JP2018099128A - オキソ脂肪酸及び希少脂肪酸の製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]9位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸から、水和酵素反応により、10位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸を誘導し、該水酸化脂肪酸から、脱水素酵素反応又は化学的酸化により、10位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸を製造する方法。
[2]9位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸が、オレイン酸、リノール酸、γ-リノレン酸、α-リノレン酸、ステアリドン酸、シス-9,トランス-11-オクタデカジエン酸又はリシノール酸である[1]の方法。
[3]水和酵素及び脱水素酵素が乳酸菌由来である[1]又は[2]の方法。
[4]乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)FERM BP-10549菌株である[3]の方法。
[5]10位にカルボニル基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸から、異性化酵素反応により、10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸を製造する方法。
[6]10位にカルボニル基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸である、[5]の方法。
[7]異性化酵素が乳酸菌由来である[5]又は[6]の方法。
[8]乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)FERM BP-10549菌株である[7]の方法。
[9]10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸から飽和化酵素により、10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸を製造する方法。
[10]10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸である、[9]の方法。
[11]飽和化酵素が乳酸菌由来である[9]又は[10]の方法。
[12]乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)FERM BP-10549菌株である[11]の方法。
[13]以下の(a)〜(c)のいずれかの酵素タンパク質。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失及び/又は置換及び/又は挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ[9]の飽和化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
(c)配列番号1に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつ[9]の飽和化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
[14][13]の酵素タンパク質をコードする核酸。
[15][14]の核酸を含むベクター。
[16][15]のベクターで形質転換された宿主細胞。
[17][16]の宿主細胞を培養し、該培養物から[13]の酵素タンパク質を回収することを含む、該酵素の製造方法。
[18]飽和化酵素が、[13]のタンパク質である[9]の方法。
[19]10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸から、脱水素酵素反応により、10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸を製造する方法。
[20]10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸である、[19]の方法。
[21]脱水素酵素が乳酸菌由来である[19]又は[20]の方法。
[22]乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)FERM BP-10549菌株である[21]の方法。
[23]10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸から、脱水素酵素反応により、10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸を製造する方法。
[24]10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸が、10-オキソオクタデカン酸、10-オキソ-シス-6-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-15-オクタデセン酸又は10-オキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸である、[23]の方法。
[25]脱水素酵素が乳酸菌由来である[23]又は[24]の方法。
[26]乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)FERM BP-10549菌株である[25]の方法。
[27]10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸から、脱水酵素反応により、9位にシス型二重結合及び11位にトランス型二重結合を有する共役脂肪酸又は9位及び11位にトランス型二重結合を有する共役脂肪酸を製造する方法。
[28]10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸が、10-ヒドロキシ-トランス-11-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸、10-ヒドロキシ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸である、[27]の方法。
[29]脱水酵素が乳酸菌由来である[27]又は[28]の方法。
[30]乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)FERM BP-10549菌株である[29]の方法。
[31]10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸から、脱水酵素反応により、9位にシス型二重結合を有する部分飽和脂肪酸又は10位にトランス型二重結合を有する部分飽和脂肪酸を製造する方法。
[32]10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸が、10-ヒドロキシオクタデカン酸、10-ヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸又は10-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸である、[31]の方法。
[33]脱水酵素が乳酸菌由来である[31]又は[32]の方法。
[34]乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)FERM BP-10549菌株である[33]の方法。
[35]10位に水酸基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸から、脱水酵素反応により、9位及び12位にシス型二重結合を有する共役脂肪酸又は10位にトランス型二重結合及び12位にシス型二重結合を有する共役脂肪酸を製造する方法。
[36]10位に水酸基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸が、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸、10-ヒドロキシ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸又は10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸である、[35]の方法。
[37]脱水酵素が乳酸菌由来である[35]又は[36]の方法。
[38]乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)FERM BP-10549菌株である[37]の方法。
反応1の「基質」は、9位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸であれば特に制限されず、例えばモノエン酸(18:1)、ジエン酸(18:2)、トリエン酸(18:3)、テトラエン酸(18:4)、ペンタエン酸(18:5)などが挙げられる。ジエン酸、トリエン酸、又はテトラエン酸がより好ましく、ジエン酸類、又はトリエン酸類が特に好ましい。尚、本明細書において「脂肪酸」という場合、遊離の酸のみならず、エステル体、塩基性化合物との塩等をも包含する。
ジエン酸としては、例えば、リノール酸(cis-9,cis-12-18:2)、シス-9,トランス-11-オクタデカジエン酸(cis-9,trans-11-18:2)等が挙げられる。
トリエン酸類としては、例えば、α−リノレン酸(cis-9,cis-12,cis-15-18:3)、γ−リノレン酸(cis-6,cis-9,cis-12-18:3)等が挙げられる。
テトラエン酸としては、例えば、ステアリドン酸(cis-6,cis-9,cis-12,cis-15-18:4)等が挙げられる。
さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、モリブデン酸カリウム、モリブデン(VI)酸二ナトリウム無水和物、モリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物、オルトバナジン(V)酸ナトリウム、メタバナジン(V)酸ナトリウム、タングステン(VI)酸カリウム、タングステン(VI)酸ナトリウム無水和物、及びタングステン(VI)酸ナトリウム二水和物からなる群から選ばれる1又は2以上の化合物が挙げられる。その添加濃度は水和反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは0.1〜20mM、より好ましくは1〜10mMである。
さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応1で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。
反応3の「基質」としては、上記反応1及び2により、9位及び12位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸から誘導される10-oxo,cis-12脂肪酸であれば特に制限されず、リノール酸から誘導される10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸(KetoA)、α−リノレン酸から誘導される10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸(αKetoA)、γ−リノレン酸から誘導される10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸(γKetoA)、ステアリドン酸から誘導される10-オキソ-シス-6, シス-12, シス-15-オクタデカトリエン酸(sKetoA)等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応1及び2以外の方法により得られたものであってもよい。
反応4の「基質」としては、上記反応3により生成し得る10-oxo,trans-11脂肪酸であれば特に制限されず、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸(KetoA)から誘導される10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸(KetoC)、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸(「αKetoA」ともいう)から誘導される10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸(「αKetoC」ともいう)、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸(「γKetoA」ともいう)から誘導される10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸(「γKetoC」ともいう)、10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸(「sKetoA」ともいう)から誘導される10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸(「sKetoC」ともいう)等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応3以外の方法により得られたものであってもよい。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質、
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失及び/又は置換及び/又は挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ上記反応4を触媒する酵素活性を有するタンパク質、あるいは
(c)配列番号1に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつ上記反応4を触媒する酵素活性を有するタンパク質である。
上記のようにアミノ酸が欠失、置換又は挿入されている場合、その欠失、置換、挿入の位置は、上記酵素活性が保持される限り、特に限定されない。
さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応1で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。
反応5の「基質」としては、上記反応3により生成し得る10-oxo,trans-11脂肪酸であれば特に制限されず、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸(KetoA)から誘導される10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸(KetoC)、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸(「αKetoA」ともいう)から誘導される10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸(「αKetoC」ともいう)、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸(「γKetoA」ともいう)から誘導される10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸(「γKetoC」ともいう)、10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸(「sKetoA」ともいう)から誘導される10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸(「sKetoC」ともいう)等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応3以外の方法により得られたものであってもよい。
一方、反応6の「基質」としては、上記反応4により生成し得る10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸であれば特に制限されず、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸(KetoC)から誘導される10-オキソオクタデカン酸(KetoB)、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸(αKetoC)から誘導される10-オキソ-シス-15-オクタデセン酸(「αKetoB」ともいう)、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸(γKetoC)から誘導される10-オキソ-シス-6-オクタデセン酸(「γKetoB」ともいう)、10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸(sKetoC)から誘導される10-オキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸(「sKetoB」ともいう)等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応4以外の方法により得られたものであってもよい。
脱水素酵素は精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、大腸菌等の菌体に発現させ、その菌体自体を用いても、培養液を用いてもよい。さらには、該酵素は遊離型のものでもよく、各種担体によって固定化されたものでもよい。
さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応1で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。
反応7の「基質」としては、上記反応5により生成し得る10-hydroxy,trans-11脂肪酸であれば特に制限されず、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸(KetoC)から誘導される10-ヒドロキシ-トランス-11-オクタデセン酸(HYC)、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸(αKetoC)から誘導される10-ヒドロキシ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸(「αHYC」ともいう)、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸(γKetoC)から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸(「γHYC」ともいう)、10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸(sKetoC)から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸(「sHYC」ともいう)等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応5以外の方法により得られたものであってもよい。
反応8の「基質」としては、上記反応6により生成し得る10-hydroxy,11,12-飽和化脂肪酸であれば特に制限されず、10-オキソオクタデカン酸(KetoB)から誘導される10-ヒドロキシオクタデカン酸(HYB)、10-オキソ-シス-15-オクタデセン酸(αKetoB)から誘導される10-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸(「αHYB」ともいう)、10-オキソ-シス-6-オクタデセン酸(γKetoB)から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6-オクタデカセン酸(「γHYB」ともいう)、10-オキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸(sKetoB)から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸(「sHYB」ともいう)等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応6以外の方法により得られたものであってもよい。
反応9の「基質」としては、例えば、9位及び12位にシス型二重結合を有する不飽和脂肪酸から、上記反応1により生成し得る10-hydroxy,cis-12脂肪酸であれば特に制限されず、リノール酸から誘導される10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸(HYA)、α-リノレン酸から誘導される10-ヒドロキシ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸(「αHYA」ともいう)、γ-リノレン酸から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸(「γHYA」ともいう)、ステアリドン酸から誘導される10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸(「sHYA」ともいう)等が挙げられる。もちろん、当該基質は反応1以外の方法により得られたものであってもよい。
脱水酵素は精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、大腸菌等の菌体に発現させ、その菌体自体を用いても、培養液を用いてもよい。さらには、該酵素は遊離型のものでもよく、各種担体によって固定化されたものでもよい。
さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応1で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。
オキソ脂肪酸等を含有する医薬の剤型としては、散在、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製されるが、オキソ脂肪酸等は水に難溶性であるため、植物性油、動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、乳化剤、分散剤もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー(高圧ホモジナイザー)を用いて水溶液中に分散、乳化させて用いる。
4℃にて保管している2%寒天を含むMRS高層培地よりラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549を15 ml のMRS液体培地(Difco製; pH 6.5)に植菌し、28℃で20時間、120 rpmにて前培養を行った。本培養は、以下に示すリノール酸溶液を7.7 ml含む550 ml のMRS液体培地に前培養を全量植菌し、28℃で24時間、120 rpmにて行った。リノール酸溶液は、50 mgのリノール酸に10 mgの牛血清アルブミンを加え、1 mlの0.1 Mリン酸カリウムバッファー(pH 6.5)に懸濁し、10分間の超音波により均一にした後、0.45 μmのフィルターを用い除菌したものを用いた。培養後、3,000 rpm、4℃にて10分間遠心分離することにより集菌し、ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549の菌体を得た。
尚、ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549株は、平成18年(2006)年3月7日より独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(IPOD, AIST)(現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター (IPOD, NITE));〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6に寄託されている。
(1) ゲノムDNAの取得
ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549の湿菌体14 gを180 mlのTENバッファー(10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 1 mM EDTA; 10 mM NaCl)に懸濁した。これに9 mlのSETバッファー(20% Sucrose; 50 mM EDTA; 50 mM Tris-HCl (pH 7.5))、135 mgのリゾチームを加え37℃で10分間インキュベートしたのち、90 mlのTENバッファー、9 mlの25% SDS、18 mlの5 M NaCl、180 mlのフェノール、32 mlのクロロホルムを加えゆっくりと完全に混合した。その後、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。続いて、上層と等量のクロロホルムを加え完全に混合し、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。これに等量のエタノールを加え、完全に混合し、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離した。得られた沈殿を20分間真空デシケーターにて乾燥した後、少量のTEバッファー(10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA)に溶解した。これに20 μlのRNaseA溶液を添加し、37℃で15時間インキュベートした後、1.2 mlのクロロホルムを加え、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し上層を回収した。これに6 mlのクロロホルムを加え、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離し、上層を回収した。さらに6 mlのイソプロパノールを加え完全に混合した後、30分室温にてインキュベートし、3,500 x gにて20分間室温にて遠心分離した。得られた沈殿物を70%エタノールにて洗浄した後、真空デシケーターにて乾燥し、TEバッファーに溶解し、ゲノムDNAを得た。
公表されているラクトバチルス・プランタルムWCFS1株の全ゲノム遺伝子配列においてCLA-DCのすぐ下流に存在するopen-reading-frame (ORF)をターゲットにした。該ORFの開始コドンの5'側9〜28塩基上流の配列をもとに、センスプライマー(配列番号3)を、また、終止コドンの3'側13〜31塩基下流の配列を基にアンチセンスプライマー(配列番号4)を設計した。これらのプライマーを用い、ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549のゲノムDNAを鋳型とし、PCRを行った。PCRの結果増幅された遺伝子断片約0.7 kbpの塩基配列の解読を行った結果、本遺伝子断片には開始コドンATGから始まり終止コドンTAAで終わる654 bpの一つのORF(配列番号1)が含まれていることが判明し、本遺伝子をCLA-ER遺伝子とした。本CLA-ER遺伝子は配列番号2に示す217残基のアミノ酸からなるタンパク質をコードしていた。
大腸菌発現用ベクターpET101/D-TOPO (Invitrogen)とロゼッタ2(DE3)株からなる宿主ベクター系を用いた。ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549のCLA-ER遺伝子の開始コドンATGの前にCACCを付加し、開始コドンならびにそれを含む3'末端側23塩基の配列に基づいて設計したセンスプライマー(配列番号5)と、終止コドンのTAAを削除した5'末端側26塩基の配列に基づいて設計したアンチセンスプライマー(配列番号6)を用い、ラクトバチルス・プランタルムFERM BP-10549のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った。PCRの結果増幅された約0.6 kbpの遺伝子断片をpET101/D-TOPOに挿入し、発現ベクター(pCLA-ER)を構築した。pCLA-ERをロゼッタ2(DE3)株に形質転換し、形質転換株ロゼッタ/pCLA-ER株を得た。得られたロゼッタ/pCLA-ER株を1 mgアンピシリンを含む10 ml LB培地(1%バクトトリプトン(Difco)、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウムを含む培地(pH 7.0))にて37℃、15時間、300 rpmで好気的に培養し、前培養とした。これを75 mgアンピシリンを含む750 ml LB培地に前培養液10 ml植菌し、2時間、37℃、100 rpmで好気的に培養した後、1 M IPTGを750 μl添加し、さらに20℃にて15時間、100 rpmで好気的に培養した。培養後3,000 rpmにて10分間遠心分離し、ロゼッタ/pCLA-ER株の湿菌体を得た。飽和化酵素は、CLA-ER発現形質転換大腸菌を用いた。
岸野らの報告(Biochemical and Biophysical Research Communications 416(2011)188-193)に基づき、CLA-HY, CLA-DH, CLA-DC各発現形質転換大腸菌を作製した。水和酵素及び脱水酵素はCLA-HY発現形質転換大腸菌、異性化酵素はCLA-DC発現形質転換大腸菌及び、脱水素酵素はCLA-DH発現形質転換大腸菌を用いた。
培養により得られた菌体を3 mlのバッファーC(40 mM イミダゾール、50 mM リン酸カリウムバッファー(pH 8.0)、0.5 M NaCl)に懸濁し、超音波により菌体を破砕した。破砕後、10,000 x gにて60分間4℃にて超遠心分離し、上層を回収した。続いてFPLCを用いてアフィニティーカラム(HisTrap HP)及び透析(透析液は50 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5))により精製を行った。
培養により得られた菌体を3 mlのBugBuster Master Mix(Novagen)に懸濁し、室温で20分間インキュベートした。インキュベート後、10,000 x gにて60分間4℃にて超遠心分離し、上層を回収した。続いてFPLCを用いてゲル濾過カラム(Superdex 200 Hiload 26/60)、イオン交換カラム(MonoQ 10/100)、ゲル濾過カラム(Superdex 200 10/300)及び透析(透析液はバッファーC)により精製を行った。
水和酵素誘導形質転換大腸菌を用いリノール酸からHYAの生成試験を行った。反応液は、水和酵素誘導形質転換大腸菌(湿菌体重量 3 g)、NADH (600 mg)、FAD (15 mg)、リノール酸 (5 g)、BSA(1 g)を含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を160 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に36時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液(160 ml)に対して1.6 mlの5N HCl、200 mlのクロロホルム、200 mlのメタノールを加えスターラーで撹拌し、クロロホルム層を回収した。さらに残液に対し150 mlのクロロホルムを加えよく撹拌し、再度クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてHYAの純度を評価した。その結果、抽出物の約80%がHYAであることを確認した。
実施例7より得られた抽出物(HYAを含む混合物)の10倍重量のシリカゲル(Wakogel(R)C-100)をヘキサンで膨潤させガラスカラムに詰め、硫酸ナトリウム(無水)を重層した。ヘキサン:ジエチルエーテル=8:2の溶出液で実施例7より得られた抽出物(HYAを含む混合物)を懸濁し、カラムにアプライした。溶出液を流速約2 mlで流し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収した。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、未反応の基質や菌体由来の脂質を除去した後、溶出液をヘキサン:ジエチルエーテル=6:4に変更し、さらに溶出させた。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、HYAのみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィーにてHYAの純度を評価した。その結果、純度98%以上のHYAを得た。
実施例6により得られた精製脱水素酵素を用いHYAからKetoA生成試験を行った。反応液は、精製脱水素酵素 (酵素量83μg)、0.5 mM NAD+、0.01 mM FAD、0.1% HYAを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 8.0)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出しメチルエステル化した後ガスクロマトグラフィーにてKetoAの生成を評価した。その結果、HYAからKetoA(0.06 mg)の生成を確認した。
無水クロム酸2.67 gに硫酸2.3 ml、水7.7 mlを加えた物を、アセトンを90 ml加えてクロム酸溶液を作製した。三角フラスコに、2 gのHYAと、40 mlのアセトンを加え、氷上にてスターラーで撹拌しながら上記のクロム酸溶液を1滴ずつ加えた。溶液が青色から抹茶色になったらクロム酸溶液の滴下をやめ、イソプロピルアルコールを用いて反応を停止した。析出した沈殿をろ紙を用いて濾過し、分液ロートに入れさらにジエチルエーテルを150 ml及びミリQ水300 mlを加えてよく振り、ジエチルエーテル層を数回ミリQ水で洗浄した。洗浄後のジエチルエーテル層に硫酸ナトリウム(無水)を適量加えて撹拌し残存水分を除去した。添加した無水硫酸ナトリウムをろ紙を用いて濾過し、得られたジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてLC/MSにてKetoAの純度を評価した。その結果、抽出物の約95%がKetoAであることを確認した。
精製脱水素酵素を用いたKetoA生産法は、1 mgのHYAを含む1 mlの反応系から0.06 mgのKetoAが生成したことより、変換効率は6%であった。
それに対し無水クロム酸を用いたKetoA生産法は、2 gのHYAから抽出した全脂肪酸のうち約95%がKetoAであったことより、変換率は約95%となり、大幅なKetoA生産効率の向上に成功した。
実施例10より得られた抽出物(KetoAを含む混合物)の20〜30倍重量のシリカゲル(Wakogel(R)C-100)をヘキサンで膨潤させガラスカラムに詰め、硫酸ナトリウム(無水)を重層した。ヘキサン:ジエチルエーテル=8:2の溶出液で実施例10より得られた抽出物(KetoAを含む混合物)を懸濁し、カラムにアプライした。溶出液を流速約2 mlで流し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収した。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、KetoAのみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィーにてKetoAの純度を評価した。その結果、純度98%以上のKetoAを得た。
水和酵素誘導形質転換大腸菌を用いα-リノレン酸からαHYAの生成試験を行った。反応液は、水和酵素誘導形質転換大腸菌(湿菌体重量 0.7 g)、NADH (33 mg)、FAD (0.8 mg)、α-リノレン酸(1 g)、BSA(0.2 g)を含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を10 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に63時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、10 mlのクロロホルム、10 mlのメタノールを加え撹拌し、クロロホルム層を回収した。さらに残液に対し10 mlのクロロホルムを加えよく撹拌し、再度クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてαHYAの純度を評価した。その結果、抽出物の約35%がαHYAであることを確認した。
実施例13より得られた抽出物(αHYAを含む混合物)の20〜30倍重量のシリカゲル(Wakogel(R)C-100)をヘキサンで膨潤させガラスカラムに詰め、硫酸ナトリウム(無水)を重層した。ヘキサン:ジエチルエーテル=8:2の溶出液で実施例13より得られた抽出物(αHYAを含む混合物)を懸濁し、カラムにアプライした。溶出液を流速約3 mlで流し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収した。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、未反応の基質や菌体由来の脂質を除去した後、溶出液をヘキサン:ジエチルエーテル=6:4に変更し、さらに溶出させた。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、αHYAのみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィーにてαHYAの純度を評価した。その結果、純度99%以上のαHYAを得た。
無水クロム酸2.67 gに硫酸2.3 ml、水7.7 mlを加えた物を、アセトンを90 ml加えてクロム酸溶液を作製した。三角フラスコに、2 gのαHYAと、40 mlのアセトンを加え、氷上にてスターラーで撹拌しながら上記のクロム酸溶液を1滴ずつ加えた。溶液が青色から抹茶色になったらクロム酸溶液の滴下をやめ、イソプロピルアルコールを用いて反応を停止した。析出した沈殿をろ紙を用いて濾過し、分液ロートに入れさらにジエチルエーテルを150 ml及びミリQ水300 mlを加えてよく振り、ジエチルエーテル層を数回ミリQ水で洗浄した。洗浄後のジエチルエーテル層に硫酸ナトリウム(無水)を適量加えて撹拌し残存水分を除去した。添加した無水硫酸ナトリウムをろ紙を用いて濾過し、得られたジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてLC/MSにてαKetoAの純度を評価した。その結果、抽出物の約80%がαKetoAであることを確認した。
実施例15より得られた抽出物(αKetoAを含む混合物)の20〜30倍重量のシリカゲル(Wakogel(R)C-100)をヘキサンで膨潤させガラスカラムに詰め、硫酸ナトリウム(無水)を重層した。ヘキサン:ジエチルエーテル=8:2の溶出液で実施例15より得られた抽出物(αKetoAを含む混合物)を懸濁し、カラムにアプライした。溶出液を流速約2 mlで流し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収した。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、αKetoAのみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィーにてαKetoAの純度を評価した。その結果、純度98%以上のαKetoAを得た。
水和酵素誘導形質転換大腸菌を用いγ-リノレン酸からγHYAの生成試験を行った。反応液は、水和酵素誘導形質転換大腸菌(湿菌体重量 0.7 g)、NADH (33 mg)、FAD (0.8 mg)、γ-リノレン酸(1 g)、BSA(0.2 g)を含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を10 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に63時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、10 mlのクロロホルム、10 mlのメタノールを加え撹拌し、クロロホルム層を回収した。さらに残液に対し10 mlのクロロホルムを加えよく撹拌し、再度クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてγHYAの純度を評価した。その結果、抽出物の約85%がγHYAであることを確認した。
実施例17より得られた抽出物(γHYAを含む混合物)の20〜30倍重量のシリカゲル(Wakogel(R)C-100)をヘキサンで膨潤させガラスカラムに詰め、硫酸ナトリウム(無水)を重層した。ヘキサン:ジエチルエーテル=8:2の溶出液で実施例17より得られた抽出物(γHYAを含む混合物)を懸濁し、カラムにアプライした。溶出液を流速約3 mlで流し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収した。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、未反応の基質や菌体由来の脂質を除去した後、溶出液をヘキサン:ジエチルエーテル=6:4に変更し、さらに溶出させた。回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、γHYAのみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィーにてγHYAの純度を評価した。その結果、純度99%以上のγHYAを得た。
無水クロム酸2.67 gに硫酸2.3 ml、水7.7 mlを加えた物を、アセトンを90 ml加えてクロム酸溶液を作製した。三角フラスコに、2 gのγHYAと、40 mlのアセトンを加え、氷上にてスターラーで撹拌しながら上記のクロム酸溶液を1滴ずつ加えた。溶液が青色から抹茶色になったらクロム酸溶液の滴下をやめ、イソプロピルアルコールを用いて反応を停止した。析出した沈殿をろ紙を用いて濾過し、分液ロートに入れさらにジエチルエーテルを150 ml及びミリQ水300 mlを加えてよく振り、ジエチルエーテル層を数回ミリQ水で洗浄した。洗浄後のジエチルエーテル層に硫酸ナトリウム(無水)を適量加えて撹拌し残存水分を除去した。添加した無水硫酸ナトリウムをろ紙を用いて濾過し、得られたジエチルエーテル層をロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてLC/MSにてγKetoAの純度を評価した。その結果、抽出物の約95%がγKetoAであることを確認した。
水和酵素誘導形質転換大腸菌を用いステアリドン酸からsHYAの生成試験を行った。反応液は、水和酵素誘導形質転換大腸菌(湿菌体重量 0.7 g)、NADH (33 mg)、FAD (0.8 mg)、ステアリドン酸(0.2 g)、BSA(40 mg)を含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を10 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に63時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、10 mlのクロロホルム、10 mlのメタノールを加え撹拌し、クロロホルム層を回収した。さらに残液に対し10 mlのクロロホルムを加えよく撹拌し、再度クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてsHYAの純度を評価した。その結果、抽出物の約50%がsHYAであることを確認した。
水和酵素誘導形質転換大腸菌を用いリシノール酸からrHYAの生成試験を行った。反応液は、水和酵素誘導形質転換大腸菌(湿菌体重量 0.7 g)、NADH (33 mg)、FAD (0.8 mg)、リシノール酸(1 g)、BSA(0.2 g)を含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を10 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に63時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、10 mlのクロロホルム、10 mlのメタノールを加え撹拌し、クロロホルム層を回収した。さらに残液に対し10 mlのクロロホルムを加えよく撹拌し、再度クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてrHYAの純度を評価した。その結果、抽出物の約95%がrHYAであることを確認した。
KetoA (1 g)、BSA(0.2 g)、100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)(4 ml)を超音波にて乳化後、試験管10本に分注した。各々の試験管に2 ml/gの100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)で懸濁した異性化酵素発現形質転換大腸菌を添加し、全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に15時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、各々の試験管に2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌、遠心分離後上澄みを回収した。さらに残渣に対し2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌し、遠心分離後再度上澄みを回収した。回収した上澄みをまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮した。濃縮液に1 mlの蒸留水と3 mlのヘキサンを加えてVortexで撹拌、遠心分離後ヘキサン層を回収した。反応産物及び未反応の基質を抽出した。さらに残液に対し3 mlのヘキサンを加えよく撹拌し、遠心分離後再度ヘキサン層を回収した。回収したヘキサン層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてKetoCの純度を評価した。その結果、抽出物の約56%がKetoCであることを確認した。
野村化学社製のDevelosil C30-UG-3 (10 X 150 mm)を用い、移動相はアセトニトリル:水:酢酸(80:20:0.002)、流速3.5 ml/min、カラム温度は30℃、検出は225 nmの吸収でモニターした。上記実施例24で得られた混合物を、メタノールを用いて100 mg/mlとなるように溶解し、0.15 mlをカラムにアプライした。保持時間7.5分あたりで溶出されてくるKetoCのピークのみを分取した。分取した溶液をまとめてエバポレーターにて溶出液を除去した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィー及びLC/MSにてKetoCの純度を評価した。その結果、純度98%以上で
KetoCを得た。
αKetoA (0.5 g)、BSA(0.1 g)、100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)(2 ml)を超音波にて乳化後、試験管4本に分注した。各々の試験管に2 ml/gの100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)で懸濁した異性化酵素発現形質転換大腸菌を0.5 mlずつ添加し、全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に15時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、各々の試験管に2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌、遠心分離後上澄みを回収した。さらに残渣に対し2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌し、遠心分離後再度上澄みを回収した。回収した上澄みをまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮した。濃縮液に1 mlの蒸留水と3 mlのヘキサンを加えてVortexで撹拌、遠心分離後ヘキサン層を回収した。反応産物及び未反応の基質を抽出した。さらに残液に対し3 mlのヘキサンを加えよく撹拌し、遠心分離後再度ヘキサン層を回収した。回収したヘキサン層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いて高速液体クロマトグラフィーにてαKetoCの純度を評価した。その結果、抽出物の約65%がαKetoCであることを確認した。
野村化学社製のDevelosil C30-UG-5を用い、移動相はアセトニトリル:水:酢酸(60:40:0.002)、流速10 ml/min、カラム温度は30℃、検出は210 nmと233 nmの吸収でモニターした。上記実施例26で得られた混合物を、メタノールを用いて100 mg/mlとなるように溶解し、0.17 mlをカラムにアプライした。リサイクルシステムを用い溶出されてくるαKetoCのピークのみを分取した。分取した溶液をまとめてエバポレーターにて溶出液を除去した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィー及びLC/MSにてαKetoCの純度を評価した。その結果、純度98%以上でαKetoCを得た。
γKetoA (0.5 g)、BSA(0.1 g)、100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)(2 ml)を超音波にて乳化後、試験管4本に分注した。各々の試験管に2 ml/gの100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)で懸濁した異性化酵素発現形質転換大腸菌を0.5 mlずつ添加し、全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に15時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、各々の試験管に2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌、遠心分離後上澄みを回収した。さらに残渣に対し2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌し、遠心分離後再度上澄みを回収した。回収した上澄みをまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮した。濃縮液に1 mlの蒸留水と3 mlのヘキサンを加えてVortexで撹拌、遠心分離後ヘキサン層を回収した。反応産物及び未反応の基質を抽出した。さらに残液に対し3 mlのヘキサンを加えよく撹拌し、遠心分離後再度ヘキサン層を回収した。回収したヘキサン層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてLC/MSにてγKetoCの純度を評価した。その結果、抽出物の約95%がγKetoCであることを確認した。
野村化学社製のDevelosil C30-UG-5を用い、移動相はアセトニトリル:水:酢酸(60:40:0.002)、流速10 ml/min、カラム温度は30℃、検出は210 nmと233 nmの吸収でモニターした。上記実施例26で得られた混合物を、メタノールを用いて100 mg/mlとなるように溶解し、0.17 mlをカラムにアプライした。リサイクルシステムを用い溶出されてくるγKetoCのピークのみを分取した。分取した溶液をまとめてエバポレーターにて溶出液を除去した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィー及びLC/MSにてγKetoCの純度を評価した。その結果、純度96%以上でγKetoCを得た。
KetoA (1 g)、BSA(0.2 g)、100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)(4 ml)を超音波にて乳化後、試験管10本に分注した。各々の試験管に2 ml/gの100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)で懸濁した異性化酵素発現形質転換大腸菌を添加し、全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に15時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、各々の試験管に2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌、遠心分離後上澄みを回収した。さらに残渣に対し2 mlのメタノールを加えVortexで撹拌し、遠心分離後再度上澄みを回収した。回収した上澄みをまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮した。濃縮液に1 mlの蒸留水と3 mlのヘキサンを加えてVortexで撹拌、遠心分離後ヘキサン層を回収した。反応産物及び未反応の基質を抽出した。さらに残液に対し3 mlのヘキサンを加えよく撹拌し、遠心分離後再度ヘキサン層を回収した。回収したヘキサン層をまとめてロータリーエバポレーターにて濃縮し、反応産物及び未反応の基質を抽出した。抽出物の一部を用いてメチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてKetoCの純度を評価した。その結果、抽出物の約56%がKetoCであることを確認した。
野村化学社製のDevelosil C30-UG-3 (10 X 150 mm)を用い、移動相はアセトニトリル:水:酢酸(80:20:0.002)、流速3.5 ml/min、カラム温度は30℃、検出は225 nmの吸収でモニターした。上記実施例28で得られた混合物を、メタノールを用いて100 mg/mlとなるように溶解し、0.15 mlをカラムにアプライした。保持時間7.5分あたりで溶出されてくるKetoCのピークのみを分取した。分取した溶液をまとめてエバポレーターにて溶出液を除去した。得られた最終生成物の一部を用いてメチルエステル化した後に、ガスクロマトグラフィー及びLC/MSにてKetoCの純度を評価した。その結果、純度98%以上でKetoCを得た。
飽和化酵素を用いKetoB生成試験を行った。反応液は、飽和化酵素誘導形質転換大腸菌(湿菌体重量 33 mg)、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、KetoC(5.2 mg)、1 mg BSAを含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に17時間、200 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてKetoBの生成を評価した。その結果、変換率30%でKetoBが生成していることを明らかにした。
異性化酵素及び飽和化酵素を用いαKetoB生成試験を行った。反応液は、異性化酵素誘導形質転換大腸菌(湿菌体重量 80 mg)、飽和化酵素誘導形質転換大腸菌(湿菌体重量 80 mg)、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、αKetoA(2 mg)、0.4 mg BSAを含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 7.5)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に18時間、225 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてαKetoBの生成を評価した。その結果、変換率99%でαKetoBが生成していることを明らかにした。
実施例6より得られた精製脱水素酵素を用いHYC生成試験を行った。反応液は、精製脱水素酵素(酵素量83 μg)、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、 0.005% KetoCを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を0.8 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてにてHYCの生成を評価した。その結果、KetoCからHYC(0.02 mg)の生成を確認した。
脱水素酵素を用いHYB生成試験を行った。反応液は、脱水素酵素誘導形質転換大腸菌(湿菌体重量 50 mg)、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、0.02% KetoBを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてHYBの生成を評価した。その結果、KetoBからHYB(0.08 mg)の生成を確認した。
実施例5より得られた精製脱水酵素を用いCLA1及びCLA2生成試験を行った。反応液は、精製脱水酵素(酵素量300 μg)、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、0.035% HYCを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を0.8 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてCLA1及びCLA2の生成を評価した。その結果、HYCからCLA1(0.05 mg)及びCLA2(0.15 mg)の生成を確認した。
脱水酵素を用いオレイン酸及びtrans-10-オクタデセン酸生成試験を行った。反応液は、脱水酵素誘導形質転換大腸菌(湿菌体50 mg)、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、0.2% HYBを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてオレイン酸及びtrans-10-オクタデセン酸の生成を評価した。その結果、HYBからオレイン酸(0.02 mg)及びtrans-10-オクタデセン酸(0.1 mg)の生成を確認した。
脱水酵素を用いリノール酸及びtrans-10,cis-12-CLA生成試験を行った。反応液は、脱水酵素誘導形質転換大腸菌(湿菌体50 mg)、0.5 mM NADH、0.01 mM FAD、0.07% HYAを含む20 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を1 mlとした。反応は、37℃にて、酸素吸着剤アネロパック(三菱化学)存在下で嫌気的に4時間、120 rpmで振とうしながら行った。反応後、反応液よりブライダイヤー法にて脂質を抽出し、メチルエステル化した後にガスクロマトグラフィーにてリノール酸及びCLA3の生成を評価した。その結果、HYAからリノール酸(0.26 mg)及びtrans-10,cis-12-CLA (0.07 mg)の生成を確認した。
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
Claims (34)
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1又は複数個のアミノ酸が欠失及び/又は置換及び/又は挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ請求項5記載の飽和化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
(c)配列番号1に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつ請求項5記載の飽和化反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
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