JP2018506991A - Adamts−5又はadam17発現を抑制する組成物及びその方法 - Google Patents
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Abstract
Description
b)リボース又はデオキシリボースの2’−O−メチル修飾;
c)リボース又はデオキシリボースの2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾;
d)ロックド核酸(LNA)修飾;
e)開環核酸修飾;
f)インドール修飾;
g)塩基の5−メチルシトシン修飾;
h)塩基の5−エチニルウラシル修飾;
i)末端ヌクレオチドのコレステロール又はその誘導体修飾;
j)末端ヌクレオチドのガラクトース修飾;
k)末端ヌクレオチドのポリペプチド修飾;
l)リン酸化修飾;
m)末端ヌクレオチドの蛍光標記修飾;
n)末端ヌクレオチドのビオチン修飾。
Kは、5’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロール基であることができ、
Rは5’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
dTはチミンデオキシリボヌクレオチドであることができ、
Lは未修飾又は2’−O−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Mは未修飾又は2’−O−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Pは未修飾又は2’−O−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Qは未修飾又は2’−O−メチル修飾のウラシルリボースヌクレオチドであって、
L、M、P及びQの中の少なくとも一つがチオリン酸骨格を有することができる。
a)リン酸骨格のホスホロチオエート修飾;
b)リボース又はデオキシリボースの2’−O−メチル修飾;
c)リボース又はデオキシリボースの2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾;
d)ロックド核酸(LNA)修飾;
e)開環核酸修飾;
f)インドール修飾;
g)塩基の5−メチルシトシン修飾;
h)塩基の5−エチニルウラシル修飾;
i)末端ヌクレオチドのコレステロール又はその誘導体修飾;
j)末端ヌクレオチドのガラクトース修飾;
k)末端ヌクレオチドのポリペプチド修飾;
l)リン酸化修飾;
m)末端ヌクレオチドの蛍光標記修飾;
n)末端ヌクレオチドのビオチン修飾。
K’は5’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロールであることができ、
R’は5’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
dTはチミンデオキシリボースヌクレオチドであって、
L’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
M’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
P’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Q’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のウラシルリボースヌクレオチドであって、
L’、M、’P’及びQ’の中の少なくとも一つはチオリン酸骨格を有することができる。
特別に定義していない限り、本文で使用する全ての科学技術用語は当業者が通常に理解している意味と同じ意味を持つ。情報を開示するため、以下のものを定義する。
抑制を、このような一つ又は複数の変量とコントロールと比較した絶対又は相対的減少によって評価することができる。コントロールレベルは本分野で使用されるいずれかのコントロールレベル、例えば薬物投入前の基線レベル、又は類似する被験者、細胞から定められるレベル、又は未処理のサンプル又はコントロール(例えば、緩衝液のみのコントロール又は非活性剤コントロール)で処理した後のレベルであることができる。
開示したある態様によると、体外で、例えば溶液又は無細胞系(例えば、細胞溶解物又は再構成システム)において、又は細胞、例えば体外培養細胞(例えば、ADAMTS−5又はADAM17を発現する細胞)において、又は被験者体内の細胞においては、ADAMTS−5又はADAM17遺伝子の発現を抑制するsiRNAsを提供する。被験者は、例えばラット、マウス又はヒトのような哺乳類動物であることができる。一部の実施例において、被験者は、例えば炎症に関連する病気等のADAMTS−5又はADAM17に関連する病気にかかっているか又は上記病気にかかる可能性がある。実例の炎症に関連する疾患は、関節炎(OA、RA、慢性感染性関節炎、脊椎炎、乾癬関節炎、痛風を含む)を含む。一部の実施例において、疾患は関節炎であることができる。一部の実施例において、疾患はOAであることができる。一部の実施例において、疾患はRAであることができる。
複数の実施例において、siRNAは活性(例えば、安定性、有効性、特異性)、細胞分布、細胞取込又は他の性能を向上させるため化学修飾されることができる。前記siRNAは、既存の方法で合成及び/又は修飾されることができる。異なる実施例において、siRNAは少なくとも一つの任意の適切な基によって修飾されたヌクレオチド(例えば、化学修飾、共役又は置換)を含むことでsiRNA性能を向上させる。所定のsiRNAの全ての位置に同一の修飾を行う必要はない。一部の実施例において、単一のsiRNA又はsiRNAの単一のヌクレオチドに1個を超える修飾を含むことができる。実例の修飾は、例えば5’端修飾(例えば、リン酸化、共役、反転結合等)又は3’端修飾(例えば、共役、DNAヌクレオチド、反転結合等)のような末端修飾と、例えば安定な塩基、不安定な塩基、又は拡張した配偶体レパートリーと塩基ペアリングする塩基への入れ替え、塩基の移転(非塩基ヌクレオチド)又は塩基の共役のような塩基修飾と、糖修飾(例えば、2'位又は4'位)又は糖置換と、及び/又は、ホスホジエステル結合の修飾又は入れ替えを含む骨格修飾とを含む。
Kは5’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロール基であることができ、
Rは5’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
dTはチミンデオキシリボヌクレオチドであって、
Lは未修飾又は2’−O−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Mは未修飾又は2’−O−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Pは未修飾又は2’−O−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Qは未修飾又は2’−O−メチル修飾のウラシルデオキシリボースヌクレオチドであって、
L、M、P及びQの中の少なくとも一つがチオリン酸骨格を有することができる。
K’は5’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロール基であることができ、
R’は5’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
dTはチミンデオキシリボースヌクレオチドであって、
L’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
M’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
P’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Q’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のウラシルリボースヌクレオチドであって、
L’、M,’、P’及びQ’の中の少なくとも一つがチオリン酸骨格を有することができる。
開示した他の態様は前記siRNAsをコーディングする核酸を含む。例えば、核酸は、例えばヌクレオチド配列がSEQ ID NOs:1〜4、7〜10、又は表1〜3(SEQ ID NOs: 17−49)と表8〜10(SEQ ID NOs: 98〜128)に開示した任意のヌクレオチド配列との同一性が少なくとも60%(例えば、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%)又は100%であるsiRNAをコーディングすることができる。一部の実施例において、核酸がコーディングしたsiRNAは、SEQ ID NO: 2との同一性が少なくとも60%(例えば、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%)であるアンチセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸がコーディングしたsiRNAは、SEQ ID NO: 2に示すヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸はSEQ ID NO: 6の36〜54位を有するヌクレオチドを含むことができる。一部の実施例において、核酸はSEQ ID NO: 6に示すヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸がコーディングしたsiRNAは、SEQ ID NO: 1との同一性が少なくとも60%(例えば、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%)であるセンス配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸がコーディングしたsiRNAはSEQ ID NO: 1に示すヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施例において、核酸はSEQ ID NO: 5の10〜28位ヌクレオチドを有することができる。一部の実施例において、核酸はSEQ ID NO: 5を含むことができる。
本開示はさらに、1種類又は複種類の上述したsiRNAsを含む薬物組成物に係わっている。一部の実施例において、薬物組成物はsiRNAと選択できる1種類の製薬的に許容されるベクター、希釈剤又は賦形剤を含むことができる。一部の実施例において、siRNAはADAMTS−5の発現を抑制できる。他の実施例において、siRNAはADAM17の発現を抑制できる。特定の実施例において、前記薬物組成物は一つ又は複数の第1核酸を標的とするsiRNAと、一つ又は複数の第2核酸を標的とするsiRNAとを含む。例えば、前記薬物組成物はADAMTS−5の発現を抑制するsiRNAと、ADAM17の発現を抑制するsiRNAとを含むことができる。一部の実施例において、薬物組成物はADAMTS−5又はADAM17の発現を抑制するsiRNAと、1種類の他の遺伝子を標的とするsiRNAとを含むことができる。他の実施例において、化学組成物は二つ又は複数の同一の標的核酸の異なる領域を標的とするsiRNAsを含むことができる。例えば、薬物組成物は二つ又は複数のADAMTS−5 mRNAの異なる領域を標的とするsiRNAsを含むことができる。一部の実施例において、薬物組成物は二つ又は複数のADAM17 mRNAの異なる領域を標的とするsiRNAを含むことができる。2種類又は複種類の異なるsiRNAsを組み合わせて使用する時、siRNAsのモルが同じであることができる。2種類又は複種を組み合せしたsiRNAsを同時に使用することができれば、順序に使用することもできる。
開示した一態様において調整方法を提供し、例えばADAMTS−5又はADAM17の体外発現を、例えば溶液又は無細胞系(例えば、再構築系又は細胞溶解物)において、又は、体外培養した細胞(例えば、ADAMTS−5又はADAM17を発現した細胞)又は被験者の体内細胞のような細胞において抑制する。一部の実施例において、前記方法は、細胞を有効量のsiRNA、siRNAをコーディングする核酸、又はsiRNAを含む薬物組成物と接触させて、細胞中のADAMTS−5又はADAM17の発現を抑制することを含む。開示した他の態様において調整方法を提供し、例えば炎症性因子の発現を、例えば溶液又は無細胞系(例えば、再構築系又は細胞溶解物)のような試験管内において、又は体外培養した細胞(例えば、発現ADAMTS−5又はADAM17の細胞)又は被験者の体内細胞において抑制する方法を提供する。一部の実施例において、前記方法は、細胞を有効量のsiRNA、siRNAをコーディングする核酸、又はsiRNAを含む薬物組成物と接触させて、細胞中の炎症性因子の発現を抑制することを含む。一部の実施例において、炎症性因子は、TNF、COX−2、IL−1βから選ばれるものであることができる。
他の部分は、上述したいずれかのsiRNAs及び/又は方法を使用したキットを含む。一部の実施例において、キットは、1種類又は複種類のsiRNA(s)と、例えば細胞を有効量のsiRNA(s)に接触させることでADAMTS−5又はADAM17の発現を抑制することを説明したり又は被験者に治療有効量のsiRNA(s)を適用してADAMTS−5又はADAM17に関連する疾患を治療又は予防することを説明したその使用説明を含む。一部の実施例において、読み取り可能な媒体に記録されていると説明した。一部の実施例において、炎症が発生した箇所に前記siRNAs、siRNAをコーディングする核酸、又は薬物組成物を適用可能であると説明した。
生物情報学技術、例えばBLAST(登録商標)を利用して、ADAMTS−5を標的とするsiRNAsを設計した。ヒトソースADAMTS−5のmRNA配列(登録番号:NM_007038.3、SEQ ID NO: 191)、ラットソースADAMTS−5の mRNA配列(登録番号:NM_198761.1、SEQ ID NO: 192)、マウスソースADAMTS−5の mRNA配列(登録番号:No. NM_011782、SEQ ID NO: 193)を使用する。選択したいずれのsiRNAが標的ADAMTS−5に対して特異性を有することを確保するため、即ち、選択した配列がターゲットの遺伝子のみを標的とし、他の遺伝子を標的とすることがないように、BLAST(登録商標)で配列のホモロジー解析を行って、潜在的な標的mRNAと一部配列ホモロジーを有する多くの遺伝子中の配列差異が最も大きい配列のみを選択する。選別した8個のADAMTS−5の発現を抑制できるsiRNAsは、siRNA−RB−01、siRNA−RB−02、siRNA−RB−03、siRNA−RB−04、siRNA−RB−05、siRNA−RB−06、siRNA−RB−07、siRNA−RB−08である。8個の配列の全てが同時にヒト、ラット、マウスの三つの物の中のADAMTS−5を標的とすることができる。
5'−O−(4、4'−ジメトキシトリチル)−2'−O−t−ブチルジメチルシリル−3'−O−(2−シアノエチル−N、N−ジイソプロピル)RNA、2'−デオキシ−DNAフォスフォラミダイト、2'−O−メチルフォスフォラミダイト、6−N−ベンゾイルアデノシンのモノマー(A−Bz)、4−N−アセチルシチジン(C−Ac)、2−N−イソブチリル−グアノシン(G−iBu)、ウリジン(U)はProligoから購入した。2’−デオキシ−2’−フルオロフォスフォラミダイト、5−メチル−2’−デオキシシチジン、Cy5蛍光修飾のフォスフォラミダイトはThermo Fisherから購入した。2’−O−TBDMS−イノシン、コレステロールフォスフォラミダイト、ベンゾジチオール−3−オン−1,1−二酸化物(Beaucage試薬)、チオール基修飾のC6 S−S及びCPG固体支持体はChemgenesから購入した。環状ペプチドシクロ[Arg−Gly−Asp−D−Phe−Lys(PEG−MAL)](cRGD)はInternational Incから購入した。ロックド核酸、開環核酸及びガラクトース修飾のフォスフォラミダイトは、中国科学院広州生物医薬と健康研究院により提供した。他の溶剤又は試薬はAladdin Reagentsから購入した。
実験を、標的無し(No target)対照組(NTC)と、陰性対照組(NC)と、siRNA−RB−01〜siRNA−RB−08の8つの実験組との10組に分けて行った。
センス鎖:5’−AGAUCGUUAGUUAGGUUGCdTdT−3’(SEQ ID NO: 175);
アンチセンス鎖:5’−GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT−3’(SEQ ID NO: 176)。
24hトランスフェクションした後、各組のhFLS細胞を収集し、1000rpmで5分遠心処理し、上清液を除去した。Trizol(登録商標)でRNAを抽出した後、各組のRNAをcDNAに逆転写した。cDNAをモデルとし、以下のFとRをプライマーとし、β−actinを参照遺伝子としてqPCRを行った。
F: 5’−CTGCTCCCAGAAACAACG−3’(SEQ ID NO: 177)
R: 5’−ATTCAGTGCCATCGGTCA−3’(SEQ ID NO: 178)
siRNA−RB−04実験組、NTC組、NC組のhFLS細胞を取ってWesternブロットを行った。細胞培養液を除去し、PBSで細胞を2回洗浄し、PBSを捨て、その後、適切な量の予備冷却された2×溶解緩衝液(Lysis Buffer)を加入し、セルスクレーパーで細胞を掻き取って氷上で30min孵化し、そして、サンプルを4℃に放置し、12000g、15min遠心処理して、上清液を取って、Bradford法でタンパク質濃度を測定し、最後に、サンプルタンパク質の最終濃度を2μg/μlに調整して、−80℃に保存した。それぞれ12μgの総タンパク質量サンプルを取って、同体積の2Xローディング緩衝液(loading buffer)を加入し、両方を充分且つ均一に混合した後、沸騰水浴で10分孵化した後、4℃に放置する。10%SDS−PAGE分離ゲルと5%濃縮ゲルを利用して、タンパク質を分離させた。電気泳動を終了した後、4℃、400mA定電流条件で、2時間電力トレーディングし、タンパク質をPVDF膜に転移した。
濃度がそれぞれ0.01nM、0.5nM、2.5nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nMであるsiRNA−RB−04をトランスフェクションしたhFLS細胞にIC50検出を行った(対照組に比べ、ADAMTS−5 mRNA発現を50%抑制したsiRNAの濃度)。IC50値をソフトウェアOrigin 8.0で計算した結果、siRNA−RB−04のIC50は12.6nMで、ADAMTS−5 mRNAの発現レベルはsiRNAの使用量に依存し、上記濃度において、発現レベルはそれぞれ16%、19%、36%、39%、41%、63%、73%、74%低下された。
センス鎖:5’−AGAUCGUUAGUUAGGUUGCdTdT−3’(SEQ ID NO: 175)
アンチセンス鎖:5’−GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT−3’(SEQ ID NO: 176)
センス鎖:5’−AGAUCGUUAGUUAGGUUGCdTdT−3’(SEQ ID NO: 175)
アンチセンス鎖:5’−GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT−3’(SEQ ID NO: 176)
TNF−F:5’−CGAGTGACAAGCCTGTAGCC−3’(SEQ ID NO: 179)
TNF−R:5’−TGAAGAGGACCTGGGAGTAGAT−3’(SEQ ID NO: 180)
Cox2−F:5’−CAGGGTTGCTGGTGGTAGGA−3’(SEQ ID NO: 181)
Cox2−R:5’−GCATAAAGCGTTTGCGGTAC−3’(SEQ ID NO: 182)
IL−Iβ −F:5’−ACGAATCTCCGACCACCA−3’(SEQ ID NO: 183)
IL−Iβ −R:5’−GGACCAGACATCACCAAGC−3’(SEQ ID NO: 184)
hFLS−No target(NTC+)対照組:IL−1α処理したhFLS−NTC組。
hFLS−No target(NTC−)対照組:IL−1α処理していないhFLS−NTC組。
293T−No target(NTC+)対照組:IL−1α処理した293T−NTC組。
293T−No target(NTC)対照組:IL−1α処理していないの293T−NTC組。
センス鎖:5’−AGAUCGUUAGUUAGGUUGCdTdT−3’(SEQ ID NO: 175)
アンチセンス鎖:5’−GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT−3’(SEQ ID NO: 176)
生物情報学技術を利用して、例えばBLAST(登録商標)に基づいて、ADAM17を標的とするsiRNAsを設計した。設計中にヒトソースADAM17のmRNA配列(登録番号:NM_003183、SEQ ID NO: 194))、ラットソースADAM17の mRNA配列(登録番号:NM_020306、SEQ ID NO: 195)、マウスソースADAM17の mRNA配列(登録番号:NM_001277266、SEQ ID NO: 196;NM_001291871、SEQ ID NO: 197;NM_009615、SEQ ID NO: 198)を使用した。ADAM17を標的とするsiRNAsの特異性は実施例1の方法で確認した。選別した8個のADAM17の発現を抑制できるsiRNAsは、siRNA−AD−01、siRNA−AD−02、siRNA−AD−03、siRNA−AD−04、siRNA−AD−05、s iRNA−AD−06、siRNA−AD−07、siRNA−AD−08である。
ADAM17を標的とするsiRNAsの合成は実施例1と同じである。
実験を、標的無し対照組(NTC)と、陰性対照組(NC)と、siRNA−AD−01〜siRNA−AD−08の八つの実験組との10組に分けて行った。
センス鎖:5’−AGUAUGCCACAUAAGCAUCdTdT−3’(SEQ ID NO: 185);
アンチセンス鎖:5’−GAUGCUUAUGUGGCAUACUdTdT−3’(SEQ ID NO: 186)
24hトランスフェクションした後、各組のhFLS細胞を収集し、1000rpmで5分遠心処理し、上清液を除去した。Trizol(登録商標)法で各組のRNAを抽出した後、RNAをcDNAに逆転写した。cDNAをモデルとし、以下のADAM17−F1とADAM17−R1をプライマーとし、β−actinを参照遺伝子としてqPCR検出を行った。
ADAM17−F1:5’−GGACCAGGGAGGGAAATA−3’(SEQ ID NO: 187)
ADAM17−R1:3’−TTGCTGTGGACGACGTTG−5’(SEQ ID NO: 188)
siRNA−AD−08 センス鎖:5’−GCAUCAUGUAUCUGAACAA−3’ (SEQ ID NO: 7);
siRNA−AD−08アンチセンス鎖:5’−UUGUUCAGAUACAUGAUGC−3’ (SEQ ID NO: 8)である。
siRNA−AD−08実験組、NTC組、NC組のhFLS細胞を取ってWesternブロットを行った。細胞培養液を除去し、PBSで細胞を2回洗浄し、PBSを捨て、その後、適切な量の予備冷却された2×溶解緩衝液を加入した。その後、セルスクレーパーで細胞を掻き取って氷上で30min孵化し、そして、4℃に放置し、12000g、15min遠心処理して、上清液を取って、Bradford法でタンパク質濃度を測定し、最後に、サンプルタンパク質の最終濃度を2μg/μlに調整して、−80℃に保存した。それぞれ12μgの総タンパク質量サンプルを取って、同体積の2Xローディング緩衝液を加入した。両方を充分且つ均一に混合した後、沸騰したお湯で10分煮て、4℃に放置する。10%SDS−PAGE分離ゲルと5%濃縮ゲルを利用して、タンパク質を電気泳動分離させた。電気泳動を終了した後、4℃、400mA定電流条件で、2時間電力トレーディングし、タンパク質をPVDF膜に転移した。
濃度がそれぞれ0.01nM、0.1nM、0.5nM、2.5nM、25nM、50nM、100nMであるsiRNA−AD−08をトランスフェクションしたhFLS細胞にIC50検出を行った(対照組に比べ、ADAM17 mRNAを50%抑制したsiRNAの濃度)。IC50値をソフトウェアOrigin 8.0で計算した結果、siRNA−AD−08のIC50は0.25nMで、ADAM17 mRNAの発現レベルがそれぞれ26%、39%、77%、84%、87%、89%、91%低下された。
センス鎖:5’−AGUAUGCCACAUAAGCAUCdTdT−3’(SEQ ID NO: 185)
アンチセンス鎖:5’−GAUGCUUAUGUGGCAUACUdTdT−3’(SEQ ID NO: 186)
センス鎖:5’−AGUAUGCCACAUAAGCAUCdTdT−3’(SEQ ID NO: 185)
アンチセンス鎖:5’−GAUGCUUAUGUGGCAUACUdTdT−3’(SEQ ID NO: 186)
hFLS−標的無し(NTC+)対照組:IL−1α処理したhFLS−NTC組。
hFLS−標的無し(NTC−)対照組:IL−1α処理していないhFLS−NTC組。
MCF7−標的無し(NTC+)対照組:IL−1α処理したMCF7−NTC組。
MCF7−標的無し(NTC−)対照組:IL−1α処理していないMCF7−NTC組。
センス鎖:5’−AGUAUGCCACAUAAGCAUCdTdT−3’(SEQ ID NO: 185)
アンチセンス鎖:5’−GAUGCUUAUGUGGCAUACUdTdT−3’(SEQ ID NO: 186)
センス鎖:5’−UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT−3’(SEQ ID NO: 189);
アンチセンス鎖:5’−ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT−3’(SEQ ID NO: 190)。
5'−O−(4、4'−ジメトキシトリチル)−2'−O−t−ブチルジメチルシリル−3'−O−(2−シアノエチル−N、N−ジイソプロピル)RNA、2'−デオキシ−DNAフォスフォラミダイト、2'−O−メチルフォスフォラミダイト、6−N−ベンゾイルアデノシンのモノマー(A−Bz)、4−N−アセチルシチジン(C−Ac)、2−N−イソブチリル−グアノシン(G−iBu)、ウリジン(U)はProligoから購入した。2’−デオキシ−2’−フルオロフォスフォラミダイト、5−メチル−2’−デオキシシチジン、Cy5蛍光修飾のフォスフォラミダイトはThermo Fisherから購入した。2’−O−TBDMS−イノシン、コレステロールフォスフォラミダイト、ベンゾジチオール−3−オン−1,1−二酸化物(CAS番号:66304−01−6)(Beaucage試薬)、チオール基修飾のC6 S−S及びCPG固体支持体はChemgenesから購入した。環状ペプチドシクロ[Arg−Gly−Asp−D−Phe−Lys(PEG−MAL)](cRGD)はInternational Incから購入した。ロックド核酸、開環核酸及びガラクトース修飾のフォスフォラミダイトは、中国科学院広州生物医薬と健康研究院により提供した。他の溶剤又は試薬はAladdin Reagentsから購入した。
Claims (66)
- SEQ ID NO: 1と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、SEQ ID NO: 2と少なくとも60%の同一性を有し前記センス鎖と相互補完するヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、を含むADAMTS−5を標的とする二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 1と少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 2と少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む請求項1に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 1と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 2と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む請求項1に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 1と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 2と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む請求項1に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 1と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 2を含む請求項1に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 1を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 2と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む請求項1に記載の二重鎖siRNA。
- 少なくとも11個の連続するヌクレオチドを有し且つSEQ ID NO: 1と差異が8個のヌクレオチドを超えない配列を含むセンス鎖と、少なくとも11個の連続するヌクレオチドを有し且つSEQ ID NO: 2と差異が8個のヌクレオチドを超えない配列を含み、前記センス鎖と相互補完するアンチセンス鎖と、を含むADAMTS−5を標的とする二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖が少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有し且つSEQ ID NO: 1と差異が4個のヌクレオチドを超えない配列を含み、前記アンチセンス鎖が少なくとも15個の連続して同一なヌクレオチドを有し且つSEQ ID NO: 2と差異が4個のヌクレオチドを超えない配列を含む請求項7に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 1に示すヌクレオチド配列又は表1と表3から選ばれたセンス配列を含む請求項1乃至8の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 2に示すヌクレオチド配列又は表2と表3から選ばれたセンス配列を含む請求項1乃至8の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 1に示すヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 2に示すヌクレオチド配列を含む請求項1乃至10の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖とアンチセンス鎖の中の少なくとも一つがさらに、鎖の少なくとも一端に、少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを含む請求項1乃至11の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖とアンチセンス鎖の中の少なくとも一つがさらに、鎖の3’末端に二つのヌクレオチドオーバーハングを含む請求項12に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 3に示すヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 4に示すヌクレオチド配列を含む請求項13に記載の二重鎖siRNA。
- 前記siRNAの少なくとも1本鎖が、末端修飾、塩基修飾、糖修飾及び骨格修飾から選ばれた少なくとも1種類の化学修飾を含む請求項1乃至14の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記siRNAの少なくとも1本鎖が、
a)リン酸骨格のホスホロチオエート修飾、
b)リボース又はデオキシリボースの2’−O−メチル修飾、
c)リボース又はデオキシリボースの2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾、
d)ロックド核酸(LNA)修飾、
e)開環核酸修飾、
f)インドール修飾、
g)塩基の5−メチルシトシン修飾、
h)塩基の5−エチニルウラシル修飾、
i)末端ヌクレオチドのコレステロール又はその誘導体修飾、
j)末端ヌクレオチドのガラクトース修飾、
k)末端ヌクレオチドのポリペプチド修飾、
l)リン酸化修飾、
m)末端ヌクレオチドの蛍光標記修飾、
n)末端ヌクレオチドのビオチン修飾
から選ばれた少なくとも一つの化学修飾を含む請求項15に記載の二重鎖siRNA。 - 前記センス鎖がヌクレオチド配列5’−K−LLMUUUAUGUGGGCAUPMQdTdT−3’(SEQ ID NO: 13)を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド配列5’−R−MQLAUGCCCACAUAAAQPPdTdT−3’(SEQ ID NO: 14)を含む請求項16に記載の二重鎖siRNA。
(ここで、Kは、5’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロール基であることができ、
Rは5’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
dTはチミンデオキシリボヌクレオチドで、
Lは未修飾又は2’−O−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Mは未修飾又は2’−O−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Pは未修飾又は2’−O−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Qは未修飾又は2’−O−メチル修飾のウラシルリボースヌクレオチドであって、
L、M、P及びQの中の少なくとも一つがチオリン酸骨格を有する。) - 前記センス鎖が表7から選ばれたセンス配列を含み、前記アンチセンス鎖が表7から選ばれたアンチセンス配列を含む請求項15乃至17の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記アンチセンス鎖はADAMTS−5 mRNAと交雑し、前記センス鎖は前記アンチセンス鎖と交雑する請求項1乃至18の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- SEQ ID NO: 7と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含むセンス鎖と、SEQ ID NO: 8と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖と相互補完するアンチセンス鎖と、を含むADAM17を標的とする二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 7と少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 8と少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む請求項20に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 7と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 8と少なくとも80%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む請求項20に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 7と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 8と少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む請求項20に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 7と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 8に示すヌクレオチド配列を含む請求項20に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 7に示すヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 8と少なくとも60%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む請求項20に記載の二重鎖siRNA。
- 少なくとも11個の連続するヌクレオチドを有し且つSEQ ID NO: 7と差異が8個のヌクレオチドを超えない配列を含むセンス鎖と、少なくとも11個の連続するヌクレオチドを有し且つSEQ ID NO: 8と差異が8個のヌクレオチドを超えない配列を含み、前記センス鎖と相互補完するアンチセンス鎖と、を含むADAM17を標的とする二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖が少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有し且つSEQ ID NO: 7と差異が4個のヌクレオチドを超えない配列を含み、前記アンチセンス鎖が少なくとも15個の連続するヌクレオチドを有し且つSEQ ID NO: 8と差異が4個のヌクレオチドを超えない配列を含む請求項26に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 7に示すヌクレオチド配列又は表8と表10から選ばれたセンス配列を含む請求項20乃至27の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 8に示すヌクレオチド配列又は表9と表10から選ばれたセンス配列を含む請求項20乃至27の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 7に示すヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 8に示すヌクレオチド配列を含む請求項20乃至29の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖とアンチセンス鎖の中の少なくとも一つが、鎖の少なくとも一端に、少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを含む請求項20乃至30の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖とアンチセンス鎖の中の少なくとも一つが、鎖の3’−末端に二つのヌクレオチドオーバーハングを含む請求項31に記載の二重鎖siRNA。
- 前記センス鎖がSEQ ID NO: 9に示すヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖がSEQ ID NO: 10に示すヌクレオチド配列を含む請求項32に記載の二重鎖siRNA。
- 前記siRNAの少なくとも1本鎖が、末端修飾、塩基修飾、糖修飾及び骨格修飾から選ばれた少なくとも1種類の化学修飾を含む請求項20乃至33の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記siRNAの少なくとも1本鎖が、
a)リン酸骨格のホスホロチオエート修飾、
b)リボース又はデオキシリボースの2’−O−メチル修飾、
c)リボース又はデオキシリボースの2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾、
d)ロックド核酸(LNA)修飾、
e)開環核酸修飾、
f)インドール修飾、
g)塩基の5’−メチルシトシン修飾、
h)塩基の5’−エチニルウラシル修飾、
i)末端ヌクレオチドのコレステロール又はその誘導体修飾、
j)末端ヌクレオチドのガラクトース修飾、
k)末端ヌクレオチドのポリペプチド修飾、
l)リン酸化修飾、
m)末端ヌクレオチドの蛍光標記修飾、
n)末端ヌクレオチドのビオチン修飾
から選らばれた少なくとも1種類の化学修飾を含む請求項34に記載の二重鎖siRNA。 - 前記センス鎖がヌクレオチド配列5’−K’−L’P’M’UCAUGUAUCUGAAP’Μ’M’dTdT−3’(SEQ ID NO: 15)を含み、アンチセンス鎖がヌクレオチド配列5’−R’−Q’Q’L’UUCAGAUACAUGAQ’L’ P’dTdT−3’(SEQ ID NO: 16)を含む請求項35に記載の二重鎖siRNA。
(ここで、
K’は5’−末端ヌクレオチドに接続されたコレステロールであることができ、
R’は5’−末端ヌクレオチドのリン酸化修飾であることができ、
dTはチミンデオキシリボースヌクレオチドであって、
L’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のグアニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
M’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のアデニンデオキシリボースヌクレオチドであって、
P’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のシトシンデオキシリボースヌクレオチドであって、
Q’は未修飾又は2’−O−メチル修飾のウラシルリボースヌクレオチドであって、
L’、M、’P’及びQ’の中の少なくとも一つはチオリン酸骨格を有する。) - 前記センス鎖が表13から選ばれたセンス配列を含み、前記アンチセンス鎖が表13から選ばれたアンチセンス配列を含む請求項34乃至36の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 前記アンチセンス鎖がADAM17 mRNAと交雑し、前記センス鎖が前記アンチセンス鎖と交雑する請求項20乃至37の中のいずれかに記載の二重鎖siRNA。
- 請求項1乃至38の中のいずれかに記載のsiRNAをコーディングする核酸。
- DNA分子である請求項39に記載の核酸。
- 前記DNA分子がSEQ ID NO: 6の第36〜54位ヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列を含む請求項40に記載の核酸。
- 前記DNA分子がSEQ ID NO: 6に示すヌクレオチド配列を含む請求項41に記載の核酸。
- 前記DNA分子がSEQ ID NO: 11の第38〜56位ヌクレオチドを含有するヌクレオチド配列を含む請求項40に記載の核酸。
- 前記DNA分子がSEQ ID NO: 11に示すヌクレオチド配列を含む請求項43に記載の核酸。
- 請求項39乃至44の中のいずれかに記載の核酸を含む宿主細胞。
- 請求項1乃至38の中のいずれかに記載のsiRNA又は請求項39乃至44の中のいずれかに記載の核酸と、選択可能な1種類の製薬的に許容されるベクターと、を含む薬物組成物。
- 少なくとも1種類のADAMTS−5を標的とするsiRNAと、少なくとも1種類のADAM17を標的とするsiRNAとを含む請求項46に記載の薬物組成物。
- 請求項1乃至38の中のいずれかに記載のsiRNA、又は請求項39乃至44の中のいずれかに記載の核酸、又は請求項46又は47に記載の薬物組成物を含むキット。
- ADAMTS−5又はADAM17に関連する病気を予防及び/又は治療する薬剤の調製における請求項1乃至38の中のいずれかに記載のsiRNA、又は請求項39乃至44の中のいずれかに記載の核酸、又は請求項46又は47に記載の薬物組成物の応用。
- 関節線維化を抑制し、軟骨浸食を抑制し、滑膜炎を予防及び/又は治療し、又は軟骨及び/又は滑膜を保護する薬剤の調製における請求項1乃至38の中のいずれかに記載のsiRNA、又は請求項39乃至44の中のいずれかに記載の核酸、又は請求項46又は47に記載の薬物組成物の応用。
- 被験者に治療有効量の請求項1乃至38の中のいずれかに記載のsiRNA、又は請求項39乃至44の中のいずれかに記載の核酸、又は請求項46又は47に記載の薬物組成物を適用すること含む被験者においてADAMTS−5又はADAM17に関連する病気を予防及び/又は治療する方法。
- 被験者に治療有効量の請求項1乃至38の中のいずれかに記載のsiRNA、又は請求項39乃至44の中のいずれかに記載の核酸、又は請求項46又は47に記載の薬物組成物を適用することを含む被験者において関節線維化を抑制し、軟骨浸食を抑制し、滑膜炎を予防及び/又は治療し、又は軟骨及び/又は滑膜を保護する方法。
- 前記被験者がADAMTS−5又はADAM17に関連する病気にかかっているか又はその病気にかかるリスクがある請求項52に記載の方法。
- 前記適用が関節又は関節内注射を含む請求項51乃至53の中のいずれかに記載の方法。
- 前記適用が被験者の関節腔へ治療有効量のsiRNA、核酸又は薬物組成物を注射することを含む請求項51乃至53の中のいずれかに記載の方法。
- 前記ADAMTS−5又はADAM17に関連する疾患が炎症に関連する疾患である請求項49又は50に記載の応用又は請求項51乃至53の中のいずれかに記載の方法。
- 前記炎症に関連する疾患が関節炎である請求項56に記載の応用又は方法。
- 前記炎症に関連する疾患が変形性関節症である請求項57に記載の応用又は方法。
- 前記炎症に関連する疾患がリウマチ性関節炎である請求項57に記載の応用又は方法。
- 前記被験者がヒトである請求項51乃至59の中のいずれかに記載の方法。
- 細胞を有効量の請求項1乃至38の中のいずれかに記載のsiRNAに接触させて、前記細胞におけるADAMTS−5又はADAM17の発現を抑制することを含む細胞におけるADAMTS−5又はADAM17の発現を抑制する方法。
- 細胞を有効量の請求項1乃至38の中のいずれかに記載のsiRNAに接触させて、前記細胞における炎症性因子の発現を抑制することを含む細胞における炎症性因子発現を抑制する方法。
- 前記炎症性因子が、TNF、COX−2、IL−1βから選ばれる請求項62に記載の方法。
- 前記接触が体外又は体内操作である請求項61乃至63の中のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が哺乳類動物の細胞である請求項61乃至64の中のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞がヒトの細胞である請求項65に記載の方法。
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