JP2018091792A - マラリア原虫に感染した赤血球の検出方法及び血液分析装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】実質的に凍結保存液を含まない凍結した血液試料を解凍し、解凍した血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出することにより、上記の課題を解決する。
【選択図】なし
Description
本実施形態に係るマラリア原虫に感染した赤血球の検出方法(以下、単に「検出方法」ともいう)では、まず、実質的に凍結保存液を含まない凍結した血液試料を解凍する。
本発明の範囲には、本実施形態の検出方法を実行するための血液分析装置も含まれる。すなわち、本実施形態の血液分析装置は、実質的に凍結保存液を含まない解凍した血液試料中のマラリア感染赤血球を検出するための装置である。ここで、実質的に凍結保存液を含まない解凍した血液試料とは、上記の「実質的に凍結保存液を含まない凍結した血液試料」を解凍して得られる試料である。凍結試料を解凍する手段は、本実施形態の検出方法について述べたことと同様である。
本実施形態に係る血液分析装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本実施形態はこの例のみに限定されない。図2に示されるように、血液分析装置1は、測定部2と、解析部3とを備える。測定部2は、血液試料を取り込み、血液試料から測定試料を調製し、測定試料を光学測定する。解析部3は、測定部2の測定により得られた測定データを処理し、血液試料の分析結果を出力する。
図5を参照して、血液分析装置1の動作について説明する。まず、解析部3のCPU301が、ユーザからの測定実行の指示を、入力部309を介して受け付ける(ステップS101)。測定実行の指示を受け付けると、CPU301は、測定部2に測定開始を指示する指示データを送信し(ステップS102)、測定部2が指示データを受信する(ステップS103)。マイクロコンピュータ82は、測定試料調製処理を実行し(ステップS104)、第1測定処理を実行し(ステップS105)、第2測定処理を実行する(ステップS106)。
凍結保存液を添加せずに凍結保存した血液試料をFCMで測定することにより、マラリア感染赤血球を検出できるか否かを検討した。
培養マラリア原虫(国立大学法人大阪大学微生物病研究所から入手:以下、「培養マラリア」ともいう)を、健常ボランティアから採取した血液(以下、「ヒト全血」ともいう)に添加して、マラリア感染血液を模した試験試料1及び2を調製した。ヒト全血には、抗凝固剤が通常の使用量で添加されている。よって、試験試料1及び2にも抗凝固剤が含まれる。なお、培養マラリア原虫とは、白血球を除去したヒト血液にマラリア原虫を感染させて得た培養物であり、マラリア原虫そのものではない。該培養物において、マラリア原虫はヒト赤血球内に存在する。試験試料1は、マラリアの症状のある患者を想定した試料であり、マラリア感染赤血球を約2,000/μLで含む。試験試料2は、無症候患者を想定した試料であり、マラリア感染赤血球を約200/μLで含む。対照の血液試料として、ヒト全血及び培養マラリアのそれぞれを用いた。
血球の細胞膜を部分的に損傷させる試薬(試料処理液)として、以下の組成の溶液(pH 6.1、277 mOsm/kg・H2O)を調製した。溶媒には精製水(1.0 L)を用いた。
[試料処理液の組成]
LTAC (カチオン系界面活性剤) 2.95 mM
STAC (カチオン系界面活性剤) 1.11 mM
PBC-44 (ノニオン系界面活性剤) 2.90 mM
ADA (緩衝剤) 20 mM
NaCl 適量 (浸透圧が上記の値となる量)
1.5 mLエッペンドルフチューブに各血液試料を500μLずつ分注した。これらのチューブを冷凍庫内に入れ、−20℃で一晩(約18時間)保存した。凍結した血液試料を室温にて解凍した。解凍後、すみやかに血液試料(17μL)に処理液(1mL)及び染色液(20μL)を添加し、41℃にて20秒間混合して、測定試料を調製した。測定試料を、光源として波長405 nmの青色半導体レーザを用いるフローサイトメータXN-30(シスメックス株式会社)により測定した。各血液試料より得られた前方散乱光強度及び蛍光強度に基づいてスキャッタグラムを作成した。比較のため、上記(1)で調製した各血液試料の一部を取り、冷凍せずに上記と同様にして測定を行い、スキャッタグラムを作成した。また、各血液試料の血球数算定(CBC)も行った。
各血液試料のスキャッタグラムを図8に示した。また、ヒト全血、培養マラリア、試験試料1及び2のCBCデータをそれぞれ表1〜4に示した。図8中の数値(/μL)は、スキャッタグラム上のマラリア感染赤血球の出現領域内の粒子数(細胞数)である。本実施例では、この粒子数をマラリア感染赤血球数として計数した。表中、WBCは白血球、RBCは赤血球、Hgbはヘモグロビン、Hctはヘマトクリット、MCVは平均赤血球容積、MCHは平均赤血球ヘモグロビン量、MCHCは平均赤血球ヘモグロビン濃度、PLTは血小板、MI-RBC#はマラリア感染赤血球を指す。
凍結保存液を添加せずに凍結保存した血液試料を顕微鏡で観察することにより、マラリア感染赤血球を検出できるか否かを検討した。
血液試料として、実施例1で調製した、凍結したヒト全血、培養マラリア及び試験試料1を用いた。これらの血液試料を実施例1と同様にして解凍し、塗抹標本を作製した。これらの塗抹標本を常法に従ってギムザ染色して、顕微鏡で観察した。比較のため、凍結保存していないヒト全血から塗抹標本を作製し、これをギムザ染色して顕微鏡で観察した。
染色した各血液試料の写真を図9A〜Cに示す。図中、矢印は、マラリア感染赤血球を示す。図9A(ヒト全血)の左パネルには、正常赤血球が多数存在しており、赤血球に特徴的な窪みのある形状を明確に認識できる。これに対して、図9Aの右パネルには、正常赤血球は全く見当たらず、凍結により溶血したことが分かる。図9B(培養マラリア)及び図9C(試験試料1)でも同様に、正常赤血球(非感染赤血球)は全く見当たらず、赤血球は溶血している。しかし、図9B及びCでは、リングフォームやトロフォゾイトのマラリア原虫を内包する赤血球を見出すことができた。よって、血液試料を実質的に希釈せずに凍結しても、マラリア感染赤血球自体は検出できることがわかった。しかし、非感染赤血球は溶血しているので、マラリア感染赤血球の定量的検出はできない。顕微鏡による定量的検出(感染率の算出)のためには、非感染赤血球の数を計数する必要があるからである。
マラリアの流行地域から検査機関までの血液試料の輸送に長期間かかった場合、輸送の間に保冷材が溶けて、凍結した血液試料が解凍することがあり得る。また、保冷材の追加投入により、解凍した血液試料が再凍結することも十分に考えられる。そこで、血液試料の再凍結及び再解凍によるマラリア感染赤血球及びその測定への影響を検討した。
血液試料として、実施例1で調製した、凍結したヒト全血、培養マラリア及び試験試料1を用いた。これらの血液試料を室温にて解凍した後、再び冷凍庫内に入れて−20℃で凍結させた。再凍結した血液試料を室温にて解凍した。解凍後、実施例1と同様にして、測定試料を調製してフローサイトメータXN-30(シスメックス株式会社)により測定した。各血液試料より得られた前方散乱光強度及び蛍光強度に基づいてスキャッタグラムを作成した。また、再凍結した各血液試料の血球数算定も行った。
実施例1のスキャッタグラムと合わせて、再凍結した各血液試料のスキャッタグラムを図10A〜Cに示した。また、実施例1のデータと合わせて、再凍結した各血液試料のCBCデータをそれぞれ表5〜7に示した。
−20℃での凍結保存は、一般的な冷凍庫の温度を想定している。実際の試料輸送時には、保冷材としてドライアイスや液体窒素を用いることが想定される。そこで、より低い温度で凍結させても、FCMによるマラリア感染赤血球の検出が可能か否かを検討した。比較のため、凍結保存液を添加した血液試料についても検討した。
培養マラリア原虫をヒト全血に添加して、マラリア感染赤血球を約4,000/μLで含む試験試料3を調製した。1.5 mLエッペンドルフチューブに試験試料3を300μLずつ分注した。試験試料3が入っているチューブの一部に、下記の組成の凍結保存液を1.0 mLずつ添加して、試験試料4を調製した。
超純水 72 mL
ソルビトール 4.2 g
塩化ナトリウム 0.9 g
グリセロール 28 mL
得られた溶液を0.22μmフィルターでろ過滅菌した。
チューブを−20℃(冷凍庫)、−80℃(冷凍庫)又は-196℃(液体窒素)にて2日間保存した。凍結した血液試料を室温にて解凍した。試験試料3については、解凍後すみやかに試験試料3(17μL)に実施例1と同じ処理液(1mL)及び染色液(20μL)を添加し、41℃にて20秒間混合して、測定試料を調製した。試験試料4については、解凍後すみやかに遠心分離を行い、上清を1mL除去した(残量は約300μL)。上清を除いた試験試料4から17μL取り、上記と同様にして測定試料を調製した。調製した測定試料を、実施例1と同様にしてフローサイトメータXN-30(シスメックス株式会社)により測定した。各血液試料より得られた前方散乱光強度及び蛍光強度に基づいてスキャッタグラムを作成した。対照として、上記(1)で調製した試験試料3の一部を取り、冷凍せずに上記と同様にして測定を行い、スキャッタグラムを作成した。
各血液試料のスキャッタグラムを図11に示した。図11中の数値(/μL)は、スキャッタグラム上のマラリア感染赤血球の出現領域内の粒子数(細胞数)である。試験試料3(凍結保存液なし)のスキャッタグラムより、−80℃以下で血液試料を凍結保存した場合、感染赤血球の数はほとんど減少しなかった。一方、−20℃で血液試料を凍結保存した場合は、感染赤血球の数がわずかに減少したことから、凍結による細胞の損傷が、−80℃以下での保存に比べて大きいと推測された。試験試料4(凍結保存液あり)については、凍結保存液の添加により試料が希釈されているので、定量的評価には誤差が生じ得る。そのため、試験試料4を定量的に評価することは適切ではないが、−20℃での凍結保存により、マラリア感染赤血球数が顕著に低下していた。
2 測定部
3 解析部
5 試料調製部
6 光学検出部
7 第2検出部
61 フローセル
62 光源部
63 検出部
64 検出部
301 CPU
310 表示部
320 コンピュータプログラム
321 可搬型記録媒体
Claims (16)
- 実質的に凍結保存液を含まない凍結した血液試料を解凍する工程と、
解凍した血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する工程と、
を含む、マラリア原虫に感染した赤血球の検出方法。 - 凍結した血液試料が、−20℃以下で凍結された血液試料である請求項1に記載の方法。
- 凍結した血液試料が、−80℃以下で凍結された血液試料である請求項1に記載の方法。
- マラリア原虫に感染した赤血球を検出する工程において、フローサイトメータを用いて血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 解凍した血液試料、核酸染色用蛍光色素を含む試薬、及び血球の細胞膜を部分的に損傷させる試薬から測定試料を調製する工程をさらに含み、
前記マラリア原虫に感染した赤血球を検出する工程において、調製した測定試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 前記マラリア原虫に感染した赤血球を検出する工程において、
調製した測定試料に光を照射して、散乱光情報及び蛍光情報を取得し、
取得した散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、解凍した血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 検出したマラリア原虫に感染した赤血球に基づいて、血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を計数する工程をさらに含む請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 計数したマラリア原虫に感染した赤血球の数に基づいて、血液試料におけるマラリア原虫に感染した赤血球の濃度を取得する工程をさらに含む請求項7に記載の方法。
- 凍結した血液試料を解凍する工程において、一部の赤血球を溶血させる請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 実質的に希釈されていない凍結した血液試料を解凍する工程と、
解凍した血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する工程と、
を含む、マラリア原虫に感染した赤血球の検出方法。 - 実質的に添加剤を含まない凍結した血液試料又は添加剤として実質的に抗凝固剤のみを含む凍結した血液試料を解凍する工程と、
解凍した血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する工程と、
を含む、マラリア原虫に感染した赤血球の検出方法。 - 解凍した血液試料、核酸染色用蛍光色素を含む試薬、及び血球の細胞膜を部分的に損傷させる試薬から測定試料を調製する工程をさらに含み、
前記マラリア原虫に感染した赤血球を検出する工程において、
調製した測定試料に光を照射して、散乱光情報及び蛍光情報を取得し、
取得した散乱光情報及び蛍光情報に基づいて、解凍した血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する、請求項10又は11に記載の方法。 - 検出したマラリア原虫に感染した赤血球に基づいて、血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を計数する工程をさらに含む請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 実質的に凍結保存液を含まない解凍した血液試料、核酸染色用蛍光色素を含む試薬、及び血球の細胞膜を部分的に損傷させる試薬から測定試料を調製する試料調製部と、
前記試料調製部によって調製された前記測定試料を流すためのフローセルと、
前記フローセル内を流れる前記測定試料に光を照射するための光源部と、
前記測定試料に光が照射されたときに得られる散乱光情報及び蛍光情報を取得する光学検出部と、
前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する解析部と
を備える、血液分析装置。 - 実質的に希釈されていない解凍した血液試料又は添加剤として抗凝固剤のみを含む解凍した血液試料、核酸染色用蛍光色素を含む試薬、及び血球の細胞膜を部分的に損傷させる試薬から測定試料を調製する試料調製部と、
前記試料調製部によって調製された前記測定試料を流すためのフローセルと、
前記フローセル内を流れる前記測定試料に光を照射するための光源部と、
前記測定試料に光が照射されたときに得られる散乱光情報及び蛍光情報を取得する光学検出部と、
前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する解析部と
を備える、血液分析装置。 - 実質的に添加剤を含まない凍結した血液試料又は添加剤として実質的に抗凝固剤のみを含む解凍した血液試料、核酸染色用蛍光色素を含む試薬、及び血球の細胞膜を部分的に損傷させる試薬から測定試料を調製する試料調製部と、
前記試料調製部によって調製された前記測定試料を流すためのフローセルと、
前記フローセル内を流れる前記測定試料に光を照射するための光源部と、
前記測定試料に光が照射されたときに得られる散乱光情報及び蛍光情報を取得する光学検出部と、
前記散乱光情報及び前記蛍光情報に基づいて、前記血液試料中のマラリア原虫に感染した赤血球を検出する解析部と
を備える、血液分析装置。
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