JP2018148830A - 細胞の分取方法 - Google Patents
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〔1〕顕微鏡、動画撮影装置、電動ステージおよび採取用ピペットを装着したマニピュレーターを用いて細胞の分取を行う方法において、
(1)マニピュレーターに装着した電動ステージに細胞溶液を入れた保存容器および培養容器を装着する工程、
(2)保存容器を電動ステージの水平上の動きによりマニピュレーターの細胞採取部の下に移動させる工程、
(3)採取用ピペットを装着したマニピュレーター上部を下降させ、採取用ピペットを細胞溶液に挿入させる工程、
(4)細胞溶液から一つの細胞をマニピュレーターに装着した採取用ピペットを用いて採取する工程、
(5)採取用ピペットを装着したマニピュレーター上部を上昇させ、採取用ピペットを細胞溶液から離脱させる工程、
(6)保存容器を電動ステージの水平上の動きにより、マニピュレーターの細胞採取部の下から離脱させる工程、
(7)培養容器の空のウエルの一つを電動ステージの水平上の動きにより、マニピュレーターの細胞採取部の下に移動させる工程、
(8)培養容器の空のウエルの中に採取した一つの細胞を細胞採取部から排出する工程、
(9)電動ステージの水平上の動きによりマニピュレーターの細胞採取部の下から排出された細胞をいれたウエルを離脱させ、保存容器をマニピュレーターの細胞採取部の下に移動させる工程
および、前記(2)〜(9)の操作を繰り返して行うことにより個々のウエルに細胞を一個ずつ分取することを特徴とする方法に関する。
〔2〕動画撮影下に細胞分取を行うことを特徴とする〔1〕記載の細胞の分取方法、
〔3〕採取用ピペットによる一つの細胞の採取および排出をマイクロポンプにより行うことを特徴とする〔1〕〜〔2〕記載の細胞の分取方法、
〔4〕細胞溶液から一つの細胞を採取用ピペットに採取する工程を肉眼または画像処理による自動化機能を用いて行うことを特徴とする〔1〕〜〔3〕記載の細胞の分取方法、
〔5〕水平方向から採取用ピペット中の細胞を撮影する第二動画撮影装置を有することを特徴とする〔1〕〜〔4〕記載の細胞の分取方法、
〔6〕全体の細胞分取操作を記録するための第三動画撮影装置を有することを特徴とする〔1〕〜〔5〕記載の細胞の分取方法、
〔7〕保存容器が6wellプレートであることを特徴とする〔1〕〜〔6〕記載の細胞の分取方法、
〔8〕培養容器が96wellプレートであることを特徴とする〔1〕〜〔7〕記載の細胞の分取方法、
〔9〕電動ステージがXYテーブルであることを特徴とする〔1〕〜〔8〕記載の細胞の分取方法、および
〔10〕〔2〕〜〔9〕記載の細胞の分取方法を用いることを特徴とするモノクローナリティーの検査方法に関する。
〔11〕顕微鏡の視野内で採取用ピペットを操作するマニピュレーションシステムを有し、前記採取用ピペットを用いて1ウエルに1細胞ずつ分取する細胞分取装置であって、前記採取用ピペットを上方から観察するために前記顕微鏡を介して画像を撮影する第一動画撮影装置、前記採取用ピペットを水平方向から観察する顕微鏡を介して画像を撮影する第二動画撮影装置、装置全体を俯瞰できる画像を撮影する第三動画撮影装置、並びに前記第一動画撮影装置、前記第二動画撮影装置および前記第三動画撮影装置により撮影された画像を時間情報と対応させて記録する記録装置を有することを特徴とする細胞分取装置、
〔12〕時間情報が前記第一動画撮影装置、前記第二動画撮影装置および前記第三動画撮影装置により撮影された各画像の撮影時刻であることを特徴とする〔11〕記載の細胞分取装置、および
〔13〕前記第一動画撮影装置、前記第二動画撮影装置および前記第三動画撮影装置により撮影された各画像を同時に表示する表示装置を有することを特徴とする〔12〕記載の細胞分取装置に関する。
(1)前記のコントローラは、切替えスイッチに接続され、前記切替えスイッチの切替え操作に従って前記モータまたは前記圧電素子に対して駆動を指令する要素。
(2)前記のコントローラは、顕微鏡の倍率を認識する倍率認識装置に接続され、前記倍率認識装置の認識結果に従って前記モータまたは前記圧電素子に対して駆動を指令する要素。
(3)前記コントローラは、ジョイスティックに接続され、前記ジョイスティックの操作に従って前記モータまたは圧電素子に対して駆動を指令する要素。
(4)前記コントローラは、顕微鏡画像を表示するパソコンディスプレイに接続され、前記顕微鏡画像を操作するマウスの動作に従って前記モータまたは前記圧電素子に対して駆動を指令する要素。
採取された細胞の単一性は、上方向にある第一動画撮影装置、横方向にある第二動画撮影装置および斜め上方の俯瞰できる位置にある第三動画撮影装置の3つの撮影装置の画像記録により確認することができる。
細胞は一つずつ単一細胞としてマニピュレーターに結合した採取用ピペットにより採取され、単一細胞として一つずつ培養容器上の別々のウエルに排出される。
株式会社製の機器を組み合わせ図1のシステムを構成した。
(1)1×106Cells/mLの細胞密度で抗体発現遺伝子を組み込んだCHO細胞を(遠沈管100 /mL、AGCテクノグラス社製)中の液体培地(CD CHO Medium、Thermo Fisher Scientific社製)へと懸濁した。
(2)上記細胞懸濁液を細胞保存容器として用いる6 well プレート(FalconTM 6ウェル透明平底未処理マルチウェル・セルカルチャープレート、Corning社製)の一つのウエルへと分取した。なお6 wellプレート(FalconTM 6ウェル透明平底未処理マルチウェル・セルカルチャープレート、Corning社製)の一つのウエルは洗浄容器として用いるため液体培地(CD CHO Medium、Thermo Fisher Scientific社製)のみを入れた。
(3)上記細胞保存容器を1000 rpmで5分間遠心分離し、細胞をディッシュ底面へ沈めた。なお、単一細胞の単離および搬送工程は室温、CO2インキュベーター外にて行われるため、細胞懸濁の調整後は速やかに細胞の単離工程に移行した。
(4)予め、培養容器として用いる96 well プレートに培地を100 μL程度分注した。
(1)アクチュエーター(Sz:Z軸モータ)へと採取用ピペットを取り付けた。
(2)電動ステージ(Ss:電動試料ステージ)へ細胞の入った前記6 wellプレートの保存容器および前記96 wellプレートの培養容器を取り付けた。
(3)電動ステージが水平方向自動的に動き採取用ピペットの直下に保存容器の6 wellプレートの細胞溶液を入れたウエルを配置するとともに、アクチュレーターが自動的に下降し、採取用ピペットの先端を保存容器のソースデ底面に配置した。
(4)第一顕微鏡(M1:実体顕微鏡SZX16、オリンパス株式会社製)第一動画撮影装置(C1:第一カメラ、Basler社製)の映し出す映像の観察下にて、ジョイスティック(JS:操作インターフェース、Saitek社製)を操作し単一細胞をピペットへと吸引した。
(5)単一細胞の吸引後は、アクチュエーター(Sz)および電動ステージ(Ss)が自動的に動き、第二動画撮影装置を装着する第二顕微鏡(M2)の観察位置までピペットを移動させた。
(6)第一撮影装置が撮影した単一細胞像が誤りで無いことを確認するため、第二動画撮影装置(C2:第二カメラ、Basler社製)を用いて、第一動画撮影装置(C1)から90度の角度でもピペット中に単一細胞のみが存在することを確認し、映像として記録した。また、第二顕微鏡(M2:第二顕微鏡、EdmundOptics社製)の焦点深度を自動で変動させ、ピペット外壁への異物付着を否定するための映像も記録した。
(7)上記(6)工程での映像撮影後、電動ステージ(Ss)が自動的に保存容器を移動させるとともに培養容器の96 well プレートを採取用ピペットの下に配置し、アクチュエーター(Sz)が自動的に下降し、96 well プレートの任意のwell底面に細胞を吐出した。その後採取用ピペットを上昇させた。
(8)上記(5)から(7)までの工程中、C1はピペット中の細胞に焦点を合わせたまま動画として単一細胞の単離過程を記録した。
(9)上記(7)工程での細胞の吐出後は、電動ステージ(Ss)が自動的に培養容器を移動させるとともに洗浄用容器として用いる保存容器の6wellプレートの培地のみを入れたウエルを採取用ピペット下方に配置させた。
(10)アクチュエーター(Sz)が自動的に下降し、採取用ピペットを洗浄容器の液体培地中に入れるとともにマイクロポンプ(MP:電動マイクロポンプ)でエアを噴出し、ピペット内を洗浄した。
(11)(3)工程から(10)工程までの動作を繰り返し行うことにより、96wellプレートの各ウエル上に単一細胞のクローンを作成した。
(12)上記(1)〜(11)の操作は第三動画撮影装置により俯瞰画像が撮影されたが、同一撮影時刻を持つ第一動画撮影装置、第二動画撮影装置、第三動画撮影装置により撮影された画像は記録装置(R)に記録され、表示装置(D)の同一画面上に再生されたため、マスターセルのモノクローナリティーが検証された。
M2:第二顕微鏡
C1:第一カメラ
C2:第二カメラ
C3:第三カメラ&レンズ
Sz:Z軸モータ
Ss:電動試料ステージ
M p:電動マイクロポンプ
St:マニュピレータ
A1:M2ホルダ
A2:C3ホルダ
N:専用針
L:バックライト
B1:ベース板
G1:防振部材
R:記録装置
D:表示装置
Claims (13)
- 顕微鏡、動画撮影装置、電動ステージおよび採取用ピペットを装着したマニピュレーターを用いて細胞の分取を行う方法において、
(1)マニピユレーターに装着した電動ステージに細胞溶液を入れた保存容器および培養容器を装着する工程、
(2)保存容器を電動ステージの水平上の動きによりマニピュレーターの細胞採取部の下に移動させる工程、
(3)採取用ピペットを装着したマニピュレーター上部を下降させ、採取用ピペットを細胞溶液に挿入させる工程、
(4)細胞溶液から一つの細胞をマニピュレーターに装着した採取用ピペットを用いて採取する工程
(5)採取用ピペットを装着したマニピュレーター上部を上昇させ、採取用ピペットを細胞溶液から離脱させる工程、
(6)保存容器を電動ステージの水平上の動きにより、マニピュレーターの細胞採取部の下から離脱させる工程、
(7)培養容器の空のウエルの一つを電動ステージの水平上の動きにより、マニピュレーターの細胞採取部の下に移動させる工程、
(8)培養容器の空のウエルの中に採取した一つの細胞を細胞採取部から排出する工程
(9)電動ステージの水平上の動きによりマニピュレーターの細胞採取部の下から排出された細胞をいれたウエルを離脱させ、保存容器をマニピュレーターの細胞採取部の下に移動させる工程
および、前記(2)〜(9)の操作を繰り返して行うことにより個々のウエルに細胞を一個ずつ分取することを特徴とする方法。 - 動画撮影下に細胞分取を行うことを特徴とする請求項1記載の細胞の分取方法。
- 採取用ピペットによる一つの細胞の採取および排出をマイクロポンプにより行うことを特徴とする請求項1または2記載の細胞の分取方法。
- 細胞溶液から一つの細胞を採取用ピペットに採取する工程を肉眼または画像処理による自動化機能を用いて行うことを特徴とする請求項1〜3いずれか1項記載の細胞の分取方法。
- 水平方向から採取用ピペット中の細胞を撮影する第二動画撮影装置を有することを特徴とする請求項1〜4いずれか1項記載の細胞の分取方法。
- 全体の細胞分取操作を記録するための第三動画撮影装置を有することを特徴とする請求項1〜5いずれか1項記載の細胞の分取方法。
- 保存容器が6wellプレートであることを特徴とする請求項1〜6いずれか1項記載の細胞の分取方法。
- 培養容器が96wellプレートであることを特徴とする請求項1〜7いずれか1項記載の細胞の分取方法。
- 電動ステージがXYテーブルであることを特徴とする請求項1〜8いずれか1項記載の細胞の分取方法。
- 請求項2〜9いずれか1項記載の細胞の分取方法を用いることを特徴とするモノクローナリティーの検査方法。
- 顕微鏡の視野内で採取用ピペットを操作するマニピュレーションシステムを有し、前記採取用ピペットを用いて1ウエルに1細胞ずつ分取する細胞分取装置であって、前記採取用ピペットを上方から観察するために前記顕微鏡を介して画像を撮影する第一動画撮影装置、前記採取用ピペットを水平方向から観察する顕微鏡を介して画像を撮影する第二動画撮影装置、装置全体を俯瞰できる画像を撮影する第三動画撮影装置、並びに前記第一動画撮影装置、前記第二動画撮影装置および前記第三動画撮影装置により撮影された画像を時間情報と対応させて記録する記録装置を有することを特徴とする細胞分取装置。
- 時間情報が前記第一動画撮影装置、前記第二動画撮影装置および前記第三動画撮影装置により撮影された各画像の撮影時刻であることを特徴とする請求項11記載の細胞分取装置。
- 前記第一動画撮影装置、前記第二動画撮影装置および前記第三動画撮影装置により撮影された各画像を同時に表示する表示装置を有することを特徴とする請求項12記載の細胞分取装置。
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