JP2018196379A - ヒトbrafのコドン600における一塩基多型(snp)を検出する方法 - Google Patents
ヒトbrafのコドン600における一塩基多型(snp)を検出する方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
(a)核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、3’末端の最後の3個のヌクレオチドがXをコードし、および3’末端から4番目のヌクレオチドがアデニン(A)以外の塩基を含有するプライマーを含み、ここで、Xが存在する場合は、プライマーはXにアニーリングし、
ここで、核酸の試料がmRNAである場合、段階(a)は、増幅反応を実施する前にmRNAから逆転写されたcDNAを得ることまたはmRNAからcDNAを逆転写することをさらに含み、
この後、Xが存在する場合は、増幅反応はXを含有する増幅産物を生成する、
(b)Xを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、ならびに
ここで、Xが2以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含む。増幅反応は少なくとも1つのペプチド核酸(PNA)クランプをさらに含むことができ、ここで少なくとも1つのPNAクランプは野生型であり、および増幅反応が1以上の他のPNAクランプを含む場合、PNAは検出可能オリゴヌクレオチドおよび/またはプライマーを捕捉し、PNAは、望ましくない標的に結合し、プライマーが望ましくない標的から増幅するのを妨げることによって検出可能オリゴヌクレオチドおよび/またはプライマーを捕捉する。Xを含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、Xを含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。増幅反応は、内部対照プライマーをさらに含むことができ、この場合、増幅反応は内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合、段階(b)は、内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む。内部対照を含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、内部対照を含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。Xは、E、K、D、RおよびNから成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸である。例えば、Xは、E、KおよびDから成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸であり得る。Xは、E、EおよびK、EおよびD、KおよびD、またはE、KおよびDであり得る。この方法が2以上のXを検出する段階を含む場合、この方法は、各々のXについてのDNAの試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る。これに関して、この方法はまた、いずれのXが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含み得る。
(a)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAA[配列番号:44]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAG[配列番号:45]を含むオリゴヌクレオチド、
(b)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAA[配列番号:46]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAG[配列番号:47]を含むオリゴヌクレオチド、
(c)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAT[配列番号:48]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAC[配列番号:49]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAT[配列番号:50]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAC[配列番号:51]を含むオリゴヌクレオチド、
(e)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGT[配列番号:52]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGC[配列番号:53]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGA[配列番号:54]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGG[配列番号:55]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACN AGA[配列番号:56]を含むオリゴヌクレオチド、および3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAGG[配列番号:57]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)および(e)、
(a)および(b)、
(a)および(c)、
(b)および(c)、
(a)、(b)および(c)、
(d)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、
(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、ならびに
(d)および(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか
から成る群より選択される少なくとも1つのプライマーを含み、
ここでNは、アデニン(A)以外の塩基を含むヌクレオチドであり、および
ここでオリゴヌクレオチドは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の5’末端のGと隣接して、ヌクレオチド配列の3’末端のTから始まるヌクレオチド配列5’ AATAGGTGATTTT 3’[配列番号:58]の1以上の連続するヌクレオチドをさらに含み得る。プライマーのセットは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む、逆プライマーなどのプライマーをさらに含むことができ、ここで、プライマーが15から27ヌクレオチドを含む場合、プライマーは配列番号:10の15から27個の連続するヌクレオチドを含む。検出可能オリゴヌクレオチドは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含むことができ、ここで、検出可能オリゴヌクレオチドが15から20ヌクレオチドを含む場合、検出可能オリゴヌクレオチドは配列番号:11の15から20個の連続するヌクレオチドを含む。
(i)ヒト由来の核酸の試料中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるV600Xの検出のためのプライマーのセット、ここでプライマーのセットは、
(a)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAA[配列番号:44]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAG[配列番号:45]を含むオリゴヌクレオチド、
(b)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAA[配列番号:46]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAG[配列番号:47]を含むオリゴヌクレオチド、
(c)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAT[配列番号:48]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAC[配列番号:49]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAT[配列番号:50]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAC[配列番号:51]を含むオリゴヌクレオチド、
(e)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGT[配列番号:52]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGC[配列番号:53]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGA[配列番号:54]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGG[配列番号:55]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACN AGA[配列番号:56]を含むオリゴヌクレオチド、および3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAGG[配列番号:57]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)および(e)、
(a)および(b)、
(a)および(c)、
(b)および(c)、
(a)、(b)および(c)、
(d)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、
(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、ならびに
(d)および(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか
から成る群より選択される少なくとも1つのプライマーを含み、
ここでNは、アデニン(A)以外の塩基を含むヌクレオチドであり、および
ここでオリゴヌクレオチドは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む、ならびに
(ii)ヒト由来の核酸の試料中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるアミノ酸位置600のバリンをコードするコドンの少なくとも1つの変異(X)(V600X)を検出する方法についての指示書、この方法は、
(a)核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、3’末端の最後の3個のヌクレオチドがXをコードし、および3’末端から4番目のヌクレオチドがアデニン(A)以外の塩基を含有するプライマー、ここで、Xが存在する場合は、プライマーはXにアニーリングし、ならびに少なくとも1つのペプチド核酸(PNA)クランプを含み、ここで少なくとも1つのPNAクランプは野生型標的からの増幅をブロックし、
ここで、核酸の試料がmRNAである場合、段階(a)は、増幅反応を実施する前にmRNAから逆転写されたcDNAを得ることまたはmRNAからcDNAを逆転写することをさらに含み、
この後、Xが存在する場合は、増幅反応はXを含有する増幅産物を生成する、ならびに
(b)Xを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、
ここで、Xが2以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
ここで、この方法が2以上のXを検出する段階を含む場合、この方法は、各々のXについての核酸の試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含むことができ、および
ここで、この方法はまた、いずれのXが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含み得る。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の5’末端のGと隣接して、ヌクレオチド配列の3’末端のTから始まるヌクレオチド配列5’ AATAGGTGATTTT 3’[配列番号:58]の1以上の連続するヌクレオチドをさらに含み得る。キットは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む、逆プライマーなどのプライマーをさらに含むことができ、ここで、プライマーが15から27ヌクレオチドを含む場合、プライマーは配列番号:10の15から27個の連続するヌクレオチドを含む。キットは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む検出可能オリゴヌクレオチドをさらに含むことができ、ここで、検出可能オリゴヌクレオチドが15から20ヌクレオチドを含む場合、検出可能オリゴヌクレオチドは配列番号:11の15から20個の連続するヌクレオチドを含む。Xは、E、K、D、RおよびNから成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸であり得る。Xは、E、KおよびDから成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸、例えばE、EおよびK、EおよびD、KおよびD、またはE、KおよびDであり得る。
(a)核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、3’末端の最後の3個のヌクレオチドがXをコードし、および3’末端から4番目のヌクレオチドがアデニン(A)以外の塩基を含有するプライマーを含み、ここで、Xが存在する場合は、プライマーはXにアニーリングし、
ここで、核酸の試料がmRNAである場合、段階(a)は、増幅反応を実施する前にmRNAから逆転写されたcDNAを得ることまたはmRNAからcDNAを逆転写することをさらに含み、
この後、Xが存在する場合は、増幅反応はXを含有する増幅産物を生成する、
(b)Xを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、ならびに
ここで、Xが2以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含む。増幅反応は少なくとも1つのペプチド核酸(PNA)クランプをさらに含むことができ、ここで少なくとも1つのPNAクランプは野生型標的からの増幅をブロックし、およびここで、増幅反応が1以上の他のPNAクランプを含む場合、PNAは、好ましくは検出可能オリゴヌクレオチドおよび/またはプライマーを捕捉する。Xを含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、Xを含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。増幅反応は、内部対照プライマーをさらに含むことができ、この場合増幅反応は内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合段階(b)は、内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む。内部対照を含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、内部対照を含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。この方法が2以上のXを検出する段階を含む場合、この方法は、各々のXについての核酸の試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る。これに関して、この方法はまた、いずれのXが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含み得る。
(a)「約」は、指定される値から±10%の変動を指す。このような変動は、具体的な言及が為されているか否かに関わらず、本明細書で提供される所与の値に常に包含されることが理解されるべきである。
被験者(例えばヒト被験者)からの核酸の試料中の、例えばBRAF遺伝子のエクソン15におけるアミノ酸位置600のバリンをコードするコドンの少なくとも1つの変異(X)(V600X)を検出する方法が提供される。この方法は、
(a)核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、3’末端の最後の3個のヌクレオチドがXをコードし、および3’末端から4番目のヌクレオチドがアデニン(A)以外の塩基を含有するプライマーを含み、ここで、Xが存在する場合は、プライマーはXにアニーリングし、
ここで、核酸の試料がmRNAである場合、段階(a)は、増幅反応を実施する前にmRNAから逆転写されたcDNAを得ることまたはmRNAからcDNAを逆転写することをさらに含み、
この後、Xが存在する場合は、増幅反応はXを含有する増幅産物を生成する、
(b)Xを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、ならびに
ここで、Xが2以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含む。プライマーに関して、本明細書では3’末端のヌクレオチド(nt)を以下のように参照する:
nt −− nt −− nt −− nt 3’
位置: 4番目 3番目 2番目 1番目
増幅反応は少なくとも1つのペプチド核酸(PNA)クランプをさらに含むことができ、ここで少なくとも1つのPNAクランプは野生型標的からの増幅をブロックし、およびここで、増幅反応が1以上の他のPNAクランプを含む場合、PNAは、好ましくは、望ましくない標的に結合することによって検出可能オリゴヌクレオチドおよび/またはプライマーを捕捉し、プライマーが望ましくない標的から増幅するのを妨げる。Xを含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、Xを含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。増幅反応は、内部対照プライマーをさらに含むことができ、この場合増幅反応は内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合段階(b)は、内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む。内部対照を含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、内部対照を含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。Xは、E、K、D、RおよびNから成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸である。例えば、Xは、E、KおよびDから成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸であり得る。Xは、E、EおよびK、EおよびD、KおよびD、またはE、KおよびDであり得る。Xはまた、野生型で認められるもの以外のコドン(即ちサイレント突然変異)または中途終止コドンによってコードされるVを含む、E、K、D、RまたはN以外の別のアミノ酸であり得る。好ましくは、しかし、Xは、前記のようにE、K、D、RまたはNの少なくとも1つである。
(a)DNAの試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、3’末端の最後の3個のヌクレオチドがXをコードし、および3’末端から4番目のヌクレオチドがアデニン(A)以外の塩基を含有するプライマーを含み、ここで、Xが存在する場合は、プライマーはXにアニーリングし、
この後、Xが存在する場合は、増幅反応はXを含有する増幅産物を生成する、
(b)Xを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、ならびに
ここで、Xが2以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含む。増幅反応は、(iii)少なくとも1つのペプチド核酸(PNA)クランプをさらに含むことができ、ここで少なくとも1つのPNAクランプは野生型標的からの増幅をブロックし、およびここで、増幅反応が1以上の他のPNAクランプを含む場合、PNAは、好ましくは検出可能オリゴヌクレオチドおよび/またはプライマーを捕捉する。Xを含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、Xを含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。増幅反応は、内部対照プライマーをさらに含むことができ、この場合、増幅反応は内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合、段階(b)は、内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む。内部対照を含有する増幅産物を検出する段階は、標識プライマーを検出することまたは増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、内部対照を含有する増幅産物への検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含み得る。この方法が2以上のXを検出する段階を含む場合、この方法は、各々のXについてのDNAの試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る。これに関して、この方法はまた、DNAの試料中にいずれのXが存在するかを決定する段階もさらに含み得る。
ヒト由来の核酸の試料中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるV600Xの増幅のためのプライマーのセットも提供される。プライマーのセットは、正プライマーなどのプライマーを含み、これらの各々はオリゴヌクレオチドであり、前記オリゴヌクレオチドは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチド長であり、および3’末端にXをコードするヌクレオチド配列を含む。V600Eの増幅のためのプライマーを含むプライマーのセットは、3’末端にGAAをコードする1つのプライマーおよび3’末端にGAGをコードする別のプライマーを含む。V600Kの増幅のためのプライマーのセットは、3’末端にAAAをコードする1つのプライマーおよび3’末端にAAGをコードする別のプライマーを含む。V600Dの増幅のためのプライマーを含むプライマーのセットは、3’末端にGATをコードする1つのプライマーおよび3’末端にGACをコードする別のプライマーを含む。V600Nの増幅のためのプライマーのセットは、3’末端にAATをコードする1つのプライマーおよび3’末端にAACを含む別のプライマーを含む。V600Rの増幅のためのプライマーを含むプライマーのセットは、3’末端にCGTをコードする1つのプライマー、3’末端にCGCをコードするプライマー、3’末端にCGAをコードするプライマー、3’末端にCGGをコードするプライマー、3’末端にAGAをコードするプライマーおよび3’末端にAGGをコードするプライマーを含む。前記プライマーのすべてに関して、ヌクレオチド配列の残りの部分(即ち3’側終止コドンまでのヌクレオチド配列)は、プライマーとV600Xをコードする正確に相補的な対立遺伝子配列との間で安定な二重鎖が選択的に形成するようなヌクレオチド配列であるべきである。言い換えると、V600Eの増幅のためのプライマーはV600Eを選択的に増幅するが、これ以外、例えばV600、V600K、V600D、V600NおよびV600Rは増幅しない。V600Kの増幅のためのプライマーはV600Kを選択的に増幅するが、V600E、V600D、V600NおよびV600Rは増幅しない。V600Dの増幅のためのプライマーはV600Dを選択的に増幅するが、V600E、V600K、V600NおよびV600Rは増幅しない。V600Nの増幅のためのプライマーはV600Nを選択的に増幅するが、V600E、V600K、V600DおよびV600Rは増幅しない。好ましくは、EがGAAによってコードされるV600Eの増幅のためのプライマーは、EがGAGによってコードされるV600Eを選択的に増幅せず、および逆もまた同様であり、KがAAAによってコードされるV600Kの増幅のためのプライマーは、KがAAGによってコードされるV600Kを選択的に増幅せず、および逆もまた同様であり、DがGATによってコードされるV600Dの増幅のためのプライマーは、DがGACによってコードされるV600Dを選択的に増幅せず、および逆もまた同様であり、NがAATによってコードされるV600Nの増幅のためのプライマーは、NがAACによってコードされるV600Nを選択的に増幅せず、逆もまた同様である。同様に、RがCGTによってコードされるV600Rの増幅のためのプライマーは、RがCGC、CGA、CGG、AGAおよびAGGによってコードされるV600Rを選択的に増幅せず、RがCGCによってコードされるV600Rの増幅のためのプライマーは、RがCGT、CGA、CGG、AGAおよびAGGによってコードされるV600Rを選択的に増幅せず、RがCGAによってコードされるV600Rの増幅のためのプライマーは、RがCGT、CGC、CGG、AGAおよびAGGによってコードされるV600Rを選択的に増幅せず、RがCGGによってコードされるV600Rの増幅のためのプライマーは、RがCGT、CGC、CGA、AGAおよびAGGによってコードされるV600Rを選択的に増幅せず、RがAGAによってコードされるV600Rの増幅のためのプライマーは、RがCGT、CGC、CGA、CGGおよびAGGによってコードされるV600Rを選択的に増幅せず、ならびにRがAGGによってコードされるV600Rの増幅のためのプライマーは、RがCGT、CGC、CGA、CGGおよびAGAによってコードされるV600Rを選択的に増幅しない。好ましくは、プライマーのセットは、
(a)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAA[配列番号:44]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAG[配列番号:45]を含むオリゴヌクレオチド、
(b)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAA[配列番号:46]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAG[配列番号:47]を含むオリゴヌクレオチド、
(c)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAT[配列番号:48]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAC[配列番号:49]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAT[配列番号:50]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAC[配列番号:51]を含むオリゴヌクレオチド、
(e)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGT[配列番号:52]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGC[配列番号:53]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGA[配列番号:54]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGG[配列番号:55]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACN AGA[配列番号:56]を含むオリゴヌクレオチド、および3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAGG[配列番号:57]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)および(e)、
(a)および(b)、
(a)および(c)、
(b)および(c)、
(a)、(b)および(c)、
(d)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、
(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、ならびに
(d)および(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか
から成る群より選択される少なくとも1つのプライマーを含み、
ここでNは、アデニン(A)以外の塩基を含むヌクレオチドであり、およびここでオリゴヌクレオチドは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む。「(a)、(b)および(c)のいずれか」とは、(a)、(b)、(c)、(a)および(b)、(a)および(c)、(b)および(c)、ならびに(a)、(b)および(c)を意味する。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の5’末端のGと隣接して、ヌクレオチド配列の3’末端のTから始まるヌクレオチド配列5’ AATAGGTGATTTT 3’[配列番号:58]の1以上の連続するヌクレオチドをさらに含み得る。プライマーのセットは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む、逆プライマーなどのプライマーをさらに含むことができ、ここで、プライマーが15から27ヌクレオチドを含む場合、プライマーは配列番号:10の15から27個の連続するヌクレオチドを含む。検出可能オリゴヌクレオチドは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含むことができ、ここで、検出可能オリゴヌクレオチドが15から20ヌクレオチドを含む場合、検出可能オリゴヌクレオチドは配列番号:11の15から20個の連続するヌクレオチドを含む。
キットも提供される。キットは、
(i)ヒト由来の核酸の試料中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるV600Xの検出のためのプライマーのセット、ここでプライマーのセットは、
(a)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAA[配列番号:44]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAG[配列番号:45]を含むオリゴヌクレオチド、
(b)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAA[配列番号:46]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAG[配列番号:47]を含むオリゴヌクレオチド、
(c)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAT[配列番号:48]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAC[配列番号:49]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAT[配列番号:50]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAC[配列番号:51]を含むオリゴヌクレオチド、
(e)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGT[配列番号:52]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGC[配列番号:53]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGA[配列番号:54]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGG[配列番号:55]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACN AGA[配列番号:56]を含むオリゴヌクレオチド、および3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAGG[配列番号:57]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)および(e)、
(a)および(b)、
(a)および(c)、
(b)および(c)、
(a)、(b)および(c)、
(d)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、
(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、ならびに
(d)および(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか
から成る群より選択される少なくとも1つのプライマーを含み、
ここでNは、アデニン(A)以外の塩基を含むヌクレオチドであり、および
ここでオリゴヌクレオチドは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む、ならびに
(ii)ヒト由来の核酸の試料中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるアミノ酸位置600のバリンをコードするコドンの少なくとも1つの変異(X)(V600X)を検出する方法についての指示書、この方法は、
(a)核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階、ここで増幅反応は、3’末端の最後の3個のヌクレオチドがXをコードし、および3’末端から4番目のヌクレオチドがアデニン(A)以外の塩基を含有するプライマー、ここで、Xが存在する場合は、プライマーはXにアニーリングし、ならびに少なくとも1つのペプチド核酸(PNA)クランプを含み、ここで少なくとも1つのPNAクランプは野生型標的からの増幅をブロックし、
ここで、核酸の試料がmRNAである場合、段階(a)は、増幅反応を実施する前にmRNAから逆転写されたcDNAを得ることまたはmRNAからcDNAを逆転写することをさらに含み、
この後、Xが存在する場合は、増幅反応はXを含有する増幅産物を生成する、ならびに
(b)Xを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、
ここで、Xが2以上のコドンによってコードされる場合、増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
ここで、この方法が2以上のXを検出する段階を含む場合、この方法は、各々のXについての核酸の試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含むことができ、および
ここで、この方法はまた、いずれのXが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含み得る。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の5’末端のGと隣接して、ヌクレオチド配列の3’末端のTから始まるヌクレオチド配列5’ AATAGGTGATTTT 3’[配列番号:58]の1以上の連続するヌクレオチドをさらに含み得る。キットは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む、逆プライマーなどのプライマーをさらに含むことができ、ここで、プライマーが15から27ヌクレオチドを含む場合、プライマーは配列番号:10の15から27個の連続するヌクレオチドを含む。
この実施例は、DNA中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるV600の個々のSNPの検出のための反応を述べる。
この実施例は、BRAF遺伝子のエクソン15におけるV600の複数のSNPの検出のためのプールされた反応を述べる。
この実施例は、本発明の方法における使用のための選択的正プライマーおよび検出可能オリゴヌクレオチドを述べる。
この実施例は、mRNA中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるV600の個々のSNPの検出のための反応を述べる。
この実験で使用した配列は上記および図1に示されている。図8は実験からのデータを示し、これらの実験では、野生型BRAF、V600E変異を有するBRAFおよびV600K変異を有するBRAFを区別するようにプライマー(図1のプライマー)を作製した。最初の列に(列は左側から右側へ進む;縦行は上から下へ進む。)、標的配列についての野生型または変異体の名称を示す。標的配列の名称の下は、標的配列の3’末端のヌクレオチド配列である。配列に下線を付し、変異体ヌクレオチドを赤色で示す。配列の下は、示されている配列によってコードされるアミノ酸である。
Claims (32)
- ヒト由来の核酸の試料中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるアミノ酸位置600のバリンをコードするコドンの少なくとも1つの突然変異(X)(V600X)を検出する方法であって、
(a)核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階であって、該増幅反応は、3’末端の最後の3個のヌクレオチドがXをコードし、かつ3’末端から4番目のヌクレオチドがアデニン(A)以外の塩基を含有するプライマーを含み、Xが存在する場合は、該プライマーはXにアニーリングし、
ここで、核酸の試料がmRNAである場合、段階(a)は、前記増幅反応を実施する前にmRNAから逆転写されたcDNAを得ることまたはmRNAからcDNAを逆転写することをさらに含み、
Xが存在する場合は、該増幅反応はXを含有する増幅産物を生成する、段階と、
(b)Xを含有する増幅産物を検出し、任意選択的に定量化する段階
を含み、
ここで、Xが2以上のコドンによってコードされる場合、前記増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
ヒト由来の核酸の試料中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるV600X突然変異が検出される、方法。 - 前記増幅反応が、少なくとも1つのペプチド核酸(PNA)クランプをさらに含み、ここで該少なくとも1つのPNAクランプが野生型標的からの増幅をブロックし、前記増幅反応が1以上の他のPNAクランプを含む場合、前記PNAが、望ましくない標的に結合し、プライマーが望ましくない標的から増幅するのを妨げることによって検出可能オリゴヌクレオチドおよび/またはプライマーを捕捉する、請求項1に記載の方法。
- 前記Xを含有する増幅産物を検出する段階が、標識プライマーを検出すること、または前記増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、かつ前記Xを含有する増幅産物への前記検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅反応が内部対照プライマーをさらに含み、この場合前記増幅反応が前記内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合段階(b)が、前記内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記内部対照を含有する増幅産物を検出する段階が、標識プライマーを検出すること、または前記増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、前記内部対照を含有する増幅産物への前記検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項4に記載の方法。
- Xが、E、K、D、RおよびNから成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸である、請求項1に記載の方法。
- Xが、E、KおよびDから成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸である、請求項1に記載の方法。
- XがEである、請求項1に記載の方法。
- Xが、EおよびKであるか、またはEおよびDであるか、またはKおよびDである、請求項1に記載の方法。
- XがE、KおよびDである、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前記方法が2以上のXを検出する段階を含む場合、前記方法が、各々のXについてのDNAの試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る、請求項1に記載の方法。
- いずれのXがDNAの試料中に存在するかを決定する段階をさらに含む、請求項11に記載の方法。
- ヒト由来の核酸の試料中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるV600Xの増幅のためのプライマーのセットであって、前記プライマーのセットが、
(a)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAA[配列番号:59]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAG[配列番号:60]を含むオリゴヌクレオチド、
(b)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAA[配列番号:46]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAG[配列番号:47]を含むオリゴヌクレオチド、
(c)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAT[配列番号:48]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAC[配列番号:49]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAT[配列番号:50]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAC[配列番号:51]を含むオリゴヌクレオチド、
(e)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGT[配列番号:52]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGC[配列番号:53]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGA[配列番号:54]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGG[配列番号:55]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACN AGA[配列番号:56]を含むオリゴヌクレオチド、および3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAGG[配列番号:57]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)および(e)、
(a)および(b)、
(a)および(c)、
(b)および(c)、
(a)、(b)および(c)、
(d)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、
(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、ならびに
(d)および(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか
から成る群より選択される少なくとも1つのプライマーを含み、
ここでNは、アデニン(A)以外の塩基を含むヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチドは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む、
プライマーのセット。 - 前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド配列の5’末端のGと隣接して、ヌクレオチド配列の3’末端のTから始まるヌクレオチド配列5’ AATAGGTGATTTT 3’[配列番号:58]の1以上の連続するヌクレオチドをさらに含む、請求項13に記載のプライマーのセット。
- 約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含むプライマーをさらに含み、ここで、逆プライマーが15から27ヌクレオチドを含む場合、該逆プライマーが配列番号:10の15から27個の連続するヌクレオチドを含む、請求項13に記載のプライマーのセット。
- 約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む検出可能オリゴヌクレオチドをさらに含み、ここで、該検出可能オリゴヌクレオチドが15から20ヌクレオチドを含む場合、該検出可能オリゴヌクレオチドが配列番号:11の15から20個の連続するヌクレオチドを含む、請求項13に記載のプライマーのセット。
- キットであって、
(i)ヒト由来の核酸の試料中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるV600Xの検出のためのプライマーのセットであって、該プライマーのセットは、
(a)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAA[配列番号:59]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAG[配列番号:60]を含むオリゴヌクレオチド、
(b)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAA[配列番号:46]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAG[配列番号:47]を含むオリゴヌクレオチド、
(c)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAT[配列番号:48]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNGAC[配列番号:49]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAT[配列番号:50]を含むオリゴヌクレオチドおよび/または3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAAC[配列番号:51]を含むオリゴヌクレオチド、
(e)3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGT[配列番号:52]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGC[配列番号:53]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGA[配列番号:54]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNCGG[配列番号:55]を含むオリゴヌクレオチド、3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACN AGA[配列番号:56]を含むオリゴヌクレオチド、および3’末端にヌクレオチド配列GGTCTAGCTACNAGG[配列番号:57]を含むオリゴヌクレオチド、
(d)および(e)、
(a)および(b)、
(a)および(c)、
(b)および(c)、
(a)、(b)および(c)、
(d)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、
(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか、ならびに
(d)および(e)とのさらなる組合せで、(a)、(b)および(c)のいずれか
から成る群より選択される少なくとも1つのプライマーを含み、
ここでNは、アデニン(A)以外の塩基を含むヌクレオチドであり、
前記オリゴヌクレオチドは、約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む、プライマーのセット、ならびに
(ii)ヒト由来の核酸の試料中のBRAF遺伝子のエクソン15におけるアミノ酸位置600のバリンをコードするコドンの少なくとも1つの変異(X)(V600X)を検出する方法についての指示書であって、前記方法は、
(a)核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階であって、該増幅反応は、3’末端の最後の3個のヌクレオチドがXをコードし、かつ3’末端から4番目のヌクレオチドがアデニン(A)以外の塩基を含有するプライマーであって、Xが存在する場合は、該プライマーはXにアニーリングするプライマーと、少なくとも1つのペプチド核酸(PNA)クランプであって、野生型標的からの増幅をブロックする少なくとも1つのPNAクランプを含み、
ここで、核酸の試料がmRNAである場合、段階(a)は、前記増幅反応を実施する前にmRNAから逆転写されたcDNAを得ることまたはmRNAからcDNAを逆転写することをさらに含み、
Xが存在する場合は、前記増幅反応はXを含有する増幅産物を生成する、段階と、
(b)Xを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、
ここで、Xが2以上のコドンによってコードされる場合、前記増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
前記方法が2以上のXを検出する段階を含む場合、前記方法は、各々のXについての核酸の試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含むことができ、
前記方法は、いずれのXが核酸の試料中に存在するかを決定する段階もさらに含む、指示書
を含む、キット。 - 前記(i)のオリゴヌクレオチドが、ヌクレオチド配列の5’末端のGと隣接して、ヌクレオチド配列の3’末端のTから始まるヌクレオチド配列5’ AATAGGTGATTTT 3’[配列番号:58]の1以上の連続するヌクレオチドをさらに含む、請求項17に記載のキット。
- 約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含むプライマーをさらに含み、ここで、該プライマーが15から27ヌクレオチドを含む場合、該プライマーが配列番号:10の15から27個の連続するヌクレオチドを含む、請求項17に記載のキット。
- 約15ヌクレオチドから約35ヌクレオチドを含む検出可能オリゴヌクレオチドをさらに含み、ここで、該検出可能オリゴヌクレオチドが15から20ヌクレオチドを含む場合、検出可能オリゴヌクレオチドが配列番号:11の15から20個の連続するヌクレオチドを含む、請求項17に記載のキット。
- Xが、E、K、D、RおよびNから成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸である、請求項17に記載のキット。
- Xが、E、KおよびDから成る群より選択される少なくとも1個のアミノ酸である、請求項17に記載のキット。
- XがEである、請求項17に記載のキット。
- Xが、EおよびKであるか、またはEおよびDであるか、またはKおよびDである、請求項17に記載のキット。
- XがE、KおよびDである、請求項17に記載のキット。
- 核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも1つの突然変異(X)を検出する方法であって、前記方法は、
(a)核酸の試料を用いて増幅反応を実施する段階であって、該増幅反応は、3’末端の最後の3個のヌクレオチドがXをコードし、かつ3’末端から4番目のヌクレオチドが野生型塩基以外の塩基を含有するプライマーを含み、Xが存在する場合は、該プライマーはXにアニーリングし、
ここで、核酸の試料がmRNAである場合、段階(a)は、前記増幅反応を実施する前にmRNAから逆転写されたcDNAを得ることまたはmRNAからcDNAを逆転写することをさらに含み、
Xが存在する場合は、前記増幅反応はXを含有する増幅産物を生成する、段階と、
(b)Xを含有する増幅産物を検出する段階
を含み、
ここで、Xが2以上のコドンによってコードされる場合、前記増幅反応は各々のコドンについてのプライマーを含み、
ヒト由来の核酸の試料中の遺伝子のコドンにおいて変異が検出される、方法。 - 前記増幅反応は、少なくとも1つのPNAクランプをさらに含み、ここで該少なくとも1つのPNAクランプが野生型標的からの増幅をブロックし、前記増幅反応が1以上の他のPNAクランプを含む場合、前記PNAは、望ましくない標的に結合し、プライマーが望ましくない標的から増幅するのを妨げることによって検出可能オリゴヌクレオチドおよび/またはプライマーを捕捉し、前記PNAが、検出可能オリゴヌクレオチドおよび/またはプライマーを捕捉する、請求項26に記載の方法。
- 前記Xを含有する増幅産物を検出する段階が、標識プライマーを検出すること、または前記増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、前記Xを含有する増幅産物への前記検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記増幅反応が内部対照プライマーをさらに含み、この場合前記増幅反応が前記内部対照を含有する増幅産物も生成し、この場合段階(b)が、前記内部対照を含有する増幅産物を検出することを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記内部対照を含有する増幅産物を検出する段階が、標識プライマーを検出すること、または前記増幅産物を検出可能オリゴヌクレオチドと接触させ、前記内部対照を含有する増幅産物への前記検出可能オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出することを含む、請求項29に記載の方法。
- 請求項29に記載の方法であって、前記方法が2以上のXを検出する段階を含む場合、前記方法が、各々のXについてのDNAの試料を用いた増幅反応を一緒にまたは別々に実施することを含み得る、請求項29に記載の方法。
- 核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも1つの突然変異(X)を検出するためのプライマーを設計する方法であって、3’末端の最後の3個のヌクレオチドがXをコードし、かつ3’末端から4番目のヌクレオチドが野生型遺伝子中に存在する塩基以外の塩基を含有するプライマーを合成して、核酸の試料中の遺伝子におけるコドンの少なくとも1つの突然変異(X)を検出するためのプライマーを設計することを含む、方法。
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