JP2018087170A - 老化遅延剤、老化遅延用飲食品、健康寿命延長剤及び健康寿命延長用飲食品 - Google Patents

Abstract

【課題】レモンポリフェノールの新規な用途を提供すること。【解決手段】エリオシトリンを有効成分とする老化遅延剤。【選択図】なし

Description

本発明は、老化遅延剤、老化遅延用飲食品、健康寿命延長剤及び健康寿命延長用飲食品
に関する。

近年、人々の健康志向から、健康寿命についての関心が高まっている。健康寿命とは、健康上の問題がない状態で日常生活を送れる期間を指す。そして、平成２６年版厚生労働白書（厚生労働省）によれば、健康寿命と平均寿命の差は、日常生活に制限のある「不健康な期間」を意味し、２０１０（平成２２）年で、男性９．１３年、女性１２．６８年であると言われている。

ところで、レモンは料理又は飲料に使用することで毎日無理なく摂取できる果実であり、レモンに含まれるクエン酸には抗疲労効果があることが知られている（非特許文献１）。また、レモンポリフェノールに含まれる成分であるエリオシトリンにはコレステロール低下作用といった健康機能効果が認められている（特許文献１）。

特開２００５−２２５８４７号公報

薬理と治療，２００７年，３５巻，ｐｐ．８０９−８１９

一方、レモンポリフェノールが老化遅延現象に及ぼす影響についてはこれまで知られていなかった。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、レモンポリフェノールの新規な用途を提供することを目的とする。

本発明は、エリオシトリンを有効成分とする老化遅延剤を提供する。

本発明に係る老化遅延剤は、エリオシトリンを有効成分とするため、老化を遅延することができる。

本発明に係る老化遅延剤は、エリオシトリンを含む柑橘類抽出物を有効成分とするものであることが好ましい。これにより、老化遅延作用がより優れたものとなる。

本発明に係る老化遅延剤は、上記柑橘類抽出物がレモン抽出物であることが好ましい。これにより、老化遅延作用がより一層優れたものとなる。

本発明に係る老化遅延剤は、上記レモン抽出物が、レモン果皮のメタノール、エタノール及び水からなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒抽出物であることが好ましい。

本発明はまた、エリオシトリンを有効成分とする老化遅延用飲食品を提供する。

本発明に係る老化遅延用飲食品は、エリオシトリンを有効成分とするため、老化を遅延することができる。

本発明に係る老化遅延用飲食品は、エリオシトリンを含む柑橘類抽出物を有効成分とするものであることが好ましい。これにより、老化遅延作用がより優れたものとなる。

本発明に係る老化遅延用食品は、上記柑橘類抽出物がレモン抽出物であることが好ましい。これにより、老化遅延作用がより一層優れたものとなる。

本発明に係る老化遅延用食品は、上記レモン抽出物が、レモン果皮のメタノール、エタノール及び水からなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒抽出物であることが好ましい。

本発明に係る老化遅延剤は、老化遅延作用を介して健康寿命を延長できるため、健康寿命延長剤と捉えることもできる。

本発明に係る老化遅延用食品は、老化遅延作用を介して健康寿命を延長できるため、健康寿命延長用飲食品と捉えることもできる。

本発明によれば、レモンポリフェノールの新規な用途を提供することができる。

実施例におけるマウスの摂餌量の推移を示すグラフである。 実施例におけるマウスの体重の推移を示すグラフである。 実施例におけるマウスの摂水量の推移を示すグラフである。 実施例におけるマウス生存数の推移を示すグラフである。 実施例における老化度（眼周辺病変）の推移を示すグラフである。 実施例における老化度（毛の密集度）の推移を示すグラフである。 実施例における老化度（抜け毛）の推移を示すグラフである。 実施例における老化度（脊椎の前弯度）の推移を示すグラフである。 実施例におけるマウスの行動量測定結果を示すグラフである。 実施例におけるマウスの腸内フローラ解析結果を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。

〔老化遅延剤〕
本実施形態に係る老化遅延剤は、エリオシトリンを有効成分とする。

本明細書において、「老化遅延」とは、老化（エイジング）を遅延する作用を意味する。そして、「老化遅延」は健康寿命の延長に繋がるものである。

エリオシトリンは、エリオディクティオール−７−ルチノサイド（Ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ−７−ｒｕｔｉｎｏｓｉｄｅ）と称される化合物であり、フラボノイド化合物のうちフラバノン類に属するエリオディクティオール［Ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ（３’，４’，５，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖａｎｏｎｅ、Ｃ_１５Ｈ_１２Ｏ_６）］にルチノース（Ｌ−ラムノシル−Ｄ−グルコース）が結合したフラボノイド配糖体である。

本実施形態に係る老化遅延剤におけるエリオシトリンの含有量は、１０ｗ／ｗ％以上であってよく、１５ｗ／ｗ％以上であってよく、２０ｗ／ｗ％以上であってよい。エリオシトリンの含有量が上記範囲にあることにより、老化遅延作用がより一層顕著に奏されることとなる。また、本実施形態に係る老化遅延剤におけるエリオシトリンの含有量は、１００ｗ／ｗ％以下であってよく、９５ｗ／ｗ％以下であってもよい。

エリオシトリンは、例えば、柑橘類からの抽出、市販品及び化学合成により得ることができる。

本実施形態に係る老化遅延剤は、エリオシトリンを含む柑橘類抽出物を有効成分とするものであることが好ましい。エリオシトリンを含む柑橘類抽出物を有効成分とすることにより、老化遅延作用がより優れたものとなる。

上記柑橘類としては、例えば、レモン、ライム、シークワサー、スダチ、ユズ、ダイダイ、カボスなどの香酸柑橘類、グレープフルーツ、ネーブルオレンジ、バレンシアオレンジ、サワーオレンジ、ハッサク、温州ミカン、イヨカン、ポンカン、あま夏、ブンタン等が挙げられる。上記柑橘類抽出物は、これらの柑橘類のうち、１種単独に由来するものであってもよく、２種以上に由来するものであってもよい。上記柑橘類としては、エリオシトリンの含有量が多いことから、レモン及びライムからなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましく、レモンであることがより好ましい。

抽出に用いられる原料（抽出原料）としては、柑橘類の果実又はその構成成分が使用される。果実の構成成分としては、果皮、果汁、じょうのう膜、さのう及び種子が挙げられる。果実又はその構成成分のうち、エリオシトリンを多量に得ることが容易である点から、抽出原料として、果皮を用いることが好ましい。上記抽出原料は、乾燥、凍結、加工、粉砕、選別等の処理が施されたものであってもよい。

エリオシトリンを含む柑橘類抽出物は、上記抽出原料を抽出溶媒により抽出し、固液分離することで抽出液を得る工程（抽出工程）及び抽出液を合成吸着樹脂等により精製する工程（精製工程）を経て得ることができる。抽出溶媒としては、極性溶媒であることが好ましく、メタノール、エタノール及び水からなる群から選ばれる少なくとも１種の抽出溶媒であることがより好ましい。

上記精製工程は、柑橘類抽出液を、例えば合成吸着樹脂を用いて、精製し、エリオシトリンを含む柑橘類抽出物を得る工程である。柑橘類抽出物は濃縮、乾燥等の処理を行った処理物を用いてもよい。濃縮、乾燥は公知の方法（例えば、減圧濃縮、凍結乾燥）により行うことができる。

上記柑橘類抽出物はレモン抽出物であることが好ましい。これにより、老化遅延作用がより一層優れたものとなる。

上記レモン抽出物は、レモン果皮のメタノール、エタノール及び水からなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒抽出物であることが好ましい。

上記レモン抽出物の成分としては、レモン由来のポリフェノール、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、及びクエン酸等が挙げられる。ここで、レモン由来のポリフェノールとは、レモンに含まれるポリフェノールを意味する。レモン由来のポリフェノールとしては、例えば、エリオシトリン、エリオディクティオール、エリオディクティオール−７−グルコシド、ヘスペリジン、及びナリンジン等が挙げられる。

エリオシトリンは、例えば、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）分析等の公知の方法により分析することができる。

本実施形態に係る老化遅延剤は、更に、エリオシトリン以外のポリフェノール類を含んでいてもよい。上記ポリフェノール類としては、例えば、エリオディクティオール、エリオディクティオール−７−グルコシド、ネオエリオシトリン、ヘスペリジン、ヘスペレチン、ネオヘスペリジン、７−グルコシルヘスペレチン、ナリンジン、ナリンゲニン、ナリルチン等が挙げられる。

本実施形態に係る老化遅延剤は、他の成分として、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等の添加剤を含んでいてもよい。

例えば、賦形剤としては、ラクトース、スクロース、デンプン、デキストリン等が挙げられる。結合剤としては、ポリビニルアルコール、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン等が挙げられる。基剤としては、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール、米糠油、魚油（ＤＨＡ、ＥＰＡ等）、オリーブ油等が挙げられる。溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ８０等が挙げられる。懸濁化剤としては、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｓｐａｎ８０、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。

本実施形態に係る老化遅延剤は、固体（例えば、粉末）、液体（水溶性又は脂溶性の溶液又は懸濁液）、ペースト等のいずれの形状でもよく、また、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、軟膏剤、硬膏剤等のいずれの剤形をとってもよい。また、放出制御製剤の形態をとることもできる。

本実施形態に係る老化遅延剤は、飲食品（飲料、食品）、飲食品添加物、医薬品、医薬部外品、飼料、飼料添加物等の製品の成分として使用することができる。例えば、飲料としては、水、清涼飲料水、果汁飲料、乳飲料、アルコール飲料、ノンアルコール飲料、スポーツドリンク、栄養ドリンク等が挙げられる。食品としては、パン類、麺類、米類、豆腐、乳製品、醤油、味噌、菓子類等が挙げられる。また、健康食品、機能性表示食品、特別用途食品、栄養補助食品、サプリメント又は特定保健用食品等の関与成分として使用することもできる。

本実施形態に係る老化遅延剤からなる、又は老化遅延剤を含有する上記製品は、老化遅延用であってよい。本実施形態に係る老化遅延剤を含有する飲食品は、老化遅延用飲食品として好適に用いることができる。上記製品には、老化を遅延する、寿命を延ばす、健康寿命を延ばす、元気に長生きする、若々しさを維持する、散歩や運動を楽しむ、ハツラツとした毎日を過ごす旨等の表示が付されていてもよい。

本実施形態に係る老化遅延剤を飲食品に添加して使用する場合及び老化遅延用飲食品の有効成分とする場合、老化遅延作用をより効果的に発揮する観点から、飲食品におけるエリオシトリンの含有率が０．００１％以上１００％以下となるように含有することが好ましく、０．０１％以上９５％以下となるように含有することがより好ましい。

本実施形態に係る老化遅延剤を飲食品に添加して使用する場合及び老化遅延用飲食品の有効成分とする場合、老化遅延作用をより効果的に発揮する観点から、飲食品におけるエリオシトリンを含む柑橘類抽出物の含有率が０．００１％以上１００％以下となるように含有することが好ましく、０．０１％以上９５％以下となるように含有することがより好ましい。

本実施形態に係る老化遅延剤は、ヒトに摂取されても、非ヒト哺乳動物に摂取されてもよい。本実施形態に係る老化遅延剤の投与量（摂取量）は、エリオシトリンを基準として、成人１日あたり、体重１ｋｇあたり例えば０．１ｍｇ〜５００ｍｇであってよく、１〜２００ｍｇであってよく、１０〜１００ｍｇであってよい。投与量は、個体の状態、年齢等に応じて適宜決定することができる。

本実施形態に係る老化遅延剤は、経口投与されてもよく、非経口投与されてもよいが、経口投与されることが好ましい。経口投与されることで全身に老化遅延作用が期待できるため、老化遅延作用はより一層優れたものとなる。老化遅延剤は、１日あたりのエリオシトリン投与量が上記範囲内にあれば、１日１回投与されてもよく、１日複数回に分けて投与されてもよい。

本実施形態に係る老化遅延剤は、継続的に摂取されることにより、老化遅延作用がより一層優れたものとなる。本実施形態に係る老化遅延剤は、４週間以上継続して摂取されることがより好ましく、８週間以上継続して摂取されることが更に好ましく、１２週間以上継続して摂取されることがより更に好ましい。

本実施形態に係る老化遅延剤は、全身の老化遅延作用を介して健康寿命を延長できるため、健康寿命延長剤と捉えることができる。そして、上記健康寿命延長剤を含有する飲食品は、健康寿命延長用飲食品として好適に用いることができる。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。

老化促進モデルマウスＳＡＭＰ１（免疫不全、皮膚老化などの外観老化が特徴のモデル）を用いて、エリオシトリン及びエリオシトリンを含む柑橘類抽出物の老化遅延作用について調べた。使用マウス及び飼育条件等については下記のとおりである。

（試験試料の調製）
エリオシトリンを含む柑橘類抽出物は、特開２０１０−５９１０４に記載の方法と同様にして得た。すなわち、レモン果皮を粉砕したものに対して、蒸留水を抽出溶媒として抽出処理を行なった後、固液分離処理を行なうことによりレモン抽出液を得た。そして、このレモン抽出液を合成吸着樹脂に供するとともに、蒸留水にて同合成樹脂の洗浄を行なった。その後、合成樹脂に吸着した吸着成分を３０％エタノール水溶液にて溶出させるとともに、その中で、エリオシトリンが最も多く含まれる画分を回収し、濃縮し、凍結乾燥し、粉末化することにより粉末状のレモン抽出物を得た（以下、「ＬＰＰ」とも称する）。

試験試料の分析結果を表１に示す。表１に示すとおり、試験試料は、ポリフェノールの中でも特に、エリオシトリンを高含有するものである。試験試料は冷凍保存した。飲水ボトルに溶解する必要量を室温に戻し、０．１ｗ／ｖ％になるように水道水で溶解し、０．２２μｍのフィルターでろ過し、試験液（０．１ｗ／ｖ％ＬＰＰ）とした。試験液（０．１ｗ／ｖ％ＬＰＰ）は、滅菌したマウスの飲水ボトルに入れて使用した。

エリオディクティオール−７−グルコシド、エリオシトリン、ヘスペリジン、エリオディクティオール及びクエン酸はＨＰＬＣにより測定した。

（使用マウス及び飼育条件）
ＳＡＭＰ１マウス（老化促進モデル、５週齢、雄）計３６匹を試験群（ＬＰＰ群）計１８匹と対照群計１８匹と、に群分けし、各群１８匹は３ケージに分け、各ケージに６匹ずつ集団飼育を行った。また、老化促進でないモデルであるＳＡＭＲ１マウス（５週齢、雄）を用いた正常群計１８匹についても、上記同様に集団飼育を行った。なお、新しいマウスと同居するストレスをなくすため、集団飼育開始時から死亡するまで各ケージの飼育メンバーをシャッフルせずに維持した。

ＬＰＰ群は、納入時の５週齢から８週齢までは飲料水として水道水を自由に摂取させ、９週齢より飲料水として０．１ｗ／ｖ％ＬＰＰを自由に摂取させた。一方、対照群及び正常群は、飼育期間を通して飲料水として水道水を自由に摂取させた。飲料水は週３回交換を標準とした。各群のマウスは、飼育期間を通して、固形飼料ＣＲＦ−１(日本チャールスリバー製)を自由摂取させた。各群のマウスいずれも、温度２３℃、湿度５５％、明暗サイクル１２時間サイクルの条件で飼育した。床敷は紙製の床敷を使用し、床替えは週1回行った。

〔試験例１：摂餌量、体重、摂水量及び生存数〕
５週齢納入時から１０９週齢までの体重、摂餌量、摂水量及び生存数をそれぞれ図１〜図４に示す。

（摂餌量）
摂餌量は、固形飼料ＣＲＦ−1の減少量をケージ内のマウス数で割り、１匹あたり、１日あたりの摂餌量として、週に１回測定した。若干床に固形飼料から出た粉が落ちるが、糞尿と混ざるためその部分は計量していない。そのため、摂餌量は各群の相対比較で表される。

図１に週齢の進行に伴う各群のマウスの摂餌量の推移を示す。図１に示すとおり、摂餌量は５週齢時から緩やかに減少した。また、ＬＰＰ群、対照群及び正常群の摂餌量は大きな差がなかった。

（体重）
体重は、週に１回、床替え時に計測した。図２に週齢の進行に伴う各群のマウスの体重の推移を示す。

図２に示すとおり、ＬＰＰ群及び対照群の体重は５週齢の納入時から３０週齢ごろまで順調に増加し、その後、死亡するまで緩やかに減少した。一方、正常群は、ＬＰＰ群及び対照群より平均体重が重かった。この点については、ＳＡＭＲ１マウスとＳＡＭＰ１マウスとの間で摂餌量に大きな差がないため、種差による代謝効率の差等に起因するものと考えられた。

（摂水量）
摂水量は、飲水ボトル交換時減少量から算出した。摂水量は、ケージ内のマウス数で割り、１匹あたり、１日あたりの量で表した。図３に週齢の進行に伴う各群のマウスの摂水量の推移を示す。

約９０週齢まで正常群はＬＰＰ群及び対照群より摂水量が少なかった。また、ＬＰＰ群と対照群との間で、約７０週齢まで摂水量に大きな差はなかった。

ＬＰＰ群の１匹あたりの１日平均摂水量は５ｍｌであり、マウスの体重を３５ｇとすると、ＬＰＰとして約１４３ｍｇ／ｋｇ体重を毎日摂取した計算になる。また、エリオシトリンとしては１日あたり約３１ｍｇ／ｋｇ体重の摂取に相当する。

（生存数）

図４に週齢の進行に伴うマウス生存数の推移を示す。

ＬＰＰ群は対照群より生存数は多い時期が長く、１０９週齢時点において生存しているマウス（正常群：３匹、対照群１匹、ＬＰＰ群１匹）以外の各群マウスの平均寿命は、正常群が８４．７週齢であり、対照群が７９．４週齢であり、ＬＰＰ群が８３．１週齢であった。ここで、ＳＡＭＰ１マウスの試験区であるＬＰＰ群と対照群を比較すると、ＬＰＰ群の方が平均寿命は長かった。

すなわち、エリオシトリン及びエリオシトリンを含む柑橘類抽出物が、摂取により寿命を延長する効果を奏することを確認できた。

〔試験例２：老化度〕
老化度は、眼周辺病変、毛の密集度、抜け毛、脊椎の前湾度を指標として評価した。

各判定項目における老化度は、武田らの方法（小児歯科学雑誌 １９９９年，３７巻（４号），ｐｐ．７９８−８０９）に基づき、下記基準にて１か月ごとに評価した。眼周辺病変及び脊椎の前湾度は、評点０〜３の４段階、毛の密集度及び抜け毛は、０〜４の５段階で評価した。評点が高い程、老化度が高いことを示し、評点が低い程、老化度が低いことを示す。
（眼周辺病変）
０：変化なし、１：瞼が腫れている、閉眼、及び／又は目の周囲のみ潰瘍、２：とにかく潰瘍が鼻先まで広がっているもの、３：顔全体に広がったもの
（毛の密集度）
０：毛玉全く無し、すべすべ、１：頭、顔面のあたり、２：１の２倍程度（肩あたりまで）、３：１の３倍程度（背中まで）、４：１の４倍程度（おしりまで以上）
（抜け毛）
０：全くロスがない、１：毛の薄いマウスでは全体の１／２以下、２：毛の薄い部分が全体の１／２以上、３：全く毛のない部分１／４以上１／２以下、４：全く毛のない部分１／２以上
（脊椎の前湾度）
０：ひっかからない、１：優しく撫でるとひっかかるが、強くするとなくなる、２：強く撫でても無くならないが、尻尾を引っ張ると無くなる、３：どうしても無くならない

各判定項目における評価結果をそれぞれ図５〜８に示す。統計解析は、２元配置の分散分析を行った。週齢と群間で交互作用があったため（Ｐ＜０．００１）、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの下位検定を行い各週齢における群間差を調べた。明らかに正常群が、ＬＰＰ群及び対照群より老化度が低かったことから、統計解析結果としてはＬＰＰ群において、対照群より有意に低い老化度のポイントに、図５〜８中でアスタリスクマーク（＊）を付けた。

（眼周辺病変）
図５に週齢の進行に伴う眼周辺（周囲）病変における老化度の平均評点の推移を示す。なお、炎症は、必ずしも両目に出るわけではなく、片目のみに顕著に現れる個体もいたため、図５では左右の目の老化度の合計で示す。

個体によっては目の潰瘍が２５週齢ごろから、腫れたような初期症状として現れた。４９−５１週齢から７７週齢では、眼周辺病変における老化度において、ＬＰＰ群は対照群より有意に低かった。

（毛の密集度）
図６に週齢の進行に伴う毛の密集度における老化度の平均評点の推移を示す。４５−４６週齢以降では、ＬＰＰ群が対照群より毛の密集度における老化度が低かった。また、６５週齢及び６９週齢では、ＬＰＰ群が対照群より毛の密集度における老化度が有意に低かった。

（抜け毛）
図７に週齢の進行に伴う抜け毛における老化度の平均評点の推移を示す。４５−４６週齢以降では、ＬＰＰ群が対照群より抜け毛における老化度が低かった。また、６５週齢では、ＬＰＰ群が対照群より抜け毛における老化度が有意に低かった。

（脊椎の前湾度）
図８に週齢の進行に伴う脊椎の前湾度における老化度の平均評点の推移を示す。５９週齢の時点では、ＬＰＰ群は対照群より有意に脊椎の前湾度における老化度が低かった。

以上のとおり、エリオシトリン及びエリオシトリンを含む柑橘類抽出物は、摂取により全身症状の老化の進行を遅らせる効果を奏することを確認できた。

〔試験例３：行動量の評価〕
（行動量評価方法）
運動能力の指標として、新規物体認知試験（Ｏｂｊｅｃｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｔｅｓｔ：ＯＲＴ）用の装置（Ｂｒａｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｄｅａ Ｉｎｃ., Ｏｓａｋａ,Ｊａｐａｎ）ＯＲＴボックス内の１０分間の行動量を行動解析ソフトＡＮＹ−ｍａｚｅ Ｖｉｄｅｏ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍで計測した。照度は２５ルクスに設定した。１３−１６、２１、３３、４９、６６、７８、８６及び９２週齢の時点で１０分間行動量を計測した。上記行動解析ソフトは、白黒コントラストでマウスの背中をトラッキングするシステムであり、白い床敷きと白いＳＡＭマウスを区別できるように、行動量計測時はＳＡＭマウスの背中に黒いビニールテープを貼り、トラッキングさせた。行動量は、１０分間ＯＲＴボックス内で移動した距離（単位：ｍ）を経時的に計測することにより評価した。

評価結果を図９に示す。図９（ａ）は週齢の進行に伴う行動量測定値の推移を示す。また、図９（ｂ）は６６週齢時点の行動量測定結果を示す。統計解析は、二元配置の分散分析を行い、週齢：Ｐ＜０．００１、群間：Ｐ＜０．００１、週齢と群間の交互作用：Ｐ＜０．００１のため、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの下位検定で各週齢時点での群間差を調べた。図９では正常群と有意差のついたポイントにアスタリスク（＊）を付けた。図９において、^＊＊＊はＰ＜０．００１、^＊＊はＰ＜０．０１、^＊はＰ＜０．０５を示す。

（行動量評価結果）
ＳＡＭＲ１マウス（正常群）は９２週齢でも若い週齢（１３−１６週齢）と行動量に差はなかった。これに対し、ＳＡＭＰ１マウス（ＬＰＰ群及び対照群）は週齢が進むに従い行動量は低下した。老齢期の６６週齢以降ではＬＰＰ群は対照群と比較して行動量が多かった。図９（ｂ）に示すとおり６６週齢時点ではＬＰＰ群は対照群と比較して有意に行動量が多かった。この結果から、ＬＰＰにより老化に伴う運動量の低下が抑制されていることがわかった。

また、試験例１と試験例３の結果を考慮すると、エリオシトリン及びエリオシトリンを含む柑橘類抽出物は、摂取により健康寿命を延長する効果を奏することが確認できた。

〔試験例４：腸内フローラ解析〕
老化により腸内の菌叢は変化し、また、乳酸菌が増加することが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００７年，１０２巻，ｐｐ．１１７８−１１８６、Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．１９９２年，５０巻，ｐｐ．４３８−４４６）。そこで、腸内の菌叢の変化及び乳酸菌の増加を指標として、ＬＰＰの老化遅延作用を調べた。

（腸内フローラの解析方法）
１９週齢（５４匹）、７０週齢（４３匹）の時点で生存していたマウスの便を摂取後−３０℃で冷凍し、糞便サンプルとした。各群の糞便サンプル約５０ｍgに対し９倍量のＤ−ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ社製）を添加し撹拌後、１２，０００ｒｐｍ、５分間遠心した。沈殿物に対し、超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）２００μＬ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）３５０μＬ、φ０．１ｍｍビーズ３００ｍｇ、１０％ＳＤＳ、５０μＬ、ＴＥ飽和フェノール５００μＬを添加し、７０℃で１０分間加熱した後、ｍｉｃｒｏ ｓｍａｓｈ ＭＳ−１００(株式会社トミー精工社製)で４０００ｒｐｍ、６０秒間振動撹拌し、菌体を破砕した。１５０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール溶液を用いた除タンパク質処理およびエタノール沈殿作業を経て糞便由来ＤＮＡを回収した。

得られたＤＮＡをテンプレートとし、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ１およびＶ２領域を増幅させるＰＣＲプライマーセット、及びＰｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃３分間の変性処理の後、９４℃３０秒（変性）→５５℃４５秒（アニーリング）→６８℃６０秒（伸長）のサイクルを２５回繰り返す条件とした。

プライマーセットは、フォーワードプライマー（５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧＮＮ・・・ＮＮＧＴＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＹＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）及びリバースプライマー（５’−ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’）の組み合わせである。フォーワードプライマー配列中の「ＮＮ・・・ＮＮ」は１０〜１２塩基からなる任意のバーコード配列（ＤＮＡシーケンシングシステムで多検体処理する際に各サンプルを識別するための配列）である。各糞便サンプルについて、フォーワードプライマーとリバースプライマーをそれぞれ組み合わせて、計９７サンプルのＰＣＲ産物を得た。

得られたＰＣＲ産物は、それぞれＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で精製を行った後、Ｑｕｂｉｔ２．０（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により濃度を測定した。ＰＣＲ産物が等量となるように混合した後、２％のアガロースを用いた電気泳動を行い、ＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（株式会社日本ジーン社製）によりゲル精製を行った。ゲル精製後のＰＣＲ産物をテンプレートとし、ＤＮＡシーケンシングシステム（Ｉｏｎ ＰＧＭ（ＬｉｇｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））により塩基配列の決定を行った。

得られた塩基配列を菌叢解析ソフトＱＩＩＭＥ（コロラド大学開発）パイプラインを用いて解析を実施した。得られた塩基配列の両末端にフォーワードプライマー及びリバースプライマーの配列を正確に有しているものを選抜した。次いで、ＱＶ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｖａｌｕｅ）値が２０以上の配列を選抜した。ＱＶ値２０以上は塩基配列の精度が９９％以上であることを示す。そして、相同性が９７％以上ある配列同士を一つのＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ Ｕｎｉｔ）としてまとめ、ＯＴＵを用いて菌叢の類似性についてＵｎｉｆｒａｃ解析（塩基配列に基づく細菌群集間の系統学的距離を示す指標）により検討した。また、ＲＤＰ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒにより属の各分類階級で腸内細菌の存在比率を決定した。

（腸内フローラ解析結果）
図１０に１９週齢時及び７０週齢時におけるマウス腸内フローラの解析結果を示す。菌叢の類似度を解析した結果、ＳＡＭＲ１マウスを用いた正常群とＳＡＭＰ１を用いた群（ＬＰＰ群及び対照群）では菌叢が異なっていることが明らかとなった。このため、菌叢におけるＬＰＰ投与の影響を検討する際は、ＬＰＰ群と対照群との間で実施することが妥当と考えられた。１９週齢時において、ＬＰＰ群及び対照群の菌叢は類似していたが。７０週齢時は対照群で菌叢の変化（異なる場所にプロット）が認められた一方、ＬＰＰ群では１９週齢時の菌叢に類似していた。このことは、ＬＰＰ投与により、弱週齢時（１９週齢時）の菌叢が保たれていることを示しており、ＬＰＰの老化遅延効果を裏付けるものと考えられる。

また、属レベルでの菌叢解析の結果、高週齢化時（７０週齢）に乳酸菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属が増加することが確認された。一方、対照群と比較して、ＬＰＰ群は高週齢化時におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の増加が抑制されていたため、ＬＰＰの老化遅延効果を裏付けるものと考えられる。

以上のとおり、エリオシトリン及びエリオシトリンを含む柑橘類抽出物は、摂取により老化の進行を遅らせる効果を奏することが確認できた。

Claims (10)

1. エリオシトリンを有効成分とする老化遅延剤。
2. エリオシトリンを含む柑橘類抽出物を有効成分とする老化遅延剤。
3. 前記柑橘類抽出物がレモン抽出物である、請求項２に記載の老化遅延剤。
4. 前記レモン抽出物が、レモン果皮のメタノール、エタノール及び水からなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒抽出物である、請求項３に記載の老化遅延剤。
5. エリオシトリンを有効成分とする老化遅延用飲食品。
6. エリオシトリンを含む柑橘類抽出物を有効成分とする老化遅延用飲食品。
7. 柑橘類抽出物がレモン抽出物である、請求項６に記載の老化遅延用飲食品。
8. 前記レモン抽出物が、レモン果皮のメタノール、エタノール及び水からなる群から選ばれる少なくとも１種の溶媒抽出物である、請求項７に記載の老化遅延用飲食品。
9. エリオシトリンを有効成分とする健康寿命延長剤。
10. エリオシトリンを有効成分とする健康寿命延長用飲食品。