JP2018506972A - クロストリジウム・ディフィシル感染症の治療のための、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンa及びトキシンbに対する四重特異性の八量体型結合剤及び抗体 - Google Patents
クロストリジウム・ディフィシル感染症の治療のための、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンa及びトキシンbに対する四重特異性の八量体型結合剤及び抗体 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号DK084509による政府の支援を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明における一定の権利を有し得る。
電子形式(ASCIIテキストファイル)の配列表は、本出願と同時に提出され、引用することにより本明細書の一部をなす。ASCIIテキストファイルのファイル名は、「2016_0045A_ST25」であり、そのファイルは、2016年2月5日に作成されたものであり、ファイルサイズは108KBである。
特に指定のない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は例えば、Benjamin Lewin, Genes VII, Oxford University Press刊行, 2000(ISBN019879276X)、Kendrew et al.(編);The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Publishers刊行, 1994(ISBN0632021829)、及びRobert A. Meyers(編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, Wiley, John & Sons, Inc.刊行, 1995(ISBN0471186341)、並びに他の同様の技術的参照文献に見ることができる。
動物におけるCDIの一次作用因子は、C.ディフィシルの外毒素TcdA及びTcdB(トキシンA及びトキシンB)である。これらのトキシンは、構造的に類似した、宿主細胞に類似の作用機序を示す300kDaの単鎖タンパク質である。両者のトキシンとも宿主のRho GTPアーゼを標的とし、酵素不活性化に続いて、細胞骨格崩壊及びアポトーシスを起こす。腸上皮細胞において、TcdAは、Rho GTPアーゼのグルコシル化を触媒し、細胞の完全な円形化のような形態変化を伴ってアクチン細胞骨格の再構築が起こり、そして腸管バリア機能が破壊される。それらのトキシンは、動物において個別にCDIを引き起こすことができ、当該細菌のTcdA− TcdB−菌株は無毒性である。
本発明者らは、C.ディフィシルの両方のトキシンの特異的ドメインに対するVHH単量体をスクリーニングするための効果的なプラットフォームを確立した。免疫原性の高い非毒性のホロトキシンを免疫化のために使用し、かつ生体活性のキメラ型トキシン(通常のドメイン機能を有する)をスクリーニングのために使用することで、VHH単量体の、TcdA又はTcdBの異なるドメインへの結合のパネルを作製した。これらのVHH単量体の多くが強力な中和活性を有しており、それらの特異的ドメインへの結合を確認した(図1)。
ペプチド単量体及びヘテロ二量体の成功によって、本発明者らは、4つの連結されたVHHペプチド単量体を含む結合剤の開発が可能となった。このことは、研究の目標であった。それというのも、過去の研究では、殆どの病原性C.ディフィシル菌株に対する十分な防御をもたらすためにはTcdA及びTcdBの両方を同時に中和することができることが必要であると考えられるため、それが可能な単独の抗体がCDIの治療及び予防において最も有効な結合剤であることを示しているからである。各々のトキシンにある2種のエピトープを認識し結合する四重特異性の結合剤を作製することによって、該タンパク質の結合活性及び中和活性を強化することができる。したがって、4ドメイン型(四重特異性)VHH結合剤が作製された。
キメラFc融合タンパク質は、in vivoでのタンパク質の半減期を高める能力を有することがよく知られている。この戦略は、幾つかのFDA認可薬剤、例えばエタネルセプトで利用されている。原理証明研究は、単鎖抗体が、正しく集合し、かつヒトコブラクダVHH及びヒトIgGのFcドメインをコードするmini−Ig構築物を有するトランスジェニックマウスのB細胞によって発現されることを示している。またキメラ抗EGFR/EGFRvIII VHH,EG2−Fcは、in vivoで優れた腫瘍集積を示し、膠芽細胞腫のターゲティングを改善し得る薬物動態特性を有する。
また本発明には、Fcドメインのみではなく抗体に結合されたVHHペプチド単量体を含む結合剤も含まれる。VHH−IgG結合剤は、抗体の可変領域を欠いたIgG抗体の軽(κ又はλ)鎖及び重鎖に結合された1つ、2つ、3つ、4つ又はそれより多くのVHHペプチド単量体を含む。したがって、ペプチド単量体は、該抗体の可変領域と置き換えられている。
VHHペプチド単量体は、それらの小さいサイズ及びそれらの骨格のファミリーIIIのヒトVH骨格との高度の同一性のため、ヒトに投与される場合に低い免疫原性しか示さないことが期待される。小さい一価VHH単量体の全身性適用は、あってもごく僅かな中和性の抗体応答しか誘発しないと思われるが、タンパク質の免疫原性は、一般的にサイズ及び複雑さに伴って増大する。VHH単量体の繰り返しの及び/又は長期にわたるin vivoでの使用のための2つの大きな障壁は、それらの短いと考えられる半減期及び潜在的な免疫原性である。価数及び血中半減期を高めるために、VHH単量体は、本明細書で論じられるようにヒトIgG及びFcドメインと融合させることができる。考えられる免疫原性に対処するために、VHH単量体は、その発現レベル、親和性、可溶性及び安定性を損なうことなく、必要に応じてヒト化することができる。これらの戦略は、ループドナーVHHの抗原特異性及び親和性を維持しながら、ヒト化されたVHH単量体(hVHH単量体)の良好な発現、安定性及び可溶性をもたらすはずである。
本発明の結合剤には、本明細書で定義されるVHH−Fc結合剤及びVHH−IgG結合剤のそれぞれのエピトープ結合断片が含まれる。VHH−Fc結合剤及びVHH−IgG結合剤は、可変領域がVHH単量体によって置き換えられたヒトIgG抗体と構造の点で同等であることから、ヒト抗体フラグメントに関する用語は、そのような結合剤についても該当し得る。該フラグメントには、限定されるものではないが、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、単鎖Fv(scFv)抗体、及びFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメント、並びに二重特異性抗体及び三重特異性抗体が含まれる。
本発明には、本明細書で規定される各々の結合剤をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド及びそれらの相補鎖が含まれる。
本発明の結合剤は、被験体におけるC.ディフィシルによって誘発される疾患症状を治療又は予防する方法において使用することができる。これらの方法は、一般的に、治療的有効量の1種以上の本明細書で定義される結合剤を、C.ディフィシル感染症又はC.ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む。
結合剤が被験体に直接的に投与され得る場合には、本発明の方法は、好ましくは1種以上の結合剤及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬製剤を投与することを基礎とする。したがって、本発明には、1種以上の本明細書で定義される結合剤及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬製剤が含まれる。
VHH単量体型及びヘテロ二量体型結合剤
単独のドメイン(単量体型)の、トキシンTcdA及びTcdBの特異的ドメインに対する一重特異性のVHHペプチド単量体をスクリーニングするための効果的なプラットフォームを確立した。免疫原性の高い非毒性のホロトキシンを免疫化のために使用し、かつ生体活性のキメラ型トキシン(通常のドメイン機能を有する)をスクリーニングのために使用することで、VHH単量体の、TcdA又はTcdBの種々のドメインへの結合のパネルを作製した。これらのVHH単量体の多くが強力な中和活性を有し、それらの特異的ドメインへの結合を確認した(図1)。その非毒性のホロトキシンは、従来に記載(Wang et al., 2012)される通り、それらの酵素的グルコシルトランスフェラーゼドメインに点突然変異を有する。生体活性のキメラ型トキシンを、また従来に記載(Wang et al., 2012)される通り、TcdA及びTcdBの間で機能的ドメインを交換することによって作製した。
ABABと称される4つのドメイン(四量体型)の四重特異性のVHH結合剤を、VHH単量体AH3、5D、E3及びAA6を連結させることによって作製した。この四重特異性の四量体型結合剤は、保存された重複していないエピトープを標的とし、優れたトキシン中和活性を有する。ABAB(図3)の設計において、VHHペプチド単量体AH3及びAA6を、それらの間に5D単量体を配置することによって隔離した。それというのも、AH3及びAA6は、それぞれ互いに空間的に距離が置かれたGT及びTDに結合するからである(図1)。この設計により、AH3及びAA6は、TcdAに同時に結合することが可能となった。
ABAB−Fc結合剤は、ヒトIgG1のFcドメインに結合されたVHHペプチド単量体AH3/5D/AA6/E3(示される順序で連結される)をコードする発現ベクターを作製することによって製造した。VHHペプチド単量体は、表2のフレキシブルなリンカーによって隔離した。該タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号23に規定されている。ABAB−Fcは、安定にトランスフェクションされたHEK293細胞系統の培養上清からプロテインAビーズを使用して(図7)、ジスルフィド結合形成及び二価の分子産生を可能にする条件下で発現及び精製した。発現レベルは、培養上清1L当たりに約20mgであった。ABAB−Fcは、TcdA及びTcdBの両方との結合及び中和において十分に機能的である。ABAB−Fcのアミノ酸配列は、配列番号22に規定されている。
図6に図説されるように、二重特異性のVHH−IgG(AH3/5D−IgG及びE3/AA6−IgG)は、単量体を、ヒトIgG重鎖及び軽(κ又はλ)鎖と個別に融合させることによって作製することができる。四重特異性のVHH−IgG(ABAB−IgG)は、二量体を、ヒトIgG重鎖及び軽鎖と個別に融合させることによって作製することができる。重鎖及び軽鎖の構築物を同時トランスフェクションすることで、AH3/5D−IgG、E3/AA6−IgG及びABAB−IgGのキメラタンパク質が生成する。2つのVHHを重鎖及び軽鎖へと分けると、恐らく二重特異性及び四重特異性のVHHキメラ型タンパク質の収率及び安定性が改善する。これによって、VHH−ヒトIgGキメラ型抗体がABABのin vivoでの安定性及び効力を補助するか否かを決定することができる。同様に、ABAB−IgGのin vivo半減期の更なる改善は、FcRn受容体に対する高められた結合親和性を有するABAB−IgG変異体において試験することもできる。
ABAB−IgG1結合剤を、予防処置アッセイ及び再負荷生存アッセイの両方で試験した。図15は、両方の研究の実験デザインを示している。6週齢〜8週齢の雌のC57マウスを使用し、含まれる条件は、PBS:10ml/kg、腹腔内、n=14;ABAB−IgG:200μg/kg、腹腔内、n=10;ABAB−IgG:1mg/kg、腹腔内、n=10;ABAB−IgG:5mg/kg、腹腔内、n=10であった。
様々な選択基準を用いて、本明細書のアプローチに記載される実験で作製された結合剤を選択する。第一に、本明細書に定義される構築物の各々は、プロテインA親和性クロマトグラフィーによる小規模組換えタンパク質の製造のための293T細胞の一過性トランスフェクションにおいて使用することができる。各々の構築物の産生収率は、定量的ELISAによって測定することができる。第二に、組換えタンパク質の結合活性をELISA及び表面プラズモン共鳴(SPR)を使用してスクリーニングすることで、それらのトキシンに対する本来の結合活性を維持している構築物を選択することができる。第三に、それらのタンパク質を、in vitroアッセイにおいて中和活性について評価する(図2)。
本明細書で言及される全ての特許及び出版物は、本発明の属する技術分野の当業者の技術水準の指標である。各々の引用される特許及び出版物はその全体が引用することにより本明細書の一部をなす。以下の参考資料は、全て本出願で引用されている。
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Claims (111)
- IgG抗体と、2組の連結された第一のVHHペプチド単量体及び第二のVHHペプチド単量体と、2組の連結された第三のVHHペプチド単量体及び第四のVHHペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、
前記IgG抗体は2つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、
該抗体の各アームにつき、1組の連結された第一のVHHペプチド単量体及び第二のVHHペプチド単量体が、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ1組の連結された第三のVHHペプチド単量体及び第四のVHHペプチド単量体が、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつそれらのVHHペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンA(TcdA)又はトキシンB(TcdB)のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤。 - 第一のVHHペプチド単量体、第二のVHHペプチド単量体、第三のVHHペプチド単量体及び第四のVHHペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する、請求項1に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体のうち2つはTcdAのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記VHHペプチド単量体のうち2つはTcdBのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項1に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体は、独立して、TcdA又はTcdBのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する、請求項1に記載の結合剤。
- 前記結合剤の軽鎖は、配列番号46に示されるアミノ酸配列(AA6/E3κ)又はその配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ前記結合剤の重鎖は、配列番号44に示されるアミノ酸配列(AH3/5D重鎖)又はその配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、TcdA結合特異性及び/又はTcdB結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項1に記載の結合剤。
- 前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記VHHペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項5に記載の結合剤。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の結合剤のヒト化された変異体。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の結合剤のエピトープ結合断片。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
- 前記軽鎖は、配列番号47に示される核酸配列によってコードされ、かつ前記重鎖は、配列番号45に示される核酸配列によってコードされる、請求項9に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
- 請求項9に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項10に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項11に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 請求項12に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項13に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項14に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- IgG抗体と、第一のVHHペプチド単量体、第二のVHHペプチド単量体、第三のVHHペプチド単量体及び第四のVHHペプチド単量体とを含む二重特異性又は四重特異性の四量体型結合剤であって、
前記IgG抗体は2つのアームを含み、各アームは、可変領域を欠いた重鎖及び可変領域を欠いた軽鎖を含み、かつ各鎖は、アミノ末端を有しており、
該抗体の第一のアームにつき、第一のVHHペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第二のVHHペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、
該抗体の第二のアームにつき、第三のVHHペプチド単量体は、該軽鎖のアミノ末端に結合されており、かつ第四のVHHペプチド単量体は、該重鎖のアミノ末端に結合されており、かつ、
それらのVHHペプチド単量体は、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンA(TcdA)又はトキシンB(TcdB)のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤。 - 前記結合剤は、二重特異性であり、ここで、第一の単量体及び第二の単量体は、異なるエピトープに対する結合特異性を有し、第一の単量体及び第三の単量体は、同一のアミノ酸配列を有し、かつ第二の単量体及び第四の単量体は、同一のアミノ酸配列を有する、請求項17に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体のうち1つはTcdAのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記VHHペプチド単量体のうち1つはTcdBのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項18に記載の結合剤。
- 前記結合剤は、四重特異性であり、ここで、前記VHHペプチド単量体の各々は、異なるエピトープに対する結合特異性を有する、請求項17に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体のうち2つはTcdAのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記VHHペプチド単量体のうち2つはTcdBのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項20に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体の各々は、TcdAのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項17に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体の各々は、TcdBのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項17に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体は、独立して、TcdA又はTcdBのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する、請求項17に記載の結合剤。
- 前記結合剤の軽鎖は、配列番号40に示されるアミノ酸配列(AA6κ)又はその配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ前記結合剤の重鎖は、配列番号36に示されるアミノ酸配列(AH3重鎖)又はその配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、TcdA結合特異性及び/又はTcdB結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項17に記載の結合剤。
- 前記結合剤の軽鎖は、配列番号42に示されるアミノ酸配列(E3κ)又はその配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有する配列変異体を含み、かつ前記結合剤の重鎖は、配列番号38に示されるアミノ酸配列(5D重鎖)又はその配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、TcdA結合特異性及び/又はTcdB結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項17に記載の結合剤。
- 前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記VHHペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項25に記載の結合剤。
- 前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記VHHペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項26に記載の結合剤。
- 請求項17〜28のいずれか一項に記載の結合剤のヒト化された変異体。
- 請求項17〜28のいずれか一項に記載の結合剤のエピトープ結合断片。
- 請求項17〜28のいずれか一項に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
- 前記軽鎖は、配列番号41に示される核酸配列(AA6κ)によってコードされ、かつ前記重鎖は、配列番号37に示される核酸配列(AH3重鎖)によってコードされる、請求項31に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
- 前記軽鎖は、配列番号43に示される核酸配列(E3κ)によってコードされ、かつ前記重鎖は、配列番号39に示される核酸配列(5D重鎖)によってコードされる、請求項31に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
- 請求項31に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項32に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項33に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項34に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 請求項35に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 請求項36に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項37に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項38に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項39に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 抗体のFcドメインと、2組の連結された第一のVHHペプチド単量体、第二のVHHペプチド単量体、第三のVHHペプチド単量体及び第四のVHHペプチド単量体とを含む四重特異性の八量体型結合剤であって、
前記抗体のFcドメインは2つのアームを含み、各アームは、抗体重鎖のヒンジ領域、CH2領域及びCH3領域を含み、かつ各アームは、アミノ末端を有しており、
該Fcドメインの各アームにつき、1組の連結された第一のVHHペプチド単量体、第二のVHHペプチド単量体、第三のVHHペプチド単量体及び第四のVHHペプチド単量体が、該アームのアミノ末端に結合されており、かつ、
それらのVHHペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンA(TcdA)又はトキシンB(TcdB)のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤。 - 第一のVHHペプチド単量体、第二のVHHペプチド単量体、第三のVHHペプチド単量体及び第四のVHHペプチド単量体は、それぞれ異なるエピトープに対する結合特異性を有する、請求項43に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体のうち2つはTcdAのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記VHHペプチド単量体のうち2つはTcdBのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項43に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体は、独立して、TcdA又はTcdBのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する、請求項43に記載の結合剤。
- 前記結合剤は、配列番号22に示されるアミノ酸配列(ABAB−Fc)又はその配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、TcdA結合特異性及び/又はTcdB結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項43に記載の結合剤。
- 前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記VHHペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項47に記載の結合剤。
- 請求項43〜48のいずれか一項に記載の結合剤のヒト化された変異体。
- 請求項43〜48のいずれか一項に記載の結合剤のエピトープ結合断片。
- 請求項43〜48のいずれか一項に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
- 前記結合剤は、配列番号23に示される核酸配列(ABAB−Fc)によってコードされる、請求項51に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
- 請求項51に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項52に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項53に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 請求項54に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項55に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項56に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 抗体のFcドメインと、2組の連結された第一のVHHペプチド単量体及び第二のVHHペプチド単量体とを含む二重特異性の四量体型結合剤であって、
前記抗体のFcドメインは2つのアームを含み、各アームは、抗体重鎖のヒンジ領域、CH2領域及びCH3領域を含み、かつ各アームは、アミノ末端を有しており、
該Fcドメインの各アームにつき、1組の連結された第一のVHHペプチド単量体及び第二のVHHペプチド単量体が、該アームのアミノ末端に結合されており、かつ、
それらのVHHペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンA(TcdA)又はトキシンB(TcdB)のエピトープに対する結合特異性を有する、結合剤。 - 第一のVHHペプチド単量体及び第二のVHHペプチド単量体は、同じ又は異なるエピトープに対する結合特異性を有する、請求項59に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体は、独立して、TcdA又はTcdBのグリコシルトランスフェラーゼドメイン、システインプロテアーゼドメイン、移行ドメイン又は受容体結合ドメイン中のエピトープに対する結合特異性を有する、請求項59に記載の結合剤。
- 前記結合剤は、配列番号32に示されるアミノ酸配列(AH3/5D−Fc)又はその配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、TcdA結合特異性及び/又はTcdB結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項59に記載の結合剤。
- 前記結合剤は、配列番号34に示されるアミノ酸配列(AA6/E3−Fc)又はその配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、TcdA結合特異性及び/又はTcdB結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項59に記載の結合剤。
- 前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記VHHペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項62に記載の結合剤。
- 前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記VHHペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項63に記載の結合剤。
- 請求項59〜65のいずれか一項に記載の結合剤のヒト化された変異体。
- 請求項59〜65のいずれか一項に記載の結合剤のエピトープ結合断片。
- 請求項59〜65のいずれか一項に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド配列。
- 前記結合剤は、配列番号33に示される核酸配列(AH3/5D−Fc)によってコードされる、請求項68に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
- 前記結合剤は、配列番号35に示される核酸配列(AA6/E3−Fc)によってコードされる、請求項68に記載の単離されたポリヌクレオチド配列。
- 請求項68に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項69に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項70に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項71に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 請求項72に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 請求項73に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項74に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項75に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項76に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 少なくとも1つのVHHペプチド単量体を含むVHHペプチド結合剤であって、各々のVHHペプチド単量体が、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンA(TcdA)又はトキシンB(TcdB)の固有のエピトープに対して結合特異性を有する、結合剤。
- 2つの連結されたVHHペプチド単量体を含む、請求項80に記載の結合剤。
- 3つの連結されたVHHペプチド単量体を含む、請求項80に記載の結合剤。
- 4つの連結されたVHHペプチド単量体を含む、請求項80に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体のうち2つはTcdAのエピトープに対する結合特異性を有し、かつ前記VHHペプチド単量体のうち2つはTcdBのエピトープに対する結合特異性を有する、請求項83に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体は、VHHペプチド単量体5D(配列番号1)、E3(配列番号3)、AA6(配列番号5)及びAH3(配列番号7)からなる群から選択される、請求項80〜84のいずれか一項に記載の結合剤。
- 前記VHHペプチド単量体は、リンカー−1(配列番号9)、リンカー−2(配列番号11)及びリンカー−3(配列番号13)から独立して選択されるリンカーを使用して連結される、請求項81〜84のいずれか一項に記載の結合剤。
- 前記結合剤は、配列番号19に示されるアミノ酸配列又はその配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有する配列変異体を含み、ここで、該配列変異体は、TcdA結合特異性及び/又はTcdB結合特異性を維持しているか、又は該配列変異体は、トキシン中和活性を維持しているか、又はその両方を維持している、請求項83に記載の結合剤。
- 前記配列変異体の変異アミノ酸は、前記VHHペプチド単量体の骨格領域に位置している、請求項87に記載の結合剤。
- 請求項80〜84及び87〜88のいずれか一項に記載の結合剤のヒト化された変異体。
- 請求項80〜84及び87〜88のいずれか一項に記載の結合剤のエピトープ結合断片。
- 請求項80〜84及び87〜88のいずれか一項に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項85に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項86に記載の結合剤をコードするヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項91に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項92に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項93に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項94に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 請求項95に記載の発現ベクターを含む単離された宿主細胞。
- 請求項96に記載の発現ベクターを含む単離された細胞。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項97に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項98に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 結合剤を製造する方法であって、請求項99に記載の単離された細胞を、前記発現ベクターによってコードされる該結合剤の発現を促進する条件下で培養することと、該結合剤を細胞培養物から回収することとを含む、方法。
- 請求項1〜8、17〜30、43〜50、59〜67及び80〜90のいずれか一項に記載の結合剤と、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬製剤。
- 被験体におけるC.ディフィシルによって誘発された疾患症状を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の1種以上の請求項1〜8、17〜30、43〜50、59〜67及び80〜90のいずれか一項に記載の結合剤を、C.ディフィシル感染症又はC.ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
- C.ディフィシルにより感染された被験体におけるC.ディフィシルのトキシンTcdA及び/又はTcdBを中和する方法であって、治療的有効量の1種以上の請求項1〜8、17〜30、43〜50、59〜67及び80〜90のいずれか一項に記載の結合剤を、C.ディフィシル感染症を伴う被験体に投与することを含む、方法。
- 被験体におけるC.ディフィシル感染症を治療又は予防する方法であって、治療的有効量の1種以上の請求項1〜8、17〜30、43〜50、59〜67及び80〜90のいずれか一項に記載の結合剤を、C.ディフィシル感染症又はC.ディフィシル感染症の発症のリスクを伴う被験体に投与することを含む、方法。
- 前記中和は、部分的又は完全な中和である、請求項105に記載の方法。
- 治療的有効量の抗生物質を前記被験体に投与することを更に含む、請求項106に記載の方法。
- 前記結合剤は、該結合剤及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む医薬製剤において存在する、請求項104〜106のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合剤の治療的有効量は、前記被験体の体重当たりの結合剤量として10μg/kgから100mg/kgの間である、請求項104〜106のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合剤を、前記被験体へと経口で、非経口で、又は直腸内で投与する、請求項104〜106のいずれか一項に記載の方法。
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