ES2833028T3

ES2833028T3 - Composiciones y métodos para inhibir la expresión de ADAMTS-5 y ADAM17

Info

Publication number: ES2833028T3
Application number: ES15872041T
Authority: ES
Inventors: Bill Zhang; Xiuqun Yang
Original assignee: GUANGZHOU RIBOBIO CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU RIBOBIO CO Ltd
Priority date: 2014-12-25
Filing date: 2015-12-23
Publication date: 2021-06-14
Anticipated expiration: 2035-12-23
Also published as: DK3237619T3; JP6706628B2; US10709729B2; EP3237619A4; JP2018506991A; WO2016103042A8; EP3237619B8; EP3237619B1; EP3237619A1; WO2016103042A1; US20180250323A1

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende al menos un ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 y al menos un ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde la hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 5 comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, y la hebra antisentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 2, y en donde la hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17 comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 7, y la hebra antisentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17 comprende una secuencia de nucleótidos que tiene un al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 8.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para inhibir la expresión de ADAMTS-5 y ADAM17

La invención se refiere a ARN de interferencia pequeño (ARNip), al uso de ARNip en ARN de interferencia (ARNi) para inhibir la expresión de ADAMTS-5 y ADAM17, y al uso de ARNip para tratar afecciones patológicas regulando negativamente ADAMTS-5 y ADAM17. Las afecciones patológicas pueden incluir artritis, tal como, por ejemplo, artrosis (OA, por sus siglas en inglés) y artritis reumatoide (AR).

La OA es una enfermedad crónica caracterizada por degeneración de huesos y articulaciones. Al imponer graves peligros para la salud humana, la OA carece actualmente de un tratamiento eficaz. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos métodos para prevenir y/o tratar la OA de manera eficaz. Las características clínicas y patológicas de la artritis incluyen daño del cartílago resultante de la proteólisis de la matriz extracelular (MEC). La degradación de la MEC del cartílago causada por el aumento de la actividad proteolítica actúa como una causa directa de la degeneración del cartílago, que lleva en última instancia a daños en el cartílago. La interleucina-1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral a (TNF-a) tienen una implicación funcional significativa en el catabolismo de las células hFLS y la degradación de la MEC. Los estudios han demostrado la presencia de IL-1 y TNF-a en concentraciones elevadas en el líquido sinovial de los pacientes con artritis. Estas proteínas se consideran citocinas proinflamatorias clave, que desempeñan un papel importante en la patogenia de la artritis.

Una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina (ADAMTS) es una familia de metaloendopeptidasas de zinc asociadas a la matriz multidominio secretadas que tienen diversas funciones en el desarrollo embrionario, la angiogénesis, la coagulación y la inflamación. Con 19 miembros, la familia utiliza una variedad de componentes de la MEC como sustratos. La familia ADAMTS comparte un alto grado de similitud estructural de proteínas. Por ejemplo, los miembros contienen un dominio de proproteína que sigue a una secuencia de péptido señal N-terminal y experimentan una escisión postraduccional para convertirse en proteasas activas. Además, las proteasas incluyen en el C-terminal al menos un motivo de repetición conservativo similar a TSP1, que media la unión de las proteasas con la MEC.

ADAMTS-5 cataliza la degradación del agrecano como un tipo de agrecanasas o proteoglicanasas. Existen dos sitios principales de escisión en agrecano: un sitio de escisión de metaloproteinasa de matriz (MMP) ubicado en Asn341 y Phe342, y un sitio de escisión de agrecanasa ubicado en Glu373 y Ala374. El agrecano abundante presente en el cartílago articular ayuda a mejorar la tensión y la fuerza anti-presión en las articulaciones. Se ha descubierto daño severo del agrecano en pacientes con OA y a R. Por lo tanto, las agrecanasas se han convertido en un nuevo objetivo para el tratamiento de la artritis y otras enfermedades. Por ejemplo, en glioma maligno, el nivel de expresión de ADAMTS-5 aumenta significativamente, lo que lleva a la invasión de gliomas y metástasis como resultado de la degradación del agrecano. Además, la degradación o el daño de las proteínas extracelulares pueden causar enfermedades tales como cáncer, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, ateroesclerosis, degeneración macular relacionada con la edad, infarto de miocardio, hepatitis, tendinitis, angiogénesis, esclerosis múltiple, glomerulonefritis, osteopenia y enfermedades periodontales.

ADAM17 pertenece a la familia de desintegrina A y metaloproteasa (ADAM). Como clase de glicoproteínas de la superficie celular, la familia ADAM juega un papel en una variedad de procesos fisiológicos y patológicos, tal como la adhesión célula-célula y célula-matriz, la fusión celular, la degradación de la MEC, la transducción de señales y la formación, el crecimiento y la metástasis de tumores, ADAM17 también se conoce como enzima convertidora de TNF-a (TACE), que produce TNF-a libre mediante la liberación de TNF-a unido a la membrana. El TNF-a libre a su vez provoca una secreción excesiva de citocinas inflamatorias, apoptosis celular y trastornos de la señalización intracelular, lo que lleva a una variedad de enfermedades, incluyendo AR, lupus eritematoso sistémico (LES), esclerosis múltiple, enfermedades infecciosas agudas, asma, dermatitis atópica y psoriasis. Además de TNF-a, ADAM17 también regula un factor estimulante de colonias de macrófagos o quimiocina, fractalquina (FKN). Como resultado, los inhibidores de ADAM17 se consideran posibles candidatos para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación. Desafortunadamente, estudios previos han demostrado que los inhibidores de ADAM de amplio espectro poseen toxicidad tisular. Por lo tanto, sigue existiendo un desafío para desarrollar inhibidores de moléculas pequeñas altamente selectivos de la familia de las ADAM conservadas.

En 1998, Craig Mello y Andrew Farr descubrieron el silenciamiento de genes. Posteriormente, Tuschl y sus colegas descubrieron que los ARNip sintetizados químicamente de 19 a 25 pb pueden silenciar de manera específica y eficaz los ARNm diana en células de mamíferos. Desde entonces, el ARNip se ha utilizado ampliamente para el estudio de la función genética y el tratamiento de enfermedades.

Song et al., (2007) Arthritis & Rheumatism 56(2): 575-585 desvela ARNip dirigido contra ADAMTS-5.

Shojio et al., (2009) Arthritis Research and Therapy 11(6): R166 desvela ARNip dirigido contra ADAM-TS5.

Chu et al., (2013) International Journal of Molecular Medicine 31(5): 1222-1228 desvela ARNip dirigido contra ADAM-TS5.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica y una composición farmacéutica para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad relacionada con la inflamación tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Se desvela un ARNip de cadena doble dirigido contra ADAMTS-5 que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido complementaria. En algunas realizaciones, la hebra antisentido puede hibridar con un ARNm de ADAMTS-5, y la hebra sentido puede hibridar con la hebra antisentido.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 y al menos un ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17 y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable. La hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad con 5'-GGAUUUAUGUGGGCAUCAU-3' (SEQ ID NO: 1), y la hebra antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad con 5'-Au GAu GCCCACAUAAAUCC-3' (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, y la hebra antisentido puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 1, y la hebra antisentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, y la hebra antisentido puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 2.

En diversas realizaciones, la hebra sentido puede comprender al menos 11 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 8 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, y la hebra antisentido puede comprender al menos 11 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 8 nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender al menos 15 nucleótidos contiguos que se diferencian en no más de 4 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1; en donde la hebra antisentido puede comprender al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 4 nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 o una secuencia sentido elegida de las Tablas 1 y 3. En algunas realizaciones, la hebra antisentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o una secuencia antisentido elegida de las Tablas 2 y 3. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, y la hebra antisentido puede comprender el nucleótido de la SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, al menos una de las hebras sentido y antisentido puede comprender además al menos un nucleótido que sobresalga de al menos un extremo de la hebra. En algunas realizaciones, al menos una de las hebras sentido y antisentido puede comprender además dos protuberancias de nucleótidos en el extremo 3' de la hebra. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de 5'-GGAUUUAUGUGGGCAUCAUdTdT-3' (SEQ ID NO: 3); y la molécula de hebra antisentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de 5'-AUGAUGCCCACAUAAAUCCdTdT-3' (SEQ ID NO: 4).

En realizaciones adicionales, al menos una hebra del ARNip puede comprender al menos una modificación química elegida entre modificaciones de extremo, modificaciones de base, modificaciones de azúcar y modificaciones de la estructura principal. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender al menos una modificación química elegida entre:

(a) una modificación de fosforotioato en la cadena principal de fosfato;

(b) modificación 2'-O-metilo en una ribosa o desoxirribosa;

(c) modificación 2'-desoxi-2'-fluoro en una ribosa o desoxirribosa;

(d) una modificación de ácido nucleico bloqueado (ANB);

(e) una modificación de ácido nucleico de bucle abierto;

(f) una modificación del indol;

(g) una modificación de 5-metilcitosina en una base;

(h) una modificación de 5-etiniluracilo en una base;

(i) un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo;

(j) un nucleótido terminal unido a una galactosa;

(k) un nucleótido terminal unido a un polipéptido;

(l) una modificación de fosforilación;

(m) un nucleótido terminal unido a un marcador fluorescente; y

(n) un nucleótido terminal unido a una molécula de biotina.

En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender la secuencia de nucleótidos 5'-K-LLMUUUAUGUGGGCAUPMQdTdT-3' (SEQ ID NO: 13), y la hebra antisentido puede comprender la secuencia de nucleótidos 5'-RMQLAUGCCCACAUAAAQPPdTdT-3' (SEQ ID NO: 14), en donde

K es un grupo de colesterol opcional unido a un nucleótido del extremo 5';

R es una modificación de fosforilación opcional en un nucleótido del extremo 5';

dT es un desoxirribonucleótido de timina;

L es un desoxirribonucleótido de guanina no modificado o modificado con 2'-O-metilo;

M es un desoxirribonucleótido de adenina no modificado o modificado con 2-O-metilo;

P es un desoxirribonucleótido de citosina no modificado o modificado con 2-O-metilo;

Q es un ribonucleótido de uracilo no modificado o modificado con 2'-O-metilo; y

opcionalmente, al menos uno de L, M, P y Q tienen una estructura principal de fosforotioato.

En algunas realizaciones, al menos uno de L, M, P y Q pueden tener una estructura principal de fosforotioato. En algunas realizaciones, todos los L, M, P, y Q pueden tener una cadena principal de fosforotioato. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender una secuencia sentido elegida de la Tabla 7, y la hebra antisentido puede comprender una secuencia antisentido elegida de la Tabla 7.

Se describe un ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17 que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido complementaria. En algunas realizaciones, la hebra antisentido puede hibridar con un ARNm de ADAM17, y la hebra sentido puede hibridar con la hebra antisentido.

En las composiciones farmacéuticas de la invención, la hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMT17 comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad con 5'-GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3' (SEQ ID NO: 7), y la hebra antisentido puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad con 5'-UUGUUCAGAUACAUGAUGC-3' (SEQ ID NO: 8). En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 7, y la hebra antisentido puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, en donde la hebra sentido puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 60% (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 7, y la hebra antisentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, y la hebra antisentido puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 60% (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 8.

En diversas realizaciones, la hebra sentido que comprende al menos 11 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 8 nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 y la hebra antisentido que comprende al menos 11 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 8 nucleótidos de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender al menos 15 nucleótidos contiguos que se diferencian en no más de 4 nucleótidos de la SEQ ID NO: 7; en donde la hebra antisentido puede comprender al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 4 nucleótidos de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la hebra con sentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7 o una secuencia con sentido elegida de las Tablas 8 y 10. En algunas realizaciones, la hebra antisentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8 o una secuencia antisentido elegida de las Tablas 9 y 10. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, y la hebra antisentido puede comprender el nucleótido de la SEQ ID NO: 8.

En algunas realizaciones, al menos una de las hebras sentido y antisentido puede comprender además al menos un nucleótido que sobresalga de al menos un extremo de o antisentido puede comprender la secuencia de nucleótidos de 5'-UUGUUCAGAUACAUGAUGCdTdT-3' (SEQ ID NO: 10).

(a) una modificación de fosforotioato en la cadena principal de fosfato;

(b) modificación 2'-O-metilo en una ribosa o desoxirribosa;

(c) modificación 2'-desoxi-2'-fluoro en una ribosa o desoxirribosa;

(d) una modificación de ácido nucleico bloqueado (ANB);

(e) una modificación de ácido nucleico de bucle abierto;

(f) una modificación del indol;

(g) una modificación de 5-metilcitosina en una base;

(h) una modificación de 5-etiniluracilo en una base;

(i) un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo;

(j) un nucleótido terminal unido a una galactosa;

(k) un nucleótido terminal unido a un polipéptido;

(l) una modificación de fosforilación;

(m) un nucleótido terminal unido a un marcador fluorescente; y

(n) un nucleótido terminal unido a una molécula de biotina.

En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender la secuencia de nucleótidos 5'-K'-L'P'M'UCAUGUAUCUGAAP'M'M'dTdT-3' (SEQ ID NO: 15), y la hebra antisentido puede comprender la secuencia de nucleótidos 5'-R'-Q'Q'L'UUCAGAUACAUGAQ'L'P'dTdT-3' (SEQ ID NO: 16), en donde

K' es un grupo de colesterol opcional unido a un nucleótido del extremo 5';

R' es una modificación de fosforilación opcional en un nucleótido del extremo 5';

dT es un desoxirribonucleótido de timina;

L' es un desoxirribonucleótido de guanina no modificado o modificado con 2'-O-metilo;

M' es un desoxirribonucleótido de adenina no modificado o modificado con 2'-O-metilo;

P' es un desoxirribonucleótido de citosina no modificado o modificado con 2'-O-metilo; y

Q' es un ribonucleótido de uracilo no modificado o modificado con 2'-O-metilo; y

opcionalmente, al menos uno de L', M', P' y Q' tienen una estructura principal de fosforotioato.

En algunas realizaciones, al menos uno de L', M', P' y Q' pueden tener una estructura principal de fosforotioato. En algunas realizaciones, todos los L', M', P', y Q' pueden tener una cadena principal de fosforotioato. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender una secuencia sentido elegida de la Tabla 13, y la hebra antisentido puede comprender una secuencia antisentido elegida de la Tabla 13.

Se desvela un ácido nucleico que codifica el ARNip descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede ser una molécula de ADN. En algunas realizaciones, la molécula de ADN puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene los nucleótidos 36-54 de 5'-GATCCCCATGATGCCCACATAAATCCTTCAAGAGAGGATTT ATGTGGGCATCATTTTTT-3' (SEQ ID NO: 6). En algunas realizaciones, la molécula de ADN comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, la molécula de ADN puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene los nucleótidos 38-56 de 5'-AGCTAAAAATTGTTC AGATACATGATGCTCTCTTGAAGCATCATGTATCTGAACAAGGG-3' (SEQ ID NO: 11).En algunas realizaciones, la molécula de ADN puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11.

Se desvela una composición farmacéutica que comprende los ARNip descritos en el presente documento, o el ácido nucleico descrito en el presente documento, y opcionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede comprender al menos un ARNip dirigido contra ADAMTS-5 y al menos un ARNip dirigido contra ADAM17.

Se desvela un kit que comprende el ARNip de los descritos en el presente documento, el ácido nucleico descrito en el presente documento, o la composición farmacéutica descrita en el presente documento.

Se desvela el uso del ARNip descrito en el presente documento, el ácido nucleico descrito en el presente documento, o la composición farmacéutica descrita en el presente documento en la preparación de un medicamento para prevenir y/o tratar una enfermedad asociada a ADAMTS-5 o ADAM17. En diversas realizaciones, el uso también puede incluir la preparación de un medicamento para inhibir la fibrosis articular, inhibir la erosión del cartílago, prevenir y/o tratar la sinovitis, o proteger el cartílago y/o la membrana sinovial. La presente invención proporciona la composición farmacéutica de la invención para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad relacionada con la inflamación. En algunas realizaciones, la enfermedad relacionada con la inflamación puede ser artritis. En algunas realizaciones, la artritis es artrosis. En algunas realizaciones, la artritis puede ser artritis reumatoide. Se desvela un método para prevenir y/o tratar una enfermedad asociada a ADAMTS-5 o ADAM 17 en un sujeto, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del ARNip descrito en el presente documento, el ácido nucleico descrito en el presente documento, o la composición farmacéutica descrita en el presente documento al sujeto. En diversas realizaciones, el método también puede incluir inhibir la fibrosis articular, inhibir la erosión del cartílago, prevenir y/o tratar la sinovitis, o proteger el cartílago y/o la membrana sinovial en un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto padece o tiene riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a ADAMTS-5 o ADAM17. En algunas realizaciones, la administración puede comprender la administración que comprende una inyección articular o intraarticular. En algunas realizaciones, la administración puede comprender la inyección en una cavidad articular del sujeto. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a ADAMTS-5 o ADAM17 puede ser una enfermedad relacionada con la inflamación. En algunas realizaciones, la enfermedad relacionada con la inflamación puede ser artritis. En algunas realizaciones, la artritis puede ser artrosis. En algunas realizaciones, la artritis puede ser artritis reumatoide. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un ser humano.

Se desvela un método para inhibir la expresión de ADAMTS-5 o ADAM17 en una célula, que comprende poner en contacto una célula con los ARNip descritos en el presente documento en una cantidad eficaz para inhibir la expresión de ADAMTS-5 o ADAM17 en la célula. Se desvela un método para inhibir la expresión de una citocina inflamatoria en una célula, que comprende poner en contacto una célula con los ARNip descritos en el presente documento en una cantidad eficaz para inhibir la expresión de la citocina inflamatoria en la célula. En algunas realizaciones, la citocina inflamatoria se puede elegir de TNF, COX-2 e IL-1p. En algunas realizaciones, el contacto se puede realizar ex vivo o in vivo. En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula de mamífero. En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula humana.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra los resultados del cribado de ARNip para inhibir la expresión de ADAMTS-5.

La FIG. 2 muestra un análisis por transferencia de Western de ARNip-RB-04.

La FIG. 3 muestra que el ARNip-RB-04 reguló negativamente ciertas citocinas inflamatorias.

La FIG. 4 representa una modificación de fosforotioato que da como resultado un enlace P-S en la estructura principal de fosfato de un ARNip.

La FIG. 5 muestra que ciertas modificaciones químicas mejoraron la estabilidad de ciertos ARNip ilustrativos dirigidos contra ADAMTS-5 en el suero.

La FIG. 6A-P muestra los resultados de la biopsia de tejido de un modelo de artritis de rata tratado con ciertos ARNip ilustrativo dirigidos contra ADAMTS-5.

La FIG. 7 muestra los niveles de expresión de citocinas inflamatorias en articulaciones de rata tratadas con ciertos ARNip ilustrativos dirigidos contra AdAMTS-5.

La FIG. 8 muestra los resultados del cribado de ARNip para inhibir la expresión de ADAM17.

La FIG. 9 muestra un análisis por transferencia de Western de ARNip-AD-08.

La FIG. 10A-B muestra que el ARNip-AD-08 reguló negativamente ciertas citocinas inflamatorias.

La FIG. 11 muestra que ciertas modificaciones químicas mejoraron la estabilidad de ciertos ARNip ilustrativos que se dirigen contra ADAM17 en el suero.

La FIG. 12A-P muestra los resultados de la biopsia de tejido de un modelo de artritis de rata tratado con ciertos ARNip ilustrativo dirigidos contra ADAM17.

La FIG. 13 muestra los niveles de expresión de citocinas inflamatorias en articulaciones de rata tratadas con ciertos ARNip ilustrativos dirigidos contra ADAM17.

La FIG. 14A-B muestra los resultados de la administración a largo plazo de ciertos ARNip ilustrativos dirigidos contra ADAM-17.

La FIG. 15 muestra que una combinación de ciertos ARNip ilustrativos dirigidos contra ADAMTS-5 y ADAM-17 redujo los niveles de expresión de ciertas citocinas inflamatorias.

La FIG. 16A-B muestra los resultados de la biopsia de tejido de un modelo de artritis de rata tratado con una combinación de ciertos ARNip dirigidos contra a Da M-17 dirigidos contra ADAMTS-5 y ADAM17.

Descripción detallada

I. Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado entendido normalmente por los expertos habituales en la materia a la que pertenece la presente divulgación. Para los fines de la presente divulgación, a continuación se definen los siguientes términos.

Tal como se usa en el presente documento, los artículos "un" y "uno" se refieren a uno o más de uno (es decir al menos uno) del objeto gramatical del artículo. Por ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

El término "o" significa, y se usa indistintamente con, el término "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

En la medida en que el término "contener", "incluir", "tener", o variantes gramaticales de dicho término se utilizan en la divulgación o en las reivindicaciones, tal término puede ser inclusivo de una manera similar al término "que comprende", ya que "que comprende" se interpreta cuando se emplea como una palabra de transición en una reivindicación. El término "que incluye" o sus variantes gramaticales significan y se usan indistintamente con, la expresión "que incluye, pero sin limitación".

El término "aproximadamente" significa una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía tanto como el 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o el 1 % para una cantidad de referencia, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud. Cuando el término "aproximadamente" se utiliza junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo al extender los límites por encima y por debajo de los valores numéricos establecidos. En general, el término "aproximadamente" pretende modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor establecido por una variación del ^ 10 %.

Tal como se usa en el presente documento, "ADAMTS-5" se refiere a una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 5. El término "ADAMTS-5" incluye ADAMTS-5 humano, cuya secuencia de ARNm se puede encontrar en, por ejemplo, el n.° de referencia de GenBank NM_007038.3 (SEQ ID NO: 191); ADAMTS-5 de rata, cuya secuencia de ARNm se puede encontrar en, por ejemplo, el n.° de referencia de GenBank NM_198761.1 (SEQ ID NO: 192); ADAMTS-5 de ratón, cuya secuencia de ARNm se puede encontrar en, por ejemplo, el n.° de referencia de GenBank NM_011782 (SEQ ID NO: 193). Ejemplos adicionales de secuencias de ARNm de ADAMTS-5 están fácilmente disponibles usando, por ejemplo, GenBank.

Tal como se usa en el presente documento, "ADAM 17" se refiere a una proteína que contiene un dominio de desintegrina y metaloproteinasa 17, también conocida como enzima convertidora del factor de necrosis tumoral a (TACE). El término "ADAM 17" incluye ADAM17 humano, cuya secuencia de ARNm se puede encontrar en, por ejemplo, el n.° de referencia de GenBank NM_003183 (SEQ ID NO: 194); ADAM17 de rata, cuya secuencia de ARNm se puede encontrar en, por ejemplo, el n.° de referencia de GenBank NM_020306 (SEQ ID NO: 195); ADAM17 de ratón, cuya secuencia de ARNm se puede encontrar en, por ejemplo, el n.° de referencia de GenBank NM_001277266 (SEQ ID NO: 196), NM_001291871 (SEQ ID NO: 197) o NM_009615 (SEQ ID NO: 198). Ejemplos adicionales de secuencias de ARNm de ADAM17 están fácilmente disponibles usando, por ejemplo, GenBank.

La expresión "secuencia diana" se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARN formada durante la transcripción de un gen diana, por ejemplo, un gen ADAMTS-5 o ADAM17, incluido el ARNm producido por el procesamiento de ARN de un producto de transcripción primaria. En diversas realizaciones, la secuencia diana puede comprender 10-30 nucleótidos contiguos de un ARNm de ADAMTS-5 o ADAM17, tal como, por ejemplo, 10-25 o 15-20 nucleótidos contiguos del ARNm. En algunas realizaciones, la secuencia diana puede comprender 11, 13, 15, 17, 19, 21,23, 25 o 27 nucleótidos contiguos del ARNm. En algunas realizaciones, la secuencia diana puede comprender 19 nucleótidos contiguos del ARNm.

El término "complementario" significa que un ácido nucleico puede hibridar mediante un enlace de hidrógeno y formar una estructura de dúplex con otra secuencia de ácido nucleico en determinadas condiciones. Tales condiciones pueden incluir, por ejemplo, condiciones rigurosas. La expresión "condiciones rigurosas" para la hibridación se refieren a las condiciones en las que un ácido nucleico que tiene complementariedad con una secuencia diana hibrida predominantemente con la secuencia diana, y sustancialmente no hibrida con secuencias no diana. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y varían dependiendo de una serie de factores. Por ejemplo, cuanto más larga sea la secuencia, mayor será la temperatura a la que la secuencia puede hibridar específicamente con su secuencia diana. Los ejemplos no limitantes de condiciones rigurosas pueden incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM, pH 6,4, EDTA 1 mM, 50 °C o 70 °C durante 12-16 horas seguido de lavado. Pueden aplicarse otras condiciones, como las condiciones fisiológicamente relevantes que se pueden encontrar dentro de un organismo. El experto en la materia podrá determinar el conjunto de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación final de los nucleótidos hibridados. La hibridación puede estar mediada por emparejamiento de bases de Watson-Crick o emparejamiento de bases que no son de Watson-Crick, o emparejamiento de bases formado con nucleótidos no naturales o modificados, siempre que se cumplan los requisitos anteriores con respecto a su capacidad para hibridar. Los ejemplos de emparejamiento de bases que no son de Watson-Crick incluyen el emparejamiento de bases G:U por balanceo o Hoogstein. En determinadas realizaciones, la hibridación entre una molécula de ácido nucleico y su secuencia complementaria es suficiente para permitir que prosiga la función relevante del ácido nucleico, por ejemplo, la actividad de ARNi.

En algunas realizaciones, las dos secuencias de nucleótidos son "completamente complementarias" entre sí cuando todos los nucleótidos contiguos de la primera secuencia de nucleótidos se emparejan con el mismo número de nucleótidos contiguos de la segunda secuencia de nucleótidos. "Sustancialmente complementaria" significa que las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar uno o más pares de bases no emparejados tras la hibridación, conservando la capacidad de hibridar en las condiciones más relevantes para su aplicación final. En algunas realizaciones, las dos secuencias forman no más de 6 emparejamientos erróneos tras la hibridación. Por ejemplo, las dos secuencias pueden formar no más de 4, 3, 2 o 1 desajuste. Cuando se diseñan dos secuencias para formar uno o más salientes de nucleótidos monocatenarios tras la hibridación, dichos salientes no se considerarán desajustes para determinar la complementariedad. Por ejemplo, un oligonucleótido que tiene 19 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido que tiene 23 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 19 nucleótidos que es completamente complementaria al oligonucleótido más corto, aún puede denominarse "completamente complementaria" a los efectos de la presente divulgación.

La expresión "identidad de secuencia" (por ejemplo, una "secuencia que tiene el 50 % de identidad con") se refiere al grado en que una secuencia es idéntica nucleótido por nucleótido en una ventana de comparación (es decir, la secuencia completa de una secuencia de referencia). Se puede calcular un "porcentaje de identidad" (o "% de identidad") comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U) se da en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, la longitud completa de la secuencia de referencia) y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede realizar mediante implementaciones computarizadas de algoritmos disponibles en la técnica, tal como, por ejemplo, la familia de programas BLAST®, o por inspección y la mejor alineación (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generada por cualquiera de los diversos métodos seleccionados. Por lo tanto, la expresión "identidad de secuencia" se refiere a la proporción entre el número de nucleótidos idénticos y la secuencia de referencia cuando esas secuencias idénticas se comparan con la secuencia completa de la secuencia de referencia. La identidad de secuencia entre las secuencias de ARNip químicamente modificadas se calcula comparando las correspondientes secuencias de nucleótidos no modificadas. Por ejemplo, si un ARN monocatenario tiene 15 nucleótidos de longitud, incluyendo 14 nucleótidos contiguos o no contiguos idénticos a una secuencia de ARN de referencia que tiene 19 nucleótidos, la identidad entre las dos secuencias de ARN es el 74 % (14nt/19nt). A modo de otro ejemplo, si un ARN monocatenario tiene 23 nucleótidos de longitud y la secuencia de ARN de referencia tiene 19 nucleótidos de longitud, y el ARN más largo comprende 19 nucleótidos contiguos o no contiguos idénticos a la secuencia de ARN de referencia más corta, se puede decir que la secuencia de ARN más larga "contiene" la secuencia corta de ARN de referencia. En otras palabras, una secuencia de referencia puede interrumpirse mediante inserciones o deleciones, así como con sustituciones al calcular el porcentaje de identidad.

"G", "C", "A", y "U" significan las bases de nucleótidos de guanina, citosina, adenina y uracilo, respectivamente. "T" y "dT" se usan indistintamente y se refieren a un desoxirribonucleótido cuya nucleobase contiene timina, tal como, por ejemplo, desoxirribotimina, 2'-desoxitimidina o timidina. El término "nucleótido" o "ribonucleótido" o "desoxirribonucleótido" se refiere a un nucleótido natural que comprende una nucleobase, un azúcar y al menos un grupo fosfato (por ejemplo, un grupo de enlace fosfodiéster). Estos términos también pueden referirse a un nucleótido modificado, por ejemplo, un nucleótido químicamente modificado o un resto de sustitución sustituto. La guanina, la citosina, la adenina y el uracilo se pueden reemplazar por otros restos sin alterar sustancialmente las propiedades de emparejamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que lleva dicho resto de sustitución. Por ejemplo, un nucleótido que comprende inosina como base puede emparejarse con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por lo tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina, o adenina en las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento pueden ser sustituidos por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. Y la citosina en cualquier parte de las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento puede ser sustituida con guanina o uracilo.

El término "nucleobase" o "base" se usa indistintamente para referirse a una base de purina o pirimidina que se encuentra en el ADN o ARN natural (por ejemplo, uracilo, timina, adenina, citosina y guanina). Los términos también incluyen análogos u homólogos modificados de estas purinas y pirimidinas naturales, que pueden conferir propiedades mejoradas a la molécula de ácido nucleico.

La expresión "ARN de interferencia pequeño" o "ARNip" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico capaz de inhibir o regular negativamente la expresión génica, por ejemplo, al mediar la degradación específica de secuencia de una transcripción de ARN, por ejemplo, un ARNm, mediante ARNi o silenciamiento génico. En algunas realizaciones, el ARNip puede ser una molécula polinucleotídica bicatenaria que comprende regiones autocomplementarias sentido y antisentido. La región antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana (por ejemplo, un ARNm de ADAMTS-5 o ADAM17) o una porción de la misma (por ejemplo, una secuencia diana o una porción de la misma), y la región sentido comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia diana o una porción de la misma. En algunas realizaciones, el ARNip se puede ensamblar a partir de dos oligonucleótidos separados y comprender una hebra sentido y una hebra antisentido, en donde las hebras antisentido y sentido son complementarias, es decir, cada hebra comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en la otra hebra de modo que la hebra antisentido y la hebra sentido forman una estructura dúplex o bicatenaria. La hebra antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana (por ejemplo, un ARNm de ADAMTS-5 o ADAM17) o una porción de la misma (por ejemplo, una secuencia diana o una porción de la misma), y la hebra sentido comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia diana o una porción de la misma. En algunas realizaciones, el ARNip también se puede ensamblar a partir de un solo oligonucleótido, en donde las regiones autocomplementarias sentido y antisentido del ARNip están unidas por un enlazador o enlazadores basados en nucleótidos o no basados en nucleótidos. En algunas realizaciones, el ARNip puede ser un polinucleótido que tiene una estructura de dúplex, dúplex asimétrico, horquilla secundaria u horquilla asimétrica. En algunas realizaciones, el ARNip puede ser un polinucleótido circular monocatenario que tiene dos o más estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones sentido y antisentido autocomplementarias. El polinucleótido circular se puede procesar in vivo o in vitro para generar una molécula de ARNip activa capaz de mediar ARNi. En algunas realizaciones, el ARNip también puede comprender un polinucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico diana o una porción de la misma (por ejemplo, un ARNm de ADAMTS-5 o ADAM17), donde tal molécula de ARNip no requiere la presencia dentro la molécula de ARNip de una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia diana o una porción de la misma.

En determinadas realizaciones, las moléculas de ARNip no necesitan limitarse a aquellas moléculas que contienen solo nucleótidos naturales, pero incluye además nucleótidos modificados y no nucleótidos. Por ejemplo, la mayoría de los nucleótidos de cada hebra de una molécula de ARNip son ribonucleótidos, pero tal como se describe en detalle a continuación, cada una o ambas hebras también pueden incluir uno o más no ribonucleótidos, por ejemplo, un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado, por ejemplo, un nucleótido químicamente modificado. En algunas realizaciones, las moléculas de ARNip pueden incluir modificaciones químicas en múltiples nucleótidos o múltiples modificaciones químicas en un solo nucleótido. Tales modificaciones pueden incluir todos los tipos de modificaciones desveladas en el presente documento o conocidas en la técnica.

El término "ARNip" también puede incluir otros términos usados para describir moléculas de ácido nucleico capaces de mediar ARNi específico de secuencia, por ejemplo, ARN bicatenario (ARNbc), microARN (miARN), a Rn de horquilla corta (ARNhc), oligonucleótido interferente corto, ácido nucleico corto de interferencia, oligonucleótido corto de interferencia modificado, ARNip químicamente modificado y ARN silenciador de genes postranscripcional (ARNsgpt). Además, el término "ARNi" puede incluir otros términos utilizados para describir el ARNi específico de secuencia, tal como el silenciamiento génico postranscripcional, el silenciamiento génico, la inhibición de la traducción o la epigenética. En algunas realizaciones, el ARNip puede modular, por ejemplo, inhibir, la expresión de ADAMTS-5 o ADAM17 en una célula, por ejemplo, una célula en un cultivo o una célula dentro de un sujeto, tal como, por ejemplo, un sujeto mamífero, por ejemplo, un ser humano.

Un "saliente de nucleótidos" se refiere al nucleótido o nucleótidos desemparejados que sobresalen de la estructura de dúplex de una molécula de ARNip bicatenario cuando un extremo 3' de una cadena del ARNip se prolonga más allá del extremo 5' de la otra hebra, o viceversa. "Romo" o "extremo romo" significa que no existen nucleótidos desemparejados en ese extremo de una molécula de ARNip bicatenario, es decir, sin saliente de nucleótidos. Los ARNip descritos en el presente documento incluyen ARNip bicatenarios con salientes de nucleótidos en un extremo, es decir, ARNip con un saliente y un extremo romo, o con salientes de nucleótidos en ambos extremos. Los ARNip descritos en el presente documento también incluyen ARNip que es bicatenario en toda su longitud, es decir, sin salientes de nucleótidos en ninguno de los extremos de la molécula.

El término "modular" significa que la expresión del gen, o el nivel de la molécula de ARNm o moléculas de ARN equivalentes que codifican una o más proteínas o subunidades de proteínas, o el nivel o actividad de una o más proteínas o subunidades de proteínas está regulado positivamente o regulado negativamente, de tal manera que la expresión, el nivel o la actividad es mayor o menor que la observada en ausencia del modulador. Por ejemplo, el término "modular" puede significar "inhibir", pero el uso de la palabra "modular" no se limita a esta definición.

Los términos "inhibir", "regular negativamente", "reducir", "silenciar", "bloquear" o "suprimir", todos utilizados indistintamente, significa que la expresión del gen, o el nivel de las moléculas de ARNm o moléculas de ARN equivalentes que codifican una o más proteínas o subunidades de proteínas, o el nivel o actividad de una o más proteínas o subunidades de proteínas, se reduce por debajo de lo observado en ausencia de las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ARNip) descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, la inhibición, la regulación negativa, la reducción, el silenciamiento, el bloqueo o la supresión con una molécula de ARNip está por debajo del nivel observado en presencia de una molécula inactiva o atenuada. En otra realización, la inhibición, la regulación negativa, la reducción, el silenciamiento, el bloqueo o la supresión con una molécula de ARNip está por debajo del nivel observado en presencia de, por ejemplo, una molécula de ARNip con una secuencia codificada o con desajustes (por ejemplo, una molécula de ARNip con una secuencia aleatoria inespecífica).

La expresión "inhibir la expresión de ADAMTS-5" o "inhibir la expresión de ADAM17" incluye la inhibición de la expresión de cualquier gen de ADAMTS-5 o ADAM17 (tal como, por ejemplo, un gen de ratón, un gen de rata, un gen de mono o un gen humano), así como variantes genéticas, (por ejemplo, variantes de origen natural) o mutantes de un gen de ADAMTS-5 o ADAM17. Por lo tanto, el gen de a Da MTS-5 o ADAM17 puede ser un gen de tipo silvestre, una variante génica, un gen mutante o un gen transgénico en el contexto de una célula, grupo de células u organismo manipulado genéticamente.

"Inhibir la expresión de ADAMTS-5" o "inhibir la expresión de ADAM17" incluye cualquier nivel de inhibición del gen diana, por ejemplo, al menos supresión parcial de la expresión de un gen de ADAMTS-5 o ADAM17. La expresión de un gen diana se puede evaluar en función del nivel de cualquier variable asociada con la expresión del gen diana, por ejemplo, el nivel de ARNm de ADAMTS-5 o ADAM17, el nivel de proteína ADAMTS-5 o a Da M17, o niveles de otros factores inmunes incluyendo citocinas inflamatorias implicadas funcionalmente en trastornos asociados a ADAMTS-5 o ADAM17, tal como, por ejemplo, el factor de necrosis tumoral (TNF, tal como, por ejemplo, TNF-a), ciclooxigenasa (COX, tal como, por ejemplo, COX-2) e interleucina (IL, tal como, por ejemplo, IL-1p). La inhibición se puede evaluar mediante una disminución en un absoluto de una o más de estas variables o en un nivel relativo de una o más de estas variables en comparación con un nivel de control. El nivel de control puede ser cualquier tipo de nivel de control que se utilice en la técnica, por ejemplo, un nivel de referencia previo a la dosis, o un nivel determinado a partir de un sujeto, célula, o muestra similar que no está tratada o tratada con un control (como, por ejemplo, control de solo tampón o control de agente inactivo).

Los términos "poner en contacto una célula", "introducir" o "suministrar" incluye el suministro de los oligómeros de la divulgación en una célula mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, transfección (por ejemplo, vía liposoma, fosfato de calcio, polietilenimina), electroporación (por ejemplo, nucleofección) o microinyección. El contacto incluye poner en contacto a una célula in vitro o in vivo. La puesta en contacto con una célula in vitro se puede hacer, por ejemplo, incubando la célula con el ARNip. La puesta en contacto con una célula in vivo se puede hacer, por ejemplo, inyectando el ARNip en o cerca del tejido donde se encuentra la célula, o inyectando el ARNip en otra área, por ejemplo, el torrente sanguíneo o el espacio subcutáneo, de manera que el ARNip llegará posteriormente al tejido donde se encuentra la célula con la que se va a poner en contacto.

El término un "sujeto" o un "sujeto que lo necesite" incluye un sujeto mamífero tal como un sujeto humano. Los mamíferos ilustrativos padecen o tienen riesgo de desarrollar una enfermedad asociada a ADAMTS-5 o ADAM17, tal como, por ejemplo, artritis, incluyendo artrosis y artritis reumatoide.

Una "enfermedad asociada a ADAMTS-5" o "enfermedad asociada a ADAM17" incluye cualquier trastorno, enfermedad o afección asociada con el gen de ADAMTS-5 o ADAM17 o la proteína ADAMTS-5 o ADAM17. Tal enfermedad puede ser causada, por ejemplo, por variantes o mutaciones del gen de ADAMTS-5 o ADAM17, por plegamiento incorrecto de la proteína ADAMTS-5 o ADAM17, acumulación intracelular de la proteína (por ejemplo, proteína mal plegada), exceso de producción de la proteína, escisión anómala de la proteína, interacciones anómalas entre ADAMTS-5 o ADAM17 y otras proteínas u otras sustancias endógenas o exógenas. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a ADAMTS-5 o ADAM17 puede ser una enfermedad relacionada con la inflamación. En algunas realizaciones, la enfermedad asociada a ADAMTS-5 o a ADAM17 puede ser artritis, tal como, por ejemplo, artrosis, artritis reumatoide, artritis infecciosa crónica, espondilitis, artritis psoriásica y gota. Las afecciones o síntomas ilustrativos de la enfermedad asociada a ADAMTS-5 o ADAM17 incluyen fibrosis articular, erosión de cartílago, pérdida de colágeno del cartílago, daño de las superficies del cartílago articular, sinovitis, inflamación en cápsulas articulares, dolor de articulaciones, engrosamiento de los ligamentos articulares, osificación del menisco y desorganización de las células del cartílago.

La expresión una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" de un compuesto o composición se refiere a una cantidad eficaz en la prevención o tratamiento de un trastorno para cuyo tratamiento el compuesto o composición es eficaz. La expresión incluye la cantidad de una molécula de ARNip que, cuando se administra a un sujeto para tratar una enfermedad asociada a ADAMTS-5 o ADAM17, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad, por ejemplo, disminuyendo, mejorando o manteniendo la enfermedad existente o uno o más síntomas de la enfermedad, o inhibiendo la progresión de la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" o la "cantidad eficaz" puede variar dependiendo de la molécula de ARNip, de la vía de administración, de la enfermedad y de su gravedad, y de la salud, la edad, el peso, los antecedentes familiares, la constitución genética, la etapa de procesos patológicos mediados por la expresión de ADAMTS-5 o ADAM17, los tipos de tratamientos anteriores o concomitantes, si los hubiera, y otras características individuales del sujeto que se va a tratar.

En diversas realizaciones, el término "tratamiento" incluye el tratamiento de un sujeto (por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano) o una célula para alterar el curso actual del sujeto o célula. El tratamiento incluye, pero sin limitación, la administración de una composición farmacéutica, y se puede realizar por vía profiláctica o después del inicio de un evento patológico o el contacto con un agente etiológico. También se incluyen tratamientos "profilácticos", que pueden estar dirigidos a reducir la tasa de progresión de la enfermedad o afección que se está tratando, retrasar la aparición de esa enfermedad o afección, o reducir la gravedad de su aparición. "Tratamiento" o "profilaxis" no indica necesariamente la erradicación completa, cura o prevención de la enfermedad o afección o los síntomas asociados. En diversas realizaciones, el término "tratamiento" puede incluir aliviar, ralentizar o revertir los procesos patológicos o síntomas mediados por la expresión de ADAMTS-5 o ADAM17, tal como, por ejemplo, ralentizar la progresión de la artritis, tal como, por ejemplo, artrosis, artritis reumatoide, artritis infecciosa crónica, espondilitis, artritis psoriásica y gota, o aliviar los síntomas, tal como, por ejemplo, fibrosis articular, erosión de cartílago, pérdida de colágeno del cartílago, daño de las superficies del cartílago articular, sinovitis, inflamación en cápsulas articulares, dolor de articulaciones, engrosamiento de los ligamentos articulares, osificación del menisco y desorganización de las células del cartílago.

Los términos "administración", o "administrar" incluye el suministro de los ARNip descritos en el presente documento a un sujeto mediante administración local o sistémica. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica y las membranas mucosas, incluyendo administración vaginal y rectal), pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador, intratraqueal, intranasal), epidérmica, transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular, o inyección articular o intraarticular.

II. ARNip

Se desvelan ARNip que inhiben la expresión de un gen de ADAMTS-5 o ADAM17 in vitro, tal como, por ejemplo, en una solución o un sistema libre de células (por ejemplo, un lisado celular o en un sistema reconstituido), o en una célula, tal como, por ejemplo, ex vivo en una célula en cultivo (por ejemplo, una célula que expresa ADAMTS-5 o ADAM17), o in vivo en una célula dentro de un sujeto. El sujeto puede ser un mamífero, tal como, por ejemplo, una rata, ratón o humano. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto puede padecer una enfermedad asociada a ADAm t S-5 o ADAM17, tal como, por ejemplo, una enfermedad relacionada con la inflamación, o tiene riesgo de desarrollar dicha enfermedad. Las enfermedades ilustrativas relacionadas con la inflamación incluyen, por ejemplo, artritis, incluida la artrosis, artritis reumatoide, artritis infecciosa crónica, espondilitis, artritis psoriásica y gota. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser artritis. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser artrosis. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria puede ser artritis reumatoide.

Se puede decir que los ARNip están "dirigidos a" o "dirigidos contra" una secuencia diana con la que hibrida. En diversas realizaciones, la secuencia diana puede comprender 10-30 nucleótidos contiguos de una transcripción de ARN de un gen de ADAMTS-5 o ADAM17 (por ejemplo, un ARNm diana), tal como, por ejemplo, 10-25 o 15-20 nucleótidos contiguos del ARNm diana, incluyendo todos los números enteros entre estos intervalos. Por ejemplo, la secuencia diana puede comprender, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 o 27 nucleótidos contiguos del ARNm diana. En algunas realizaciones, la secuencia diana puede comprender 19 nucleótidos contiguos del ARNm diana. En diversas realizaciones, los ARNip descritos en el presente documento pueden comprender una región antisentido que tiene suficiente complementariedad con una secuencia de ARNm diana para llevar a cabo la actividad de ARNi. Por ejemplo, la región antisentido puede comprender al menos 11 nucleótidos contiguos o no contiguos complementarios con la secuencia de ARNm diana, tal como, por ejemplo, al menos 15 nucleótidos contiguos o no contiguos complementarios con la secuencia de ARNm diana. En algunas realizaciones, la región antisentido puede comprender 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 o 27 nucleótidos contiguos o no contiguos complementarios con la secuencia de ARNm diana. En algunas realizaciones, la región antisentido puede comprender 15 nucleótidos contiguos o no contiguos complementarios con la secuencia de ARNm diana. En algunas realizaciones, la región antisentido puede comprender 17 nucleótidos contiguos o no contiguos complementarios con la secuencia de ARNm diana. En algunas realizaciones, la región antisentido puede comprender 19 nucleótidos contiguos o no contiguos complementarios con la secuencia de ARNm diana. En algunas realizaciones, la región antisentido puede ser sustancialmente complementaria con al menos parte de un transcrito de ARN de un gen de ADAMTS-5 o ADAM17, tal como, por ejemplo, un ARNm de ADAMTS-5 o ADAM17. En algunas realizaciones, la región antisentido puede ser completamente complementaria con al menos parte de la transcripción de ARN del gen de ADAMTS-5 o ADAM17.

Se desvelan ARNip monocatenarios, en donde las regiones sentido y antisentido autocomplementarias del ARNip pueden estar unidas por un enlazador o enlazadores basados en nucleótidos o no basados en nucleótidos. En algunas realizaciones, el ARNip puede ser un polinucleótido monocatenario que tiene un dúplex, dúplex asimétrico, estructura secundaria de horquilla u horquilla asimétrica. En algunas realizaciones, el ARNip puede ser un polinucleótido circular monocatenario que tiene dos o más estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones sentido y antisentido autocomplementarias. En algunas realizaciones, el polinucleótido circular se puede procesar in vivo o in vitro para generar una molécula de ARNip activa capaz de mediar ARNi. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender un polinucleótido monocatenario que tiene una región antisentido complementaria con una secuencia diana (por ejemplo, un ARNm de ADAMTS-5 o ADAM17 o una porción del mismo), en donde tal molécula de ARNip no requiere la presencia dentro de la molécula de ARNip de una región sentido correspondiente a la secuencia diana.

En las composiciones farmacéuticas de la invención, el ARNip es un ARNip bicatenario que comprende una hebra sentido y una hebra antisentido. La hebra antisentido puede comprender una región antisentido del ARNip. La hebra sentido y la hebra antisentido del ARNip pueden formar una estructura de dúplex. En algunas realizaciones, la hebra antisentido puede hibridar con un ARNm de ADAMTS-5, y la hebra sentido puede hibridar con la hebra antisentido. En otras realizaciones, la hebra antisentido puede hibridar con un ARNm de ADAM17, y la hebra sentido hibrida con la hebra antisentido. En algunas realizaciones, la región de dúplex del ARNi puede tener al menos 11 pares de bases, tal como, por ejemplo, al menos 15 pares de bases, al menos 17 pares de bases, o al menos 19 pares de bases. Por ejemplo, la región de dúplex del ARNi puede tener 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 o 27 pares de bases. En algunas realizaciones, la región de dúplex del ARNi puede tener 15 pares de bases. En algunas realizaciones, la región de dúplex del ARNi puede tener 17 pares de bases. En algunas realizaciones, la región de dúplex del ARNi puede tener 19 pares de bases.

Cuando el ARNip es una molécula de cadena doble, cada hebra puede tener la misma longitud o diferentes longitudes. En algunas realizaciones, cada hebra del ARNip, monocatenario o bicatenario, puede ser de 10 a 60 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra puede tener entre 10 y 50 nucleótidos de longitud, 10-40 nucleótidos de longitud, 10-30 nucleótidos de longitud, 10-25 nucleótidos de longitud, 10-20 nucleótidos de longitud, 15-25 nucleótidos de longitud, 15-27 nucleótidos de longitud o 15-20 nucleótidos de longitud, incluyendo todos los números enteros entre estos intervalos. En algunas realizaciones, cada hebra puede tener 15-27 nucleótidos de longitud, incluyendo todos los números enteros entre estos intervalos. En algunas realizaciones, cada hebra puede tener 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 o 27 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, cada hebra puede tener 15 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, cada hebra puede tener 17 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, cada hebra puede tener 19 nucleótidos de longitud. Cuando se utilizan dos o más moléculas de ARNip diferentes en combinación, las longitudes de cada hebra de cada ARNip pueden ser idénticas o pueden ser diferentes. Para el fin de la presente divulgación, el cálculo de la longitud de cualquier hebra de ARNip bicatenario excluirá cualquier saliente de nucleótidos que pueda estar presente.

Pueden ser posibles inserciones, sustituciones, deleciones o desemparejamientos de nucleótidos en los ARNip descritos en el presente documento mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina, o adenina en las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento pueden ser sustituidos por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. La citosina en cualquier parte de las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento puede reemplazarse con guanina o uracilo. Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido que comprende las SEQ ID NO: 2, 4, 8 o 10 o elegida de las Tablas 2, 3, 9 y 10, que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 inserciones, sustituciones, deleciones o desemparejamientos de nucleótidos. Se desvela ARNip que puede comprender además una secuencia sentido que comprende la SEQ ID NO: 1, 3, 7 o 9 o elegida de las Tablas 1, 3, 8 y 10, que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 inserciones, sustituciones, deleciones o desemparejamientos de nucleótidos. Se desvela ARNip que comprende una secuencia antisentido que comprende la SEQ ID NO: 2, 4, 8 o 10 o se elige de las Tablas 2, 3, 9 y 10, que tienen 1,2, 3 o 4 inserciones, sustituciones, deleciones o desemparejamientos de nucleótidos. Se desvela ARNip que puede comprender además una secuencia sentido que comprende la SEQ ID NO: 1, 3, 7 o 9 o elegida de las Tablas 1, 3, 8 y 10, que tienen 1, 2, 3 o 4 inserciones, sustituciones, deleciones o desemparejamientos de nucleótidos. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que comprende la SEQ ID NO: 2 que tiene 1,2, 3 o 4 inserciones, sustituciones, deleciones o desemparejamientos de nucleótidos. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que comprende la SEQ ID NO: 1 que tiene 1, 2, 3 o 4 inserciones, sustituciones, deleciones o desemparejamientos de nucleótidos. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que comprende la SEQ ID NO: 8 que tiene 1, 2, 3 o 4 inserciones, sustituciones, deleciones o desemparejamientos de nucleótidos. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que comprende la SEQ ID NO: 7 que tiene 1, 2, 3 o 4 inserciones, sustituciones, deleciones o desemparejamientos de nucleótidos.

En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que comprende al menos 11, tal como, por ejemplo, al menos 15 o al menos 19, nucleótidos contiguos que difieren en no más de 8 nucleótidos de una secuencia antisentido elegida de las Tablas 1, 3, 8 y 10. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que comprende al menos 11, tal como, por ejemplo, al menos 15 o al menos 19, nucleótidos contiguos que difieren en no más de 4 nucleótidos de una secuencia antisentido elegida de las Tablas 1, 3, 8 y 10. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que comprende al menos 11, tal como, por ejemplo, al menos 15 o al menos 19, nucleótidos contiguos que difieren en no más de 8 nucleótidos de una secuencia con sentido elegida de las Tablas 2, 3, 9 y 10. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que comprende al menos 11, tal como, por ejemplo, al menos 15 o al menos 19, nucleótidos contiguos que difieren en no más de 4 nucleótidos de una secuencia con sentido elegida de las Tablas 2, 3, 9 y 10.

Se desvelan ARNip que pueden comprender una secuencia de nucleótidos que tiene cierta identidad de secuencia con las secuencias de nucleótidos desveladas en el presente documento, tal como, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1-4 y 7-10 y las desveladas en las Tablas 1-3 (SEQ ID NO: 17-49) y 8-10 (SEQ ID NO: 98-128). Por ejemplo, se desvela ARNip que puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 60 %, tal como, por ejemplo, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, o mayor identidad con cualquiera de las secuencias desveladas. Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de identidad con cualquiera de las secuencias desveladas.

Los ARNip desvelados dirigidos contra ADAMTS-5 pueden comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 2 o 4 o con una secuencia antisentido elegida de las Tablas 2 y 3. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que tenga al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 1 o 3 o con una secuencia sentido elegida de las Tablas 1 y 3.

En la composición farmacéutica de la presente invención, el ARNip dirigido contra ADAMTS-5 comprende una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 2 y una secuencia sentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 2, y una secuencia sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, y una secuencia sentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 1.

Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones de la divulgación, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que tenga al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones de la invención, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones de la invención, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3. Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 4, y una secuencia sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3. Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4, y una secuencia sentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 3.

Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con una secuencia antisentido elegida de las Tablas 2 y 3. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que tenga al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con una secuencia sentido elegida de las Tablas 1 y 3. En algunas realizaciones de la invención, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido elegida de las Tablas 2 y 3. En algunas realizaciones de la invención, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido elegida de las Tablas 1 y 3. Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con una secuencia antisentido elegida de las Tablas 2 y 3, y una secuencia sentido elegida de las Tablas 1 y 3. Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido elegida de las Tablas 2 y 3, y una secuencia sentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con una secuencia sentido elegida de las Tablas 1 y 3.

Los ARNip desvelados dirigidos contra ADAM17 pueden comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 8 o 10 o con una secuencia antisentido elegida de las Tablas 9 y 10. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que tenga al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 7 o 9 o con una secuencia sentido elegida de las Tablas 8 y 10.

En la composición farmacéutica de la presente invención, el ARNip dirigido contra ADAM17 comprende una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 8 y una secuencia sentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 8, y una secuencia sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8, y una secuencia sentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 7.

Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones de la divulgación, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que tenga al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones de la invención, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10. En algunas realizaciones de la invención, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9. Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 10, y una secuencia sentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9. Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 10, y una secuencia sentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 9.

Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con una secuencia antisentido elegida de las Tablas 9 y 10. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido que tenga al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con una secuencia sentido elegida de las Tablas 8 y 10. En algunas realizaciones de la invención, el ARNip puede comprender una secuencia antisentido elegida de las Tablas 9 y 10. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una secuencia sentido elegida de las Tablas 8 y 10. Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con una secuencia antisentido elegida de las Tablas 9 y 10, y una secuencia sentido elegida de las Tablas 8 y 10. Se desvela ARNip que puede comprender una secuencia antisentido elegida de las Tablas 9 y 10, y una secuencia sentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con una secuencia sentido elegida de las Tablas 8 y 10.

Ciertas realizaciones del ARNip bicatenario descrito en el presente documento pueden comprender uno o más nucleótidos monocatenarios que sobresalen de uno o más nucleótidos en el extremo 5', del extremo 3', o de ambos extremos de una o ambas hebras. Los salientes de nucleótidos en cada hebra pueden ser iguales o diferentes en términos del número, la longitud, la secuencia y la ubicación. Por ejemplo, el saliente de nucleótidos puede estar ubicado en el extremo 3' de la hebra sentido, la hebra antisentido, o ambas hebras. Por consiguiente, el ARNip también puede tener un extremo romo, ubicado en el extremo 5' de la hebra antisentido (o el extremo 3' de la hebra sentido) o viceversa. En algunas realizaciones, la hebra antisentido del ARNip puede tener un saliente de nucleótidos en el extremo 3' y un extremo 5' romo. El saliente puede formar un desajuste con la secuencia diana o puede ser complementario a la secuencia diana o puede ser otra secuencia. En algunas realizaciones, al menos un extremo de cualquiera de las hebras del ARNip puede comprender un saliente de nucleótidos de 1-10 nucleótidos de longitud, tal como, por ejemplo, 1-8, 2-8, 1-6, 2-6, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3, o 1-2 nucleótidos, incluyendo todos los números enteros entre estos intervalos. En algunas realizaciones, el saliente de nucleótidos puede tener 1 o 2 nucleótidos de longitud. En diversas realizaciones, cada uno de los nucleótidos en el saliente puede ser independientemente un nucleótido no modificado o un nucleótido modificado tal como se desvela en el presente documento o se conoce en la materia. Por ejemplo, el saliente de nucleótidos puede comprender al menos una desoxitimina (dT). En algunas realizaciones, el saliente de nucleótidos puede ser dTdT. En algunas realizaciones, la hebra antisentido del ARNip puede tener dTdT en el extremo 3'. En algunas realizaciones, la hebra sentido del ARNip puede tener dTdT en el extremo 3'. En algunas realizaciones, ambas hebras del ARNip pueden tener dTdT en el extremo 3'. Cuando se utilizan dos o más moléculas de ARNip diferentes en combinación, cada ARNip puede tener estructuras de salientes iguales o diferentes. Por ejemplo, el número, la longitud, la secuencia y la ubicación del saliente de nucleótidos en cada hebra se pueden seleccionar independientemente.

III. Modificaciones químicas

En diversas realizaciones, el ARNip se puede modificar químicamente para mejorar la actividad (por ejemplo, estabilidad, eficacia y especificidad), distribución celular o captación celular u otras propiedades del ARNip. Los ARNip desvelados en el presente documento se pueden sintetizar y/o modificar mediante métodos bien establecidos en la materia. Diversas realizaciones del ARNip pueden comprender al menos un nucleótido modificado (tal como, por ejemplo, por modificación química, conjugación o sustitución) con cualquier grupo adecuado para mejorar las propiedades del ARNip. No es necesario que todas las posiciones en un ARNip dado se modifiquen uniformemente. En alguna realización, se pueden incorporar más de una modificación en un solo ARNip o en un solo nucleósido dentro de un ARNip. Las modificaciones ilustrativas incluyen, por ejemplo, modificaciones en los extremos, por ejemplo, modificaciones del extremo 5' (por ejemplo, fosforilación, conjugación, enlaces invertidos, etc.) o modificaciones en el extremo 3' (por ejemplo, conjugación, nucleótidos de ADN, enlaces invertidos, etc.); modificaciones de base, por ejemplo, reemplazo con bases estabilizadoras, bases desestabilizadoras, o bases que se emparejan con un repertorio ampliado de miembros de unión, eliminación de bases (nucleótidos abásicos) o bases conjugadas; modificaciones del azúcar (por ejemplo, en la posición 2' o 4') o sustitución del azúcar; y/o modificaciones de la estructura principal, incluida la modificación o sustitución de los enlaces fosfodiéster.

Las realizaciones de ARNip que tienen estructuras principales modificadas pueden incluir aquellas que conservan un átomo de fósforo en la estructura principal y aquellas que no. Los ejemplos de modificaciones en las estructuras principales de fosfato del ARNip incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de alquilo y aquellos que tienen polaridad invertida en los que los pares adyacentes de nucleótidos están unidos 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. En algunas realizaciones, la estructura principal de azúcar del ARNip se puede sustituir por, por ejemplo, amida, morfolina, ciclobutilo, etc. En determinadas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender una estructura principal de fosfato modificada con fosforotioato. El fosforotioato puede comprender un enlace P-S que sustituye un enlace P-OH en la estructura principal de fosfato.

En diversas realizaciones, cualquiera de los ARNip modificados descritos en el presente documento también puede comprender uno o más restos de azúcar modificados. El resto de azúcar modificado puede ser una ribosa o una desoxirribosa. Por ejemplo, el ARNip puede comprender al menos un nucleótido modificado elegido entre: por ejemplo, un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-flúor, un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido modificado con 2'-O-(2-metoxietil) (2'-MOE-nucleótido), un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-alquilo y un nucleótido modificado con 2-SH. Los ejemplos de restos de azúcar modificados también incluyen, por ejemplo, un ácido nucleico bloqueado (ANB), un ácido nucleico de bucle abierto o desbloqueado (ANDB) y un ácido nucleico peptídico (ANP). También pueden producirse modificaciones similares en otras posiciones sobre el ARNip, tal como, por ejemplo, en la posición 3' del azúcar en el nucleótido de 3' terminal, o en la posición 5' del azúcar en el nucleótido de 5' terminal, al menos una hebra del ARNip puede comprender un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, es decir, una modificación 2'-O-metilo en una ribosa o una desoxirribosa. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, es decir, una modificación 2'-desoxi-2'-fluoro en una ribosa o una desoxirribosa. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender un ANB. El ANB puede comprender una estructura cíclica formada entre 2'-O y 4'-C en una ribosa o desoxirribosa. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender un ácido nucleico de bucle abierto o ANDB. El ácido nucleico de bucle abierto o ANDB puede comprender una rotura entre 2'-C y 3'-C de una ribosa o desoxirribosa. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender un ANP. El ANP puede comprender una estructura principal que contiene amida que reemplaza la estructura principal de azúcar de un nucleótido.

En diversas realizaciones, los ARNip descritos en el presente documento pueden comprender una modificación de nucleobase (o base). Tal como se usa en el presente documento, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases púricas adenina (A) y guanina (G) y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales, tal como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil-citosina, 5-acetilenil uracilo, 5-etiniluracilo, 5-propinil uracilo, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 5-halouracilo, 5-propiniluracilo, 6-azocitosina, 5-uracilo (pseudouracilo), indol, 8-halo, 8-amino y otras adeninas y guaninas modificadas en 8. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender una modificación de indol. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender una modificación de 5-metilcitosina. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender una modificación de 5-etiniluracilo.

Las modificaciones ilustrativas de los ARNip descritos en el presente documento también incluyen unir el ARNip a uno o más restos o conjugados, que pueden mejorar la actividad de captación o direccionamiento celular, o mejorar la vida media del ARNip. Dichos restos pueden incluir, entre otros, restos de lípidos (tales como, por ejemplo, derivado de colesterilo, fosfolípido, cadena alifática), péptidos, nanopartícula, marcadores (tales como, por ejemplo, tinte fluorescente de cianina (por ejemplo, Cy3 o Cy5)), polímeros (tales como, por ejemplo, cadena de poliamina o polietilenglicol), azúcares (tales como, por ejemplo, derivados de galactosilo), anticuerpos, biotina, ácido cólico, ligando, tiol, vitamina (tal como, por ejemplo, vitamina E), NH², fosfato y folato. Los conjugados se pueden unir al ARNip en el extremo 5', el extremo 3', o ambos extremos, o internamente. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo. En algunas realizaciones, el derivado de colesterilo es colesterol. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender un nucleótido terminal unido a un derivado de galactosilo. En algunas realizaciones, el derivado de galactosilo es galactosa. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender un nucleótido terminal unido a un péptido. En algunas realizaciones, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos N'-Arg-Gly-Asp-C', es decir, un péptido RGD. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender un nucleótido terminal unido a un marcador fluorescente. En algunas realizaciones, el marcador fluorescente es el marcador de cianina. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender un nucleótido terminal unido a una molécula de biotina. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender un nucleótido terminal fosforilado.

Diversas realizaciones del ARNip pueden comprender cualquier combinación de una o más modificaciones desveladas en el presente documento o conocidas en la materia. En algunas realizaciones, al menos una hebra del ARNip puede comprender al menos una modificación química elegida entre: (a) una estructura principal de fosfato modificada con fosforotioato; (b) una modificación de 2'-O-metilo en una ribosa o desoxirribosa; (c) una modificación 2'-desoxi-2'-fluoro en una ribosa o desoxirribosa; (d) un ANB; (e) un ácido nucleico de bucle abierto o (ANDB); (f) una modificación de indol; (g) una 5-metilcitosina; (h) un 5'-etiniluracilo; (i) un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo (tal como, por ejemplo, colesterol); (j) un nucleótido terminal unido a un derivado de galactosilo (tal como, por ejemplo, galactosa); (k) un nucleótido terminal unido a un péptido (tal como, por ejemplo, un péptido RGD); (1) un nucleótido terminal fosforilado (tal como, por ejemplo, fosforilación en 5'); (m) un nucleótido terminal unido a un marcador fluorescente (tal como, por ejemplo, un marcador de cianina); y (n) un nucleótido terminal unido a una molécula de biotina. Por ejemplo, al menos una hebra del ARNip puede comprender una combinación de una o más modificaciones elegidas entre las desveladas en las Tablas 7 y 13.

En algunas realizaciones, el ARNip descrito en el presente documento puede comprender una hebra antisentido modificada químicamente elegida de la Tabla 7. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una hebra sentido modificada químicamente elegida de la Tabla 7. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender una hebra antisentido modificada químicamente elegida de la Tabla 13. En algunas realizaciones, el ARNip puede comprender además una hebra sentido modificada químicamente elegida de la Tabla 13.

K es un grupo de colesterol opcional unido a un nucleótido del extremo 5';

dT es un desoxirribonucleótido de timina;

M es un desoxirribonucleótido de adenina no modificado o modificado con 2'-O-metilo;

P es un desoxirribonucleótido de citosina no modificado o modificado con 2'-O-metilo;

En algunas realizaciones, al menos uno de L, M, P y Q pueden tener una estructura principal de fosforotioato. En algunas realizaciones, todos los L, M, P y Q pueden tener una estructura principal de fosforotioato. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender una secuencia sentido elegida de la Tabla 7, y la hebra antisentido puede comprender una secuencia antisentido elegida de la Tabla 7.

En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender la secuencia de nucleótidos 5'-K'-L'P'M'UCAUGUAUCUGAAP'M'M'dTdT-3' (SEQ ID NO: 15), y la hebra antisentido puede comprender la secuencia de nucleótidos 5'-R'-Q'Q'L'UUCAGAUACAUGAQ'L'P 'dTdT-3' (SEQ ID NO: 16), en donde

K' es un grupo de colesterol opcional unido a un nucleótido del extremo 5';

dT es un desoxirribonucleótido de timina;

P' es un desoxirribonucleótido de citosina no modificado o modificado con 2'-O-metilo;

En algunas realizaciones, al menos uno de L', M', P' y Q' pueden tener una estructura principal de fosforotioato. En algunas realizaciones, todos los L', M', P' y Q' pueden tener una estructura principal de fosforotioato. En algunas realizaciones, la hebra sentido puede comprender una secuencia sentido elegida de la Tabla 13, y la hebra antisentido puede comprender una secuencia antisentido elegida de la Tabla 13.

IV. Ácidos nucleicos que codifican ARNip

Se desvelan los ácidos nucleicos que codifican los ARNip descritos en el presente documento. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar cualquier ARNip que comprenda una secuencia de nucleótidos que tenga al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad o el 100 % de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos desveladas en el presente documento, tal como, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1-4 y 7-10 y las desveladas en las Tablas 1-3 (SEQ iD NO: 17-49) y 8-10 (SEQ ID NO: 98-128). En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede codificar un ARNip que comprende una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede codificar un ARNip que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene los nucleótidos 36-54 de la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede codificar un ARNip que comprende una secuencia sentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede codificar un ARNip que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene los nucleótidos 10-28 de la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5.

En realizaciones adicionales, el ácido nucleico puede codificar un ARNip que comprende una secuencia antisentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede codificar un ARNip que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene los nucleótidos 38-56 de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede codificar un ARNip que comprende una secuencia sentido que tiene al menos el 60 % (tal como, por ejemplo, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 %) de identidad con la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede codificar un ARNip que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene los nucleótidos 8-26 de la SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede comprender la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 12.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede ser un vector. Tal como se usa en el presente documento, un "vector" permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. Puede ser un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, en el que se puede insertar otro segmento de ácido nucleico para lograr la replicación del segmento insertado. En algunas realizaciones, un vector puede ser capaz de replicarse cuando está asociado con los elementos de control apropiados. En general, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha enlazado. Los vectores ilustrativos incluyen moléculas de ácido nucleico que son monocatenarias, bicatenarias o parcialmente bicatenarias; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres, sin extremos libres (por ejemplo, circulares); moléculas de ácido nucleico que comprenden ADN, ARN, o ambos; y otras variedades de polinucleótidos conocidas en la técnica. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales, tal como por técnicas estándar de clonación molecular. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde las secuencias de ADN o ARN derivadas de virus están presentes en el vector para empaquetar en un virus, tal como, por ejemplo, retrovirus, retrovirus defectuosos para la replicación, adenovirus, adenovirus defectuosos para la replicación y virus adenoasociados. Los vectores víricos también incluyen polinucleótidos transportados por un virus para la transfección en una célula hospedadora. Determinados vectores son capaces de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (tales como, por ejemplo vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y, de este modo, se replican junto con el genoma del hospedador. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se citan en el presente documento como "vectores de expresión". Los vectores de expresión comunes de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos.

Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender un ácido nucleico que codifica ARNip desvelado en el presente documento en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora. Por ejemplo, los vectores de expresión recombinantes pueden incluir uno o más elementos reguladores, que pueden seleccionarse basándose en las células hospedadoras que se van a usar para la expresión, que están unidos operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "operativamente unidos" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida al elemento o elementos reguladores de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos, tal como, por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora.

En algunas realizaciones, el vector puede ser una construcción lineal, un plásmido circular, o un vector vírico, que puede ser un vector integrador o no integrador. En algunas realizaciones, la hebra o hebras individuales de un ARNip se pueden transcribir a partir de un promotor en un vector de expresión. Cuando dos hebras separadas se van a expresar para generar, por ejemplo, un ARNip bicatenario, se pueden co-introducir dos vectores de expresión separados (por ejemplo, mediante transfección o infección) en una célula diana. Como alternativa, cada hebra individual de un ARNip bicatenario puede ser transcrita por promotores, ambos ubicados en el mismo vector de expresión. En algunas realizaciones, un ARNip bicatenario se puede expresar como polinucleótidos repetidos invertidos unidos por una secuencia de polinucleótidos enlazadores de modo que el ARNip bicatenario tenga una estructura de tallo y bucle.

En algunas realizaciones, los vectores de expresión de ARNip pueden ser plásmidos de ADN o vectores víricos. En algunas realizaciones, los vectores útiles para la administración de un ARNip pueden incluir elementos reguladores (promotor, potenciador, etc.) suficientes para la expresión del ARNip en la célula o tejido diana. Se pueden elegir los elementos reguladores para proporcionar una expresión constitutiva o regulada/inducible. La expresión del ARNip puede estar regulada, por ejemplo, mediante el uso de una secuencia reguladora inducible que es sensible a ciertos reguladores fisiológicos, tal como, por ejemplo, niveles de glucosa en circulación u hormonas. Tales sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión de ARNip en células o en mamíferos incluyen, por ejemplo, regulación por ecdisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización e isopropil-beta-Dl-tiogalactopiranósido (IPTG). Un experto en la materia podrá elegir la secuencia promotora/reguladora apropiada basándose en el uso pretendido del transgén de ARNip.

Los vectores de expresión compatibles con células eucariotas, tal como, por ejemplo, aquellos compatibles con células de mamíferos, se pueden usar para producir construcciones recombinantes para la expresión de un ARNip descrito en el presente documento. Los vectores de expresión de células eucariotas son bien conocidos en la técnica y están disponibles en varias fuentes comerciales. Por ejemplo, se pueden proporcionar tales vectores que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ácido nucleico deseado. En algunas realizaciones, el vector de expresión de ARNip puede comprender el plásmido pGCsi-H1/Neo que tiene una secuencia de nucleótidos sustituida entre los sitios de restricción BamHI y HindlIl. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos sustituida puede codificar cualquiera de los ARNip descritos en el presente documento.

La administración de vectores que expresan ARNip puede ser sistémica, tal como, por ejemplo, por administración intravenosa, intramuscular, articular o intraarticular, por administración a células diana explantadas de un sujeto seguido de reintroducción en el sujeto, o por cualquier otro medio que permita la introducción en una célula diana deseada, por ejemplo, una célula diana en un sujeto. En algunas realizaciones, los vectores de expresión de ARNip se pueden transfectar en células diana como un complejo con ciertos vehículos de administración, tal como, por ejemplo, vehículos de lípidos catiónicos (por ejemplo, oligofectamina) o vehículos basados en lípidos no catiónicos (por ejemplo, Transit-TKO.TM.). También se contemplan en la divulgación múltiples transfecciones de lípidos para reducciones de expresión mediadas por ARNip que se dirigen a diferentes regiones de un ARN diana durante un período de una semana o más. La introducción exitosa de vectores en células hospedadoras puede monitorearse usando diversos métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria se puede señalar con un indicador, tal como un marcador fluorescente, tal como la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés). La transfección estable de células ex vivo se puede garantizar utilizando marcadores que proporcionen a la célula transfectada resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tales como la resistencia a la higromicina B.

Los sistemas de vectores víricos que se pueden utilizar con los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyen (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus, por ejemplo, vectores lentivíricos, virus de la leucemia murina de Moloney, etc.; (c) vectores de virus adenoasociados; (d) vectores del virus del herpes simple; (e) vectores de SV 40; (f) vectores del virus del polioma; (g) vectores del virus del papiloma; (h) vectores de picornavirus; (i) vectores del virus de la viruela como un ortopox, por ejemplo, vectores del virus vaccinia o avipox, por ejemplo, viruela del canario o viruela aviar; y (j) un adenovirus dependiente de ayudante o sin intestino. Los virus de replicación defectuosa también pueden ser ventajosos. Se incorporarán o no diferentes vectores al genoma de la célula diana. Las construcciones pueden incluir secuencias víricas para transfección, si se desea. Como alternativa, la construcción se puede incorporar en vectores capaces de la replicación episomal, por ejemplo, vectores EPV y EBV. Las construcciones para la expresión recombinante de un ARNip pueden comprender además elementos reguladores, por ejemplo, promotores, potenciadores, etc., para asegurar la expresión del ARNip en las células diana.

Las células hospedadoras que comprenden los ácidos nucleicos que codifican el ARNip también se contemplan en la divulgación. En algunas realizaciones, una célula hospedadora se puede transfectar de forma transitoria o no transitoria con uno o más ácidos nucleicos, por ejemplo, vectores, descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, una célula se puede transfectar tal como se da de forma natural en un sujeto. En algunas realizaciones, una célula que se transfecta se puede tomar de un sujeto. En algunas realizaciones, la célula puede provenir de células tomadas de un sujeto, tal como una línea celular. Se conoce una amplia variedad de líneas celulares para el cultivo de tejidos en la materia. Los ejemplos de líneas celulares incluyen C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calul, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRCS, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 epitelial de riñón de mono, BALB/3T3 de fibroblasto de embrión de ratón, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 de fibroblastos fetales humanos; 10.1 de fibroblastos de ratón, 293T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, células BCP-1, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr-/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepalclc7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, células JY, células K562, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/lX10, NCI-H69/lX20, NCI-H69/lX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, líneas celulares OPCN/OPCT, Peer, PNT-1A/PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, células Saos-2, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1, U373, U87, U937, VCaP, células Vero, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, y variantes transgénicas de las mismas. Las líneas celulares están disponibles en una variedad de fuentes conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, la American Type Culture Collection (ATCC)). En algunas realizaciones, una célula transfectada con uno o más vectores descritos en el presente documento se puede usar para establecer una nueva línea celular que puede comprender una o más secuencias procedentes de vectores.

V. Composiciones farmacéuticas

La presente divulgación también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los ARNip descritos en el presente documento. Las composiciones farmacéuticas desveladas pueden comprender un ARNip y, opcionalmente, un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas divulgaciones, el ARNip puede inhibir la expresión de a Da MTS-5. En otras divulgaciones, el ARNip puede inhibir la expresión de ADAM 17. En determinadas divulgaciones, la composición farmacéutica puede comprender uno o más ARNip dirigidos contra un primer ácido nucleico y uno o más ARNip adicionales dirigidos contra un segundo ácido nucleico diana. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender un ARNip que inhibe la expresión de ADAMTS-5 y un ARNip que inhibe la expresión de ADAM17.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede comprender ARNip que inhiben la expresión de ADAMTS-5 y ADAM17, y un ARNip dirigido contra otro gen. En otras realizaciones, la composición farmacéutica puede comprender dos o más ARNip dirigidos contra diferentes regiones del mismo ácido nucleico diana. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender dos o más ARNip dirigidos contra diferentes regiones de un ARNm de ADAMTS-5. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede comprender dos o más ARNip dirigidos contra diferentes regiones de un ARNm de ADAM17. Cuando se utilizan dos o más ARNip diferentes en combinación, los ARNip pueden estar presentes, por ejemplo, en una proporción equimolar. Se pueden usar dos o más ARNip combinados juntos o secuencialmente.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden ser útiles para prevenir o tratar una enfermedad o procesos patológicos asociados con la expresión o actividad de ADAMTS-5 y/o ADAM17, tal como, por ejemplo, enfermedades relacionadas con la inflamación, tal como, por ejemplo, artritis, incluida la artrosis, artritis reumatoide, artritis infecciosa crónica, espondilitis, artritis psoriásica y gota. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser artritis. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser artrosis. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria puede ser artritis reumatoide. Las composiciones farmacéuticas se pueden usar para prevenir o tratar afecciones o síntomas de enfermedades asociadas a ADAMTS-5 o ADAM17, que incluyen, por ejemplo, fibrosis articular, erosión de cartílago, pérdida de colágeno del cartílago, daño de las superficies del cartílago articular, sinovitis, inflamación en cápsulas articulares, dolor de articulaciones, engrosamiento de los ligamentos articulares, osificación del menisco y desorganización de las células del cartílago. Las composiciones farmacéuticas también se pueden usar para tratar a un sujeto que tiene artritis asociada con TNF-a o COX-2 o IL-1 p. Los usos ilustrativos de las composiciones farmacéuticas también incluyen, por ejemplo, inhibir la degradación de la matriz extracelular; regular la expresión de citocinas inflamatorias, la migración de células inmunes y la transducción de señales inflamatorias; y proteger el cartílago, el líquido sinovial, las articulaciones y los huesos. Las composiciones farmacéuticas también se pueden usar para el tratamiento o alivio del dolor, por ejemplo, dolor de huesos o dolor de articulaciones. Diversas realizaciones también incluyen el uso de composiciones farmacéuticas para prevenir o tratar las enfermedades, afecciones o síntomas descritos en el presente documento.

Un "vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los vehículos, diluyentes, tampones y excipientes farmacéuticos convencionales, tal como, por ejemplo, una solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución acuosa de dextrosa al 5 % y emulsiones, tales como una emulsión de aceite/agua o de agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes y/o adyuvantes. Se conocen en la técnica vehículos, diluyentes o excipientes y formulaciones farmacéuticas adecuadas. Se pueden seleccionar vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticos adecuados dependiendo del modo de administración pretendido del agente activo.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante métodos conocidos en la técnica o desvelados en el presente documento. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de varias maneras dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área que se va a tratar. La administración puede ser tópica (incluyendo oftálmica y las membranas mucosas, incluyendo administración vaginal y rectal), pulmonar (por ejemplo, por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador, intratraqueal, intranasal), epidérmica y transdérmica, medular, oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; subdérmica, por ejemplo, mediante un dispositivo implantado; intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intraventricular; o inyección articular o intraarticular. En algunas realizaciones, el ARNip se puede administrar de manera que se dirija a un tejido en particular, tal como una articulación (por ejemplo, una cavidad articular). Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede administrar mediante inyección conjunta o intraarticular. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede inyectar en una cavidad articular del sujeto que se va a tratar.

La composición farmacéutica se puede administrar a las células mediante una variedad de vehículos de administración, tal como, por ejemplo, liposomas, compuestos poliméricos, polipéptidos, nanomateriales, quitosano, ácido hialurónico y similares. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede administrar a las células mediante un vehículo elegido entre un liposoma catiónico, nanopartícula de quitosano, péptido y polímero.

A diferencia de un compuesto de vehículo de administración, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente" se refiere a un disolvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión, o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para administrar uno o más ácidos nucleicos a un sujeto. El excipiente puede ser líquido o sólido y se puede seleccionar, según la forma de administración prevista, para proporcionar el volumen deseado, la consistencia, etc., cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los vehículos farmacéuticos ilustrativos incluyen, por ejemplo, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa, etc.); rellenos (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato sódico, acetato sódico, etc.); desintegrantes (por ejemplo, almidón, glicolato de almidón de sodio, etc.); y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio, etc.). Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en cualquiera de las muchas formas de dosificación posibles, tal como, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, polvos o gránulos. Las composiciones farmacéuticas también se pueden formular como soluciones, suspensiones, emulsiones o medios mixtos.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se pueden formular como una solución. Por ejemplo, el ARNip se puede administrar en una solución sin tampón, tal como, por ejemplo, en solución salina o en agua. En algunas realizaciones, el ARNip también se puede administrar en una solución de tampón adecuada. Por ejemplo, la solución de tampón puede comprender acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la solución tampón puede ser solución salina tamponada con fosfato (PBS). El pH y la osmolalidad de la solución tampón que contiene el ARNip se pueden ajustar para que sean adecuados para su administración a un sujeto.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas también se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas también se pueden formular como emulsiones. Las emulsiones ilustrativas incluyen sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotitas que normalmente exceden 0,1 pm de diámetro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas, y el fármaco activo que puede estar presente como una solución en la fase acuosa, la fase oleosa, o en sí misma como una fase separada. Las microemulsiones también se incluyen como una realización de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas también se pueden formular como formulaciones liposómicas. Tal como se usa en el presente documento, el término "liposoma" se refiere a una vesícula compuesta de lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas. Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada a partir de un material lipófilo y un interior acuoso que contiene la composición que se va a suministrar. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente que se cree que interactúan con moléculas de ácido nucleico cargadas negativamente, por ejemplo, las moléculas de ADN, para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o que están cargados negativamente atrapan al ADN en lugar de formar un complejo con este. Se pueden usar tanto liposomas catiónicos como no catiónicos para administrar las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento a las células.

Los liposomas también incluyen liposomas "estabilizados estéricamente", que pueden tener uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en los liposomas, dan como resultado una mayor vida útil en la circulación en relación con los liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente incluyen aquellos en los que parte de la porción lipídica formadora de vesículas del liposoma comprende uno o más glucolípidos o se derivatiza con uno o más oligómeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG).

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también pueden incluir tensioactivos. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas también pueden emplear diversos potenciadores de la penetración para efectuar la administración eficaz de ácidos nucleicos. Además de ayudar a la difusión de fármacos no lipofílicos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también pueden mejorar la permeabilidad de los fármacos lipofílicos. Los potenciadores de la penetración ilustrativos incluyen tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes.

VI. Métodos de uso

Se desvela un método de modular, por ejemplo, inhibir, la expresión de ADAMTS-5 o ADAM17 in vitro, tal como, por ejemplo, en una solución o un sistema libre de células (por ejemplo, un lisado celular o en un sistema reconstituido), o en una célula, tal como, por ejemplo, ex vivo en una célula en cultivo (por ejemplo, una célula que expresa ADAMTS-5 o ADAM17), o in vivo en una célula dentro de un sujeto. En algunas realizaciones, el método puede comprender poner en contacto una célula con un ARNip, un ácido nucleico que codifica el ARNip, o una composición farmacéutica que comprende el ARNip, en una cantidad eficaz para inhibir la expresión de ADAMTS-5 o ADAM17 en la célula. Se desvela un método de modular, por ejemplo, inhibir, la expresión de una citocina inflamatoria in vitro, tal como, por ejemplo, en una solución o un sistema libre de células (por ejemplo, un lisado celular o en un sistema reconstituido), o en una célula, tal como, por ejemplo, ex vivo en una célula en cultivo (por ejemplo, una célula que expresa ADAMTS-5 o ADAM17), o in vivo en una célula dentro de un sujeto. En algunas realizaciones, el método puede comprender poner en contacto una célula con un ARNip, un ácido nucleico que codifica el ARNip, o una composición farmacéutica que comprende el ARNip, en una cantidad eficaz para inhibir la expresión de la citocina inflamatoria en la célula. En algunas realizaciones, la citocina inflamatoria se puede elegir de t Nf , COX-2 e IL-1 p.

En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula de mamífero (tal como, por ejemplo, una célula de rata, una célula de ratón o una célula humana), un sinoviocito o una célula recombinante. En algunas realizaciones, la célula puede ser una célula humana. El sujeto puede ser un mamífero, tal como, por ejemplo, una rata, ratón o humano. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto puede padecer una enfermedad asociada a ADAMTS-5 o ADAM17, tal como, por ejemplo, una enfermedad relacionada con la inflamación, o tiene riesgo de desarrollar dicha enfermedad. Las enfermedades ilustrativas relacionadas con la inflamación incluyen, por ejemplo, artritis, incluida la artrosis, artritis reumatoide, artritis infecciosa crónica, espondilitis, artritis psoriásica y gota. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser artritis. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser artrosis. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria puede ser artritis reumatoide.

Se da a conocer un método para modular, por ejemplo, inhibir, la expresión del gen de ADAMTS-5 y/o ADAM17 en un sujeto. En algunas realizaciones, el método puede comprender administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNip, un ácido nucleico que codifica el ARNip, o una composición farmacéutica que comprende el ARNip, a un sujeto de manera que se inhiba la expresión del gen diana de ADAMTS-5 y/o ADAM17. En algunas realizaciones, el método puede comprender administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene dos o más moléculas de ARNip diferentes, una dirigida contra el gen de ADAMTS-5 y la otra dirigida contra el gen ADAM17 del sujeto que se va a tratar. El sujeto puede ser un mamífero, tal como, por ejemplo, una rata, ratón o humano. En algunas realizaciones, el sujeto puede ser un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto puede tener una enfermedad asociada a ADAMTS-5 o ADAM17, tal como, por ejemplo, una enfermedad relacionada con la inflamación, o tiene riesgo de desarrollar dicha enfermedad. Las enfermedades ilustrativas relacionadas con la inflamación incluyen, por ejemplo, artritis, incluida la artrosis, artritis reumatoide, artritis infecciosa crónica, espondilitis, artritis psoriásica y gota. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser artritis. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser artrosis. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria puede ser artritis reumatoide.

La invención proporciona la composición farmacéutica de la invención para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad relacionada con la inflamación. Se describe el uso de al menos un ARNip (tal como, por ejemplo, ADAMTS-5-ARNip, ADAM17-ARNip, o una combinación de los mismos), un ácido nucleico que codifica el ARNip, o una composición farmacéutica que comprende el ARNip, por ejemplo, para prevenir o tratar enfermedades relacionadas con la inflamación, tal como, por ejemplo, artritis, incluida la artrosis, artritis reumatoide, artritis infecciosa crónica, espondilitis, artritis psoriásica y gota. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser artritis. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser artrosis. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmunitaria puede ser artritis reumatoide. Los ARNip o los ácidos nucleicos codificantes o las composiciones farmacéuticas se pueden usar para prevenir o tratar afecciones o síntomas de enfermedades asociadas con ADAMTS-5 o ADAM17 que incluyen, por ejemplo, fibrosis articular, erosión de cartílago, pérdida de colágeno del cartílago, daño de las superficies del cartílago articular, sinovitis, inflamación en cápsulas articulares, dolor de articulaciones, engrosamiento de los ligamentos articulares, osificación del menisco y desorganización de las células del cartílago. Los ARNip o los ácidos nucleicos codificantes o las composiciones farmacéuticas también se pueden usar en el tratamiento de un sujeto que tiene artritis asociada con TNF-a o COX-2 o IL-1 p. Los usos ilustrativos de los ARNip o los ácidos nucleicos codificantes o las composiciones farmacéuticas también incluyen, por ejemplo, inhibir la degradación de la matriz extracelular; regular la expresión de citocinas inflamatorias, la migración de células inmunes y la transducción de señales inflamatorias; proteger el cartílago, el líquido sinovial, las articulaciones y los huesos. Los ARNip o los ácidos nucleicos codificantes o las composiciones farmacéuticas también se pueden utilizar para el tratamiento o alivio del dolor, por ejemplo, dolor de huesos o dolor de articulaciones. Se desvela el uso de ARNip en la preparación de un medicamento para prevenir o tratar las enfermedades, afecciones o síntomas descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el uso o método descrito en el presente documento puede comprender administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un ARNip, un ácido nucleico que codifica el ARNip, o una composición farmacéutica que comprende el ARNip a un sujeto que padece o tiene riesgo de desarrollar cualquiera de estas enfermedades, afecciones o síntomas.

En diversas realizaciones, el ARNip se administrará en dosis suficientes para inhibir la expresión de ADAMTS-5 o ADAM17. Por ejemplo, una dosis adecuada de un ARNip puede oscilar entre aproximadamente 20 y aproximadamente 1000 nmol por kilogramo (kg) de peso corporal del receptor por dosis única. En algunas realizaciones, la dosis puede oscilar entre aproximadamente 40 y aproximadamente 500 nmol por kg de peso corporal por dosis única. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede administrar a una dosis de aproximadamente 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 nmol por kg de peso corporal por dosis única. La composición farmacéutica se puede administrar en una sola dosis o con cierta frecuencia de repetición. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede administrar una o más veces al día, o en intervalos más largos, tal como, por ejemplo, semanalmente, quincenalmente, mensualmente o anualmente. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar dos veces por semana. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar a intervalos regulares durante un período de tiempo corto, por ejemplo, diariamente o semanalmente durante dos semanas o menos. En algún caso, la composición farmacéutica se puede administrar de forma intermitente durante un período de tiempo más largo.

En algunas realizaciones, los ARNip descritos en el presente documento se pueden usar en combinación con otros compuestos farmacéuticamente activos, incluyendo compuestos capaces de mejorar el efecto de los ARNip descritos en el presente documento, tal como, por ejemplo, otros ARNip o agentes antiinflamatorios. En algunas realizaciones, el ARNip se puede administrar de manera simultánea o secuencial a otra terapia con fármacos, tal como, por ejemplo, corticoesteroides, ácido hialurónico o una sal del mismo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE, tal como, por ejemplo, ibuprofeno, paracetamol), fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FAME, tal como, por ejemplo, metotrexato), medicamentos para la artrosis modificadores de la enfermedad (DMOAD, por sus siglas en inglés), agentes protectores del cartílago (tal como, por ejemplo, glucosamina, condroitín sulfato).

En algunas realizaciones, los ARNip descritos en el presente documento se pueden usar en combinación con uno o más reactivos (tales como, por ejemplo, moléculas pequeñas, anticuerpos monoclonales, reactivos de ARNi, etc.) capaces de regular las citocinas inflamatorias, los factores inmunes o el proceso inflamatorio. Los reactivos ilustrativos incluyen, por ejemplo, inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib), antagonistas de TNF-a (por ejemplo, etanercept, adalimumab, infliximab), inhibidores de JAK3, inhibidores de interleucina. En algunas realizaciones, los ARNip descritos en el presente documento también se pueden usar con uno o más agentes terapéuticos auxiliares, tal como, por ejemplo, analgésicos o calmantes (por ejemplo, dipirona); o se puede usar en combinación con ARNip dirigido contra otros genes. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden combinar con otras terapias, tal como, por ejemplo, cirugía (por ejemplo, trasplante de cartílago, etc.), inmunosupresión, radioterapia y fisioterapia.

VII. Kits

Se desvelan kits para usar cualquiera de los ARNip y/o realizar cualquiera de los métodos desvelados en el presente documento. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir uno o más ARNip e instrucciones de uso, por ejemplo, instrucciones para inhibir la expresión de ADAMTS-5 o ADAM17 en una célula al poner en contacto la célula con el ARNip en una cantidad eficaz para inhibir la expresión de ADAMTS-5 o ADAM17, o instrucciones para tratar o prevenir una enfermedad por ADAMTS-5 o ADAM17 en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del(los) ARNip(s) al sujeto. En algunas realizaciones, la instrucción puede grabarse en un soporte legible. En algunas realizaciones, la instrucción puede comprender la descripción de la administración de los ARNip, ácidos nucleicos que codifican ARNip o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento en un sitio donde se produce la inflamación.

Opcionalmente, los kits pueden comprender además medios para poner en contacto la célula con el ARNip o administrar el ARNip a un sujeto (por ejemplo, un dispositivo de inyección, tal como un dispositivo para inyección articular o intraarticular), o medios para medir la inhibición de ADAMTS-5 o ADAM17 (por ejemplo, medios para medir la inhibición de ARNm de ADAMt S-5 o ADAM17). Dichos medios para medir la inhibición de AdAMTS-5 o ADAM17 pueden comprender un medio para obtener una muestra de un sujeto, tal como, por ejemplo, una muestra de sangre o una muestra de líquido articular. En algunas realizaciones, la muestra de líquido articular puede ser de, por ejemplo, las manos, los pies, las muñecas, los codos o los tobillos. Opcionalmente, los kits pueden comprender además medios para administrar el ARNip a un sujeto o medios para determinar la cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o prueba de los ARNip y los métodos presentados en la invención, a continuación se describen los métodos y materiales adecuados. Además, los materiales, los métodos y los ejemplos son solamente ilustrativos y no tienen por objeto ser limitantes.

VIII. Ejemplos

Cuando no se dan instrucciones específicas, los materiales y reactivos de los ejemplos se pueden obtener de fuentes comerciales. Se usaron los siguientes materiales y reactivos en los ejemplos: células hFLS de artrosis (Hospital de Medicina Tradicional China de Guangdong); células 293T (ATCC, número de catálogo CRL-3216); células MCF-7 (ATCC, número de catálogo HTB-22); kit ELISA de IL-1 p AssayMax™ (AssayPro, número de catálogo EI2200-1); vector de expresión pGCsi-H1/Neo (Genscript, también publicado en Ji et al, "Construction and identification of small hairpin RnA gene Smad4 /DPC4 plasmids", Medical Study, 2006, 19(11 ):973-977); Kit Lipofectamine®2000 (Invitrogen); ratas macho Sprague Dawley® (SD) (220 ± 20 g, Centro Médico de Animales Experimentales de Guangdong).

A menos que se identifique específicamente, en los ejemplos se usaron ARNip bicatenarios y como solución para inyección se usó solución salina tamponada con fosfato (PBS). A menos que se identifique específicamente, todas las células hFLS mencionadas en los ejemplos se refieren a células hFLS de artrosis.

Ejemplo 1

Detección de ARNip para inhibir la expresión de ADAMTS-5

Diseño de ARNip

Los ARNip dirigidos contra ADAMTS-5 se diseñaron utilizando técnicas bioinformáticas, por ejemplo, alineación BLAST®. El proceso de diseño utilizó la secuencia de ARNm de ADAMTS-5 en humanos (número de referencia NM_007038.3, SEQ ID NO: 191), rata (número de referencia NM_198761.1, SEQ ID NO: 192) o ratón (número de referencia NM_011782, SEQ ID NO: 193). Para garantizar la especificidad de cada ARNip elegido dirigido contra ADAMTS-5, lo que significa que la secuencia elegida solo se dirige al gen deseado, pero no a ningún otro gen, el análisis de homología de secuencia se llevó a cabo utilizando BLAST®. Sólo se eligieron las secuencias con la máxima divergencia de secuencia de la lista de genes con identidad de secuencia parcial con la diana de ARNm pretendida. Se identificaron ocho ARNip capaces de inhibir la expresión de ADAMTS-5, ARNip-RB-01, ARNip-RB-02, ARNip-RB-03, ARNip-RB-04, ARNip-RB-05, ARNip-RB-06, ARNip-RB-07 y ARNip-RB-08. Las ocho secuencias podrían dirigirse a ADAMTS-5 humana, de rata y de ratón. Síntesis de ARNip

El 5'-O-(4,4'-dimetoxitritil)-2'-O-t-butildimetilsilil-3'-O-(2-cianoetil-N,N -diisopropil)ARN, 2'-desoxi-ADN fosforamidita, 2'-O-metil fosforamidita, los monómeros de 6-N-benzoiladenosina (A-Bz), 4-N-acetilcitidina (C-Ac), 2-N-isobutirilguanosina (G-iBu) y uridina (U) se encargaron de Proligo. La 2'-desoxi-2'-fluoro fosforamidita, 5-metil-2'-desoxicitidina, las fosforamiditas modificadas por fluorescencia en Cy5 se encargaron de Thermo Fisher. La 2'-O-TBDMS-inosina, fosforamiditas de colesterol, benzoditiol-3-ona-1,1-dióxido (reactivo de Beaucage), el modificador de tiol C6 S-S y el soporte sólido CPG se encargaron de Chemgenes. El péptido ciclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys (PEG-MAL)] (cRGD) se adquirió de Peptides International Inc. El ácido nucleico bloqueado, el ácido nucleico desbloqueado y las fosforamiditas modificadas con galactosa fueron proporcionadas por los Institutos de Biomedicina y Salud de Guangzhou, Academia China de Ciencias. Los otros disolventes y reactivos se compraron a Aladdin Reagents.

Todas las síntesis se llevaron a cabo en un sintetizador de ADN ABI 394 usando protocolos estándar con una etapa de acoplamiento prolongado de 2-10 min. En cada ciclo de acoplamiento se utilizaron un exceso de 10 a 40 veces de fosforamiditas y un exceso de 150 a 300 veces de 5-(etiltio)-1H-tetrazol. La escala de síntesis fue de 1 jmol. Los rendimientos de acoplamiento promedio monitoreados por trity fueron del 95-98 %. Los oligoribonucleótidos unidos a CPG se transfirieron desde la columna de síntesis a un vial de vidrio con tapón de rosca de 5 ml. Se añadieron 2-3 ml de amoniaco etanólico y se calentó a 55 °C durante 12-16 h. Después de enfriar a -20 °C, el amoníaco etanólico se eliminó de las perlas de CPG y las perlas de CPG se lavaron con etanol:agua a 50:50. Se secaron los sobrenadantes combinados que contenían los oligorribonucleótidos. Para eliminar los grupos protectores 2'-O-TBDMS, se añadieron 200 |jl a 1 ml de TBAF/THF 1 M y se incubaron a temperatura ambiente durante 12-24 horas. Después, la solución se añadió directamente a 2-10 ml de TEAB 0,1 M y se cargó en una columna de desalación. La cantidad de oligonucleótidos se midió mediante un detector de UV; la masa de oligonucleótidos se determinó mediante el sistema Oligo HTCS LC-MS (Novatia). Los conjugados de ARNip del péptido cRGD se prepararon siguiendo el protocolo documentado en Liu, et al., "Tumor-targeted in vivo gene silencing via systemic delivery of cRGD-conjugated siRNA" Nucleic Acids Res., 42(18):11805-17 (2014). Las hebras dobles se hibridaron a 95 °C durante 3 min y se enfriaron lentamente a 20 °C, proporcionando el ARNip deseado para su uso ex vivo. Se realizaron más desalinizaciones y filtraciones con protocolos estándar para su uso in vivo. Transfección celular

El experimento se llevó a cabo en diez grupos, incluyendo un grupo de control sin diana (CSD), un grupo de control negativo (CN), y ocho grupos experimentales, ARNip-RB-01 a ARNip-RB-08.

Los grupos experimentales: las células hFLS se digirieron con tripsina al 0,25 %. Luego, la suspensión celular a una densidad de 104 células/ml se sembró en placas de 12 pocillos con 500 j l por pocillo. Cuando las células hFLS crecieron hasta la fase logarítmica (es decir, crecieron hasta un 80 % de confluencia), se transfectaron los ARNip (50 nM para selección de dosis única) en las células con lipofectamine®2000 usando el protocolo proporcionado por el fabricante.

El grupo CSD: Se utilizó el siguiente ARNip aleatorio inespecífico, con las etapas restantes sin cambios de los grupos experimentales:

Hebra sentido: 5'-AGAUCGUUAGUUAGGUUGCdTdT-3' (SEQ ID NO: 175)

Hebra antisentido: 5'-GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3' (SEQ ID NO: 176)

El grupo CN: No se transfectó ARNip, con las etapas restantes sin cambios de los grupos experimentales.

PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)

24 horas después de la transfección, las células se recolectaron por centrifugación a 1000 rpm durante 5 min para eliminar el sobrenadante. Luego se extrajo el ARN usando TRIzol®. El ARN extraído se transcribió de forma inversa en ADNc. La qPCR se realizó utilizando el ADNc como molde y los siguientes cebadores D e I. Se utilizó p-actina como gen de referencia.

D: 5'-CTGCTCCCAGAAACAACG-3' (SEQ ID NO: 177)

I: 5'-ATTCAGTGCCATCGGTCA-3' (SEQ ID NO: 178)

La FIG. 1 ilustra la inhibición de la expresión de ADAMTS-5 por los ocho ARNip. Tal como se indica en la FIG. 1, ARNip-RB-04 fue el más eficaz para inhibir la expresión de ARNm de ADAMTS-5 en células hFLS, reduciendo el nivel de expresión en un 90 %.

Las secuencias sentido y antisentido de ARNip-RB-04 son:

Hebra sentido de ARNip-RB-04:

5'-GGAUUUAUGUGGGCAUCAU-3' (SEQ ID NO: 1)

Hebra antisentido de ARNip-RB-04:

5'-AUGAUGCCCACAUAAAUCC-3' (SEQ ID NO: 2)

Análisis por transferencia de Western

El análisis por transferencia de Western se realizó en las células hFLS de los grupos ARNip-RB-04, CSD y CN. Se desechó el medio celular y las células se lavaron con PBS 2 veces. A continuación, se descartó el PBS y se añadió una cantidad apropiada de tampón de lisis a 2X preenfriado. Después de que las células se rasparon con un raspador de células y posteriormente se incubaron en hielo durante 30 minutos, las muestras se centrifugaron a 4 °C a 12000 g durante 15 min. La concentración de proteínas en el sobrenadante se detectó mediante el método de Bradford. Después de ajustar la concentración final de la proteína a 2 pg/pl, las muestras se pueden almacenar a -80 °C para su futuro uso. Se mezclaron 12 pg de muestra de proteína total con un volumen igual de tampón de carga a 2X, se incubaron en lote de agua hirviendo durante 10 min y se almacenaron a 4 °C. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel con gel de separación SDS-PAGE al 10 % y gel de apilamiento al 5 %. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF a 4 °C con una corriente de 400 mA durante 2 h.

Los resultados se muestran en la FIG. 2. "Control" significa el grupo CN, "sin diana" el grupo CSD, y "ARNip" el grupo ARNip-RB-04. La FIG. 2 muestra que ARNip-RB-04 redujo eficazmente el nivel de expresión de la proteína ADAMTS-5. Por tanto, se tomó ARNip-RB-04 para análisis posterior.

Cribado por CI⁵⁰

CI⁵⁰(concentración de ARNip que da como resultado una inhibición del 50 % de la expresión de ARNm de ADAMTS-5 en comparación con el control no tratado) en células hFLS transfectadas con ARNip-RB-04 a concentraciones de 0,01 nM, 0,5 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM y 100 nM. El valor de CI⁵⁰se calculó mediante el programa informático Origin 8.0. El ARNip-RB-04 mostró una CI⁵⁰de 12,6 nM. El nivel de expresión de ARNm de a Da MTS-5 presentó un perfil dependiente de la dosis de ARNip, reducido el 16 %, el 19 %, el 36 %, el 39 %, el 41 %, el 63 %, el 73 % y el 74 % en concentraciones anteriores, respectivamente.

Ejemplo 2

Inhibición de la expresión de citocinas inflamatorias por ARNip

El experimento se llevó a cabo en los siguientes grupos:

Grupo experimental hFLS-ARNip-RB-04: Se sembraron células primarias de hFLS en placas de 6 pocillos. Cuando crecen al 50 % de confluencia, las células se transfectaron con ARNip-RB-04 (50 nM para cribado de dosis única) con Lipofectamine®2000 utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante.

Grupos experimentales 293T-ARNip-RB-04: Se sembraron células 293T primarias en placas de 6 pocillos. Cuando crecen al 50 % de confluencia, las células se transfectaron con ARNip-RB-04 (50 nM para cribado de dosis única) con Lipofectamine®2000 utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante.

Grupo hFLS-control sin diana (CSD): Las células hFLS se transfectaron con el siguiente ARNip no específico aleatorio, con las etapas restantes sin cambios del grupo hFLS-ARNip-RB-04.

Hebra sentido: 5'-AGAUCGUUAGUUAGGUUGCdTdT-3' (SEQ ID NO: 175)

Hebra antisentido: 5'-GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3' (SEQ ID NO: 176)

293T-Grupo de control sin diana (CSD): Se transfectaron células 293T con el siguiente ARNip inespecífico aleatorio, con las etapas restantes sin cambios del grupo 293T-ARNip-RB-04.

Hebra sentido: 5'-AGAUCGUUAGUUAGGUUGCdTdT-3' (SEQ ID NO: 175)

Hebra antisentido: 5'-GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3' (SEQ ID NO: 176)

Grupo hFLS-control negativo (CN): No se transfectó ARNip, con las etapas restantes sin cambios del grupo hFLS ARNip-RB-04.

293T-Grupo de control negativo (CN): No se transfectó ARNip, con las etapas restantes sin cambios del grupo 293T-ARNip-RB-04.

24 horas después de la transfección, las células de cada grupo se cultivaron en un medio sin suero para el cultivo por inanición durante 24 h. Las células fueron estimuladas por IL-1a con una concentración final de 10 ng/ml durante 24 h. Se extrajo ARN y se realizó la qPCR con los siguientes cebadores para detectar los niveles de expresión de TNF, COX-2 e Il-1p. Se utilizó p-actina como gen de referencia.

TNF-D: 5'-CGAGTGACAAGCCTGTAGCC-3' (SEQ ID NO: 179)

TNF-I: 5'-TGAAGAGGACCTGGGAGTAGAT-3' (SEQ ID NO: 180)

Cox2-D: 5'-CAGGGTTGCTGGTGGTAGGA-3' (SEQ ID NO: 181)

Cox2-I: 5'-GCATAAAGCGTTTGCGGTAC-3' (SEQ ID NO: 182)

IL-Ip-D: 5'-ACGAATCTCCGACCACCA-3' (SEQ ID NO: 183)

IL-Ip-I: 5'-GGACCAGACATCACCAAGC-3' (SEQ ID NO: 184)

La FIG. 3A muestra que ARNip-RB-04 redujo eficazmente la expresión de ARNm de TNF, COX-2 e IL-1 p en células hFLS y 293T. Específicamente, el nivel de expresión de IL-1 p en células hFLS se redujo en un 89 %.

El sobrenadante celular se recogió para detectar los niveles de IL-1p secretada mediante el kit ELISA de IL-1p humana AssayMax™. Las células de los grupos CSD se dividieron de la siguiente manera:

Grupo hFLS-control sin diana (CSD+): Grupo hFLS-CSD tratado con IL-1a.

Grupo hFLS-control sin diana (CSD-): Grupo hFLS-CSD no tratado con IL-1a.

293T-Grupo de control sin diana (CSD+): Grupo 293T-CSD tratado con IL-1a.

293T-Grupo de control sin diana (CSD-): Grupo 293T-CSD no tratado con IL-1a.

La FIG. 3B muestra que ARNip-RB-04 inhibió la secreción de la proteína IL-1 p a un nivel incluso más bajo que el de los grupos CSD no estimulados.

Ejemplo 3

Inhibición de ADAMTS-5 por ARNip con cierta identidad de secuencia para ARNip-RB-04

El primer conjunto de experimentos utilizó ARNip que tienen la hebra antisentido de ARNip-RB-04 5'-AUGAUGCCCACAUAAAUCC-3' (SEQ ID NO: 2), y una hebra sentido que contiene o tiene cierta identidad de secuencia con la hebra sentido de ARNip-RB-04 5'-GGAUUUAUGUGGGCAUCAU-3' (SEQ ID NO: 1), tal como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Gru o antisentido

continuación

El segundo conjunto de experimentos utilizó ARNip que tienen la hebra sentido de ARNip-RB-04 5'-GGAUUUAUGUGGGCAUCAU-3' (SEQ ID NO: 1), y una hebra antisentido que contiene o tiene cierta identidad de secuencia con la hebra antisentido de ARNip-RB-04 5'-AUGAUGCCCACAUa Aa UCC-3' (SEQ ID NO: 2), tal como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. Gru o sentido

continuación

El tercer conjunto de experimentos utilizó ARNip que tiene una hebra sentido que contiene o tiene cierta identidad de secuencia con la hebra sentido de ARNip-RB-04 5'-GGAUUUAUGUGGGCa Uc AU-3' (SEQ ID NO: 1), y una hebra antisentido que contiene o tiene cierta identidad de secuencia con la hebra antisentido de ARNip-RB-04 5'-AUGAUGCCCACAUAAAUCC-3' (SEQ ID NO: 2), tal como se muestra en la Tabla 3.

Los ARNip de las Tablas 1-3 se introdujeron cada uno en células hFLS, y se detectaron los niveles de expresión de ARNm de ADAMTS-5 usando el método del Ejemplo 1. Los tres conjuntos de experimentos utilizaron los grupos CSD y CN tal como se prepararon en el Ejemplo 1

Tal como se indica en las Tablas 1-3, todos los ARNip en tres grupos redujeron los niveles de expresión de ARNm de ADAMTS-5. Los ARNip más eficaces incluían (1) los ARNip que tienen una hebra antisentido que comprende la SEQ ID NO: 2, y una hebra sentido que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 1; (2) los ARNip que tienen una hebra sentido que comprende la SEQ ID NO: 1 y una hebra antisentido que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 2; y (3) los ARNip que tienen una hebra sentido que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, y una hebra antisentido que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 2. En particular, el ARNip-RB-13 de 21 nt que tiene nucleótidos salientes en 3' redujo el nivel de expresión de ADAMTS-5 en un 91 %. Ejemplo 4

Silenciamiento de ADAMTS-5 con plásmidos que codifican ARNip

Se diseñó un oligonucleótido de ADN que codifica la secuencia de ARNip-RB-04 tal como se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4 Oli onucleótido de ADN ue codifica el ARNi -RB-04

La región complementaria del oligonucleótido de ADN está subrayada. Los nucleótidos 10-28 (negrita) de la SEQ ID NO: 5 codifican la hebra sentido de ARNip-RB-04 (SEQ ID NO: 1). Los nucleótidos 36-54 (negrita) de la SEQ ID NO: 6 codifican la hebra antisentido de ARNip-RB-04 (Se Q ID NO: 2).

Las hebras de ADN tal como se muestran en la Tabla 4 se hibridaron y clonaron en la región entre los sitios de restricción BamHI y HindIII del vector de expresión de ARNip pGCsi-H1/Neo para obtener un plásmido de expresión de ARNip recombinante, Vector 1.

El experimento se realizó en los siguientes grupos:

Grupo experimental: las células hFLS se sembraron en placas de 6 pocillos un día antes de la transfección. Se introdujo el vector 150 nM en las células hFLS con Lipofectamine® 2000 utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante. Las células se recogieron después de la transfección durante 48 horas y se detectó el nivel de expresión de ARNm de ADAMTS-5 mediante el método del Ejemplo 1.

Grupo de control sin diana (CSD): El ADN que codifica el siguiente ARNip aleatorio inespecífico se clonó en pGCsi-H1/Neo, con las etapas restantes sin cambios del grupo experimental.

Hebra sentido: 5'-AGAUCGUUAGUUAGGUUGCdTdT-3' (SEQ ID NO: 175)

Hebra antisentido: 5'-GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3' (SEQ ID NO: 176)

Grupo de control negativo (CN): Se utilizó el plásmido pGCsi-H1/Neo original sin el fragmento de interferencia, con las etapas restantes sin cambios del grupo experimental Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Niveles de expresión relativa de ADAMTS-5

Grupo experimental Grupo CN Grupo CSD

0,20±0,02 1,15±0,18 0,97±0,15

La Tabla 5 demuestra que la transfección de ADN que codifica ARNip-RB-04 también silenció eficazmente ADAMTS-5.

Ejemplo 5

Silenciamiento de ADAMTS-5 mediante ARNip modificados químicamente

El ARNip-RB-13 y el ARNip-RB-04 se sometieron a diversos tipos o combinaciones de modificaciones químicas tal como se muestra en las Tablas 6 y 7 para aumentar aún más la estabilidad y el efecto de interferencia de las moléculas de ARNip.

Tabla 6. Modificaciones uímicas

La modificación del fosforotioato (enlace P-S) se ilustra en la FIG. 4. La modificación de ANB formó una estructura cíclica entre 2'-O y 4'-C en una ribosa o desoxirribosa. Se utilizó polipéptido RGD (N'-Arg-Gly-Asp-C', Sigma). "A" representa cualquier nucleótido.

Tabla 7. Silenciamiento de ADAMTS-5 mediante ARNi modificados uímicamente

continuación

continuación

continuación

Se transfectó ARNip químicamente modificado tal como se muestra en la Tabla 7 en células hFLS, y se determinaron los niveles de expresión de ARNm de ADAMTS-5 mediante el método del Ejemplo 1. Cuando se usaron los ARNip modificados con colesterol, polipéptidos o galactosa, no se añadió reactivo de transfección.

Los resultados de la Tabla 7 muestran que el ARNip-RB-13 y el ARNip-RB-04 con modificaciones químicas apropiadas silenciaron efectivamente ADAMTS-5.

Ejemplo 6

Estabilización de ARNip en suero mediante modificaciones químicas

La estabilidad sérica de los ARNip modificados químicamente en el ejemplo 5 se determinó tal como sigue: se añadió suero de rata fresco de igual volumen en ARNip 5 pM diluido con agua libre de ribonucleasa. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min y se sometió a electroforesis para comprobar la integridad de los ARNip.

Tal como se muestra en la FIG. 5, después de 30 min de incubación en suero de rata, se degradó una cantidad significativa de ARNip-RB-13 sin modificar, mientras que las moléculas químicamente modificadas ARNip-RB-41, ARNip-RB-40 y ARNip-RB-35 no mostraron signos de degradación.

Ejemplo 7

Eficacia de los ARNip en el tratamiento del modelo de artritis en ratas

Se construyó un modelo de artritis en ratas utilizando colágeno bovino tipo II para promover la formación de artritis, incluidos los síntomas de la artrosis. Se inyectó colágeno bovino tipo II (4 mg/ml, Sigma) en la cavidad articular de ratas SD macho (220 ± 20 g) a 100 pl por pata, en total, 200 pl por animal.

3d después de la inyección de colágeno bovino tipo II, las ratas artríticas se dividieron al azar en cuatro grupos con ocho ratas en cada grupo de la siguiente manera: Grupo PBS, inyectado con 100 pl de control de PBS y ARNip-RB-40, grupos experimentales ARNip-RB-35 y ARNip-RB-41, inyectados con solución de ARNip 10 nmol (100 pl) a 50 pl por pata. El control o ARNip se administró a cada grupo dos veces por semana durante dos semanas.

Se sacrificaron cuatro ratas de cada grupo el día después de la cuarta administración, y las articulaciones de la rodilla se fijaron en una solución de conservación de tejido para la tinción con hematoxilina-eosina (HE) o azul de toluidina (TB) utilizando un procedimiento estándar y se analizaron por microscopía óptica para determinar cambios histológicos en la estructura del tejido.

Los resultados se muestran en la FIG. 6, en la que A y B representan la tinción de HE y TB (20x) del grupo PBS, C y D representan la tinción de HE y TB (10x) del grupo PBS; E y F representan la tinción de HE y TB (20x) del grupo ARNip-RB-35, G y H representan la tinción de HE y TB (10x) del grupo ARNip-RB-35; I y J representan la tinción de HE y TB (20x) del grupo ARNip-RB-40, K y L representan la tinción de HE y TB (10x) del grupo ARNip-RB-40; M y N representan la tinción de HE y TB (20x) del grupo ARNip-RB-41, O y P representan tinción de HE y TB (10x) del grupo ARNip-RB-41.

La FIG. 6 demuestra que después de dos semanas de administración, el grupo de PBS mostró los siguientes síntomas inflamatorios: osificación en la capa superficial del cartílago del menisco y el cartílago articular, disposición desordenada de las células del cartílago y pérdida grave de colágeno, proyecciones de fibrosis en forma de dedos en la cavidad articular e hiperplasia del tejido conectivo en la cápsula articular. En comparación con el grupo PBS, la administración de ARNip-RB-40 dio como resultado superficies articulares lisas, sólo una pequeña cantidad de hiperplasia de fibrosis local en la cápsula articular y células de cartílago ordenadas sin pérdida significativa de colágeno. En el grupo de ARNip-RB-35, se produjo pérdida parcial de colágeno y fibrosis de la superficie articular, sin embargo, la estructura de las capas meniscal y cartilaginosa permaneció intacta. El grupo ARNip-RB-41 mantuvo superficies articulares lisas y estructuras de capa de cartílago intactas, con calcificación local del menisco y del cartílago y sin estructura visible de fibrosis.

Los resultados muestran que ARNip-RB-40, ARNip-RB-35 y ARNip-RB-41 inhibieron la progresión de la artrosis en ratas, que alivia diversos síntomas que incluyen, por ejemplo, fibrosis de la superficie articular, erosión del cartílago y sinovitis. Por lo tanto, los ARNip descritos en el presente documento pueden surgir como posibles agentes terapéuticos para tratar enfermedades de la artritis.

Ejemplo 8

Eficacia de los ARNip en la inhibición de factores inmunitarios en articulaciones de rata

Los grupos PBS, ARNip-RB-35, ARNip-RB-40 y ARNip-RB-41 se establecieron como en el Ejemplo 7, excepto que se inyectó ARNip empaquetado en nanopartículas de quitosano en el grupo ARNip-RB-35.

Los animales se sacrificaron al día siguiente de la cuarta dosis y las articulaciones de las rodillas se congelaron con nitrógeno líquido. Se extrajo ARN de las articulaciones de la rodilla congeladas y se llevó a cabo la transcripción inversa utilizando el Mini Kit RNeasy® (QIAGEN). Los niveles de expresión de ARNm de ADAMTS-5 y ADAM17 se determinaron usando el método de los Ejemplos 1 y 9, respectivamente. Los niveles de expresión de TNF, COX-2 e IL-1p se determinaron usando el método del Ejemplo 2.

Los resultados se muestran en la FIG. 7, donde "Normal" representa el grupo de control de rata SD macho sana, y "Modelo" representa el grupo PBS. La FIG. 7 demuestra que en comparación con el grupo normal, los niveles de expresión de ADAMTS-5, ADAM17, TNF, COX-2 e IL-1p aumentaron en el grupo PBS. Por el contrario, ARNip-RB-40, ARNip-RB-35 y ARNip-RB-41 redujeron significativamente los niveles de expresión de estos factores inmunes, protegiendo así el cartílago y el líquido sinovial. Basándose en estos resultados, los ARNip descritos en el presente documento se pueden usar para prevenir y/o tratar eficazmente enfermedades relacionadas con la inflamación. Ejemplo 9

Detección de los ARNip para inhibir la expresión de ADAM17

Diseño de ARNip

Los ARNip dirigidos contra ADAM 17 se diseñaron utilizando técnicas bioinformáticas, por ejemplo, alineación BLAST®. El proceso de diseño utilizó la secuencia de ARNm de ADAM17 en humanos (número de referencia NM_003183, SEQ ID NO: 194), rata (número de referencia NM_020306, SEQ ID NO: 195) o ratón (número de referencia NM_001277266, SEQ ID NO: 196; NM_001291871, SEQ ID NO: 197; o NM_009615, SEQ ID NO: 198). La especificidad de los ARNip dirigidos contra ADAM17 se aseguró como en el Ejemplo 1. Se identificaron ocho ARNip capaces de inhibir la expresión de ADAM17, ARNip-AD-01, ARNip-AD-02, ARNip-AD-03, ARNip-AD-04, ARNip-AD-05, ARNip-AD-06, ARNip-AD-07 y ARNip-AD-08. Síntesis de ARNip

Los ARNip dirigidos contra ADAM17 se sintetizaron como en el Ejemplo 1. Transfección celular

El experimento se llevó a cabo en diez grupos, incluyendo un grupo de control sin diana (CSD), un grupo de control negativo (CN), y ocho grupos experimentales, ARNip-AD-01 a ARNip-AD-08.

Los grupos experimentales: las células hFLS se digirieron con tripsina al 0,25 %. Luego, la suspensión celular a una densidad de 104 células/ml se sembraron en placas de 12 pocillos con 500 pl por pocillo. Cuando las células hFLS crecieron hasta la fase logarítmica (es decir, crecieron hasta un 80 % de confluencia), Se transfectaron ARNip (50 nM para el cribado de dosis única) en las células con Lipofectamine®2000 usando el protocolo proporcionado por el fabricante.

Hebra sentido: 5'-AGUAUGCCACAUAAGCAUCdTdT-3' (SEQ ID NO: 185)

Hebra antisentido: 5'-GAUGCUUAUGUGGCAUACUdTdT-3' (SEQ ID NO: 186)

PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)

24 horas después de la transfección, las células se recolectaron por centrifugación a 1000 rpm durante 5 min para eliminar el sobrenadante. Luego se extrajo el ARN usando TRIzol®. El ARN extraído se transcribió de forma inversa en ADNc. La qPCR se realizó usando el ADNc como molde y los siguientes cebadores ADAM17-F1 y ADAM17-R1. Se utilizó p-actina como gen de referencia.

ADAM17-F1: 5'-GGACCAGGGAGGGAAATA-3' (SEQ ID NO: 187)

ADAM17-R1: 3'-TTGCTGTGGACGACGTTG-5' (SEQ ID NO: 188)

La FIG. 8 ilustra la inhibición de la expresión de ADAM17 por los ocho ARNip. Tal como se indica en la FIG. 8, el ARNip-AD-08 fue el más eficaz para inhibir la expresión de ARNm de ADAM17 en células hFLS, reduciendo el nivel de expresión en un 86 %.

Las secuencias sentido y antisentido de ARNip-AD-08 son:

Hebra sentido de ARNip-AD-08:

5'-GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3' (SEQ ID NO: 7)

Hebra antisentido de ARNip-AD-08:

5'-UUGUUCAGAUACAUGAUGC-3' (SEQ ID NO: 8)

Análisis por transferencia de Western

El análisis por transferencia de Western se realizó en las células hFLS del ARNip-AD-08, Grupos CSD y CN. Se desechó el medio celular y las células se lavaron con PBS 2 veces. A continuación, se descartó el PBS y se añadió una cantidad apropiada de tampón de lisis a 2X preenfriado. Después de que las células se rasparon con un raspador de células y posteriormente se incubaron en hielo durante 30 minutos, las muestras se centrifugaron a 4 °C a 12000 g durante 15 min. La concentración de proteína en el sobrenadante se detectó mediante el método de Bradford. Después de ajustar la concentración final de la proteína a 2 pg/pl, las muestras se pueden almacenar a -80 °C para su futuro uso. Se mezclaron 12 pg de muestra de proteína total con un volumen igual de tampón de carga a 2X, incubados en lote de agua hirviendo durante 10 min y almacenados a 4 °C. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel con gel de separación SDS-PAGE al 10 % y gel de apilamiento al 5 %. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF a 4 °C con una corriente de 400 mA durante 2 h.

Los resultados se muestran en la FIG. 9. "Control" significa el grupo CN, "sin diana" el grupo CSD, y "ARNip" el grupo ARNip-AD-08. La FIG. 9 muestra que el ARNip-AD-08 redujo eficazmente el nivel de expresión de la proteína ADAM17. Por tanto, se tomó el ARNip-AD-08 para un análisis posterior.

Cribado por CI⁵⁰

La CI ⁵⁰(concentración de ARNip que da como resultado un 50 % de inhibición de la expresión de ARNm de ADAM17 en comparación con el control no tratado) se determinó en células hFLS transfectadas con ARNip-AD-08 a concentraciones de 0,01 nM, 0,1 nM, 0,5 nM, 2,5 nM, 25 nM, 50 nM y 100 nM. El valor de CI⁵⁰se calculó mediante el programa informático Origin 8.0. El ARNip-AD-08 mostró una CI⁵⁰de 0,25 nM. El nivel de expresión de ARNm de ADAM17 presentó un perfil dependiente de la dosis de ARNip, reducido el 26 %, el 39 %, el 77 %, el 84 %, el 87 %, el 89 % y el 91 % en las concentraciones anteriores, respectivamente.

Ejemplo 10

Inhibición de la expresión de citocinas inflamatorias por ARNip

El experimento se llevó a cabo en los siguientes grupos:

Grupos experimentales de hFLS-ARNip-AD-08: Se sembraron células primarias de hFLS en placas de 6 pocillos. Cuando crecen al 50 % de confluencia, las células se transfectaron con ARNip-AD-08 (50 nM para cribado de dosis única) con Lipofectamine®2000 utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante.

Grupos experimentales MCF7-ARNip-AD-08: Se sembraron células MCF7 primarias en placas de 6 pocilios. Cuando crecen al 50 % de confluencia, las células se transfectaron con ARNip-AD-08 (50 nM para cribado de dosis única) con Lipofectamine®2000 utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante.

Grupo hFLS-control sin diana (CSD): Las células hFLS se transfectaron con el siguiente ARNip no específico aleatorio, con las etapas restantes sin cambios del grupo hFLS-ARNip-AD-08.

Hebra sentido: 5'-AGUAUGCCACAUAAGCAUCdTdT-3' (SEQ ID NO: 185)

Hebra antisentido: 5'-GAUGCUUAUGUGGCAUACUdTdT-3' (SEQ ID NO: 186)

Grupo MCF7-Control sin diana (CSD): Se transfectaron células MCF7 con el siguiente ARNip inespecífico aleatorio, con las etapas restantes sin cambios del grupo hFLS-ARNip-AD-08.

Hebra sentido: 5'-AGUAUGCCACAUAAGCAUCdTdT-3' (SEQ ID NO: 185)

Hebra antisentido: 5'-GAUGCUUAUGUGGCAUACUdTdT-3' (SEQ ID NO: 186)

Grupo hFLS-control negativo (CN): No se transfectó ARNip, con las etapas restantes sin cambios del grupo hFLS-ARNip-AD-08.

Grupo MCF7-Grupo de control negativo (CN): No se transfectó ARNip, con las etapas restantes sin cambios del grupo MCF7-ARNip-AD-08.

24 horas después de la transfección, Las células de cada grupo se cultivaron en un medio sin suero para el cultivo de inanición durante 24 horas. Las células se estimularon por IL-1a con una concentración final de 10 ng/ml durante 24 h. Se extrajo ARN y se realizó qPCR con los cebadores del Ejemplo 2 para detectar los niveles de expresión de TNF, COX-2 e Il-1p. Se utilizó p-actina como gen de referencia.

La FIG. 10A muestra que el ARNip-AD-08 redujo eficazmente la expresión de ARNm de COX-2 e IL-1 p en células hFLS y MCF7. Específicamente, el nivel de expresión de IL-1p en células hFLS se redujo en un 88 %. Se observó un nivel más alto de TNF en las células MCF7 en el grupo ARNip-AD-08 que en el grupo CSD, probablemente debido a las complejas funciones celulares del TNF.

Grupo hFLS-control sin diana (CSD+): Grupo hFLS-CSD tratado con IL-1a.

Grupo hFLS-control sin diana (CSD-): Grupo hFLS-CSD no tratado con IL-1a.

MCF7-Grupo de control sin diana (CSD+): MCF7-Grupo CSD tratado con IL-1a.

MCF7-Grupo de control sin diana (CSD-): MCF7-Grupo CSD no tratado con IL-1a.

La FIG. 10B muestra que ARNip-AD-08 inhibió la secreción de la proteína IL-1 p a un nivel incluso más bajo que el de los grupos CSD no estimulados.

Ejemplo 11

Inhibición de ADAM17 por ARNip con cierta identidad de secuencia para ARNip-AD-08

El primer conjunto de experimentos utilizó ARNip que tienen la hebra antisentido de ARNip-AD-08 5'-Uu Gu UCAGa Ua CAUGAUGC-3' (SEQ ID NO: 8), y una hebra sentido que contiene o tiene cierta identidad de secuencia con la hebra sentido de ARNip-AD-08 5'-GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3' (SEQ ID NO: 7), tal como se muestra en la Tabla 8.

Tabla 8. Gru o antisentido

continuación

El segundo conjunto de experimentos utilizó ARNip que tienen la hebra sentido de ARNip-AD-08 5'-GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3' (SEQ ID NO: 7), y una hebra antisentido que contiene o tiene cierta identidad de secuencia con la hebra antisentido de ARNip-AD-085'-UUGUUCAGAUACAUGAUGC-3' (SEQ ID NO: 8), tal como se muestra en la Tabla 9.

Tabla 9. Gru o sentido

El tercer conjunto de experimentos utilizó ARNip que tiene una hebra sentido que contiene o que tiene cierta identidad de secuencia con la hebra sentido de ARNip-AD-08 5-GCAUCAUGUAUCUGAACAA-3' (SeQ ID NO: 7), y una hebra antisentido que contiene o tiene cierta identidad de secuencia con la hebra antisentido de ARNip-AD-08 5'-UUGUUCAGAUACAUGAUGC-3' (SEQ ID NO: 8), tal como se muestra en la Tabla 10.

Tabla 10. Gru o bicatenario

Los ARNip de las Tablas 8-10 se introdujeron cada uno en células hFLS, y se detectaron los niveles de expresión de ARNm de ADAM17 usando el método del Ejemplo 8. Los tres conjuntos de experimentos utilizaron los grupos CSD y CN preparados en el Ejemplo 8.

Tal como se indica en las Tablas 8-10, todos los ARNip en tres grupos redujeron los niveles de expresión del ARNm de ADAM17. Los ARNip más eficaces incluían (1) ARNip que tienen una hebra antisentido que comprende la SEQ ID NO: 8, y una hebra sentido que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 7; (2) ARNip que tienen una hebra sentido que comprende la SEQ ID NO: 7, y una hebra antisentido que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 8; y (3) ARNip que tienen una hebra sentido que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 7, y una hebra antisentido que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 8. En particular, el ARNip-AD-13 de 21 nt que tiene nucleótidos salientes en 3' redujo el nivel de expresión de ADAM17 en un 88 %.

Ejemplo 12

Silenciamiento de ADAM17 con plásmidos que codifican ARNip

Se diseñó un oligonucleótido de ADN que codifica la secuencia de ARNip-AD-08 tal como se muestra en la Tabla 11.

Tabla 11. Oli onucleótido de ADN ue codifica ARNi -AD-08

La región complementaria del oligonucleótido de ADN está subrayada. Los nucleótidos 38-56 (negrita) de la SEQ ID NO: 11 codifican la hebra antisentido de ARNip-AD-08 (SEQ ID No : 8). Los nucleótidos 8-26 (negrita) de la SEQ ID NO: 12 codifican la hebra sentido de ARNip-AD-08 (SeQ ID NO: 7).

Las hebras de ADN tal como se muestran en la Tabla 12 se hibridaron y clonaron en la región entre los sitios de restricción BamHI y HindIII del vector de expresión de ARNip pGCsi-H1/Neo para obtener un plásmido de expresión de ARNip recombinante, Vector 2.

El experimento se realizó en los siguientes grupos:

Grupo experimental: las células hFLS se sembraron en placas de 6 pocillos un día antes de la transfección. Se introdujo el vector 250 nM en las células hFLS con Lipofectamine® 2000 utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante. Las células se recogieron después de la transfección durante 48 horas y se detectó el nivel de expresión de ARNm de ADAM17 mediante el método del Ejemplo 9.

Hebra sentido: 5'-AGUAUGCCACAUAAGCAUCdTdT-3' (SEQ ID NO: 185)

Hebra antisentido: 5'-GAUGCUUAUGUGGCAUACUdTdT-3' (SEQ ID NO: 186)

Grupo de control negativo (CN): Se utilizó el plásmido pGCsi-H1/Neo original sin el fragmento de interferencia, con las etapas restantes sin cambios del grupo experimental. Los resultados se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12. Niveles de expresión relativa de ADAM17

Grupo experimental Grupo CN Grupo CSD

0,25±0,02 1,12±0,08 1,07±0,05

La Tabla 12 demuestra que la transfección del ADN que codifica el ARNip-AD-08 también silenció eficazmente ADAM17.

Ejemplo 13

Silenciamiento de ADAM17 mediante ARNip modificados químicamente

El ARNip-AD-13 se sometió a diversos tipos o combinaciones de modificaciones químicas como se muestra en las Tablas 6 y 14 para aumentar aún más la estabilidad y el efecto de interferencia de las moléculas de ARNip.

Tabla 13. Silenciamiento de ADAM17 mediante ARNi modificados uímicamente

(continuación)

(continuación)

Se transfectaron ARNip químicamente modificado como se muestra en la Tabla 13 en células hFLS, y se determinaron los niveles de expresión de ARNm de ADAM17 mediante el método del Ejemplo 9. Cuando se usaron los ARNip modificados con colesterol, polipéptidos o galactosa, no se añadió reactivo de transfección.

Los resultados de la Tabla 13 muestran que el ARNip-AD-13 y el ARNip-AD-08 con modificaciones químicas apropiadas silenciaron efectivamente ADAM17.

Ejemplo 14

Estabilización de ARNip en suero mediante modificaciones químicas

La estabilidad sérica de los ARNip modificados químicamente en el ejemplo 13 se determinó tal como sigue: se añadió suero de rata fresco de igual volumen en ARNip 5 pM diluido con agua libre de ribonucleasa. La mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min y se sometió a electroforesis para comprobar la integridad de los ARNip.

Tal como se muestra en la FIG. 11, después de 30 min de incubación en suero de rata, se degradó una cantidad significativa de ARNip-AD-13 sin modificar, mientras que las moléculas químicamente modificadas ARNip-AD-26, ARNip-AD-39 y ARNip-AD-40 no mostraron signos de degradación.

Ejemplo 15

Eficacia de los ARNip en el tratamiento del modelo de artritis en ratas

Se construyó un modelo de artritis en rata como en el ejemplo 7

3 días después de la inyección de colágeno bovino tipo II, las ratas artríticas se dividieron al azar en cuatro grupos con ocho ratas en cada grupo de la siguiente manera: Grupo PBS, inyectado con 100 pl de control de PBS y ARNip-AD-26, grupos experimentales ARNip-AD-40 y ARNip-AD-39, inyectado con solución de ARNip 10 nmol (100 pl) a 50 pl por pata. El control o ARNip se administró a cada grupo dos veces por semana durante dos semanas.

Los resultados se muestran en la FIG. 12, en la que A y B representan la tinción de HE y TB (20x) del grupo PBS, C y D representan la tinción de HE y TB (10x) del grupo PBS; E y F representan la tinción de HE y TB (20x) del grupo ARNip-AD-40, G y H representan la tinción de HE y TB (10x) del grupo ARNip-AD-40; I y J representan la tinción de HE y TB (20x) del grupo ARNip-AD-26, K y L representan la tinción de HE y TB (10x) del grupo ARNip-AD-26; M y N representan la tinción de HE y TB (20x) del grupo ARNip-AD-39, O y P representan tinción de HE y TB (10x) del grupo ARNip-AD-39.

La FIG. 12 demuestra que después de dos semanas de administración, el grupo de PBS mostró los siguientes síntomas inflamatorios: un alto nivel de fibrosis en la cavidad articular y la superficie, osificación del menisco, células de cartílago desordenadas y pérdida significativa de colágeno. En comparación con el grupo PBS, la administración de ARNip-AD-40 dio como resultado un menisco osificado pero de forma normal, superficies articulares lisas, osificación local y fibrosis, células de cartílago ordenadas y pérdida local de colágeno. En el grupo de ARNip-AD-26, se produjo osificación del menisco y pérdida local de colágeno, pero la cavidad articular permaneció limpia. El grupo de ARNip-AD-39 mostró superficies articulares lisas, una pequeña cantidad de fibrosis en la cavidad articular, osificación local del menisco y del cartílago, células de cartílago ordenadas y sólo pérdida parcial de colágeno. Los resultados demuestran que ARNip-AD-26, ARNip-AD-39 y ARNip-AD-40 inhibieron la progresión de la enfermedad en las ratas artríticas. Por lo tanto, los ARNip descritos en el presente documento pueden surgir como posibles agentes terapéuticos para tratar enfermedades de la artritis.

Ejemplo 16

Los grupos PBS, ARNip-AD-26, ARNip-AD-39 y ARNip-AD-40 se establecieron como en el Ejemplo 15, excepto que se inyectó ARNip empaquetado en nanopartículas de quitosano en el grupo ARNip-AD-41.

Los animales se sacrificaron al día siguiente de la cuarta dosis y las articulaciones de las rodillas se congelaron con nitrógeno líquido. Se extrajo ARN de las articulaciones de la rodilla congeladas y se llevó a cabo la transcripción inversa utilizando el Mini Kit RNeasy® (QIAGEN). Los niveles de expresión de ARNm de ADAMTS-5 y ADAM17 se determinaron usando el método de los Ejemplos 1 y 9, respectivamente. Los niveles de expresión de TNF, COX-2 e IL-1p se determinaron usando el método del Ejemplo 10.

Los resultados se muestran en la FIG. 13, donde "Normal" representa el grupo de control de rata SD macho sana, y "Modelo" representa el grupo PBS. La FIG. 13 demuestra que en comparación con el grupo normal, los niveles de expresión de ADAMTS-5, ADAM17, TNF, COX-2 e IL-1 p aumentaron en el grupo PBS. Por el contrario, ARNip-AD-40, ARNip-AD-39 y ARNip-AD-26 redujeron significativamente los niveles de expresión de estos factores inmunes, protegiendo así el cartílago y el líquido sinovial. Basándose en estos resultados, los ARNip descritos en el presente documento se pueden usar para prevenir y/o tratar eficazmente enfermedades relacionadas con la inflamación. Ejemplo 17

Eficacia de la administración a largo plazo de los ARNip

El grupo PBS, el grupo de dosis única de ARNip-AD-40 (dosis única, niveles de expresión examinados 1,5 o 3 semanas después de la dosificación), y los grupos de ARNip-AD-40 a largo plazo (administración a largo plazo, una vez cada 0,5 semanas durante 1,5 o 3 semanas) se establecieron como en el Ejemplo 16. Los niveles de expresión de ARNm de ADAM17 se determinaron usando el método del Ejemplo 9. Los niveles de expresión de TNF, COX-2 e IL-1 p se determinaron usando el método del Ejemplo 10.

Como se muestra en la FIG. 14B, el tratamiento de dosis única y el tratamiento a largo plazo durante 1,5 semanas mostraron una eficacia similar en la inhibición de los niveles de expresión de factores inmunes. Bajo ambos regímenes de dosificación, se redujeron los niveles de expresión de ADAM17, TNF, COX-2 e IL-1 p. Por el contrario, tal como se muestra en la FIG. 14A, la administración a largo plazo tuvo un mejor efecto inhibidor cuando el tratamiento se extendió a tres semanas.

Ejemplo 18

Inhibición de citocinas inflamatorias con combinación de ARNip

Grupo ADAMTS-5 ADAM17: Se sembraron células primarias de hFLS en placas de 6 pocillos. Cuando se cultivaron hasta un 50% de confluencia, las células se transfectaron con ARNip-RB-13 25 nM y ARNip-AD-13 25 nM usando Lipofectaminer®2000 de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante.

Grupo de ADAMTS-5: Las células hFLS se transfectaron con ARNip-RB-13 50 nM, con las etapas restantes sin cambios del grupo ADAMTS-5 ADAM17.

Grupo de ADAM17: Las células hFLS se transfectaron con ARNip-AD-1350 nM, con las etapas restantes sin cambios del grupo ADAMTS-5 ADAM17.

Grupo de control sin diana (CSD): Las células hFLS se transfectaron con el siguiente ARNip no específico aleatorio, con las etapas restantes sin cambios del grupo ADAMTS-5 ADAM17.

Sentido: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3' (SEQ ID NO: 189)

Antisentido: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3' (SEQ ID NO: 190)

Grupo de control negativo (CN): No se transfectó ARNip, con las etapas restantes sin cambios del grupo ADAMTS-5 ADAM17.

24 horas después de la transfección, las células de cada grupo se cultivaron en un medio sin suero para el cultivo por inanición durante 24 horas y se estimularon con IL-1a a una concentración final de 10 ng/ml durante aproximadamente 24 horas. Los niveles de IL-1 p secretada se determinaron como en el Ejemplo 2.

Los resultados de la FIG. 15 muestran que en comparación con los grupos de ARNip individuales, la coadministración de ARNip-RB-13 y ARNip-AD-13 mejoró significativamente el efecto inhibidor sobre la IL-1 p secretada.

Ejemplo 19

Eficacia de la combinación de ARNip en el tratamiento del modelo de artritis en ratas

Se construyó un modelo de artritis en rata como en el ejemplo 7.

3 días después de la inyección de colágeno bovino tipo II, doce ratas artríticas fueron inyectadas cada una con 100 pl de PBS en una pata trasera como grupo de control, y 10 nmol de ARNip-RB-40 y 10 nmol de ARNip-AD-26 a un volumen total de 100 pl en la otra pata trasera como el grupo AD5 y 17. La dosificación fue dos veces por semana durante tres semanas. Los animales fueron sacrificados al día siguiente de la segunda, cuarta y sexta dosis, respectivamente. Se tomaron las articulaciones de la rodilla y se fijaron en una solución de conservación de tejido para la tinción con hematoxilina-eosina (HE) o azul de toluidina (TB) utilizando un procedimiento estándar y se analizaron mediante microscopía óptica para determinar cambios histológicos en la estructura del tejido.

Los resultados de la tinción de HE y TB se muestran en las Figuras 16A y 16B, respectivamente. Una semana después de la modelización, el grupo de control presentó una disposición desordenada de las células del cartílago, engrosamiento del cartílago articular, osificación del menisco y pérdida de colágeno del cartílago. Por el contrario, la pérdida de colágeno del cartílago no fue obvia en el grupo AD5 y 17, con sólo una ligera osificación del menisco. Dos semanas después de modelar, se produjo fibrosis local en el hueso subcondral del grupo de control y se observó hiperplasia de fibrosis en las capas de cartílago cerca de la cavidad articular y la membrana sinovial, acompañado de una grave pérdida de colágeno, fibrosis severa de la cápsula articular y osificación del menisco. El grupo AD5 y 17, sin embargo, mostró sólo una ligera pérdida de colágeno del cartílago local. Tres semanas después de la modelización, en el grupo de control se dio la fibrosis severa de la superficie articular, residuos en la cavidad articular y una infiltración grave de células inflamatorias. Sin embargo, el grupo AD5 y 17 mantuvo superficies articulares lisas y células de cartílago activas. Por lo tanto, el grupo AD5 y 17 presentó cambios patológicos más leves que el grupo de control, lo que indica que la combinación de los ARNip de AD5 y 17 pueden inhibir la progresión artrítica en ratas.

Ejemplo 20

Eficacia de la combinación de ARNip en la inhibición de factores inmunitarios en articulaciones de rata

El grupo ADAMTS-5-ARNip y ADAM17-ARNip se estableció usando el método del Ejemplo 7, con ARNip-RB-40 y ARNip-AD-26 cada uno dosificado a 5 nmol por pata, dos veces a la semana. El grupo del modelo de artritis se construyó como en el Ejemplo 7 y se inyectó con PBS con la misma dosificación. El grupo de ratas sanas utilizó ratas SD macho (220 ± 20 g).

Los animales fueron sacrificados al día siguiente de la segunda, cuarta y sexta dosis, respectivamente, y las articulaciones de la rodilla se congelaron con nitrógeno líquido. Se extrajo ARN de las articulaciones de la rodilla congeladas y se llevó a cabo la transcripción inversa utilizando el Mini Kit RNeasy® (QIAGEN). Los niveles de expresión de ARNm de ADAMTS-5 y ADAM17 se determinaron usando el método de los Ejemplos 1 y 9, respectivamente. Los niveles de expresión de TNF, COX-2 e IL-1 p se determinaron usando el método del Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la Tabla 14.

Tabla 14. Expresión de factores inmunes en articulaciones de rata tratadas mediante combinación de ARNip

ADAMTS-5 ADAM 17

En comparación con el grupo de ratas sanas, los niveles de expresión de ADAMTS-5, ADAM17, TNF, COX-2 e IL-1 p aumentaron en el grupo del modelo de artritis, mientras que el grupo de combinación mostró un notable silenciamiento génico de 1-3 semanas después de la administración. Por lo tanto, la terapia combinada que usa ARNip ADAMTS-5 y ADAM17 puede tratar enfermedades relacionadas con la inflamación con alta eficacia.

Ejemplo 21

Prueba de toxicidad (datos no mostrados)

Para evaluar los efectos tóxicos de diversas concentraciones de ARNip en ratas normales, un grupo de ratas SD macho sanas (220 ± 20 g) recibió una inyección intravenosa en la vena de la cola y el otro grupo recibió una inyección articular local. El volumen de inyección fue de 0,2 ml para ambos grupos. El grupo de inyección intravenosa se dividió en un subgrupo de PBS y 10 nmol, subgrupos de ARNip de 50 nmol y 100 nmol, cada uno con seis ratas. Una combinación de ARNip-RB-40 y ARNip-AD-26, cada ARNip a 10 nmol, 50 nmol o 100 nmol, se inyectó en los tres subgrupos de ARNip, respectivamente. El grupo de inyección articular local se dividió de manera similar en cuatro subgrupos, cada uno con nueve ratas. La dosificación fue dos veces por semana.

En el grupo de inyección intravenosa, los animales se pesaron antes de la administración y se sacrificaron tres semanas después. En el grupo de inyección articular local, tres animales de cada subgrupo fueron sacrificados al tercer día después de la segunda, cuarta y sexta dosis, respectivamente, para análisis patológicos y pruebas bioquímicas. Todos los animales del grupo de inyección intravenosa sobrevivieron al experimento sin una pérdida de peso significativa. El grupo de inyección articular local también sobrevivió, sin mostrar comportamiento anormal o fibrosis significativa.

Ejemplo 22

Efectos de los ARNip administrados previamente (datos no mostrados)

Cada articulación de rodilla de 45 ratas SD macho sanas (220 ± 20 g) se pretrató con una combinación de ARNip-RB-40 y ARNip-AD-26, cada ARNip a 10 nmol, 50 nmol, o 100 nmol, y luego se administraron 0,2 ml de colágeno bovino II (2 mg/ml) para estimular la OA en un tiempo predeterminado. Los animales se sacrificaron tres días después de la estimulación con colágeno.

Grupo de 10 nmol: El pretratamiento 3 y 5 días antes de la estimulación con colágeno mostró un efecto protector en comparación con un grupo modelo de artritis inyectado con PBS. La preadministración de ARNip dio como resultado lesiones leves de rodilla, células de cartílago intactas y ordenadas, sin fibrosis significativa o proliferación de capas sinoviales, menisco intacto. El pretratamiento 8 y 12 días antes de la estimulación con colágeno mostraron síntomas similares a los del grupo modelo, incluyendo lesiones obvias de fibrosis, daño parcial o total del menisco, hiperplasia de fibrosis en superficies articulares, células de cartílago desordenadas y osificación local.

Grupos de 50 nmol y 100 nmol: El pretratamiento 3 y 8 días antes de la estimulación del colágeno proporcionó protección contra las lesiones inducidas por el colágeno. Las ratas pretratadas 3 días antes de la estimulación con colágeno tuvieron resultados similares a un grupo normal de ratas SD macho sanas sin estimulación con colágeno. Los pretratados 8 días antes de la estimulación del colágeno mostraron un leve daño y osificación del menisco, hiperplasia de fibrosis en tejidos conectivos periarticulares, pero superficies articulares intactas y lisas, células de cartílago ordenadas y osificación de condrocitos locales. El pretratamiento 12 días antes de la estimulación con colágeno tuvo síntomas similares a los del grupo modelo.

Por lo tanto, El tratamiento con ARNip antes del inicio de la OA puede tener efectos protectores, dependiendo del momento del pretratamiento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende al menos un ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 y al menos un ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde la hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, y la hebra antisentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 2, y en donde la hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17 comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 7, y la hebra antisentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17 comprende una secuencia de nucleótidos que tiene un al menos un 60 % de identidad con la SEQ ID NO: 8.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde al menos una hebra del ARNip comprende al menos una modificación química elegida entre las modificaciones de extremo, modificaciones de base, modificaciones de azúcar y modificaciones de la estructura principal.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en donde al menos una hebra del ARNip comprende al menos una modificación química elegida entre

(a) una modificación de fosforotioato en la cadena principal de fosfato;

(b) modificación de 2'-O-metilo en una ribosa;

(c) modificación de 2'-desoxi-2'-fluoro en una ribosa;

(d) una modificación de ácido nucleico bloqueado (ANB);

(e) una modificación de ácido nucleico de bucle abierto;

(f) una modificación del indol;

(g) una modificación de 5'-metilcitosina en una base;

(h) una modificación de 5'-etiniluracilo en una base;

(i) un nucleótido terminal unido a un derivado de colesterilo;

(j) un nucleótido terminal unido a una galactosa;

(k) un nucleótido terminal unido a un polipéptido;

(l) una modificación de fosforilación;

(m) un nucleótido terminal unido a un marcador fluorescente; y

(n) un nucleótido terminal unido a una molécula de biotina.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, en donde la hebra sentido comprende la secuencia de nucleótidos 5'-K'-L'P'M'UCAUGUAUCUGAAP'M'M'dTdT-3' (SEQ ID NO: 15), y la hebra antisentido comprende la secuencia de nucleótidos 5'-R'-Q'Q'L'UUCAGAUACAU GAQ'L'P'dTdT-3' (SEQ ID NO: 16), en donde

K' es un grupo de colesterol opcional unido a un nucleótido del extremo 5';

dT es un desoxirribonucleótido de timina;

L' es un ribonucleótido de guanina no modificado o modificado con 2'-O-metilo;

M' es un ribonucleótido de adenina no modificado o modificado con 2'-O-metilo;

P' es un ribonucleótido de citosina no modificado o modificado con 2'-O-metilo; y

Q' es un ribonucleótido de uracilo no modificado o modificado con 2'-O-metilo; y opcionalmente, al menos uno de L', M', P' y Q' tienen una estructura principal de fosforotioato o, en donde la hebra sentido comprende la secuencia de nucleótidos 5'-KLLMUUUAUGUGGGCAUPMQdTdT-3' (SEQ ID NO: 13), y la hebra antisentido comprende la secuencia de nucleótidos 5'-R-MQLAUGCCCACAUAAAQPP dTdT-3' (SEQ iD NO: 14), en donde

K es un grupo de colesterol opcional unido a un nucleótido del extremo 5';

R es una modificación de fosforilación opcional en un nucleótido del extremo 5'; dT es un desoxirribonucleótido de timina;

L es un ribonucleótido de guanina no modificado o modificado con 2'-O-metilo;

M es un ribonucleótido de adenina no modificado o modificado con 2'-O-metilo;

P es un ribonucleótido de citosina no modificado o modificado con 2'-O-metilo; y

Q es un ribonucleótido de uracilo no modificado o modificado con 2'-O-metilo; y opcionalmente, al menos uno de L, M, P y Q tienen una estructura principal de fosforotioato.

5. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde la hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 es una secuencia seleccionada de la Tabla 7, y la hebra antisentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 es una secuencia seleccionada de la Tabla 7,

y en donde la hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17 es una secuencia seleccionada de la Tabla 13, y la hebra antisentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17 es una secuencia seleccionada de la Tabla 13.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, en donde la hebra sentido del ARNip dirigido contra ADAMTS-5 comprende la SEQ ID NO: 80, y la hebra antisentido del ARNip dirigido contra ADAMTS-5 comprende la SEQ ID NO: 81,

y en donde la hebra sentido del ARNip dirigido contra ADAM17 comprende la SEQ ID NO: 159, y la hebra antisentido del ARNip dirigido contra ADAM17 comprende la SEQ ID NO: 160.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde la hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 comprende la SEQ ID NO: 3, y la hebra antisentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 comprende la s Eq ID NO: 4,

y en donde que la hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17 comprende la SEQ ID NO: 9, y la hebra antisentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17 comprende la SEQ ID NO: 10.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7, en donde la hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 es la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3; y la hebra antisentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAMTS-5 es la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4, y en donde la hebra sentido del ARNip bicatenario dirigido contra ADAM17 es la SEQ ID NO: 9, y la hebra antisentido del ARNip bicatenario dirigida contra ADAM17 es la SEQ ID NO: 10.

9. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad relacionada con la inflamación.

10. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 9, en donde la enfermedad relacionada con la inflamación es la artritis.

11. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 10, en donde la artritis es artrosis.