JP2018082664A - 細胞培養培地、並びにこれを用いた細胞培養装置及び細胞培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
従来、連続培養法においては、培養槽内の細胞密度を高く維持するために、培養槽から有用物質とともに抜き出された液体培地に含まれる細胞を培養槽に返送する技術が知られている(例えば、特許文献1参照)。
本発明の細胞培養培地は、刺激応答性高分子との結合体で構成されていることを主な特徴とする。また、本発明の細胞培養装置及び細胞培養方法は、この細胞培養培地を使用したことを主な特徴とする。
まず、本発明の実施形態に係る細胞培養装置の全体構成について説明した後に、この細胞培養装置に使用される細胞培養培地及び細胞培養方法について説明する。
図1は、本実施形態に係る細胞培養装置1の構成説明図である。
図1に示すように、細胞培養装置1は、培養槽2と、添加培地槽3と、刺激付与機構4と、分離機構5と、リザーバ6と、精製機構7を主に備えて構成されている。
培養槽2は、添加培地槽3から供給される液体培地(培養液)である添加培地12を収容してこの細胞培養培地8にて細胞を培養するものである。培養槽2の材質としては、例えばステンレス、アルミニウムなどの金属、ポリプロピレン、ポリスチレンなどの合成樹脂、ガラスなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。細胞培養培地8については後に詳しく説明する。
培養槽2には、培養槽2の内容物を攪拌する攪拌装置9が配置されている。この攪拌装置9は、培養槽2に収容される内容物を均一になるように混合する。
なお、本実施形態での培養槽2は、外部からの雑菌などの侵入を防ぐために、ゲージ圧で0.01〜0.05MPa程度に加圧されている。
添加培地槽3は、培養槽2と接続され、前記のように液体培地(培養液)である添加培地12を培養槽2に供給する。添加培地12の組成は、例えば後記するように培養槽2から有用物質とともに抜き出された細胞培養培地8のうち、後記する分離機構5によって分離されるろ過液の組成から老廃物などの不要物を除いた組成と同様に設定することができる。
なお、本実施形態での添加培地槽3から培養槽2への添加培地12の供給量は、分離機構5によって分離される前記のろ過液の液量と同量に設定することができる。
添加培地槽3の材質としては、例えばステンレス、アルミニウムなどの金属、ポリプロピレン、ポリスチレンなどの合成樹脂、ガラスなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
刺激付与機構4は、培養槽2に貯留された細胞培養培地8を分離機構5に送り出す配管P1に近接させて配置されている。なお、図1中、符号20aは配管P1に設けられた送液ポンプである。
この刺激付与機構4は、配管P1を通流する細胞培養培地8に所定の刺激を付与するように構成されている。具体的には、細胞培養培地8に含まれる後記する結合体21A(図2参照)の刺激応答性高分子22(図2参照)に刺激を付与する。
この刺激としては、後記する刺激応答性高分子22(図2参照)の種類、例えば温度応答性ポリマ、pH応答性ポリマ、イオン強度応答性ポリマ、光応答性ポリマ、磁界応答性ポリマ、電界応答性ポリマ、力学的刺激応答性ポリマなどに応じて適宜に選択することができる。つまり、刺激としては、例えば温度変化、pH変化、イオン強度変化、光強度変化、磁界強度変化、電界強度変化、力学的刺激変化などが挙げられる。
なお、本発明での細胞培養装置1における刺激付与機構4としては、温度調節機構に限定されるものではなく、前記した刺激応答性高分子22の種類に応じて、例えばpH調節機構、イオン強度調節機構、光強度調節機構、磁界強度調節機構、電界強度調節機構、力学的刺激強度調節機構などを使用することもできる。
分離機構5は、培養槽2から有用物質とともに抜き出された細胞培養培地8(液体培地)のうち、細胞(培養細胞)及び所定の培地成分(後記する結合体21A(図2参照))をろ別し、細胞培養培地8のその他の成分をろ過液として分離する。
このような分離機構5としては、限外ろ過膜を用いた構造体が好ましい。中でも中空糸膜モジュールがより好ましい。
また、分離機構5でろ過液として分離された細胞培養培地8の他の成分は、配管P3を介してリザーバ6に送り出される。なお、図1中、符号20bは、配管P3に設けられた送液ポンプである。
細胞培養培地8の他の成分には、培養槽2の細胞の培養によって産生された有用物質、細胞代謝物(老廃物)、及び結合体21A以外の他の培地成分が含まれている。
有用物質としては、例えば抗体、酵素などのタンパク質、生理活性物質などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。なお、有用物質が細胞内に産生されるものについては、別工程で回収した細胞から分離抽出される。
リザーバ6は、分離機構5によって分離されたろ過液23を一時的に収容する容器で構成されるリザーバ6の材質としては、例えばステンレス、アルミニウムなどの金属、ポリプロピレン、ポリスチレンなどの合成樹脂、ガラスなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
また、本実施形態でのリザーバ6は、外部からの雑菌などの侵入を防ぐために、図示しない圧力調整弁やポンプなどによって、ゲージ圧で0.01〜0.05MPa程度に加圧されている。
本実施形態の精製機構7は、配管P4によってリザーバ6と接続されている。図1中、符号20cは、配管P4に設けられた送液ポンプである。
精製機構7は、リザーバ6から送り出されるろ過液23に含まれる有用物質を精製する。
精製機構7で精製された有用物質は、任意の溶出液で溶出され、図示しない回収容器に回収される。また、精製機構7に用いた洗浄バッファや平衡化バッファは、図示しない廃棄容器に貯留され、所定の廃棄処理を行った後に廃棄される。
次に、本実施形態の細胞培養培地8(図1参照)について説明する。
細胞培養培地8は、前記のように液体培地であり、所定の細胞を培養する際に必要な細胞の生育環境を形成する各種成分(培地成分)の水溶液又は水分散液で構成されている。
本実施形態での培地成分は、後記に詳しく説明するように、細胞培養培地8に含まれる少なくとも1種が、刺激応答性高分子22(図2参照)との結合体21A(図2参照)で構成されている。
このような培地成分は、培養する細胞の種類、培養によって細胞に産生させる有用物質の種類などに応じて選択され使用される。
本実施形態での細胞としては、特に制限はないが、例えば動物細胞、植物細胞、微生物細胞、藻類細胞などの生体細胞が挙げられる。
図2は、本発明の実施形態に係る細胞培養培地8(図1参照)を構成する結合体21Aの模式図である。
図2に示すように、本実施形態での結合体21Aは、刺激応答性高分子22と、細胞増殖因子25(培地成分)とで構成されている。また、この結合体21Aは、後の他の実施形態で説明するように、刺激応答性高分子22と、結合因子24(図5参照)とで構成することもできる。
なお、図2中、符号26は、刺激応答性高分子22に導入される親水性基である。この親水性基については、刺激応答性高分子22及び細胞増殖因子25について説明した後に説明する。
刺激応答性高分子22は、所定の刺激に対する応答変化によって、構造、電位(電荷)、親水・疎水性などの刺激応答性高分子22の性状(物理的性質、化学的性質、電気的性質など)に変化を生じるポリマである。
前記の刺激としては、例えば、温度変化、pH変化、イオン強度変化、光強度変化、磁界強度変化、電界強度変化、力学的刺激変化などが挙げられるがこれに限定されるものではない。
つまり、刺激応答性高分子22の具体例としては、前記のように、温度応答性ポリマ、pH応答性ポリマ、イオン強度応答性ポリマ、光応答性ポリマ、磁界応答性ポリマ、電界応答性ポリマ、力学的刺激応答性ポリマなどが挙げられる。
溶液中における温度応答性ポリマにおいては、コンフォメーション/物理化学的特性の変化はいわゆる臨界溶液温度(CST;Critical Solution Temperature)において起こる。
ポリアミノ酸の具体例としては、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、グルタミン、システイン、アラニン、ロイシン、アルギニンなどのアミノ酸を重合単位とするポリペプチドからなるものが挙げられるがこれらに限定されるものではない。ポリアミノ酸は、単独重合体及び共重合体のいずれであっても構わない。これらのポリアミノ酸は、1種単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。中でも、ポリリジン、ポリグルタミン、及びポリアルギニンのうちの少なくともいずれか1つであることが好ましい。特に好ましいのはデンドリティックポリリジンである。
イオン強度応答性ポリマとしては、例えばアクリルアミドが挙げられる。
磁界応答性ポリマとしては、例えば磁性ナノ粒子包含高分子などが挙げられる。
力学的刺激応答性ポリマとしては、例えばアガロースなどが挙げられる。
以上の光応答性ポリマ、イオン強度応答性ポリマ、磁界応答性ポリマ、及び力学的刺激応答性ポリマは前記の例示したものに限定されるものではない。また、光応答性ポリマ、イオン強度応答性ポリマ、磁界応答性ポリマ、及び力学的刺激応答性ポリマのそれぞれは、単独で又は2種以上を組み合わせて使用することができる。
次に、前記した培地成分の代表例としての細胞増殖因子25(図2参照)について説明する。
細胞培養培地8(図1参照)に培地成分として含まれる細胞増殖因子25は、細胞培養培地8においては前記の刺激応答性高分子22(図2参照)との結合体21A(図2参照)を構成している。
細胞増殖因子25は、細胞培養培地8中で、所定の細胞(標的細胞)と接触した際に、細胞上に存在する受容体と特異的に吸着することで、細胞内シグナル伝達を誘引する。
このような位置に細胞増殖因子25を結合させることによって、細胞増殖因子25は、より確実に結合体21Aの外表面に露出する。これにより細胞増殖因子25は、細胞培養培地8(図1参照)中で、細胞上に存在する受容体と特異的に効率よく吸着することができる。
つまり、次に説明するように刺激応答性高分子22に由来する非特異的な吸着部分の面積を減少させることができるようになる。
次に、親水性基26(図2参照)について説明する。
本実施形態での刺激応答性高分子22(図2参照)においては、細胞に対する刺激応答性高分子22の非特異的な吸着を抑制するために、親水性基26が導入されている。
このような親水性基26としては、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、リン酸基などを含む官能基が挙げられる。
このような位置に親水性基26を導入することによって、親水性基26は、より確実に刺激応答性高分子22の外表面に露出する。これにより親水性基26は、細胞に対する刺激応答性高分子22の非特異的な吸着をより確実に抑制する。
図3は、結合体21Aの具体例を示す構成説明図である。
図3に示すように、この結合体21Aは、刺激応答性高分子22としてのデンドリティックポリリジンに細胞増殖因子25としてのインスリンが化学結合して形成されている。
次に、本実施形態の細胞培養方法の一態様について主に図1及び図2を参照しながら説明するが本発明はこれに限定されるものではない。また、適宜参照する図4(a)は、細胞培養方法を構成する培養工程における図2の結合体21Aの様子を示す模式図である。また、図4(b)は、細胞培養方法を構成する刺激付与工程における図2の結合体21Aの様子を示す模式図である。
まず、この方法では、結合体21A(図2参照)及びその他細胞培養に必要な培地成分を含む水溶液からなる細胞培養培地8(図1参照)を収容した陽圧の培養槽2(図1参照)内にて細胞の培養が開始される。なお、結合体21Aは、前記のように、図2に示す刺激応答性高分子22(本実施形態ではLCST型温度応答性ポリマを想定)と「培地成分の少なくとも1種」に対応する細胞増殖因子25(図2参照)とを結合させたものである。
この培養工程では、LCSTよりも低い温度(例えば、20℃)で細胞培養が行われる。そのため、結合体21Aを構成するLCST型温度応答性ポリマは親水性を示している。
これにより結合体21Aの細胞増殖因子25は、細胞C上の受容体(図示省略)に対して効率よく特異的に結合する。培養槽2(図1参照)内では、細胞Cの増殖が効率よく進行する
培養槽2内では、細胞Cの増殖が進行するにつれて、細胞培養培地8(図1参照)中に有用物質と細胞代謝物(老廃物)とが産生される。
培養開始から所定の日数が経過した後、又は細胞培養培地8(図1参照)中の培養細胞の濃度が所定値以上になった際に、培養槽2(図1参照)から細胞培養培地8が配管P1(図1参照)を通じて分離機構5(図1参照)に圧送される。細胞培養培地8の圧送には、配管P1に設けられた送液ポンプ20a(図1参照)によって行われる。このとき、必要に応じて、分離機構5に設けられた図示しないダイアフラムポンプなどの圧力発生装置を駆動させ、分離機構5内を陰圧に設定すると、培養槽2から分離機構5への細胞培養培地8の移送を迅速に行うことができる。
この工程では、培養槽2(図1参照)から分離機構5(図1参照)に向けて移送される細胞培養培地8(図1参照)に含まれる結合体21A(図2参照)に所定の刺激が付与される。本実施形態では、結合体21Aの刺激応答性高分子22(図2参照)としてのLCST型温度応答性ポリマに対してLCST以上の温度(例えば、37℃)が付与さる。
図4(b)に示すように、熱刺激を受けた結合体21Aの刺激応答性高分子22は、立体構造が崩れて分子サイズが伸長するとともに疎水性を示す。なお、図4(b)中、符号26は親水性基であり、符号25は、細胞増殖因子である。
この工程では、分離機構5(図1参照)に移送された細胞培養培地8(図1参照)のうち、細胞と分子サイズが伸長した結合体21A(図2参照)が分離機構5(図1参照)でろ別される。また、その他培地成分、有用物質、細胞代謝物(老廃物)、及び水性媒体などは、ろ過液として分離機構5を透過する。また、この際、疎水性となった結合体21Aは、親水性のろ過膜を使用することによって、より効率的にろ別される。また、刺激付与工程での刺激によって、例えば正の電荷を有するものとなった結合体21Aは、正の電荷を有するろ過膜を使用することによって、より効率的にろ別される。
この工程では、分離機構5(図1参照)でろ別された細胞と結合体21A(図2参照)とが培養槽2(図1参照)に返送される。この際、細胞と結合体21Aとは、分離機構5に残存する少量の細胞培養培地8(図1参照)に伴って返送される。したがって、培地成分として比較的高価な細胞増殖因子25(図2参照)は、この結合体21Aの返送によって再利用することができる。
また、培養槽2に返送される細胞培養培地8は、細胞と結合体21Aとを高濃度で含むこととなる。したがって、本実施形態の細胞培養装置1(図1参照)を連続的に運転する際に、定期的に培養液返送工程を繰り返すことで、培養槽2内における細胞と結合体21Aの濃度を良好に維持することができる。
分離機構5(図1参照)によってろ過されたろ過液は、分離機構5内に一時的に貯留される。このろ過液には、前記のように有用物質と細胞代謝物(老廃物)などが含まれている。
ろ過液移送工程では、分離機構5内に貯留されたろ過液が所定量になった際に、配管P3(図1参照)を通じて分離機構5からリザーバ6(図1参照)に向けてろ過液が移送される。この移送には、配管P3に設けられた送液ポンプ20b(図1参照)が使用される。この際、リザーバ6に設けられた図示しないポンプや圧力調整弁にてリザーバ6内を陰圧にすることで、リザーバ6へのろ過液の移送を促進することもできる。
この工程では、前記のように、リザーバ6(図1参照)から精製機構7(図1参照)に送り込まれたろ過液23(図1参照)に含まれる有用物質が精製される。リザーバ6から精製機構7へのろ過液23の移送は、リザーバ6でのろ過液23の貯留量が所定量となった際に、配管P4(図1参照)に設けられた送液ポンプ20c(図1参照)によって行われる。また、精製機構7の下流側に設けられた図示しないポンプや圧力調整弁にて精製機構7内を陰圧にすることで、精製機構7へのろ過液23の移送を促進することもできる。また、精製機構7には、ろ過液23から有用物質を溶出させる溶出液を供給することもできる。
この工程では、添加培地槽3(図1参照)の細胞培養培地8(図1参照)が培養槽2(図1参照)に補充される。
前記のように培養槽2から有用物質などとともに細胞培養培地8が分離機構5(図1参照)に向けて抜き出されると、培養槽2内の細胞培養培地8の液面高さが低下する。
また、このような細胞培養方法は、後記する実施例で使用した細胞培養装置1(図8参照)では、制御装置10(図8参照)の制御に基づいて行うことができる。
次に、本実施形態の奏する作用効果について説明する。
本実施形態の細胞培養培地8(図1参照)は、培地成分の少なくとも1種が、刺激応答性高分子との結合体で構成されている。具体的には、例えば図2に示すように、比較的高価な細胞増殖因子25と刺激応答性高分子22との結合体21Aを細胞培養培地8は含んでいる。
このような細胞培養培地8によれば、培養槽2(図1参照)から有用物質とともに細胞培養培地8を抜き出す際に、高価な培地成分(例えば、細胞増殖因子25)を分離機構5によって培養槽2に留めておくことができる。これにより培養槽2に追加する高価な培地成分の投入量が低減される。したがって、本実施形態の細胞培養培地8によれば、細胞培養により得られる有用物質の製造コストを従来よりも低減することができる。
このような細胞培養培地8によれば、刺激応答性高分子22(図2参照)に対する刺激量を定量的に管理し易く、刺激応答性高分子22の応答変化量を容易に制御することができる。つまり、このような細胞培養培地8によれば、高価な培地成分(例えば、細胞増殖因子25(図2参照))を含む結合体21A(図2参照)を、より確実に分離機構5(図1参照)で分離することができる。つまり、より確実に有用物質の製造コストを従来よりも低減することができる。
このような細胞培養培地8によれば、高価な培地成分(例えば、細胞増殖因子25(図2参照))を含む結合体21A(図2参照)を、より確実に分離機構5で分離することができる。つまり、より確実に有用物質の製造コストを従来よりも低減することができる。
また、これらの刺激応答性高分子22は、細胞の受容体に特異的に結合し易い位置に細胞増殖因子25(図2参照)を導入することができる。
このような細胞培養培地8によれば、細胞増殖因子25が高価な培地成分であることから、より確実に有用物質の製造コストを従来よりも低減することができる。
これにより本実施形態では、従来よりも細胞培養装置1(図1参照)及び細胞培養方法の構成要素を簡素化することができる。
これに対して変形例に係る結合体21Bは、図5に示すように、刺激応答性高分子22と、細胞増殖因子25(図2参照)を結合させる結合因子24とで構成されている。
結合体21Bの刺激応答性高分子22は、前記実施形態における刺激応答性高分子22(図2参照)と同様に構成することができる。
結合因子24としては、細胞増殖因子25に対して特異的に結合するものであれば特に制限はなく、例えば、所定の細胞増殖因子25に対して特異的に結合する抗体、酵素、タンパク質、糖鎖、核酸などが挙げられる。中でも抗体が好ましい。
図7に示すように、この結合体21Bは、刺激応答性高分子22としてのデンドリティックポリリジンに結合因子24としての抗体が化学結合して形成されている。このような結合体21Bは、温度刺激を受けると結合因子24としての抗体に細胞増殖因子25としてのトランスフェリンが化学結合する。
(実施例1)
まず、後記する実施例2で説明する細胞培養方法に使用した細胞培養装置について説明する。
図8は、実施例2で使用した細胞培養装置1の構成説明図である。
図8に示すように、細胞培養装置1は、細胞培養培地8を貯留する培養槽2と、培養槽2から抜き出される細胞培養培地8から後記する培養細胞と結合体をろ別する分離機構5と、培養槽2から抜き出された細胞培養培地8に温度刺激を付与する刺激付与機構4と、を備えている。
この分離機構5によって、細胞培養培地8の所定量がろ過工程に付され、又はこのろ過工程が所定時間行われた後、ろ別された培養細胞と後記する結合体とは、分離機構5内に残存するろ過前の少量の細胞培養培地8とともに培養槽2に返送される。この返送操作は、ダイアフラムポンプなどで構成される圧力発生機構31が、分離機構5内の圧力を陽圧に設定することで行われる。
図8中、符号P4は、図示しない添加培地槽から培養槽2に向けて細胞培養培地8を供給する配管であり、符号32は、配管P4に設けられた開閉弁である。符号33は、培養槽2内の液面を検出するセンサであり、符号10は、所定のタイミングで開閉弁32を開閉制御する制御装置である。
本実施例では、以下の細胞培養方法を実施した。
まず、刺激応答性高分子としての熱応答性ポリマと、細胞増殖因子(培地成分)との結合体として第1の結合体及び第2の結合体の2種類を調製した。
まず、刺激応答性高分子22(図2参照)としての温度応答性ポリマであるε−ポリリジンを調製した。ε−ポリリジンは、1−エチル−3−カルボジイミド(WSC)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、及び吉草酸を含む水溶液に、種々の分子量からなるポリリジンを加え、透析膜にて未反応の低分子化合物を除去することによって調製した。調製されたε−ポリリジンの分子量は、50kDa以下であった。このε−ポリリジンには、側鎖としてポリエチレングリコールからなる親水性基を結合させた。
次に、1−エチル−3−カルボジイミド(WSC)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及びインスリンを含む水溶液に、温度応答性ポリマとして調製したε−ポリリジンを加えることによって、ε−ポリリジンとインスリンとが化学的に結合した第1の結合体を得た。
まず、温度応答性ポリマであるε−ポリリジンを第1の結合体を調製したときと同様にして調製した。ただし、透析膜の種類を変更することで、100kDa以上の分子量のε−ポリリジンを得た。
次に、1−エチル−3−カルボジイミド(WSC)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)及び結合因子としての抗トランスフェリン抗体を含む水溶液に、温度応答性ポリマとして調製したε−ポリリジンを加えることによって、ε−ポリリジンと抗トランスフェリン抗体とが化学的に結合した第2の結合体を得た。
培養する細胞として、糖タンパクである組織性プラスミノーゲンアクティベータ(tPA)を産生するチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞;CRL−9606細胞)を用意した(American Type Culture Collection(ATCC)入手)。なお、この細胞は、付着培養細胞を浮遊細胞に順化したものである。
図9は、第一の結合体の細胞に対する作用図である。図10は、第二の結合体の細胞に対する作用図である。
2価の鉄イオンは2価金属トランスポーター1(DMT1)を通ってエンドソームを出て細胞質に移行し、細胞内の様々な機能に使用される不安定鉄プールに入る。鉄イオンは細胞内の様々な目的で使用される。余剰の鉄イオンは鉄貯蔵タンパク質のフェリチンの中に貯蔵される。鉄イオンは鉄排出ポンプであるフェロポーチンによって細胞外に排出される。
これにより第1の結合体及び第2の結合体の刺激応答性高分子22(図2又は図5参照)としての温度応答性ポリマであるε−ポリリジンは、分子サイズが大きくなるとともに、電荷が正に変化する。
培地成分として高価なインスリン及びトランスフェリンは、第1の結合体及び第2の結合体として培養槽8(図8参照)に返送された。
本実施例の細胞培養装置1(図8参照)を1ヶ月連続運転した結果、細胞の生存率を80%以上維持したままで、有用物質としての組織性プラスミノーゲンアクティベータを高効率で回収することができた。また、インスリン及びトランスフェリンの使用量を大幅に削減することができた。
2 培養槽
3 添加培地槽
4 刺激付与機構
5 分離機構
6 リザーバ
7 精製機構
8 細胞培養培地
9 攪拌装置
10 制御装置
11 通気手段
12 添加培地
21A 結合体
21B 結合体
22 刺激応答性高分子
23 ろ過液
24 結合因子
25 細胞増殖因子
26 親水性基
31 圧力発生機構
Claims (10)
- 培地成分の少なくとも1種が、刺激応答性高分子との結合体で構成されていることを特徴とする細胞培養培地。
- 請求項1に記載の細胞培養培地において、
前記刺激応答性高分子は、温度、光、及びpHのうちの少なくともいずれか1つの刺激に対して応答変化を示すことを特徴とする細胞培養培地。 - 請求項2に記載の細胞培養培地において、
前記応答変化は、前記刺激応答性高分子の分子鎖の伸長、及び帯電電荷の変化のうちの少なくとも1つであることを特徴とする細胞培養培地。 - 請求項1に記載の細胞培養培地において、
前記刺激応答性高分子は、ポリリシン、ポリグルタミン、及びポリアルギニンのうちの少なくともいずれか1つであることを特徴とする細胞培養培地。 - 請求項1に記載の細胞培養培地において、
前記結合体は、前記刺激応答性高分子と細胞増殖因子との結合体であることを特徴とする細胞培養培地。 - 請求項5に記載の細胞培養培地において、
前記細胞増殖因子は、上皮成長因子(EGF:Epidermal Growth Factor)、インスリン様成長因子(IGF:Insulin-like Growth Factor)、トランスフォーミング成長因子(TGF:Transforming Growth Factor)、神経成長因子(NGF:Nerve Growth Factor)、脳由来神経栄養因子(BDNF:Brain-Derived Neurotrophic Factor)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF:Vesicular Endothelial Growth Factor)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF:Granulocyte-Colony Stimulating Factor)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF:Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor)、血小板由来成長因子(PDGF:Platelet-Derived Growth Factor)、エリスロポエチン(EPO:ErythroPOietin)、トロンボポエチン(TPO:ThromboPOietin)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF又はFGF2:basic Fibroblast Growth Factor)、肝細胞増殖因子(HGF:Hepatocyte Growth Factor)、トランスフォーミング増殖因子(TGF:Transforming Growth Factor)、骨形成タンパク質(BMP:Bone Morphogenic Protein)、ニューロトロフィン[神経栄養因子](BDNF、NGF又はNT3:Brain-Derived Neurotrophic Factor)、線維芽細胞増殖因子(FGF:Fibroblast Growth Factor)、血清、ウシ血清アルブミン(BSA:Bovine Serum Albumin)、コレステロール、インスリン、及びトランスフェリンから選ばれる少なくとも1つであることを特徴とする細胞培養培地。 - 請求項1に記載の細胞培養培地において、
前記結合体は、前記刺激応答性高分子と、細胞増殖因子を結合させる結合因子との結合体であることを特徴とする細胞培養培地。 - 請求項7に記載の細胞培養培地において、
前記結合因子は、前記細胞増殖因子の抗体、酵素、タンパク質、糖鎖、及び核酸のいずれか1つであることを特徴とする細胞培養培地。 - 培地成分の少なくとも1種が、刺激応答性高分子との結合体で構成されている細胞培養培地を貯留して細胞を培養する培養槽と、
前記結合体に所定の刺激を付与して前記刺激応答性高分子に所定の応答変化を生じさせる刺激付与機構と、
前記応答変化によって前記刺激応答性高分子に現れる性状に基づいて前記結合体を前記細胞培養培地に留めて前記結合体を除く他の前記培地成分のうちの少なくとも一部を前記細胞培養培地から分離する分離機構と、
を備えることを特徴とする細胞培養装置。 - 培地成分の少なくとも1種が、刺激応答性高分子との結合体で構成されている細胞培養培地で細胞を培養する培養工程と、
前記結合体に所定の刺激を付与して前記刺激応答性高分子に所定の応答変化を生じさせる刺激付与工程と、
前記応答変化によって前記刺激応答性高分子に現れる性状に基づいて前記結合体を前記細胞培養培地に留めて前記結合体を除く他の前記培地成分のうちの少なくとも一部を前記細胞培養培地から分離する分離工程と、
を有することを特徴とする細胞培養方法。
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