JP2018145155A - 電子メディエータ - Google Patents
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Abstract
Description
異化的金属還元能を有する微生物由来のシトクロムC蛋白質からなる、電子メディエータ。
[項2]
前記異化的金属還元能を有する微生物が、Shewanella oneidensisである、項1に記載の電子メディエータ。
[項3]
シトクロムC蛋白質がOmcAである、項1または項2に記載の電子メディエータ。
[項4]
OmcAが、 以下の(a)、(b)または(c)のポリペプチドから成る、項3に記載の電子メディエータ。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド
(b)配列番号1において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列から成り、電子メディエータ機能を有するポリペプチド
(c)配列番号1のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、電子メディエータ機能を有するポリペプチド
[項5]
電極と、前記電極と接触し、酵素と項1〜4のいずれかに記載の電子メディエータとを含む反応層とを含み、
前記反応層における前記酵素と前記電極との間で前記電子メディエータを介して電子授受が行われる、
酵素電極。
[項6]
項5に記載の酵素電極を備えたバイオセンサ。
[項7]
項6に記載のバイオセンサと、
バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの電圧印加により得られる、測定対象物質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流を検出する、検出部と、
前記電流値から前記物質の濃度を算出する、演算部と、
前記算出された前記物質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置。
[項8]
電極上に、酵素と項1〜4のいずれかに記載の電子メディエータとの混合液を塗布して反応層を形成することを含む、酵素と電極間で電子授受が行われる酵素電極の製造方法。
[項9]
酵素、項1〜4のいずれかに記載の電子メディエータおよび電子受容体を含む組成物。
[項10]
酵素、項1〜4のいずれかに記載の電子メディエータおよび電子受容体を用いる、測定対象物の測定方法であって、
A)前記酵素により前記測定対象物を酸化する工程、
B)前記工程Aにおいて前記酵素内に生じる電子を、前記電子メディエータにより受容する工程、
C)前記工程Bによって生じる前記電子メディエータにおける電子を前記電子受容体により受容する工程、
D)前記工程Cによって生じる前記電子受容体における変化を検出する工程、
E)前記工程Dにおいて検出される前記電子受容体における変化の量を、前記測定対象物の量あるいは濃度と相関付ける工程、
を含む、測定方法。
[項11]
前記電子受容体が電極である、項10に記載の測定方法。
[項12]
前記電極が項5に記載の電極である、項10に記載の測定方法。
[項13]
前記電子受容体が酸化還元化合物である、項10に記載の測定方法。
本発明の実施態様の一つは、異化的金属還元能を有する微生物由来のシトクロムC蛋白質からなる、電子メディエータである。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド
(b)配列番号1において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列から成り、電子メディエータ機能を有するポリペプチド、
(c)配列番号1のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、電子メディエータ機能を有するポリペプチド
更には該ポリペプチドをコードする遺伝子を組み込んだ原核生物または真核生物の遺伝子組換え体により生産されたポリペプチドや、該ポリペプチドをコードする遺伝子に、ヒスチジンタグ等の精製時に利用されるアミノ酸付加がなされた遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え体により生産されたポリペプチドであってもよい。
(1)グルコース酸化還元酵素から電子を受け取る機能及び/又は電子受容体に電子を受け渡す機能を共に有する。
(2)金や白金等の金属電極またはカーボン電極表面から電子を受け取る機能及び/又は電子を受け渡す機能を共に有する。
(3)分子量:約80kDa(配列番号1記載のポリヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)に供した際の分子量である。)なお、上記分子量については、培養条件又は精製条件により修飾される分子等が変われば分子量は異なる。
(4)赤色を呈している。
(5)酸化型で408nm、還元型で419nm、523nm、552nmに特徴的な吸収スペクトルを有する。
(6)可溶性蛋白質である。
(7)1つ以上の鉄イオンの配位が確認される。(実施例に記載の方法によるヘム染色により青色の呈色を確認することができる。)
このような特性を有するシトクロムCとしてOmcA(例えば、Shewanella oneidensis MR−1株由来のOmcA)が挙げられる。
前記の、本発明の、異化的金属還元能を有する微生物由来のシトクロムC蛋白質からなる電子メディエータは、グルコース酸化還元酵素等の酵素電極及び前記酵素電極を備えたバイオセンサ等に使用することができる。
本発明の別の実施態様である測定対象物の測定方法は、酵素、前記のいずれかに記載の電子メディエータおよび電子受容体を用い、
A)前記酵素により前記測定対象物を酸化する工程、
B)前記工程Aにおいて前記酵素内に生じる電子を、前記電子メディエータにより受容する工程、
C)前記工程Bによって生じる前記電子メディエータにおける電子を前記電子受容体により受容する工程、
D)前記工程Cによって生じる前記電子受容体における変化を検出する工程、
E)前記工程Dにおいて検出される前記電子受容体における変化の量を、前記測定対象物の量あるいは濃度と相関付ける工程、
を含む。
細胞外膜発現シトクロムOmcAの取得
1) 培養
500 mL容の坂口フラスコに、
1% BactoTrypton(ベクトン・ディッキンソン社製)(w/v)、
0.5% Yeast Extract(ベクトン・ディッキンソン社製)(w/v)、
1% 塩化ナトリウム(ナカライテスク社製)(w/v)
及び水からなる液体培地を60mL入れ、121℃、20分間のオートクレーブ滅菌を行った。冷却した滅菌培地へShewanella oneidensis MR−1 株を白金耳1かき分植菌を行い、25℃にて24時間振盪培養を実施し、これを種培養液とした。
10L−jarファーメンターに、
1.2% BactoTrypton(ベクトン・ディッキンソン社製)(w/v)、
2.4% Yeast Extract(ベクトン・ディッキンソン社製)(w/v)、
0.4%グリセロール(ナカライテスク社製)、
1.25% リン酸水素2カリウム(ナカライテスク社製)(w/v)、
0.23% リン酸2水素カリウム(ナカライテスク社製)(w/v)、
1mM 塩化鉄(III)(ナカライテスク社製)、
1mM 5−アミノレブリン酸(ナカライテスク社製)
及び水からなる液体培地(pH7.0)を6L入れ、121℃、20分間のオートクレーブ滅菌を行った。オートクレーブ滅菌後、種培養液50mLを10L−Jarファーメンターへ播種をした。25℃にて91時間の通気撹拌培養を実施した。
2)粗精製
遠心分離機により上清を廃棄し、菌体を回収した。集菌後、ホモジナイザーNS1001L(ニロ・ソアビ社製)による菌体破砕を実施し、遠心分離機により菌体破砕上清を回収した。菌体破砕上清液に3%ポリエチレンイミン(ナカライテスク社製)(v/v)を添加し、遠心分離機により沈殿を除き上清を回収した。
3)陰イオンカラム精製
DEAE Sepharose HP(GEヘルスケア製)180mLを20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.5)にて平衡化した後、粗精製液をカラム担体へ吸着させ、同バッファーにてカラムの洗浄を実施した。1M 塩化ナトリウムを含む同バッファーにて0−50%の塩化ナトリウム濃度でのグラジエント溶出を行った。得られた各ピークを回収し、4−12%ポリアクリルアミドゲルを使用し、Laemmiliらの方法に従いSDS−PAGEを実施した。泳動後CBB染色を実施し、ベンチマークプロテインマーカー(Life technologies社製)と比較し、80kDaにバンドがあるフラクション画分の回収を行った。回収したフラクション画分は、孔径30kDa中空糸膜(SPECTRUM社製)を利用して脱塩を実施し、30%飽和の硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.5)へとバッファー置換を行った。
4)疎水カラム精製
Phenyl Sepharose HP(GEヘルスケア製)150mLを30%飽和の硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.5)にて平衡化した後、サンプルを担体へ吸着させ、同バッファーにてカラムの洗浄を実施した。硫酸アンモニウム濃度で30%ー0%のグラジエント溶出を行い、ピーク画分を回収した。3)と同様の方法にてSDS−PAGEを行い、80kDaのバンドが確認できたフラクションの回収を行ったのちに、同中空糸膜による脱塩・濃縮を実施した。
5)ゲルろ過精製
Superdex−200(GEヘルスケア製)115mLを0.3M塩化ナトリウムを含む20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.5)にて平衡化した後、サンプルを添加した。同バッファーにおいてゲルろ過を実施し、3)と同様の方法にてSDS−PAGEを行い、80kDaにほぼ単一のバンドとして現れる画分を回収した。回収したフラクションはAmicon Ultra(30kDa)を利用した限外濾過により蒸留水への置換及び濃縮を実施し、赤色の濃縮液を得た。
6)LC-MS/MS解析
本精製にて得られた濃縮液は、LC-MS/MS解析(日本プロテオミクス株式会社に解析委託)に供した。解析の結果、本精製にて細胞外膜発現シトクロムOmcAが得られたことを確認した。
1)分子量:約80kDa
2)色調:赤色
3)酸化型で408nm、還元型で419nm、523nm、552nmに特徴的な吸収スペクトルを有する。
4)ヘム染色:青色呈色あり
ヘム染色は以下の通り行った。
実施例1−3)の方法によりSDS−PAGEを実施後、ポリアクリルアミドゲルを蒸留水にて10分間洗浄した。6.3mM テトラメチルベンジジン(ナカライテスク社製)を含むメタノール溶液と0.25M酢酸ナトリウム(pH5.0)水溶液を3:7で混合する。上述混合液中にポリアクリルアミドゲルを浸漬し室温・暗所にて1時間程度振盪する。その後、過酸化水素を終濃度30mMとなるように添加し、10分間程度振盪し発色を行った。
グルコースセンサによる応答電流値測定
1)酵素電極作製
3電極を具備するディスポーサブルチップ(DEP−CHIP、バイオデバイステクノロジーズ社製)の作用極上に、3μL 0.5%カルボキシメチルセルロース(CMC)水溶液を滴下した後、50℃10分間乾固した。CMCによりコートした電極上に、8Uのアスペルギルス由来FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(東洋紡社製)と、電子メディエータとしてOmcAまたはアスペルギルステレウス由来シトクロムb562をそれぞれ最終濃度1mMとなるように1mM クエン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)3μLに溶解し、作用極上に滴下した後、50℃で10分間乾固し、酵素電極とした。
2)応答電流値測定
基質となる標準グルコース溶液は、0mM、10mM、20mMとなるように調製した。標準グルコース溶液3μLを酵素電極の作用極上に滴下し5秒後に0.5Vの電圧を印加し、1秒後の電流値を測定した。0mM グルコースの値をブランク値として差し引いた値を応答電流値とした。得られた応答電流値の電子メディエータ間の差異を比較した。結果を図1に示す。測定の結果、アスペルギルス由来シトクロムb562の2倍の応答電流値を確認した。
Claims (13)
- 異化的金属還元能を有する微生物由来のシトクロムC蛋白質からなる、電子メディエータ。
- 前記異化的金属還元能を有する微生物が、Shewanella oneidensisである、請求項1に記載の電子メディエータ。
- シトクロムC蛋白質がOmcAである、請求項1または請求項2に記載の電子メディエータ。
- OmcAが、 以下の(a)、(b)または(c)のポリペプチドから成る、請求項3に記載の電子メディエータ。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列から成るポリペプチド
(b)配列番号1において、1個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列から成り、電子メディエータ機能を有するポリペプチド
(c)配列番号1のアミノ酸配列と80%以上の同一性を有するアミノ酸配列から成り、電子メディエータ機能を有するポリペプチド - 電極と、前記電極と接触し、酵素と請求項1〜4のいずれかに記載の電子メディエータとを含む反応層とを含み、
前記反応層における前記酵素と前記電極との間で前記電子メディエータを介して電子授受が行われる、
酵素電極。 - 請求項5に記載の酵素電極を備えたバイオセンサ。
- 請求項6に記載のバイオセンサと、
バイオセンサへの電圧印加を制御する、制御部と、
バイオセンサへの電圧印加により得られる、測定対象物質に由来する電子の電極への移動に基づく電荷移動律速電流を検出する、検出部と、
前記電流値から前記物質の濃度を算出する、演算部と、
前記算出された前記物質の濃度を出力する出力部とから構成される測定装置。 - 電極上に、酵素と請求項1〜4のいずれかに記載の電子メディエータとの混合液を塗布して反応層を形成することを含む、酵素と電極間で電子授受が行われる酵素電極の製造方法。
- 酵素、請求項1〜4のいずれかに記載の電子メディエータおよび電子受容体を含む組成物。
- 酵素、請求項1〜4のいずれかに記載の電子メディエータおよび電子受容体を用いる、測定対象物の測定方法であって、
A)前記酵素により前記測定対象物を酸化する工程、
B)前記工程Aにおいて前記酵素内に生じる電子を、前記電子メディエータにより受容する工程、
C)前記工程Bによって生じる前記電子メディエータにおける電子を前記電子受容体により受容する工程、
D)前記工程Cによって生じる前記電子受容体における変化を検出する工程、
E)前記工程Dにおいて検出される前記電子受容体における変化の量を、前記測定対象物の量あるいは濃度と相関付ける工程、
を含む、測定方法。 - 前記電子受容体が電極である、請求項10に記載の測定方法。
- 前記電極が請求項5に記載の電極である、請求項10に記載の測定方法。
- 前記電子受容体が酸化還元化合物である、請求項10に記載の測定方法。
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