JP2018135393A - オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子を送達するための組成物および方法に関する。本開示は、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および経皮ビヒクル含む組成物を、それを必要とする患者の皮膚に投与するステップを含む、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達方法も提供する。一態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、経皮的である。別の態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、局所的である。別の態様において、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は、局所的適用後の表皮および真皮にである。
【選択図】なし
Description
本出願は、2009年6月17日に出願された米国仮出願第61/187,759号の、35 U.S.C. § 119(e)のもとの優先権の利益を主張し、また本出願は、2009年1月8日に出願された米国仮出願第61/143,293号および2009年4月15日に出願された米国仮出願第61/169,384号の、35 U.S.C. § 119(e)のもとの優先権の利益を主張する、2010年1月8日に出願された米国仮出願第12/684,836号の一部継続出願であり、それらの全ての開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所(NIH)より与えられた助成金番号5DP1 OD000285およびU54 CA0119341のもと、政府の援助を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
●基底層
●有棘層
●顆粒層
●角質層と名付けられる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
(項目1)
オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の経皮送達の方法であって、前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および経皮ビヒクルを含む治療上有効量の組成物を、それを必要とする患者の皮膚に投与するステップを含む、方法。
(項目2)
前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は経皮的である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子の送達は局所的である、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記経皮ビヒクルは軟膏である、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記軟膏は、Aquaphorである、項目4に記載の方法。
(項目6)
遺伝子発現を調節する方法であって、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子を含む治療上有効量の組成物を、前記オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子が標的とハイブリッド形成し、遺伝子発現を調節する条件下で皮膚に投与するステップを含む、方法。
(項目7)
前記標的はポリペプチドである、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記標的はポリヌクレオチドである、項目6に記載の方法。
(項目9)
前記ポリヌクレオチドはRNAである、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記組成物の投与は、皮膚疾患を軽減する、項目1または項目6に記載の方法。
(項目11)
前記皮膚疾患は、癌、遺伝的疾患、老化、炎症、感染、および美容上の変形から成る群から選択される、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記癌は、扁平上皮癌、基底細胞癌、乳癌、およびメラノーマから成る群から選択される、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記標的は、Ras、IkBα、ヘッジホッグ、B−Raf、Akt、およびサイクリンDから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記遺伝的疾患は、単純性表皮水疱症、水疱性魚鱗癬、先天性爪肥厚症、コステロ症候群、および結節性硬化症から成る群から選択される、項目11に記載の方法。
(項目15)
前記標的は、変異を含む遺伝子産物であって、前記遺伝子産物は、K5、K14、K1、K10、H−Ras、およびm−Torから成る群から選択される遺伝子により発現する、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記老化性疾患は、UV損傷および早老症から成る群から選択される、項目11に記載の方法。
(項目17)
前記標的は、マトリックスメタロプロテアーゼ1およびプロジェリンから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記炎症は乾癬によるものである、項目11に記載の方法。
(項目19)
前記標的はインターロイキン−23である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記ウイルス感染は疣贅をもたらす、項目11に記載の方法。
(項目21)
前記標的はE6/E7である、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記美容上の変形は、脂漏性角化症、表皮母斑、および色素性母斑から成る群から選択される、項目11に記載の方法。
(項目23)
前記標的は、変異を含む遺伝子産物であって、前記遺伝子産物は、FGFR3、K10、およびB−Rafから成る群から選択される遺伝子により発現する、項目22に記載の方法。
(項目24)
オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子および経皮ビヒクルを含む、経皮組成物。
(項目25)
項目24に記載の組成物を使用する、項目1〜23のいずれか1項に記載の方法。
幾つかの実施形態において、本開示は、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子およびビヒクルを含む抗菌性組成物を提供し、該オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成を可能にする条件下で、標的とハイブリッド形成する原核生物遺伝子の標的非コード配列に十分に相補的である。種々の実施形態において、抗菌性組成物は、原核生物細胞感染の治療のために、それを必要とする哺乳類に治療上有効量で投与するために製剤化される。幾つかの態様において、哺乳類はヒトである。
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体を含む抗菌性組成物は、抗生剤との組み合わせで、投与用に製剤化され、各抗生剤は治療上有効量である。
本明細書に使用される、「治療上有効量」という用語は、識別された疾病または病状を治療する、軽減する、もしくは防止する、または認識できる治療効果、予防効果、もしくは阻害作用を示すのに十分な組成物の量を指す。効果は、例えば、臨床状態の改善、症状の低減、または本明細書に記載されるアッセイにより認めることができる。対象に対する正確な有効量は、対象の体重、体の大きさ、および一般の健康状態、病状の性質および程度、ならびに投与に選択される抗菌性組成物または組成物の組み合わせに依存する。所与の状態の治療上有効量は、臨床医の技能および判断の内である日常の実験により決定することができる。
幾つかの態様において、本開示は、特定の核酸を標的にする方法を提供する。あらゆる種の原核生物核酸が標的とされてもよく、本方法は、例えば、機能性原核生物遺伝子産物の生成を阻害するために使用することができる。本発明の方法により標的とさえ得る核酸の例としては、遺伝子および原核生物RNAまたはDNAが挙げられるが、これらに限定されない。
本開示のオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成する時、少なくとも約45℃、典型的に、約50℃〜60℃の間のTmを有するが、Tmは、例えば、65℃等、高くてもよい。標的が原核生物ポリヌクレオチドである態様において、原核生物標的ポリヌクレオチド配列、および原核生物mRNA標的ポリヌクレオチド配列の選択は、以下に本明細書で考慮される。
細胞分裂および細胞周期標的タンパク質の標的配列
本開示のオリゴヌクレオチドは、不可欠な原核細胞遺伝子をコードする原核生物核酸の配列とハイブリッド形成するように設計される。例示的な遺伝子は、細胞分裂、細胞周期タンパク質に必要なもの、または脂質生合成もしくは核酸の複製に必要な遺伝子を含むが、これらに限定されない。遺伝子の必須性が決定されると、任意の不可欠な細菌遺伝子は標的である。生物のどの遺伝子が不可欠であるかを決定するためのアプローチの1つは、記載されるように[Gerdes et al.,J Bacteriol.185(19):5673−84,2003、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる]、遺伝子フットプリント技術を使用することである。本報告において、620大腸菌遺伝子は、健全な好気成長の培養条件下で成長に不可欠であると識別され、3,126遺伝子は、不要であると識別された。進化的状況分析は、細菌界全体で、十分な数の不可欠な大腸菌遺伝子、特に、DNA複製、細胞分裂、およびタンパク質合成等の主要な細胞プロセスのサブセットが保存されたことを実証した。
一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下で、細菌16S rRNA核酸配列をコードする配列とハイブリッド形成されるように設計され、Tmは、実質的に、37℃を超え、例えば、少なくとも45℃、好ましくは60℃〜80℃である。
家畜の胃腸管の健康な細菌叢は、健康および関連する食品の対応する産生にきわめて重要である。ヒトと同様、健康な動物の胃腸管は、多数の種類の細菌(すなわち、大腸菌、緑膿菌およびサルモネラspp.)を含有し、相互と生態的均衡に生存する。本均衡は、飼料の変化、ストレス、または抗生物質もしくは他の治療上の処置に応答して乱される場合があり、サルモネラ、カンピロバクター、腸球菌、野兎病、および大腸菌等の、細菌により一般に引き起こされる細菌病を動物にもたらす。これらの動物の細菌感染は、多くの場合、治療的介入を必要とし、これは、治療費がかかり、また頻繁に生産能の低下に関係する。
本開示の幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるON−NPを含む組成物を投与し、標的遺伝子の発現を調節することが意図される。種々の実施形態において、組成物は皮膚疾患を軽減するために投与される。
幾つかの実施形態において、本開示のON−NP組成物および方法はビヒクルを含む。本明細書に使用される、「ビヒクル」とは、オリゴヌクレオチド機能化ナノ粒子が関連する塩基化合物である。
それに結合されるポリヌクレオチドを有するように機能化されるナノ粒子を提供する。ナノ粒子の大きさ、形状、および化学組成は、得られるポリヌクレオチド機能化ナノ粒子の特性の一因となる。これらの特性は、例えば、光学特性、光電子特性、電気化学特性、電子特性、種々の溶液における安定性、磁気特性、および細孔およびチャネルの大きさの変化を含む。異なる大きさ、形状、および/または化学組成を有するナノ粒子の混合物、ならびに均一な大きさ、形状、および化学組成を有するナノ粒子の使用、したがって、特性の混合が意図される。適切な粒子の例としては、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,238,472号および国際公開第WO2003/08539号に記載されるもの等、集合粒子、等方性粒子(球形粒子等)、異方性粒子(非球形桿体、四面体、および/または角柱等)、およびコア−シェル粒子を含むが、これらに限定されない。
本明細書に使用される、「ヌクレオチド」という用語、またはその複数形は、本明細書に記載されるように、修飾形態と代替可能であり、そうでなければ当該分野において公知である。特定の場合において、当該技術は、自然に生じるヌクレオチドを包含する「核酸塩基」という用語、および修飾ヌクレオチドを含む非天然ヌクレオチドを使用する。よって、ヌクレオチドまたは核酸塩基は、Bennerらの米国特許第5,432,272号およびSusan M.Freier and Karl−Heinz Altmann,1997,Nucleic Acids Research,vol.25:pp4429−4443に記載される、自然に生じる核酸塩基アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、およびウラシル(U)を意味する。非天然核酸塩基は、例えば、キサンチン、ジアミノプリン、8−オキソ−N6−メチルアデニン、7−デアザキサンチン、7−デアザグアニン、N4,N4−エタノシトシン、N’,N’−エタノ−2,6−ジアミノプリン、5−メチルシトシン(mC)、5−(C3-C6)−アルキニル−シトシン、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、2−ヒドロキシ−5−メチル−4−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、および「非天然」核酸塩基を含むが、これらに限定されない。「核酸塩基」という用語はまた、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環式類似体およびその互変異性体も含む。さらなる自然に生じる、および非天然の核酸塩基は、米国特許第3,687,808号(Merigan,et al.)、Chapter 15 by Sanghvi,in Antisense Research and Application,Ed. S.T.Crooke and B.Lebleu,CRC Press,1993、in Englisch et al.,1991,Angewandte Chemie,International Edition,30:613−722(特に、ページ622および623、およびConcise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,J.I.Kroschwitz Ed.,John Wiley&Sons,1990,ページ858−859,Cook,Anti−Cancer Drug Design 1991,6,585−607を参照し、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるものを含む。種々の態様において、ポリヌクレオチドは、核酸塩基のように機能できる複素環式化合物等の化合物を含む、非天然ヌクレオチドの分類である、1つ以上の「ヌクレオシド塩基」または「塩基部」も含み、最も伝統的な意味でヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する、特定の「普遍的塩基」を含む。普遍的塩基は、3−ニトロピロール、任意に、置換インドール(例えば、5−ニトロインドール)、および任意に、置換ヒポキサンチンを含む。他の望ましい普遍的塩基は、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体を含み、当該分野に公知のこれらの普遍的塩基を含む。
上述のように、ナノ粒子を機能化するために、修飾されたオリゴヌクレオチドが意図される。種々の態様において、ナノ粒子上で機能化されたオリゴヌクレオチドは、完全に修飾されるか、部分的に修飾される。よって、種々の態様において、1つ以上もしくは全ての糖類および/またはポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド部の1つ以上もしくは全てのヌクレオチド間結合は、「非天然」群と置換される。
本明細書に使用される、「ポリペプチド」という用語は、天然由来の、合成生成された、または組み換えにより生成される、ペプチド、タンパク質、アミノ酸の重合体、ホルモン、ウイルス、および抗体を指す。
NPの表面上のオリゴヌクレオチドの密度は、所与の用途のために調節することができる。例えば、Seferosらの研究[Nano Lett.,9(1):308-311,2009]は、NP表面上のDNAの密度が、ヌクレアーゼにより分解される速度に影響を及ぼしたことを例証した。本密度修飾は、例えば、薬物およびON−NPが細胞に進入し、ONが制御された速度で分解される、NPベースの薬物送達系で使用されるが、これに限定されない。
本方法に使用するために意図されるオリゴヌクレオチドは、任意の手段によりナノ粒子に結合されるものを含む。オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合される手段に関わらず、種々の態様における結合は、5’結合、3’結合、内部結合の一種、またはそれらの結合の任意の組み合わせを通してもたらされる。
特定の態様において、オリゴヌクレオチドおよびドメインがスペーサーを介してナノ粒子に結合されるものを含む、機能化ナノ粒子が意図される。本明細書に記載される、「スペーサー」とは、遺伝子発現自体の調節に関与しないが、複数のコピーにおいてナノ粒子に結合される時、ナノ粒子と機能オリゴヌクレオチドとの間の距離を増加するように、または個別のオリゴヌクレオチド間の距離を増加するように機能する部分を意味する。よって、オリゴヌクレオチドが同じ配列を有するか、または異なる配列を有するかに関わらず、スペーサーは、直列型で個別のオリゴヌクレオチド間に位置するように意図される。ドメインがナノ粒子に直接結合される本発明の態様において、ドメインは、任意に、スペーサーを介してナノ粒子に機能化される。直列型のドメインがナノ粒子に機能化される態様において、スペーサーは、任意に、直列型構造のドメイン単位の幾つかまたは全ての間に存在する。一態様において、スペーサーは、存在する場合、有機部分である。別の態様において、スペーサーは重合体であり、水溶性重合体、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、エチルグリコール、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
ナノ粒子の調製
公開された手順を使用して、クエン酸塩安定化された金ナノ粒子(1〜250nm)を調製する[G.Frens,Nature Physical Science.1973,241,20]。本実施例では、13および5nmの大きさが使用されたが、他の実施例は、1nm〜500nmの大きさのナノ粒子を含む。つまり、テトラクロロ金酸は、還流水中のクエン酸塩を用いた処理により還元される。透過型電子顕微鏡法およびuv/vis吸光分光法を使用して、粒子の大きさおよび分散度を確認することができる。チオール化されたオリゴヌクレオチドは、標準固相ホスホラミダイト法を使用して合成される[Pon,R.T.Solid−phase supports for oligonucleotide synthesis.Methods in Molecular Biology(Totowa,NJ,United States)(1993),20(Protocols for Oligonucleotides and Analogs),465−496]。チオール修飾されたオリゴヌクレオチドは、次に、10nMコロイドの1mL当り3nmolのオリゴヌクレオチドの濃度で、13±1および5nm金コロイドに添加され、一晩、振蘯される。12時間後、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)溶液(10%)を混合物に添加し、0.1%SDS濃度とし、リン酸緩衝剤(0.1M、pH=7.4)を混合物に添加し、0.01リン酸濃度とし、塩化ナトリウム溶液(2.0M)を混合物に添加し、0.1M塩化ナトリウム濃度とする。次いで、塩化ナトリウム溶液(2.0M)の6つのアリコートを8時間にわたって混合物に添加し、0.3Mの最終塩化ナトリウム濃度とし、一晩、振蘯して、機能化プロセスを完了する。溶液を遠心分離し(13,000rpm、20分)、減菌リン酸緩衝生理食塩水に3回再懸濁して、精製された抱合体を生成する。
オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合方法
本実施例のオリゴヌクレオチド設計は、2つの可能な作用メカニズムを含む。第1に、配列は、アンピシリン耐性(AmpR)遺伝子β−ラクタマーゼのプロモーター部位のセンス鎖と優先的にハイブリッド形成する、公開されたプラスミド配列を使用して設計された。これは、抱合体が細菌ゲノムのAmpRのプロモーター配列と優先的にハイブリッド形成する(好適な結合定数および/または患者の細胞内濃度により付与される)利点を利用することにより、細菌をアンピシリンに対して感作させる。これは、プロモーター複合体がその標的部位に結合することを防止し、mRNA転写物(Amp耐性遺伝子)の転写を防止し、したがって、細菌をアンピシリンに対して感作させる。使用された配列は、5’−AT TGT CTC ATG AGC GGA TAC ATA TTT GAA AAA AAA AAA A−SH−3’(配列番号1)および5’−AT TGT CTC ATG AGC GGA TAC AAA AAA AAA A−SH−3’(配列番号2)であった。
プロトコル:30nM粒子を有する1mLブロス中の5μLの細菌ブロスを、3.5時間成長させた。100μLを平均培養し、一晩、成長させた。
プロトコル:30nM粒子を有する1mLブロス中の5μLの細菌ブロスを、5.5時間成長させた。100μLを平均培養し、一晩、成長させた。
オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体は転写ノックダウンをもたらす
さらなる戦略を利用して、プラスミド由来のルシフェラーゼ遺伝子において転写ノックダウンを検査する。本モデルは、ルシフェラーゼノックダウンを、ウミシイタケ発現をコードするプラスミド上の個別の領域と区別することにより、部位選択性遺伝子ノックダウンを例証するために使用された。本作用をアッセイするために、二重ルシフェラーゼリポーターアッセイシステム(Promega)を使用した。本モデルに利用された戦略は、ルシフェラーゼ遺伝子の完全なmRNA転写物の形成を遮断することであった。これは、ウミシイタケに関して、ルシフェラーゼシグナルの減少をもたらす。これに使用された配列は、5’−CCC GAG CAA CGC AAA CGC AAA AAA AAA AA−SH−3’(配列番号4)であった。代替的に、プロモーター複合体がその標的部位を結合することを遮断するように、上に使用されたものに類似する戦略を使用することができる。本実施例において、5nm粒子が使用された。300nM濃度の粒子を使用した、12時間後に得られたノックダウンは、59%であった(p値=0.0004)。これらの結果は、転写レベルでの遺伝子調節をもたらす別の方法を例証する。データの要約を図3に示す。
オリゴヌクレオチド修飾されたナノ粒子抱合体は転写を遮断する
二本鎖ゲノムDNAとハイブリッド形成することにより、転写および後続のタンパク質生成を遮断するこれらの抱合体の能力を例証するために、生体外転写アッセイを行った。オリゴヌクレオチド機能化金ナノ粒子を、ルシフェラーゼ遺伝子をコードする二本鎖プラスミドDNAを含有する生体外転写反応(Promega)に添加した。オリゴヌクレオチド配列は、ルシフェラーゼ遺伝子のセンス鎖を標的にし、よって、転写のみを遮断することができ、翻訳は遮断しない。対照として、非相補的配列で機能化されたナノ粒子抱合体も、同じ方式で使用された。転写反応を進行させ、市販のキット(Promega)を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ遺伝子を標的にするナノ粒子抱合体を含有した試料において、非相補的配列を有するナノ粒子抱合体を含有する対照反応物と比較して、ルシフェラーゼ活性の有意な減少(>75%)が観察された。
生体外で毒性のない遺伝子抑制
DNA−Au NPおよびsiRNA−Au NPの両方は、生体外の複数の細胞において、遺伝子機能を抑制することを示した。例えば、サバイビンに対するsiRNA−Au NPは、T−24およびHT−1376膀胱癌細胞の細胞死をもたらした。加えて、siRNA−Au NPは、単回治療後、培養物中、4日にわたり、HeLa細胞におけるルシフェラーゼの発現を斬進的に低減し、一方、ルシフェラーゼ発現は、従来のsiRNAで治療した後、4日でベースラインレベルまで戻った[Giljohann et al.,J Am Chem Soc 131:2072−2073(2009)]。細胞毒性は、遺伝子発現抑制に必要な濃度で観察されず、免疫媒介作用は、従来の核酸よりも顕著に低い。オリゴヌクレオチド−Au NPを用いた1つ以上の遺伝子の同時抑制も示され、ガングリオシド生合成の2つの酵素(GM2/GD2シンターゼおよびGD3シンターゼ)に対するDNA−Au NPの培養したケラチノサイト(KC)への同時添加は、開始後3日で、ケラチノサイト膜でGM3基質の蓄積をもたらし、目に見える膜発現が、アンチセンス封鎖後、少なくとも1週間継続した。
ナノ粒子抱合体は、局所適用後、経皮的に送達される
DNA−Au NPまたはsiRNA−Au NPを使用した試験は、一次ヒトケラチノサイトが、2時間以内に約100%の効率で、DNA−Au NPおよびsiRNA−Au NPを取りこむことを示す。金ナノ粒子の取り込みを測定するために、誘電結合プラズマ質量分析(ICP−MS)を使用し[Giljohannet al.,Nano Lett7:3818−3821(2007)]、DNA−Au NPの培養されたケラチノサイトによる取り込みは、任意の他の細胞の取り込みより少なくとも10倍大きく、siRNA−Au NPのKCへの取り込みは、他の細胞種より20倍高かったことが分かった。例えば、低カルシウム培地中のKCを用いた、50pMのsiRNA−Au NPの6時間のインキュベーションは、細胞当り約6×105NPの取り込みをもたらし、従来のsiRNAの細胞取り込みより非常に高い。
局所適用されたsiRNA−Au NPは、遺伝子発現を抑制する
局所アプローチを使用する遺伝子発現を標的にする試験において、緑色蛍光タンパク質(GFP)が、導入遺伝子(C57BL/6−Tg(UBC−GFP)30Scha/J)を遍在的に発現するマウスにおいて標的にされた。Aquaphorビヒクルを使用して、GFPに対してsiRNA−Au NPを15nM濃度で局所的に適用した。マウスを、4週間、連続して3回治療し、マウスの背部の半分を抗GFP siRNA−Au NPで治療し、もう半分をスクランブルsiRNA−Au NPで治療した。治療した皮膚を単離した後、対照群と抗GFP siRNA−Au NPで治療された群との間のGFPレベルを比較するために、蛍光定量法を使用した。治療されたマウス(n=5)において、本レジメンは、蛍光的に測定された時、GFP発現において43%の減少をもたらした(p<0.0036)(図6)。スクランブル(対照)siRNA−Au NPで半分を治療されたマウスの皮膚から見られる約12%のノックダウンは、抗GFP siRNA−Au NPの全身取り込みを示した。
治療標的としての転移性メラノーマ
異なる遺伝子型のヒトメラノーマ細胞株(例えば、SK−MEL−28、1205Lu、A375P、C8161、およびWM3211株)およびヒトメラノーマ組織の試験から、転移性細胞は、ガングリオシドGM3の独特の脱アセチル化形態の存在により、非転移性メラノーマ細胞および正常なメラニン細胞と区別できることが分かった。脱N−アセチルGM3は、抗原的に明確なマーカーであるだけでなく、細胞移動および侵入も促進する[Liu J de−N−acetyl GM3 promotes melanoma cell migration and invasion via urokinase plasminogen activator receptor signaling−dependent matrix metalloproteinase−2 activation.Cancer Res (2009)]。移植片マウスモデルを用いた試験は、マウスの転移性株の肺および肝臓への転移の蔓延の抑制において、脱N−アシルGM3の有用性を検証した。これらの試験の間、皮膚および転移性メラノーマの確立の時間推移は、2つのBRAF V600E/ PTEN欠損モデルである、SK−MEL−28および1205Luを用いた移植片モデルで調査された。これらのモデルにおいて、106細胞の皮下接種は、肉眼、顕微鏡、およびRT−PCR評価により、接種後、数週間内で大半のマウスに皮膚腫瘍および肺および肝臓への転移をもたらす。siRNA−Au NPのメラノーマ細胞に浸透し、サバイビンの発現を抑制する能力も試験された。SK−MEL 28メラノーマ細胞株を使用して、siRNA Au−NPは、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)により測定された時、サバイビンmRNAレベルを91%低下させることを示した。
既知の遺伝子を標的にする多機能siRNA−Au NPは、組み合わせの生体外アプローチを使用する転移性メラノーマに関与する
遺伝的にシグナル伝達経路を標的にする多機能ナノ粒子の能力を検討する。抱合体を設計し、組み合わせ形式で複数の変異を標的にするように例証する。比率測定基準アプローチを使用して、複数の遺伝子を同時に調節する目的のために、機能化された抱合体を最適化する。
シグナル伝達経路変更および細胞機能の評価
選択された個別の、および多機能のsiRNA−Au NPのシグナル伝達および細胞の生物学的様態への影響が、記載されるように比較される[Sun et al.,J Invest Dermatol119:107−117(2002)、Wang et al.,J Invest Dermatol126:2687−2696(2006)、Wang et al.,J Biol Chem276:44504−44511(2001)、Wang et al., J Biol Chem278:25591−25599(2003)]。BRAF V600E/AKT3 siRNA−Au NPは、ERKリン酸化ならびにAKT発現およびリン酸化の両方を抑制する。これは、pERK、ERK、pAKT、およびAKTに対する抗体を用いた免疫ブロットにより確認される。メラノーマ細胞増殖の増加および生存におけるBRAF/ERKおよびAKTシグナル伝達の主要な役割を考えると、生体外メラノーマ細胞機能における著明な変化は、ノックダウンの結果として生じる。アポトーシスの誘発は、PARP切断を判定するための免疫ブロットおよびアネキシンV流動試験により判断される。BRAF V600E抑制およびAKT3抑制の相対的な役割は、Bim(BRAF活性化により誘発される)、BCL−2(AKT活性化により誘発される)、およびBAD(AKT活性により抑制される)のタンパク質発現を特定することにより分析される。スクランブル配列を有する対照における誘発されたアポトーシスの欠損は、アポトーシスがsiRNA−Au NP毒性ではなく意図される標的に起因することを確実にする。増殖は、細胞計数およびWST−1[(4−[3−(4−インドフェニル)−2−(4−ニトロフェニル)−2H−5−テトラゾリオ]−1,3−ベンゼンジスルホネート)]アッセイにより判定され、サイクリンD1発現は、免疫ブロットにより評価される。メラノーマ細胞は、血管新生(特に、IL−8およびVEGF)および侵入(特に、MMP−2)の一因となる因子を発現する[Liu J et al., de−N−acetyl GM3 promotes melanoma cell migration and invasion via urokinase plasminogen activator receptor signaling−dependent matrix metalloproteinase−2 activation.Cancer Res(2009)]。腫瘍VEGF、Hif−1α、およびMMP−2の発現は、免疫ブロット細胞計数および上澄みにより判定され、培養物の上澄みのMMP−2機能酵素電気泳動アッセイの判定は、前述のように行われる[Liu J et al., de−N−acetyl GM3 promotes melanoma cell migration and invasion via urokinase plasminogen activator receptor signaling−dependent matrix metalloproteinase−2 activation.Cancer Res(2009)、Wang et al.,J Biol Chem278:25591−25599(2003)]。IL−8発現は、ELISAにより、細胞の上澄みで判定される[Crawford et al.,Mol Cancer Ther7:492−499(2008)]。細胞侵入アッセイは、マトリゲル浸潤チャンバを使用して行われる[Wang et al.,J Biol Chem278:25591−25599(2003)]。
siRNAナノ抱合体の経皮および静脈内送達のための条件、安全性、および体内分布
静脈内および経皮的に投与される組み換えsiRNA−Au NPの送達、クリアランス、および毒性を、免疫応答性マウスで比較する。加えて、抱合体の毒性および薬物動態プロファイルを判定する。多機能ナノ粒子は、本明細書に上述される、ヒトの皮膚に浸透するようにも最適化される。
表皮、真皮、および皮下細胞による25nMのフルオロフォア抱合siRNA−Au NPの広範な取り込みは、適用後、24時間内(図5)示され、僅か15nMの非機能性siRNA−Au NPの適用後でも、金粒子の皮膚、リンパ節、肺、肝臓、および腎臓への送達が示された。試験は、形質転換マウスメラノーマモデルにおいて治療が開始する週齢である、7〜8週齢の免疫応答性C57BL/6マウスで行われる。
多機能siRNA−Au NPを用いた時間経過実験は、1)経皮浸透の時間経過および効率性、2)内部臓器への送達の有効性、3)単回適用後のクリアランス、および4)刺激性および毒性の可能性を判断するために行われる。マウスを一度治療した後、治療後2時間〜7週までの8つの時間点で安楽死させる。これらの試験において、初期時間点(すなわち、2、4、24、および72時間)でのsiRNA−Au NPの分布は、皮膚への浸透、臓器への送達、およびクリアランスを確実にするために比較される。局所的に治療されたマウスにおいて、皮膚の治療部位は、金粒子濃度を定量化するためのICP−MS用に、および−80℃での保存用(例えば、後のELISAアッセイ用)に毒性がないことを確実にするために、組織学分析用に3等分される。ICP−MS用の皮膚切片を短時間60℃の水に曝し、血管新生化された真皮から表皮を単離し、これによって、真皮/皮下送達に対する表皮送達を判断する。致死する時に、金含有量について、臓器(上に記述する)および遠隔の皮膚をICP−MSにより判定し、組織学判定(以下を参照)のために各臓器の一部を取り出した。
マウスが提案された実験において、単に単回適用ではなく繰り返し治療されることから、これらの試験も、金ナノ粒子の蓄積を定量化するために、10日、4週間、および7週間の間、毎週2〜3回治療されるマウス(単回適用後の皮膚における金粒子の持続性に基づく)を用いて行われる。
2日に1回マウスの体重を量り、眼に見える皮膚の変化または行動の変化を観察する。有害な影響を検査するために、臓器レベルで組織学および免疫組織化学評価を行った。特に、全組織および皮膚における壊死および炎症の存在、表皮成熟の変化、およびメラニン沈着の存在(色素ダンピング)を判断した。皮膚および内臓の萎縮の痕跡が見られる場合、細胞増殖は、Ki67の検出により、免疫組織化学的に判定される。疑わしいアポトーシスの存在が免疫組織化学的に確認される(ApopTag In Situアポトーシス検出)[Lannutti et al.,Cancer Res.57(23):5277−80(1997)]。皮膚が先天性免疫臓器であり、アポトーシス促進性サイトカインを発現できることから、治療された皮膚で、表皮アポトーシスが見られる場合、対照治療された皮膚に対するsiRNA−Au NP皮膚において、TNF−α発現用のELISAアッセイが行われる。
フランツ拡散セルを用いた生体外実験を行うために、腹壁形成術からの正常なヒトの皮膚を使用して、siRNA−Au NPのヒトの皮膚を横断する能力を試験する。これらのフランツセルは、過去数十年間、ヒトの皮膚を通る流束(flux)を検査するための判断基準であった。これらは、ヒトの生体内条件に一致するように、そして重要な点は、浸透圧勾配視入レーション皮膚を提供するように、温度および湿度制御される。siRNAおよび金粒子は抱合されたままであるため、ヒトの皮膚を通した金粒子の輸送は、浸透のマーカーとして、ICP−MSにより定量化される。真皮から角質層/表皮を分離した後、再構成された皮膚を得る。再構成されたヒトの皮膚試料の整合性は、解剖顕微鏡下で、視覚的に確認される。組織が無損傷であることをさらに確認するために、組織が無損傷である場合、最初の30分内で、回収された試料中で金は検出できないという想定のもとに、最初の30分に、受容液試料を回収する。皮膚をフランツセルに搭載した後、siRNA−Au NP(500nMから始め、100pMの低さまで減らす)を、対照としてのAquaphorとともに適用する。試験は、少なくとも三通りで、少なくとも3回行われる。これらの試験は、時間とともにcm2の皮膚表面全体を通過する薬物の量(ng/cm2/時間)である、ヒトの表皮を通る流束を示す。6時間および24時間の終わりに、皮膚を刻み、組織中の残留Au NPを測定するために、ICP−MS測定用に金粒子を抽出する。
マウスモデルの確立
前述のように、6週齢で、左および右の脇腹に、3日間連続でDMSO中5mMの4−HTを局所投与することにより、メラノーマを誘発する[Dankort et al.,Nat Genet41:544−552(2009)]。これらの有色メラノーマは、有色腫瘍と同様に、最初に、形質転換されたモデルにおいて、4−HT投与後7〜10日で、明らかになる[Dankort et al.,Nat Genet41:544−552(2009)]。マウスモデルを生成するための試験において、溶媒のみの適用は対照として使用される。少なくとも皮膚の腫瘍が最初に検出されるまで療法が始まらない、ヒト疾病をシミュレーションするために、メラノーマが目に見えるか、または少なくとも5mm2の最低領域で明白になるまで、療法の開始は、両方のマウスモデルで保留される。
50nMから500nMの間の3用量のそれぞれで、8匹のマウスを試験する。用量設定試験の対照は、スクランブルsiRNAおよびAquaphor単独を含む。検死のために、療法後7週間で、マウスを致死した。原発性メラノーマおよび任意の皮膚の転移の写真を撮り、カリパスで各治療の時に容積を測定する。目に見える、または明白な皮膚転移の数を記述する。肺、肝臓、リンパ節、腎臓、および脳の肉眼の転移を数え(それらは暗褐色のため容易である)、微視的転移の痕跡について、各臓器全体の複数の個所で、組織学的に臓器を検査する。微視的転移は、顕微鏡的に容易に目に見えるが、必要に応じて、色素沈着をさらに顕著にするために、フォンタナ−マッソン染色を使用する。任意の毒性の痕跡なしに転移を低減するのに最も効果的な用量が、後続の試験に使用される。
前回の試験に基づく用量および頻度で、siRNA−Au NP、スクランブルsiRNA−Au NP、または対照ビヒクル(局所Aquaphor)をマウスに投与する。一組各8匹のマウスを、治療の開始後、1、3、5および7週で致死し、上述のように、肉眼で、および組織学的に内臓転移を評価する。
原発性腫瘍を、定期的な組織学試験と免疫組織化学試験、免疫ブロット分析とqPCRのために分けた。これらの試験における対照は、スクランブルsiRNA−Au NPまたはビヒクルで治療されたマウスからの腫瘍、および正常/未治療皮膚(例えば、形質転換マウスの上背部からの皮膚)である。以下を調査する:i)Ki67染色を用いた腫瘍細胞増殖、ii)抗CD31抗体を用いた腫瘍周囲の血管増生、iii)TUNELアッセイまたはカスパーゼ3染色を用いた腫瘍細胞アポトーシス、iv)前述のプライマーを用いるqPCRを使用した、形質転換モデルにおけるBrafVE、野生型Braf、およびAkt3の発現の直接的抑制[Dankort et al.,Nat Genet41:544−552(2009)、Sharma et al.,Clin Cancer Res15:1674−1685(2009)、Sharma et al.,Cancer Res66:8200−8209(2006)、Sharma et al.,Cancer Res65:2412−2421(2005)]、およびv)全Braf;Craf;p−Akt/全Akt;およびp−ERK1/2/全ERK1/2のタンパク質発現の変化。血管新生および侵入のマーカーについて(VEGF、MMP−2、およびHif−1)、免疫ブロットにより腫瘍試料から抽出したタンパク質をアッセイする。siRNA−Au NPの最終投与後2時間の致死でのベースライン眼球内出血および心穿刺は、ELISAによってIL−8レベルを判定するために行われる[Crawford et al.,Mol Cancer Ther7:492−499(2008)]。免疫応答性形質転換モデルにおいて、Brafおよび/またはAkt3活性の抑制が免疫応答に影響を与え、細胞毒性を促進するかどうかに関わらずT細胞機能も判定される。これらの試験は、未治療またはスクランブルsiRNA−Au NP治療したマウスからの細胞BrafVE Akt3 siRNA−Au NP治療した形質転換マウスと比較する。免疫組織化学検査を使用して、腫瘍切片のFoxp3+(調節T細胞)およびCTLA4+/CD152(細胞毒性CD8+T細胞)の数を数える。抗体の視覚化を確実にするために、AEC色素原(赤色)を使用する。腫瘍浸潤性リンパ球を皮膚の腫瘍[Lin et al.,J Immunol182:6095−6104(2009)]、および治療開始後1、4、および7週で致死したマウスから抽出する。CD4、CD25、Foxp3、CD8、およびCTLA4に対して、蛍光色素抱合された抗体を用いて染色した後、細胞はFACS分析を受ける。
個別の試験において、原発生腫瘍成長および転移を制御するために、マウスを7週間、siRNA−Au NPで治療する。マウスの半分(n=12)は、療法を中断する。治療なしのマウスおよび治療を継続する同齢集団を、2、4、8、および12週後に致死する。原発性メラノーマを毎週2回測定し、終了時に内臓転移を数える。加えて、皮膚および内臓腫瘍において、Au−NPを定量化し、それらのクリアランスがどのように腫瘍抑制の反転と相関するかを判断する。
形質転換マウスは、25〜50日で安楽死を要する[Dankort et al.,Nat Genet41:544−552(2009)](例えば、腫瘍がその最大直径で2cmに達するか、または栄養不良、1週間で20%の体重の損失、もしくは2週間連続で10%の体重の損失、異常呼吸、または痛みを示す体勢を示す等、マウスが病的であるかのいずれかの時)。siRNA−Au NPの作用を判定するための上述の試験において、マウスは、最高10週の時間点で致死される。マウスの治療を継続し、最高3ヶ月の生存試験のために、未治療およびスクランブルsiRNA−Au NP治療したマウスとの比較を行う。マウス生存率は、カプラン−マイヤー生存曲線を使用してプロットされる。
2日に1回マウスの体重を量り、行動または食欲の変化の痕跡を観察する。定期的な病理組織学的染色法によって、組織毒性の痕跡(例えば、アポトーシスまたは炎症)について、肝臓および腎臓組織を判定し、当該分野に公知の方法に従い、骨髄、肝臓、および腎臓機能のスクリーニング血液試験を行う。毒性の痕跡が疑われる場合、さらなる免疫組織化学評価(TUNELおよびKi67等)を行う。siRNA誘発の非特異的作用は、全ゲノム配列(Affymetrix)を行うために、心穿刺により得られる血清で判定される。遺伝子整列試験は、少なくとも7週間、BrafVE Akt 3 siRNA−Au NPに曝されたマウスおよびそれらの対照群からの試料で、少なくとも三通りで行われ、試料を保存(banked)し、非特異的作用が検出される場合、整列は、曝露が短いマウスで行われる。
合成抱合体の遺伝子をノックダウンし、タンパク質発現に影響を与える能力を、P<0.05の有意性を有する両側スチューデントt検定を使用して判定する。ノンパラメトリックマン−ウィットニーU検定およびPRISMソフトウェアを使用して、皮膚メラノーマの大きさの差の有意性ならびに肺および肝臓転移の数を決定する。生存試験における有意性は、生存プロットのログランク検定により判断される。
Claims (23)
- 経皮ビヒクルおよびオリゴヌクレオチドで表面が機能化された治療上有効量の球形ナノ粒子を含む、遺伝子発現を阻害するための組成物であって、前記ナノ粒子の表面上のオリゴヌクレオチドの密度は、少なくとも2pmol/cm 2 であり、前記ナノ粒子に表面が機能化される前記オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドとハイブリッド形成し、遺伝子発現を約10%、またはそれ以上阻害する条件下で、前記組成物は、皮膚に投与されることを特徴とする、組成物。
- 前記標的ポリヌクレオチドは、RNAである、請求項1に記載の組成物。
- 前記投与は、皮膚疾患を軽減することを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記皮膚疾患は、癌、老化性疾患、炎症、感染、および美容上の変形から成る群から選択される、請求項3に記載の組成物。
- 前記癌は、扁平上皮癌、基底細胞癌、乳癌、およびメラノーマから成る群から選択される、請求項4に記載の組成物。
- 前記標的は、Ras、IkBα、ヘッジホッグ、B−Raf、Akt、およびサイクリンDから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である、請求項5に記載の組成物。
- 前記投与は、単純性表皮水疱症、水疱性魚鱗癬、先天性爪肥厚症、コステロ症候群、または結節性硬化症を軽減することを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記標的は、変異を含む遺伝子産物であり、前記遺伝子産物は、K5、K14、K1、K10、H−Ras、およびm−Torから成る群から選択される遺伝子により発現する、請求項7に記載の組成物。
- 前記老化性疾患は、早老症である、請求項4に記載の組成物。
- 前記標的は、マトリックスメタロプロテアーゼ1およびプロジェリンから成る群から選択される遺伝子により発現する遺伝子産物である、請求項9に記載の組成物。
- 前記炎症は乾癬によるものである、請求項10に記載の組成物。
- 前記標的は、インターロイキン−23遺伝子により発現する遺伝子産物である、請求項11に記載の組成物。
- 前記感染は、ウイルス感染および細菌感染から成る群から選択される、請求項4に記載の組成物。
- 前記標的は、E6/E7遺伝子により発現する遺伝子産物である、請求項13に記載の組成物。
- 前記美容上の変形は、脂漏性角化症、表皮母斑、および色素性母斑から成る群から選択される、請求項4に記載の組成物。
- 前記標的は、変異を含む遺伝子産物であり、前記遺伝子産物は、FGFR3、K10、およびB−Rafから成る群から選択される遺伝子により発現する、請求項15に記載の方法。
- 請求項1〜16のいずれか一項に記載の組成物であって、遺伝子発現は、前記組成物の投与がない遺伝子発現と比較して、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、99%、またはそれ以上阻害される、組成物。
- 前記経皮ビヒクルは、軟膏である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組成物。
- 各オリゴヌクレオチドは、長さが約5〜約100ヌクレオチドである、請求項1に記載の組成物。
- 各オリゴヌクレオチドは、長さが約5〜約50ヌクレオチドである、請求項1に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子の表面上のオリゴヌクレオチドの密度は、少なくとも4pmol/cm 2 である、請求項1に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子の表面上のオリゴヌクレオチドの密度は、4pmol/cm 2 である、請求項1に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドは、RNAまたはDNAを含む、請求項1に記載の組成物。
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