JP2018163248A - 画像取得方法および画像取得装置 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞等の生体試料を明視野で撮影し、生体試料の観察に適した観察用画像を取得することができる画像取得方法および画像取得装置を提供する。【解決手段】まず、生体試料に照明光を照射しつつ、中心波長の異なる複数の波長帯域において生体試料を撮影する（ステップＳ１）。次に、取得した複数の撮影画像について、画素毎に、波長帯域の変化に対する輝度の変化を表す波長プロファイルを得る（ステップＳ２）。そして、波長プロファイルに応じて、各画素を複数のクラスターに分類する（ステップＳ３）。その後、各画素に、分類されたクラスターに対応する階調値を割り当てることにより、観察用画像を生成する（ステップＳ４）。これにより、生体試料の観察に適した観察用画像を生成できる。【選択図】図３

Description

本発明は、画像取得方法および画像取得装置に関する。

医療や生物化学の分野では、観察対象である細胞の撮像を行う。観察用の容器内に収容された細胞を観察する際、透明な細胞はその特徴を観察するのが困難な場合がある。そこで、従来、細胞の視認性を高めるため、染料を用いた細胞の染色が行われている。しかしながら、染色を行うと細胞がダメージを負うという問題がある。このため、無染色で細胞の視認性を高める必要がある。従来の明視野における細胞の撮像方法は、例えば、特許文献１に記載されている。特許文献１に記載の撮像方法では、撮像系の焦点距離を合焦点からずらすことにより、コントラストの向上を図っている。

特開２００８−２０４９８号公報

しかしながら、特許文献１に記載の撮像方法では、視野内に形状の異なる複数種類の細胞がある場合、細胞同士が重なり合っている場合、または細胞が密集して配置される場合などでは、観察に十分なコントラストを得ることが難しい場合がある。

また、視認性の高い細胞の画像を得るために、例えば、位相差顕微鏡を用いることも考えられる。しかしながら、位相差顕微鏡には、位相差観察用の対物レンズ、位相板、コンデンサ等の多くの部品が必要であり、装置構成が複雑となる。また、位相差顕微鏡では、比較的大きな細胞塊を撮影する際に、細胞塊と背景との間にハローと呼ばれる光の輪郭が生じる。このため、輪郭付近の構造を詳細に観察したい場合には、位相差顕微鏡は不向きである。

本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、細胞等の生体試料を明視野で撮影し、生体試料の観察に適した観察用画像を取得することができる画像取得方法および画像取得装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本願の第１発明は、生体試料を撮影して観察用画像を生成する画像取得方法であって、ａ）前記生体試料に照明光を照射しつつ、中心波長の異なる複数の波長帯域において前記生体試料を撮影する工程と、ｂ）前記工程ａ）で取得した複数の前記撮影画像について、画素毎に、前記波長帯域の変化に対する輝度の変化を表す波長プロファイルを得る工程と、ｃ）前記波長プロファイルに応じて、各画素を複数のクラスターに分類する工程と、ｄ）各画素に、分類された前記クラスターに対応する階調値を割り当てることにより、前記観察用画像を生成する工程と、を有する。

本願の第２発明は、第１発明の画像取得方法であって、前記工程ｃ）では、前記波長プロファイルの特徴が近い画素を同一のクラスターに分類する。

本願の第３発明は、第１発明または第２発明の画像取得方法であって、前記工程ｃ）では、ｋ−ｍｅａｎｓ法を用いて、各画素を複数のクラスターに分類する。

本願の第４発明は、第１発明ないし第３発明のいずれかの画像取得方法であって、前記工程ｄ）では、前記クラスターに属する前記波長プロファイルの所定の波長帯域における輝度値の平均値に基づいて、前記階調値を割り当てる。

本願の第５発明は、第１発明ないし第４発明のいずれかの画像取得方法であって、前記工程ｄ）では、特定のクラスターに属する画素を、強調表示する。

本願の第６発明は、第１発明ないし第５発明のいずれかの画像取得方法であって、前記工程ｃ）において分類されるクラスターの数を変更する工程をさらに有する。

本願の第７発明は、第１発明ないし第６発明のいずれかの画像取得方法であって、前記工程ａ）では、中心波長の異なる４つ以上の波長帯域において前記生体試料を撮影する。

本願の第８発明は、第１発明ないし第７発明のいずれかの画像取得方法であって、前記工程ａ）において、前記複数の波長帯域は、それぞれ、その半値幅が１５０ナノメートル以下である。

本願の第９発明は、第１発明ないし第８発明のいずれかの画像取得方法であって、前記工程ａ）では、合焦点位置から光軸に沿って所定の距離ずれた位置を焦点位置として、前記生体試料を撮影する。

本願の第１０発明は、第１発明ないし第９発明のいずれかの画像取得方法であって、前記工程ａ）では、通過帯域が可変のバンドパスフィルタを介して、前記生体試料を撮影する。

本願の第１１発明は、第１発明ないし第１０発明のいずれかの画像取得方法であって、前記工程ａ）では、開口数ＮＡが０．３以下の照明光学系を介して、前記生体試料に前記照明光を照射する。

本願の第１２発明は、第１発明ないし第１１発明のいずれかの画像取得方法であって、前記照明光学系の前記開口数ＮＡと撮像光学系の開口数ＮＡとの比であるコヒーレンスファクターσが、０．６以下である。

本願の第１３発明は、第１発明ないし第１２発明のいずれかの画像取得方法であって、前記生体試料は細胞である。

本願の第１４発明は、生体試料を撮影して観察用画像を生成する画像取得装置であって、前記生体試料に照明光を照射する照明部と、前記照明光が照射された前記生体試料を撮影する撮像部と、前記撮像部により取得された撮影画像を加工する画像処理部と、を備え、前記撮像部は、中心波長の異なる複数の波長帯域において前記生体試料を撮影し、前記画像処理部は、複数の前記撮影画像について、画素毎に、前記波長帯域の変化に対する輝度の変化を表す波長プロファイルを生成し、前記波長プロファイルに応じて、各画素を複数のクラスターに分類する。

本願の第１発明から第１４発明によれば、波長プロファイルに応じて、各画素を複数のクラスターに分類する。これにより、生体試料の観察に適した観察用画像を生成できる。

特に、本願の第４発明によれば、未処理画像の輝度値分布を反映した観察用画像を生成できる。これにより、より自然な観察用画像を得ることができる。

特に、本願の第６発明によれば、例えば、画像中の背景に相当する部分が多くのクラスターに分類され、生体試料に相当する部分のクラスター数が少ない場合に、クラスターの数を増加させて、生体試料に相当する部分を十分なクラスター数に分類できる。

特に、本願の第８発明によれば、撮影に用いる複数の波長帯域を、それぞれ狭帯域とする。これにより、工程ｂ）において、変化の大きい波長プロファイルを得ることができる。その結果、工程ｃ）において、各画素をより適切に分類できる。

特に、本願の第９発明によれば、合焦点位置から少し離れた位置に焦点位置をずらすことにより、透明な生体試料の明瞭な画像を得ることができる。

特に、本願の第１２発明によれば、よりコントラストの高い画像が得られる。

細胞観察装置の概略図である。 培養容器の斜視図である。 細胞観察装置の動作の流れを示したフローチャートである。 撮影処理の流れを示したフローチャートである。 複数の撮影画像を概念的に示した図である。 波長プロファイルの例を示したグラフである。 撮影画像の例を示した図である。 観察用画像の例を示した図である。 コヒーレンスファクターによる撮影画像の変化を示した図である。 波長帯域の半値幅による撮影画像の変化を示した図である。 焦点位置と細胞の見え方との関係を模式的に示した図である。

以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。

＜１．細胞観察装置の構成＞
図１は、本発明の画像取得装置の一実施形態に係る細胞観察装置１の構成を示した概略図である。本実施形態の細胞観察装置１は、撮影位置Ｐに配置された培養容器９内に保持された生体試料である細胞９２を撮影して、観察用画像Ｉｏを生成する装置である。図２は、培養容器９の斜視図である。

培養容器９は、複数の窪部９００を有するウェルプレートである。複数の窪部９００は、二次元的に規則的に配列されている。また、各窪部９００は、光透過性の底部を有する。培養容器９は、各窪部９００内に、培養液９１を収容するとともに、観察対象である細胞９２を培養液９１内に保持する。各窪部９００の内部において細胞９２を培養することにより、窪部９００の底部に沿って細胞９２が培養される。以下では、培養容器９と、培養容器９内の培養液９１および細胞９２を併せて試料９０と称する。なお、培養容器９は、ウェルプレートに代えて、ガラスや樹脂等で形成された光透過性のシャーレであってもよい。

図１に示すように、細胞観察装置１は、照明部２０と、撮像光学系３０と、撮像部４０と、コンピュータ６０とを有する。照明部２０、撮像光学系３０および撮像部４０は、装置本体（図示せず）に支持される。

照明部２０は、光源２１と、照明光学系２２とを含む。照明部２０は、撮影位置Ｐの上方に配置される。照明部２０は、細胞９２の撮影時に、撮影対象となる試料９０に対して上側から照明光を照射する。

本実施形態の光源２１は、ハロゲンランプである。このため、光源２１は、多数の波長の光が混在する白色光を出射する。

照明光学系２２は、バンドパスフィルタ５０と、コレクタレンズ２２１、視野絞り２２２、開口絞り２２３、およびコンデンサレンズ２２４とを有する。光源２１から出射された照明光は、コレクタレンズ２２１、視野絞り２２２、バンドパスフィルタ５０、開口絞り２２３およびコンデンサレンズ２２４を順に通過した後、試料９０に照射される。

バンドパスフィルタ５０は、特定の狭波長帯域を通過帯域とする光学フィルタである。バンドパスフィルタ５０は、光源２１から出射された、広い波長帯を有する白色光のうち、狭波長帯の光（単色光）のみを通過させる。照明光学系２２がバンドパスフィルタ５０を含むことにより、照明部２０は、試料９０に対して、狭波長帯の照明光を照射する。また、本実施形態のバンドパスフィルタ５０には、通過帯域を変化させることが可能なフィルタ（例えば、液晶チューナブルフィルタ）が用いられる。

コレクタレンズ２２１は、光源２１から出射された照明光の向きを調整するレンズである。視野絞り２２２は、撮影位置Ｐにおける照明領域を調節する。開口絞り２２３は、照明光学系２２の開口数ＮＡを調整する。コンデンサレンズ２２４は、照明光を集光させる。照明光学系２２の開口数ＮＡは、例えば、０．３以下とすることが好ましい。

撮像光学系３０は、撮影位置Ｐと撮像部４０との間に配置される。撮像光学系３０は、対物レンズ３１、開口絞り３２、結像レンズ３３、ビームスプリッター３４および接眼レンズ３５を有する。対物レンズ３１は、観察対象を拡大して像を映し出すためのレンズである。開口絞り３２は、撮像光学系３０の開口数ＮＡを調整する。結像レンズ３３は、撮像部４０の受光面および接眼レンズ３５に撮像対象物の像を結像させる。ビームスプリッター３４は、結像レンズ３３を通過した光を撮像部４０側と接眼レンズ３５側とに分岐させる。

照明部２０により照射され、試料９０を透過した光は、対物レンズ３１、開口絞り３２および結像レンズ３３を介して進む。そして、ビームスプリッター３４において接眼レンズ３５へと向かう光と、撮像部４０へと向かう光とに分かれる。ビームスプリッター３４は、接眼レンズ３５へ向かう光と撮像部４０へ向かう光との比率を、切り替え可能であってもよい。接眼レンズ３５は、結像位置３５０よりもビームスプリッター３４から離れた位置に配置される。接眼レンズ３５は、観察者が観察を行う際に覗くレンズである。対物レンズ３１で拡大した像を接眼レンズ３５でさらに拡大して観察できる。

なお、図１において、照明光学系２２および撮像光学系３０を構成する各部は、光軸に沿って一列に配列されている。しかしながら、照明光学系２２および撮像光学系３０における光路は、反射鏡等によって折り返されてもよい。

撮像部４０は、受光面に結像した試料９０の二次元画像を、デジタル画像データとして取得する。すなわち、撮像部４０は、撮影位置Ｐに配置された細胞９２を撮像する。撮像部４０には、例えば、ＣＣＤカメラや、ＣＭＯＳカメラが用いられる。

この細胞観察装置１では、照明部２０が、上述したバンドパスフィルタ５０によって、白色光よりも波長帯域が小さい狭波長帯の照明光を試料９０へ照射する。また、この細胞観察装置１は、バンドパスフィルタ５０の通過帯域を変化させることができる。このため、撮像部４０は、中心波長の異なる複数の波長帯域において、細胞９２の画像を取得することが可能である。

なお、本実施形態では、照明部２０が試料９０の上方から照明光を照射し、撮像部４０が試料９０の下方からの映像を撮像する。しかしながら、本発明の細胞観察装置は、このような構造に限られない。照明部２０が試料９０の下方から照明光を照射し、撮像部４０が試料９０の上方からの映像を撮像してもよい。

コンピュータ６０は、細胞観察装置１内の各部を動作制御する制御部としての機能と、撮像部４０により取得された撮影画像Ｉ１〜Ｉｎを加工する画像処理部としての機能と、を有する。図１中に概念的に示したように、コンピュータ６０は、ＣＰＵ等のプロセッサ６０１、ＲＡＭ等のメモリ６０２、およびハードディスクドライブ等の記憶部６０３を有する。記憶部６０３には、動作制御プログラムＰ１と画像処理プログラムＰ２とが、記憶されている。また、コンピュータ６０は、上述した光源２１、バンドパスフィルタ５０、および撮像部４０と、電気的に接続されている。

コンピュータ６０は、動作制御プログラムＰ１に従って動作することにより、上述した光源２１、バンドパスフィルタ５０、および撮像部４０を動作制御する。これにより、細胞観察装置１における細胞９２の撮影処理が進行する。後述の通り、この細胞観察装置１では、バンドパスフィルタ５０の通過帯域を変化させつつ、複数回の撮影を行う。これにより、コンピュータ６０は、撮像部４０から、複数の撮影画像Ｉ１〜Ｉｎを取得する。また、コンピュータ６０は、複数の撮影画像Ｉ１〜Ｉｎに、画像処理プログラムＰ２に基づく画像処理を行う。これにより、複数の撮影画像Ｉ１〜Ｉｎが、細胞９２の観察に適した１つの観察用画像Ｉｏに変換される。

＜２．細胞観察装置の動作＞
続いて、上述した細胞観察装置１の動作について、より詳細に説明する。図３は、細胞観察装置１の動作の流れを示したフローチャートである。

細胞観察装置１において細胞９２の観察を行うときには、まず、細胞９２が保持された培養容器９を、細胞観察装置１の撮影位置Ｐにセットする。そして、コンピュータ６０に撮影開始の指示を入力する。すると、コンピュータ６０は、光源２１を点灯させて、細胞９２に照明光を照射する。そして、コンピュータ６０は、バンドパスフィルタ５０と撮像部４０とを動作させて、細胞９２のマルチスペクトル撮影（多波長撮影）を行う（ステップＳ１）。すなわち、バンドパスフィルタ５０の通過帯域を変化させつつ、撮像部４０による細胞９２の撮影を、複数回行う。

図４は、ステップＳ１における撮影処理の流れを、より詳細に示したフローチャートである。図４に示すように、ステップＳ１では、撮像部４０による１回の細胞９２の撮影（ステップＳ１１）を実行した後、撮影すべき次の波長帯域があるか否かが、コンピュータ６０によって判断される（ステップＳ１２）。撮影すべき波長帯域の数は、例えば、４つ以上とすればよい。撮影すべき次の波長帯域がある場合には（ステップＳ１２においてｙｅｓ）、バンドパスフィルタ５０の通過帯域を、その波長帯域に切り替えて（ステップＳ１３）、再び細胞９２の撮影を行う（ステップＳ１１）。そして、予め設定された全ての波長帯域の撮影画像が取得されるまで、ステップＳ１１〜Ｓ１３の処理を繰り返す。やがて、撮影すべき波長帯域が無くなると（ステップＳ１２においてｎｏ）、細胞観察装置１は、細胞９２の撮影を終了する。これにより、中心波長の異なる複数の波長帯域において撮影された、複数の撮影画像Ｉ１〜Ｉｎ（ｎ：２以上の整数）が得られる。

なお、図４は、培養容器９内の１つの撮影領域（視野）についての撮影手順である。培養容器９内の複数の撮影領域において、細胞９２の画像を取得したい場合には、細胞観察装置１は、撮影領域ごとに、図４の処理を実行すればよい。

図３に戻る。ステップＳ１の撮影処理が終了すると、コンピュータ６０は、取得した複数の撮影画像Ｉ１〜Ｉｎから、１つの観察用画像Ｉｏを生成する処理を行う（ステップＳ２〜Ｓ４）。

図５は、ステップＳ１で取得された複数の撮影画像Ｉ１〜Ｉｎを、概念的に示した図である。複数の撮影画像Ｉ１〜Ｉｎは、それぞれ、複数の画素ｐにより構成される。コンピュータ６０は、まず、複数の撮影画像Ｉ１〜Ｉｎについて、同一の座標に位置する画素ｐ同士（例えば、図５中に示した画素ｐ同士）を比較する。そして、画素ｐが存在する座標（以下、「画素座標Ｃ」と称する）ごとに、波長プロファイルＷを作成する（ステップＳ２）。具体的には、同一の画素座標Ｃに位置する画素ｐ同士を比較して、輝度の変化を表す波長プロファイルＷを作成する。そして、このような波長プロファイルＷを、全ての画素座標Ｃについて作成する。

その結果、例えば、図６のように、波長帯域の変化に対する輝度の変化を表す波長プロファイルＷが、画素座標Ｃごとに得られる。図６の横軸は、撮影時の波長帯域の中心波長を示す。図６の縦軸は、輝度を示す。

図３に戻る。複数の波長プロファイルＷが得られると、続いて、コンピュータ６０は、各画素座標Ｃを、複数のクラスターに分類する（ステップＳ３）。ここでは、画素座標Ｃごとに、ステップＳ２で得られた波長プロファイルＷを参照する。そして、各画素座標Ｃを、波長プロファイルＷの特徴に応じて、予め用意された複数のクラスターの１つに分類する。このとき、コンピュータ６０は、波長プロファイルＷの特徴が近い画素座標Ｃを、同一のクラスターに分類する。例えば、波長プロファイルＷの傾き、変曲点の数、変曲点の位置、輝度の平均値、輝度の最大値、輝度の最小値等の複数の要素を考慮して、画素座標Ｃを、複数のクラスターに分類する。

また、ステップＳ３のクラスターの分類には、ｋ−ｍｅａｎｓ法を用いてもよい。ｋ−ｍｅａｎｓ法を用いる場合には、まず、複数の画素座標Ｃを、予め決められた数のクラスターに、ランダムまたは所定の法則に従って分類する。次に、各クラスターに属する波長プロファイルＷの中心を求める。その後、複数の画素座標Ｃを、波長プロファイルＷの中心が最も近いクラスターに分類し直す。コンピュータ６０は、このような処理を、各画素座標Ｃの分類結果が変動しなくなるまで、あるいは、所定の停止条件を満たすまで繰り返す。このようなｋ−ｍｅａｎｓ法を用いれば、各画素座標Ｃを、波長プロファイルＷに応じて、複数のクラスターに適切かつ自動的に分類できる。

その後、コンピュータ６０は、ステップＳ３の分類結果に基づいて、観察用画像Ｉｏを生成する（ステップＳ４）。ここでは、観察用画像Ｉｏの各画素に（すなわち各画素座標Ｃに）、分類されたクラスターに対応する階調値を割り当てる。これにより、細胞９２の観察に適した観察用画像Ｉｏが得られる。

図７は、ステップＳ１において取得される撮影画像Ｉ１〜Ｉｎの例を示した図である。図８は、ステップＳ４において生成される観察用画像Ｉｏの例を示した図である。図７と図８とを比較すると、図７の撮影画像よりも、図８の観察用画像Ｉｏの方が、細胞９２の位置や形を明瞭に把握できる。すなわち、上述した波長プロファイルＷに基づくクラスター分けによって、撮影画像Ｉ１〜Ｉｎよりも細胞９２の観察に適した観察用画像Ｉｏが生成されていることが分かる。

なお、上述した階調値には、例えば、クラスターに属する複数の画素座標Ｃの波長プロファイルＷから算出される輝度値を用いるとよい。具体的には、クラスターに属する複数の画素座標Ｃの波長プロファイルＷの、所定の波長帯域における輝度値の平均値を、そのクラスターに対応する階調値とすればよい。上述した「所定の波長帯域」は、マルチスペクトル撮影に用いた全波長帯域であってもよいし、一部の波長帯域であってもよい。

このように、観察用画像Ｉｏの各画素の階調値は、撮影画像Ｉ１〜Ｉｎがもつ輝度値を使って算出されることが好ましい。これにより、撮影画像Ｉ１〜Ｉｎの輝度値分布を反映した、より自然な観察用画像Ｉｏを得ることができる。

＜３．撮影条件について＞
続いて、上述したステップＳ１における、好ましい撮影条件について、説明する。この細胞観察装置１では、無染色の細胞９２を観察することを想定している。一般的に細胞９２は無色透明に近いため、無染色状態の細胞９２を明視野下で観察しようとすると、その構成要素の輪郭を特定しにくい。このため、ステップＳ１のマルチスペクトル撮影においては、コヒーレンスファクターσ、照明光の波長帯域の半値幅、および焦点位置を、適切に設定して、撮影画像Ｉ１〜Ｉｎのコントラストを高めることが好ましい。

＜３−１．コヒーレンスファクターについて＞
初めに、コヒーレンスファクターσの条件について、図９を参照しつつ説明する。図９は、コヒーレンスファクターσの値を変化させて撮像部４０が取得した撮影画像を示した図である。

コヒーレンスファクターσは、照明光学系２２の開口数ＮＡと、撮像光学系３０の開口数ＮＡとの比である。具体的には、コヒーレンスファクターσは、照明光学系２２の開口数ＮＡを撮像光学系３０の開口数ＮＡで割った値である。コヒーレンスファクターσを小さくすることにより、撮像部４０で取得できる画像のコントラストを向上できる。

図９には、コヒーレンスファクターσの値をσ＝１．００、σ＝０．８３、σ＝０．５８、σ＝０．３６、σ＝０．２６、およびσ＝０．１４とした場合の細胞９２の撮影画像の例が示されている。図９の例の細胞９２は、細胞体９２１と、細胞体９２１から突出した突起９２２と、細胞体９２１の内部の微細構造９２３とを有する。なお、このときのバンドパスフィルタ５０の中心波長は５５０ｎｍであり、半値幅は３９ｎｍである。したがって、細胞９２に照射される狭波長帯の照明光の中心波長は５５０ｎｍ、半値幅は３９ｎｍである。

図９に示すように、コヒーレンスファクターσの値が小さくなるにつれ、細胞９２の撮影画像のコントラストが向上する。特に、σ＝０．８３の場合にはぼやけていた細胞体９２１の輪郭が、σ＝０．５８の場合にははっきりと視認できる。また、σ＝０．８３の場合には視認が困難な突起９２２の輪郭や、細胞体９２１の微細構造９２３の輪郭の存在を、σ＝０．５８の場合には視認できる。このように、コヒーレンスファクターσの値をσ＝０．６以下とすることにより、明視野において透明な細胞９２の各部を視認できる程度まで、撮影画像のコントラストを向上できる。

また、σ＝０．５８の場合にはぼやけていた突起９２２の輪郭や、細胞体９２１の微細構造９２３の輪郭を、σ＝０．３６の場合には視認できる。このように、コヒーレンスファクターσの値をσ＝０．４以下とすることにより、明視野において透明な細胞９２の各部をより鮮明に視認できる程度まで、撮影画像のコントラストをより向上できる。

σ＝０．２６の場合には、σ＝０．３６の場合と同様、細胞体９２１の輪郭を鮮明に視認できる。また、σ＝０．２６の場合には、σ＝０．３６の場合よりもさらに撮影画像のコントラストが向上する。一方、σ＝０．１４の場合では、σ＝０．２６の場合と比べて明らかな視認性およびコントラストの向上は見られなかった。

以上の結果より、上述したステップＳ１においては、コヒーレンスファクターσが０．６以下となるように、照明光学系２２および撮像光学系３０を調整して、マルチスペクトル撮影を行うことが好ましいと言える。また、コヒーレンスファクターσを０．４以下とすれば、より好ましいと言える。また、コヒーレンスファクターσを０．３以下とすれば、さらに好ましいと言える。

＜３−２．照明光の波長帯域の半値幅について＞
次に、照明光の波長帯域の半値幅について、説明する。照明部２０から照射される照明光は、細胞９２の表面において屈折する。このとき、照明光が、白色光よりも波長帯域が小さい狭波長帯の光である場合には、白色光の場合よりも、屈折箇所における光の拡がりが少ない。すなわち、狭波長帯の照明光は、屈折後もほぼ同一方向へ進行する。このため、狭波長帯の照明光を用いれば、視認性の高い撮影画像を得ることができる。

図１０には、バンドパスフィルタ５０を使用しない場合と、バンドパスフィルタ５０の半値幅を１５３ｎｍ、１２４ｎｍ、および１０ｎｍとした場合との細胞９２の撮影画像の例が示されている。バンドパスフィルタ５０の半値幅が小さいほど、バンドパスフィルタ５０を通過した照明光の波長帯域は小さくなる。図１０の例の細胞９２は、細胞体９２１と、細胞体９２１から突出した突起９２２とを有する。なお、このときのコヒーレンスファクターσの値はσ＝０．２６であり、バンドパスフィルタ５０の中心波長は５５０ｎｍである。

図１０に示すように、バンドパスフィルタ５０を使用しない白色光における撮影画像と比べて、バンドパスフィルタ５０を使用した狭波長帯における３つの撮影画像では、細胞９２の各部を視認しやすい。特に、白色光における撮影画像では、細胞体９２１から延びる突起９２２を視認するのが困難であるのに対し、狭波長帯における３つの撮影画像では、突起９２２を視認できる。このように、狭波長帯における細胞９２の像を撮像することにより、コントラストが高い撮影画像を得ることができる。このように、バンドパスフィルタ５０が介在することにより、細胞９２による拡がりが生じにくい狭波長帯の光のみを撮像部４０が撮像する。したがって、コントラストの高い撮影画像を取得できる。

また、図１０に示すように、狭波長帯における３つの撮影画像を比較すると、狭波長帯の半値幅が小さくなるにつれ、画像のコントラストが向上する。特に、半値幅が１２４ｎｍの場合には、半値幅が１５３ｎｍの場合と比べて、突起９２２の輪郭の視認性が大きく向上している。このように、狭波長帯の半値幅は、１５０ｎｍ以下であることが好ましい。一方、半値幅が１０ｎｍの場合には、半値幅１２４ｎｍの場合と比べて、突起９２２の輪郭の視認性がさらに向上する。したがって、狭波長帯の半値幅は、１００ｎｍ以下であることがより好ましい。すなわち、狭波長帯の半値幅を１５０ｎｍ以下や、１００ｎｍ以下とすることにより、よりコントラストの高い細胞画像を取得できる。

以上の結果より、上述したステップＳ１においては、マルチスペクトル撮影に用いられる各波長帯域の半値幅を、１５０ｎｍ以下とすることが好ましいと言える。また、マルチスペクトル撮影に用いられる各波長帯域の半値幅を、１００ｎｍ以下とすれば、より好ましいと言える。これにより、上述したステップＳ２において、変化の大きい波長プロファイルＷを得ることができる。その結果、上述したステップＳ３において、各画素をより適切に分類できる。

＜３−３．焦点位置について＞
最後に、焦点位置の条件について、図１１を参照しつつ説明する。図１１は、焦点位置と細胞９２の見え方との関係を模式的に示した図である。図１１中に模式的に示したように、細胞９２は透明であるため、撮像光学系３０の焦点位置を細胞９２に合わせた合焦点位置とすると、撮像部４０により取得された画像において、細胞内部と細胞外部との輝度は近似する。このため、合焦点位置では、細胞９２が視認しにくくなる。

撮像光学系３０の焦点位置を合焦点位置から近距離方向（撮像部４０側）へとずらすと、細胞内部が細胞外部よりも白く見える。そして、撮像光学系３０の焦点位置を合焦点位置から一定距離近距離方向へずらした第１位置において、エッジの強さが極大値をとる。このため、第１位置において、細胞９２および細胞９２の各部の視認性が高くなる。撮像光学系３０の焦点位置を第１位置よりもさらに近距離方向へずらすと、画像がぼけて、エッジが弱くなり、細胞９２の視認性が低下する。

一方、撮像光学系３０の焦点距離を合焦点位置から遠距離方向（照明部２０側）へとずらすと、細胞内部が細胞外部よりも黒く見える。そして、撮像光学系３０の焦点位置を合焦点位置から一定距離遠距離方向へずらした第２位置において、エッジの強さが極大値をとる。このため、第２位置において、細胞９２および細胞９２の各部の視認性が高くなる。撮像光学系３０の焦点位置を第２位置よりもさらに遠距離方向へずらすと、画像がぼけて、エッジが弱くなり、細胞９２の視認性が低下する。

したがって、上述したステップＳ１においては、撮像光学系３０の焦点位置を、合焦点位置から一定距離ずらした第１位置または第２位置として、マルチスペクトル撮影を行うことが好ましい。これにより、より高いコントラストの撮影画像Ｉ１〜Ｉｎを取得できる。なお、合焦点位置から第１位置または第２位置までの距離は、細胞９２の種類毎に予め決めた所定の距離であってもよい。また、合焦点位置から第１位置または第２位置までの距離は、観察しながら調整して決定してもよい。

＜４．変形例＞
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。

例えば、図３のステップＳ１〜Ｓ４を行った後、得られた観察用画像Ｉｏに基づいて、画像処理の条件を変更する工程を、さらに設けてもよい。例えば、ステップＳ３の分類先として用意するクラスターの数を変更する工程を、設けてもよい。このようにすれば、背景に相当する画素座標Ｃが多くのクラスターに分類され、細胞９２に相当する画素座標Ｃのクラスター数が少ない場合に、分類先となるクラスターの数を増加させることができる。したがって、観察対象となる細胞９２も、十分な数のクラスターに分類できる。

また、ステップＳ４において、特定のクラスターに属する画素を、強調表示してもよい。例えば、観察用画像Ｉｏ中の、特定のクラスターに属する画素に特定の色を割り当て、他の画素をグレースケールで表示してもよい。このようにすれば、特定のクラスターに属する画素のみを、視覚的に把握しやすくなる。したがって、細胞９２の輪郭などの特定の部位のみを、視覚的に把握しやすくなる。

また、照明光学系２２および撮像光学系３０の構成は、上記の実施形態と異なっていてもよい。例えば、照明光学系２２および撮像光学系３０が、他の要素を有していてもよいし、上記の実施形態に含まれる要素が省略されていてもよい。また、照明光学系２２または撮像光学系３０におけるバンドパスフィルタ５０の位置は、上記の実施形態と異なっていてもよい。

上記の実施形態では、照明光学系２２にバンドパスフィルタ５０が設けられていた。しかしながら、撮像光学系３０にバンドパスフィルタ５０を設けてもよい。その場合、細胞９２には、照明光として白色光が照射されるが、撮像光学系３０のバンドパスフィルタ５０によって、撮像部４０に到達する光の波長帯域を変更することができる。したがって、撮像部４０において、複数の波長帯域における撮影画像Ｉ１〜Ｉｎを取得することができる。

また、上記の実施形態では、光源２１としてハロゲンランプを用い、バンドパスフィルタ５０によって、照明光の波長帯域を変化させていた。しかしながら、光源２１として、波長変調が可能なレーザ発振器またはＬＥＤを用いてもよい。そうすれば、光源２１からの出射光自体の波長帯域を変化させることができるため、バンドパスフィルタ５０を省略することができる。

また、上記の実施形態の細胞観察装置１は、観察者が直接観察を行うための接眼レンズ３５を有していた。しかしながら、接眼レンズ３５は省略されてもよい。

また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。

１ 細胞観察装置
９ 培養容器
２０ 照明部
２１ 光源
２２ 照明光学系
３０ 撮像光学系
３１ 対物レンズ
３２ 開口絞り
３３ 結像レンズ
３４ ビームスプリッター
３５ 接眼レンズ
４０ 撮像部
５０ バンドパスフィルタ
６０ コンピュータ
９０ 試料
９１ 培養液
９２ 細胞
２２１ コレクタレンズ
２２２ 視野絞り
２２３ 開口絞り
２２４ コンデンサレンズ
９００ 窪部
Ｃ 画素座標
Ｉ１ 撮影画像
Ｉｏ 観察用画像
Ｗ 波長プロファイル

Claims (14)

1. 生体試料を撮影して観察用画像を生成する画像取得方法であって、
   ａ）前記生体試料に照明光を照射しつつ、中心波長の異なる複数の波長帯域において前記生体試料を撮影する工程と、
   ｂ）前記工程ａ）で取得した複数の前記撮影画像について、画素毎に、前記波長帯域の変化に対する輝度の変化を表す波長プロファイルを得る工程と、
   ｃ）前記波長プロファイルに応じて、各画素を複数のクラスターに分類する工程と、
   ｄ）各画素に、分類された前記クラスターに対応する階調値を割り当てることにより、前記観察用画像を生成する工程と、
   を有する画像取得方法。
2. 請求項１に記載の画像取得方法であって、
   前記工程ｃ）では、前記波長プロファイルの特徴が近い画素を同一のクラスターに分類する画像取得方法。
3. 請求項１または請求項２に記載の画像取得方法であって、
   前記工程ｃ）では、ｋ−ｍｅａｎｓ法を用いて、各画素を複数のクラスターに分類する画像取得方法。
4. 請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の画像取得方法であって、
   前記工程ｄ）では、前記クラスターに属する前記波長プロファイルの所定の波長帯域における輝度値の平均値に基づいて、前記階調値を割り当てる画像取得方法。
5. 請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の画像取得方法であって、
   前記工程ｄ）では、特定のクラスターに属する画素を、強調表示する画像取得方法。
6. 請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の画像取得方法であって、
   前記工程ｃ）において分類されるクラスターの数を変更する工程
   をさらに有する画像取得方法。
7. 請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の画像取得方法であって、
   前記工程ａ）では、中心波長の異なる４つ以上の波長帯域において前記生体試料を撮影する画像取得方法。
8. 請求項１ないし請求項７のいずれかに記載の画像取得方法であって、
   前記工程ａ）において、前記複数の波長帯域は、それぞれ、その半値幅が１５０ナノメートル以下である画像取得方法。
9. 請求項１ないし請求項８のいずれかに記載の画像取得方法であって、
   前記工程ａ）では、合焦点位置から光軸に沿って所定の距離ずれた位置を焦点位置として、前記生体試料を撮影する画像取得方法。
10. 請求項１ないし請求項９のいずれかに記載の画像取得方法であって、
    前記工程ａ）では、通過帯域が可変のバンドパスフィルタを介して、前記生体試料を撮影する画像取得方法。
11. 請求項１ないし請求項１０のいずれかに記載の画像取得方法であって、
    前記工程ａ）では、開口数ＮＡが０．３以下の照明光学系を介して、前記生体試料に前記照明光を照射する画像取得方法。
12. 請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の画像取得方法であって、
    前記照明光学系の前記開口数ＮＡと撮像光学系の開口数ＮＡとの比であるコヒーレンスファクターσが、０．６以下である画像取得方法。
13. 請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載の画像取得方法であって、
    前記生体試料は細胞である画像取得方法。
14. 生体試料を撮影して観察用画像を生成する画像取得装置であって、
    前記生体試料に照明光を照射する照明部と、
    前記照明光が照射された前記生体試料を撮影する撮像部と、
    前記撮像部により取得された撮影画像を加工する画像処理部と、
    を備え、
    前記撮像部は、中心波長の異なる複数の波長帯域において前記生体試料を撮影し、
    前記画像処理部は、複数の前記撮影画像について、画素毎に、前記波長帯域の変化に対する輝度の変化を表す波長プロファイルを生成し、前記波長プロファイルに応じて、各画素を複数のクラスターに分類する画像取得装置。