered antibodies
EP2535349A1 (en) 2007-09-26 2012-12-19 UCB Pharma S.A. Dual specificity antibody fusions
DK2334705T3 (en) 2008-09-26 2017-03-27 Ucb Biopharma Sprl BIOLOGICAL PRODUCTS
US8648176B2 (en) * 2009-02-27 2014-02-11 Massachusetts Institute Of Technology Engineered proteins with high affinity for DOTA chelates
ES2667258T3 (es) 2009-09-10 2018-05-10 Ucb Biopharma Sprl Anticuerpos multivalentes
GB0920127D0 (en) 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
GB0920324D0 (en) 2009-11-19 2010-01-06 Ucb Pharma Sa Antibodies
GB201000467D0 (en) 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
CA2856216C (en) 2011-11-11 2021-01-12 Ucb Pharma S.A. Albumin binding antibodies and binding fragments thereof
GB201223276D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Ucb Pharma Sa Antibodies and methods of producing same
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
GB201411420D0 (en) 2014-06-26 2014-08-13 Ucb Biopharma Sprl Antibody constructs
GB201506868D0 (en) * 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method for protein purification

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