JP2018076338A - 抗菌薬耐性菌に対処するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の任意の態様又は実施形態の侵入促進剤は、一般に、ポリマーであり、このポリマーは、例えば以下の式1a又は式1bに係る、線状及び/又は分枝ポリモノグアナイド/ポリグアニジン、ポリビグアナイド、それらの類似体又は誘導体を含む。例を下の表1及び2に示す。
「n」は、ポリマー中の繰り返し単位の数を指し、nは2から1000まで、例えば、2又は5から10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800又は900までとすることができ、
G1及びG2は、独立に、ビグアナイド又はグアニジンを含むカチオン基であり、
L1及びL2は、グアナイドの窒素原子に直接結合する。したがって、ビグアナイド又はグアニジン基は、ポリマー骨格に不可欠である。ビグアナイド又はグアニジン基は、式1aの側鎖部分ではない。
抗菌薬耐性を阻害する薬剤は、抗菌薬の作用に対して抗菌薬耐性菌を感作させる任意の薬剤とすることができる。例えば、阻害剤は、抗菌薬又はあるクラスの抗菌薬に対する耐性の原因である、細菌内の分子又は細菌によって生成される分子に結合し、それを不活性化することができる。細菌中の標的分子は、例えば、細菌細胞の内部、細胞周囲腔中、又は細菌細胞壁の内部に存在し得る。好ましくは、抗菌薬耐性を阻害する薬剤は、ペプチド、核酸、他のポリマー又は小分子である。薬剤は酵素阻害剤とすることができる。不確かにならないように、酵素阻害剤は、ペプチド又は核酸とすることができる。一般に、酵素阻害剤は、分子量40,000ダルトン未満の分子などの分子である。
組換えPBP2aの産生、及びPBP2aを阻害するのに適切な結合剤の選択
PBP2a産生
切断型mecA遺伝子のクローニング。MRSA(ATCC3300)の染色体DNAをPCR用テンプレートとして使用した。国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)から公表されたmecA配列に基づいてプライマーを設計した。プライマーは、順方向プライマー5_−PBP2a−EcoRI,BamHI(5_−GGATCCGAATTCCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCATGGCTTCAAAAGATAAA−3_)(配列番号7)及び逆方向プライマー3_−PBP2a−XhoI,HindIII(5_−AAGCTTCTCGAGTTATTCATCTATATCGTA−3_)(配列番号8)であった。N末端の最初の23アミノ酸が欠失するようにプライマーを設計した。ゲル精製キット(Invitrogen)を使用して、製造者の手順に従って、生成したDNA断片(_2kb)をゲル精製し、次いで抽出した。遺伝子をT4リガーゼを用いてpGEM−Tベクター(Promega、Madison、WI)に連結し、コンピテントなXL1−Blue細胞に転換した。pGEM−Tベクター中のmecA遺伝子の配列をT7及びSP6プロモータープライマーを用いて決定した。検証済み挿入DNAとpGEX−4T1ベクター(GE Healthcare、Piscataway、NJ)の両方を同じ制限酵素(EcoRI及びXhoI)で消化し、次いで連結して、発現ベクターpGEX−PBP2aを得た。
材料
・EZ−Link(登録商標)(Thermo Scientific Pierce、カタログ番号21441)
・ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma−Aldrich、カタログ番号D8418)
・リン酸緩衝食塩水(PBS)(137mM NaCl;10mMリン酸;2.7mM KCl;pH7.4)
・PBST(PBS+0.1%Tween−20)
・スピン脱塩カラム、7K MWCO(Thermo Scientific Pierce、カタログ番号89882/89883)
・Nunc−Immuno(商標)MaxiSorp(商標)ストリップ(Thermo Scientific、カタログ番号469949)
・10xブロッキング緩衝剤(Sigma、カタログ番号B6429)
・高感度ストレプトアビジン−HRP(Thermo Scientific Pierce、カタログ番号21130)
・TMB(Seramun、カタログ番号S−001−TMB)
・ER2738 E.コリ細胞
・2TY培地(1リットル当たり:酵母エキス10g;トリプトン16g;NaCl5g)
・テトラサイクリン塩酸塩(70%エタノール中12mg/ml)
・ストレプトアビジン被覆(HBC)8ウェルストリップ(Thermo Scientific Pierce、カタログ番号15501)
・0.2Mグリシン、pH2.2
・1M Tris−HCl、pH9.1
・トリエチルアミン(Sigma−Aldrich、カタログ番号T0886)
・1M Tris−HCl、pH7
・100μg/mlカルベニシリンを含むLB寒天板
・カルベニシリン(500x原液:ddH2O中50mg/ml)
・M13K07ヘルパーファージ
・カナマイシン(500x原液:ddH2O中25mg/ml)
・PEG−NaCl沈殿溶液(20%(w/v)PEG8000、2.5M NaCl)
・TE(10mM Tris;1mM EDTA;pH8.0)
・グリセロール(Sigma−Aldrich、カタログ番号G6279)
・エッペンドルフ管(Eppendorf、カタログ番号0030 108.116)
・ストレプトアビジンビーズ(Dynabeads(登録商標)MyOne(商標)ストレプトアビジンT1、10mg/ml)(Invitrogenカタログ番号656.01/656.02)
・深いウェル96プレート(Thermo Scientific、カタログ番号95040450)
・KingFisher(200ul)96プレート(Thermo Scientific、カタログ番号97002540)
・ニュートラアビジン被覆(HBC)8ウェルストリップ(Thermo Scientific Pierce、カタログ番号15508)
・ジチオトレイトール(DTT)
パニング1回目
ステップ1:標的タンパク質をビオチンに架橋
1.EZ−Link(登録商標)NHS−SS−ビオチン(Thermo Scientific Pierce、カタログ番号21441)のバイアルを開口前に室温に平衡にする。使用直前に、DMSO中のNHS−SS−ビオチンの5mg/ml溶液(例えば、DMSO100μl中NHS−SS−ビオチン0.5mg)を調製する。
2.適切な体積のNHS−SS−ビオチン溶液をタンパク質に添加する。例えば、12KDaタンパク質の場合、1mg/ml溶液5μlを、PBS(又は疎水性タンパク質の場合はPBST)総体積50μl中のNHS−SS−ビオチン0.4μlに添加する。添加するタンパク質の体積をその分子量(MW)に応じて調節する。すなわち、MWが低いタンパク質を少なく、MWが高いタンパク質を多く添加する。
3.室温で1時間インキュベートする。
4.残留ビオチンをZebaスピン脱塩カラム7K MWCO(Thermo Scientific Pierce、カタログ番号89882/89883)を用いて製造者の指示に従って脱塩、除去する。
5.等分し、4℃で貯蔵。
1.PBS50μl/ウェルをNunc−Immuno(商標)MaxiSorp(商標)ストリップ(Thermo Scientific、カタログ番号469949)に分注する。
2.ビオチン化タンパク質1、0.1及び0.01μlを添加する。すなわち、0.1μlの場合1:10希釈物1μlを添加し、0.01μlの場合1:100希釈物1μlを添加する。
3.4℃で終夜インキュベートする。
4.プレート洗浄機によりPBST300μl/ウェルで3回洗浄する。
5.10xブロッキング緩衝剤(Sigma、カタログ番号B6429)250μl/ウェルを分注し、37℃で3時間インキュベートする。
6.プレート洗浄機によりPBST300μl/ウェルで3回洗浄する。
7.高感度ストレプトアビジン−HRP(Thermo Scientific Pierce、カタログ番号21130)を2xブロッキング緩衝剤(PBSTで希釈されたSigma10xブロッキング緩衝剤)で1:1000希釈し、50μl/ウェルを分注する。
8.振動しているプラットフォーム振とう機(Heidolph VIBRAMAX100;速度設定3)上で室温で1時間インキュベートする。
9.プレート洗浄機によりPBST300μl/ウェルで6回洗浄する。
10.TMB50μl/ウェル(SeramunBlau(登録商標)fast TMB/基質溶液、Seramun、カタログ番号S−001−TMB)を分注し、展開する。(プレートを展開する時間を記録する。)
11.620nmにおける吸光度を測定する。
1.ER2738E.コリ細胞のコロニーを12μg/mlテトラサイクリンを含む2TY培地5mlに採取し、軌道恒温器(orbital incubator)中で37℃、225rpmで終夜インキュベートする。
2.2xブロッキング緩衝剤300μl/ウェルをストレプトアビジン被覆(HBC)8ウェルストリップ(Thermo Scientific Pierce、カタログ番号15501)に分注し、(撹拌せずに)37℃で終夜インキュベートする。各標的タンパク質に対して合計4ウェルを準備する(ファージをプレパニング(pre−panning)するために3ウェル、及び標的タンパク質と結合し、ファージを用いてパニングするために1ウェル)。
3.プレート洗浄機によりPBST300μl/ウェルで3回洗浄する。
4.2xブロッキング緩衝剤100μl/ウェルを分注し、ビオチン化タンパク質2.5μlをウェルに添加して、パニングに使用する。
5.振動しているプラットフォーム振とう機(Heidolph VIBRAMAX100;速度設定3)機上で室温で2時間インキュベートする。その間に、ファージのプレパニングを開始する。
6.緩衝剤を第1のプレパニングウェルから除去し、2xブロッキング緩衝剤100μlを添加する。これに、最適な骨格ペプチドを発現する好ましいペプチドディスプレイファージライブラリー、すなわちDARPIn、アフィマー、線状5μlを添加する。振動しているプラットフォーム振とう機(Heidolph VIBRAMAX100;速度設定3)上で40分間混合し、インキュベートする。
7.第2のプレパニングウェルから緩衝剤を除去し、ファージを含む緩衝剤を第1のプレパニングウェルから第2のプレパニングウェルに移す。40分間インキュベートし、次いで第3のプレパニングウェルに対して繰り返す。
8.標的タンパク質を含むウェルを多チャネルピペットを用いてPBST200μl/ウェルで6回洗浄する。
9.ファージをプレパニングウェルから標的タンパク質を含むウェルに移し、振動しているプラットフォーム振とう機(Heidolph VIBRAMAX100;速度設定3)上で室温で2時間インキュベートする。
10.その間に、終夜培養物を約1:15希釈し、37℃、225rpmで約1時間インキュベートして0.6のA600を与えることによって、ER2738細胞の新しい培養物を準備する。
11.パニングウェルをプレート洗浄機によりPBST300μl/ウェルで6回洗浄する。
12.0.2Mグリシン、pH2.2を100μl添加し、室温で10分間インキュベートして、ファージを溶出させる。
13.1M Tris−HCl、pH9.1を15μl添加して中和する。混合し、50mlファルコンチューブ中の8ml一定分量のER2738細胞にすぐに添加する。
14.トリエチルアミン(Sigma−Aldrich、カタログ番号T0886)14μlをPBS986μlで希釈する。
15.希釈トリエチルアミン100μlを添加し、室温で6分間インキュベートして、残留ファージを溶出させる。
16.1M Tris−HCl、pH7を50μl添加して中和する。混合し、ER2738細胞にすぐに添加する。
17.細胞を37℃で1時間インキュベートする(振とうなし、又は低速振とう、最高90rpm)。
18.ファージ感染E.コリK12ER2738細胞1μlを、100μg/mlカルベニシリンを含むLB寒天板に蒔き、37℃で終夜インキュベートする。
19.残りの細胞を3,000xgで5分間遠心分離して、より小さい体積で再懸濁させ、100μg/mlカルベニシリンを含むLB寒天板上に蒔き、室温で終夜インキュベートする。
20.翌日、細胞1μlを含むプレート上のコロニーを数え、8,000を掛けて、細胞8ml当たりの総数を求める(0.5〜2×106である必要がある)。
21.残りのプレートから細胞をこすり落す。これをするために、2TY培地5ml+100μg/mlカルベニシリンをプレートに添加し、使い捨てプラスチック延展器を用いてこすり落し、50mlファルコンチューブに移し、混合する。さらに2TY培地2ml+100μg/mlカルベニシリンを添加して、残留細胞をこすり落す。
22.1:10希釈物の600nmにおける吸光度を測定して、A600=0.2において培養物25mlに必要な希釈を決定する。
23.細胞を125mlガラスフラスコ中で2TY培地+100μg/mlカルベニシリンで希釈する。
24.37℃、230rpmで1時間インキュベートする。
25.M13K07ヘルパーファージ(力価約1014/ml)1μlを添加し、37℃、90rpmで30分間インキュベートする。
26.カナマイシン(25mg/ml)50μlを添加し、軌道恒温器中で25℃、170rpmで終夜インキュベートする。
27.ファージ感染培養物を50mlファルコンチューブに移し、3,500xgで10分間遠心分離する。
28.2回目のパニングのためにファージ含有上清500μlを取り出す。
29.残りの上清を新しい管に移し、PEG−NaCl沈殿溶液(20%(w/v)PEG8000、2.5M NaCl)6mlを添加する。4℃で2時間インキュベートする。
30.5,000xgで20分間遠心分離して、ファージをペレット化する。
31.上清を捨て(管をティッシュペーパーで拭き、上清すべてを除去する)、ペレットをTE1mlに再懸濁させる。
32.微量遠心管に移し、16,000xgで10分間遠心分離する。上清はファージを含む。4℃で貯蔵する。または、長期貯蔵のために、40〜50%グリセロールで希釈し、−80℃で貯蔵する。
1.ER2738E.コリ細胞のコロニーを12μg/mlテトラサイクリンを含む2TY培地5mlに採取し、37℃、225rpmで終夜インキュベートする。
2.標的タンパク質1種当たり20μlのストレプトアビジンビーズ(Dynabeads(登録商標)MyOne(商標)ストレプトアビジンT1、10mg/ml、Invitrogenカタログ番号656.01/656.02)を磁石を用いて2xブロッキング緩衝剤500μlで3回洗浄する。
3.ストレプトアビジンビーズ20μl当たり100μlの2xブロッキング緩衝剤に再懸濁させ(又は200μl最小体積)、Stuart SB2固定速度回転装置(20rpm)上で室温で終夜インキュベートする。
4.1,000xgで1分間遠心分離し、ストレプトアビジンビーズを磁石で固定し、ブロッキング緩衝剤を除去する。
5.新しい2xブロッキング緩衝剤で置換し、ストレプトアビジンビーズ20μl当たり100μlに再懸濁させる。
6.ファージのプレパニング:1回目のパニングからのファージ含有上清125μlを2xブロッキング緩衝剤125μlと混合し、あらかじめブロックされたストレプトアビジンビーズ50μlを添加する。エッペンドルフタンパク質LoBind管(Eppendorf、カタログ番号0030 108.116)を使用する。回転装置上で室温で4時間インキュベートする。
7.同時に、標的をストレプトアビジンビーズに結合させる:ビオチン化標的タンパク質2.5μlを2xブロッキング緩衝剤200μl及びあらかじめブロックされたストレプトアビジンビーズ50μlに添加する。Stuart SB2回転装置上で室温で4時間インキュベートする。
8.その間に、プレートをKingFisher Flex(Thermo Scientific)用にあらかじめブロックする:
a.深いウェル96プレート(Thermo Scientific、カタログ番号95040450)の十分なウェルを2xブロッキング緩衝剤1ml/ウェルであらかじめブロックする。これをパニングに使用する。
b.2個のKingFisher(200ul)96プレート(Thermo Scientific、カタログ番号97002540)の十分なウェルを2xブロッキング緩衝剤300μl/ウェルであらかじめブロックする。一方をグリシンによる溶出に使用し、他方をトリエチルアミンによる溶出に使用する。37℃で4時間ブロックする。
9.2xブロッキング緩衝剤950μl/ウェルを用いて4枚の深いウェル96プレート中に十分なウェルを用意する。これらをKingFisherプロトコルの洗浄ステップに使用する。あらかじめブロックされた溶出プレートから緩衝剤を除去する。100μl/ウェルの0.2Mグリシン、pH2.2を1枚のプレートに分注する。トリエチルアミン14μlをPBS986μlで希釈し、100μl/ウェルをその他のプレートに分注する。あらかじめブロックされた深いウェル96プレートから緩衝剤を除去する。
10.プレパニングされたファージ及びビオチン化標的を含む管を1,000xgで1分間遠心分離し、磁石の上に置く。
11.ビオチン化標的タンパク質を含むビーズを2xブロッキング緩衝剤500μlで3回洗浄する。
12.ファージを含む上清をビオチン化標的タンパク質を含むビーズに移し、再懸濁させる。あらかじめブロックされた深いウェル96プレートに移す。
13.その間に、終夜培養物を約1:15希釈し、37℃、225rpmで約1時間インキュベートして、ER2738細胞の新しい培養物を準備する。
14.プロトコルは、グリシン中で10分間溶出する。終了後すぐに1M Tris−HCl、pH9.1を15μl添加して中和する。混合し、8ml一定分量のER2738細胞に添加する。
15.次いで、プロトコルは、トリエチルアミン中で6分間溶出する。終了後すぐに1M Tris−HCl、pH7を50μl添加して中和する。混合し、ER2738細胞に添加する。
16.細胞を37℃で1時間インキュベートする(振とうなし、又は低速振とう、最高90rpm)。パニング1回目のステップ17〜31に記述したようにファージを蒔き、調製する。
1.ER2738E.コリ細胞のコロニーを12μg/mlテトラサイクリンを含む2TY培地5mlに採取し、37℃、225rpmで終夜インキュベートする。
2.2xブロッキング緩衝剤300μl/ウェルをニュートラアビジン被覆(HBC)8ウェルストリップ(Thermo Scientific Pierce、カタログ番号15508)に分注し、37℃で終夜インキュベートする。各標的タンパク質に対して合計6ウェルを準備する(ファージをプレパニングするために4ウェル、標的タンパク質に対してパニングするために1ウェル、及びブランクウェルに対してパニングするための負の対照)。
3.プレート洗浄機によりPBST300μl/ウェルで3回洗浄する。
4.2xブロッキング緩衝剤100μl/ウェルを、パニングに使用するウェルに分注する(標的タンパク質に対してパニングするために1ウェル、及びブランクウェルに対してパニングするための負の対照)。ビオチン化タンパク質2.5μlを、標的タンパク質に対するパニングに用いるウェルに添加する。振動しているプラットフォーム振とう機(Heidolph VIBRAMAX100;速度設定3)上で室温で4時間インキュベートする。
5.同時に、ファージのプレパニングを開始:10xブロッキング緩衝剤20μlを第1のプレパニングウェルに分注し、2回目のパニングからのファージ含有上清200μlを添加する。振動しているプラットフォーム振とう機(Heidolph VIBRAMAX100;速度設定3)上で室温で1時間インキュベートする。残りのプレパニングウェルに2xブロッキング緩衝剤200μl/ウェルを充填する。
6.第2のプレパニングウェルから緩衝剤を除去し、第1のプレパニングウェルの内容物を第2のプレパニングウェルに移す。さらに1時間インキュベートし、第3及び第4のプレパニングウェルに対して繰り返す。
7.その間に、終夜培養物を約1:15希釈し、37℃、225rpmで約1時間インキュベートして、ER2738細胞の新しい培養物を準備する。
8.標的タンパク質を含むウェル及び負の対照ブランクウェルをPBSTで3回(手で)洗浄する。
9.プレパニングウェルからのファージ100μl/ウェルを、標的タンパク質を含むウェル及び負の対照ブランクウェルに移す。振動しているプラットフォーム振とう機(Heidolph VIBRAMAX100;最高速度設定3)上で室温で30〜45分間インキュベートする。
10.プレート洗浄機によりPBST300μl/ウェルで6回洗浄する。
11.100mM DTT100μlを添加し、室温で20分間インキュベートして、ファージを溶出させる。
12.8ml一定分量のER2738細胞に添加する。
13.37℃で1時間インキュベートする(振とうなし、又は低速振とう、最高90rpm)。パニング1回目のステップ17〜31に記述したようにファージを蒔き、調製する。
MecA阻害ペプチド及びPHMBを用いたオキサシリンに対するMRSAの感作
mecAは、タンパク質ペニシリン結合タンパク質2A(PBP2A)をコードし、メチシリン、ペニシリン、オキサシリン、エリスロマイシン、テトラサイクリンなどのβラクタム抗菌薬に対する菌耐性の原因である。ペニシリン結合タンパク質(PBP)は、細菌細胞壁合成に不可欠である。PBPは、架橋ペプチドグリカンを脂質中間体から合成し、ペプチドグリカン前駆体からのD−アラニンの除去を媒介するプロセスに関与する幾つかの反応を触媒することが示された。PBPは、ペプチドグリカンを形成するモジュール部分に化学構造が類似しているので、βラクタム抗菌薬に結合する。PBPがペニシリンに結合すると、βラクタムアミド結合が開裂して、PBP活性部位において触媒作用性セリン残基と共有結合を形成する。これは不可逆反応であり、酵素を不活性化する。βラクタム抗菌薬に対する耐性は、上で説明したように、PBPの過剰産生、及びβラクタム抗菌薬に対する親和性が低いPBPの形成によって生じる。PBP2Aはβラクタム抗菌薬に対して低親和性である。したがって、mecAの発現は、βラクタム抗菌薬の有効性を低下させ、細菌が細胞壁成分を妨げられなくすることができる。
薬物及びペプチドの最小阻止濃度(MIC)
EMRSA−15の抗菌薬感受性試験を、ブロスミクロブロス希釈のNCCLS指針に修正を加えて実施した。EMRSA−15を、−70℃グリセロール原液から、5%ウマ血液(Oxoid)及び6μg/mlオキサシリン(Sigma)を補充したコロンビア基礎寒天(Oxoid)に画線し、33℃で18〜20時間インキュベートした。2から4個の細菌コロニーを、6μg/mlオキサシリン(Sigma)を補充した3mlミュラーヒントンブロス(MHB:Mueller Hinton broth、Oxoid)に接種し、180rpmで振とうしながら33℃で18〜20時間インキュベートした。培養物をMHBを用いてOD6250.08〜0.1(0.5Mcfarland又は1〜2×108cfu/mlに相当)に調節し、更に1/50希釈して、最終濃度5×105cfu/ウェルにした。オキサシリン、PHMB又はペプチドに対する感受性を、オキサシリン(MHB中0〜1024μg/ml)、PHMB(1xPBS中0〜512μg/ml)又はペプチド(1xPBS中0〜512μg/ml)を培養物75μlに最終体積150μl/ウェルで添加することによって試験した。プレートを33℃で24時間インキュベートし、増殖を目視で点数化した。
PHMBとペプチド(MecA3136、MecA3140)の相乗作用を2倍希釈物の標準チェッカーボード法によって試験した。PHMBとペプチドを適切な濃度で混合して、96ウェルプレートの各ウェルの最終体積を30μlにし、培養物及びオキサシリンを添加して最終体積を150μlにする前に混合物を20〜22℃で30分間インキュベートした。プレートをインキュベートし、上述したように点数化した。増殖せず、PHMBとペプチドの最低の組合せを含むウェルのFIC指数を以下のように計算した:(A/MICA)+(B/MICB)=FICA+FICB=FIC指数。ここで、Aは、組合せのPHMBの濃度であり、MICAは、PHMB単独のMICであり、Bは組合せのペプチドの濃度であり、MICBはペプチド単独のMICである。オキサシリンを含まない対照プレート、及びオキサシリン(oxcaillin)が増加するがPHMBもペプチドも含まない培養物の対照ウェルを含んだ。
・PHMB及びMecAペプチドのMICは、オキサシリンの存在下で変化しなかった。
・PHMBについては、MecAペプチドの送達に対して1/2MIC(例えば、0.25μg/ml)で試験することになる(オキサシリン感作アッセイ)。
・MecAペプチドは、MRSAの増殖を阻害しない。増殖阻害は、試験濃度よりも高い濃度で起こり得るが、これについては試験しなかった。
・MecAペプチドはMICを持たないので、PHMBを用いて任意の濃度で試験することになる(オキサシリン感作アッセイ)。
・PHMB単独では、オキサシリンを増強しなかった(MICの低下なし)
・ペプチド単独では、オキサシリンを増強しなかった(MICの低下なし)
・PHMBは、オキサシリンに対するMRSA−15のMICを2倍にしたが、これは有意とはみなされず、予想外の結果である。
・しかし、これは、ある濃度において、PHMBがオキサシリンをナノ粒子中に捕捉し、細菌がそれらを利用できないようにする、又はPHMBがmecAの発現を上方制御し、オキサシリンに対する耐性を増加させることを示しているのかもしれない。
・PHMBがオキサシリンと一緒にナノ粒子を形成し、もしかするとそれを細菌細胞に送達している場合、ペプチド、PHMB及びオキサシリンを含む3次元アッセイは、明瞭な結果を示さないかもしれない。
−MecAペプチドは増殖を阻害しないので、FIC指数の計算では、ペプチドのMICを、以前に試験して増殖抑制作用を示さなかった最大濃度である22μM(又は512μg/ml)に設定した。
・ある濃度におけるPHMB及びMecA3136は、オキサシリンのMICを256μg/mlから≦16μg/mlに増強した(MICの1/16の減少、図1も参照されたい)。
・FIC<0.5は、相乗作用を示す。PHMBとMecAペプチドは相乗作用を示さなかったが、オキサシリン濃度の増加に伴うFICの減少は、PHMB及びMecA3136を使用したときの感作、並びにMecAに対するペプチドの特異性を示す。
・これらの結果は、MecA3136が2つのうちでより有望であり得ることを示唆している。
Claims (32)
- 細菌侵入促進剤と抗菌薬耐性を阻害する薬剤とを含む組成物。
- 前記組成物がさらに抗菌薬を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記侵入促進剤が、以下の式1a又は式1bに係る線状及び/又は分枝又は環式ポリモノグアナイド/ポリグアニジン、ポリビグアナイド、それらの類似体又は誘導体を含み、又はそれらからなり、
「n」は、ポリマー中の繰り返し単位の数を指し、nは2から1000まで、例えば、2又は5から10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800又は900までとすることができ、
G1及びG2は、独立に、ビグアナイド又はグアニジンを含むカチオン基であり、
L1及びL2は、前記グアナイドの窒素原子に直接結合し、
L1及びL2は、前記ポリマーにおけるG1カチオン基とG2カチオン基の連結基であり、独立に、C1〜C140炭素原子を含む脂肪族基、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、C4、C5、C6、C7、C8、C9若しくはC10;C1〜C10、〜C20、〜C30、〜C40、〜C50 〜C60、〜C70、〜C80、〜C90、〜C100、〜C110、〜C120、〜C130若しくは〜C140、アルキルなどのアルキル基、又はC1〜C140(例えば、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9若しくはC10;C1〜C10、〜C20、〜C30、〜C40、〜C50 〜C60、〜C70、〜C80、〜C90、〜C100、〜C110、〜C120、〜C130若しくは〜C140)、脂環式、複素環式、芳香族、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル若しくはオキシアルキレン基、又は場合によっては1個以上の、好ましくは1個の、酸素、窒素若しくは硫黄原子、官能基又は飽和若しくは不飽和環状部分によって分断された、ポリアルキレン基であり、
N及びG3は任意に選択できる末端基であり、
Xは存在してもしなくてもよく、
L3、L4及びXは、前記ポリマーにおけるG4カチオン基とG5カチオン基の連結基であり、独立に、C1〜C140炭素原子を含む脂肪族基、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、C4、C5、C6、C7、C8、C9若しくはC10;C1〜C10、〜C20、〜C30、〜C40、〜C50 〜C60、〜C70、〜C80、〜C90、〜C100、〜C110、〜C120、〜C130若しくは〜C140、アルキルなどのアルキル基であり、又はL3及びL4及びXは、独立に、C1〜C140(例えば、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9若しくはC10;C1〜C10、〜C20、〜C30、〜C40、〜C50 〜C60、〜C70、〜C80、〜C90、〜C100、〜C110、〜C120、〜C130若しくは〜C140)、脂環式、複素環式、芳香族、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、オキシアルキレン基とすることができ、又は場合によっては1個以上の、好ましくは1個の、酸素、窒素若しくは硫黄原子、官能基及び飽和若しくは不飽和環状部分によって分断された、ポリアルキレン基とすることができ、
「G4」及び「G5」は、カチオン部分であり、同じでも異なってもよく、その少なくとも一方は、ビグアニジン部分又はカルバモイルグアニジンであり、他方の部分は、ビグアニジン又はカルバモイルグアニジン又はアミンとすることができ、
カチオン部分G4及びG5は、単一のグアニジン基を含まない、
請求項1又は2に記載の組成物。 - 式1aに係る前記侵入促進剤が以下の1種以上を含む、若しくはそれらからなる、
請求項3に記載の組成物。 - 前記侵入促進剤がナノ粒子中に含まれる、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗菌薬耐性を阻害する薬剤が、ペプチド、核酸又は小分子である、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗菌薬耐性を阻害する薬剤が酵素阻害剤である、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチド又は核酸が、PBP2a、NDM−1又はVim2からなる群から選択される抗菌薬耐性決定因子に結合し、該抗菌薬耐性決定因子を阻害することができる、請求項6に記載の組成物。
- 前記ペプチドがPBP2a(mecAの遺伝子産物)に結合し、該PBP2a(mecAの遺伝子産物)を阻害する、請求項6に記載の組成物。
- 前記ペプチドが、配列番号1から4の1つ若しくは組合せ、又はその少なくとも90%相同である任意のペプチド配列を含む、請求項9に記載の組成物。
- 前記核酸がNDM−1に結合する、請求項6に記載の組成物。
- 前記酵素阻害剤がクラブラン酸又はその塩である、請求項7に記載の組成物。
- 前記侵入促進剤が、ポリヘキサメチレンビグアナイド(PHMB)又はその類似体若しくは誘導体である、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記侵入促進剤が、ポリヘキサメチレングアナイド(PHMG)又はその類似体若しくは誘導体である、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物。
- 細菌がグラム陰性、グラム陽性である、又はマイコバクテリウムである、請求項1から14のいずれか一項に記載の組成物。
- 細菌が、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、トロレアンドマイシン、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、アズトレオナム、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ドリペネム、パニペネム/ベタミプロン、ビアペネム、PZ−601、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフェピム、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンB、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン及びトロバフロキサシンからなる群から選択される1種以上の抗菌薬に対して耐性がある、請求項1から15のいずれか一項に記載の組成物。
- 細菌が、シプロフロキサシン、メロペネム、セフタジジム、アズトレオナム、アジスロマイシン、メチシリン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、オキシテトラサイクリン及びイミペネム/シラスタチンからなる群から選択される1種以上の抗菌薬に対して耐性があるシュードモナス エルジノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、クレブシエラ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、ブルクホルデリア セパシア(Burkholderia cepacia)、スタフィロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、プロビデンシア スチュアルティ(Providencia stuartii)又はアシネトバクター バウマニ(Acinetobacter baumannii)からなる群から選択される多剤耐性(MDR)株である、請求項1から15のいずれか一項に記載の組成物。
- ヒト又は動物における細菌感染症の治療又は予防に使用される、請求項1から17のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細菌感染症が、口腔、生殖器系、尿路、気道、消化管、腹膜、中耳、前立腺、血管内膜、結膜若しくは角膜組織を含めた眼、肺組織、心臓弁、皮膚、頭皮、爪の表面、副腎、肝臓、腎臓、すい臓、下垂体、甲状腺、免疫、卵巣、精巣、前立腺、子宮内膜、眼球、乳房、脂肪、上皮、内皮、神経、筋肉、肺、真皮、表皮若しくは骨組織の創傷内部若しくは表面からなる群から選択される内部若しくは外部の体表、又は血液、血しょう、血清、脳脊髄液、消化管内容物、痰、肺分泌物及び精液から選択される体液中、又は副腎、肝臓、腎臓、すい臓、脳、心臓、下垂体、甲状腺、免疫、卵巣、精巣、前立腺、子宮内膜、眼球、乳房、脂肪、上皮、内皮、神経、筋肉、肺、表皮及び骨組織から選択される体組織の中若しくは上である、請求項18に記載の組成物。
- ヒト又は動物の抗菌薬耐性細菌感染に対処する方法であって、
(a)細菌のタイプ及び前記細菌の少なくとも1種の抗菌薬耐性決定因子の性質を特定するステップと、
(b)決定された抗菌薬耐性を阻害する薬剤を選択するステップと、
(c)特定された抗菌薬耐性決定因子によって前記細菌が耐性である抗菌薬を選択するステップと、
(d)前記ヒト又は動物に、侵入促進剤の存在下で、特定された抗菌薬耐性を阻害する薬剤と前記抗菌薬を投与するステップと
を含む、方法。 - 前記侵入促進剤及び特定された抗菌薬耐性を阻害する薬剤を前記抗菌薬と同時に又は逐次的に投与する、請求項20に記載の方法。
- 複数の異なるタイプの細菌が特定される、請求項20又は21に記載の方法。
- 細菌を抗菌薬に対して感作させる方法であって、前記細菌を、侵入促進剤の存在下で、抗菌薬耐性を阻害する薬剤に暴露するステップを含む方法。
- 抗菌薬耐性菌を死滅させる方法であって、細菌を、侵入促進剤の存在下で、抗菌薬耐性を阻害する薬剤に暴露し、前記細菌を抗菌薬に暴露するステップを含む方法。
- 前記細菌を、侵入促進剤の存在下で、前記抗菌薬耐性を阻害する薬剤に暴露するステップと、前記細菌を前記抗菌薬に暴露するステップが同時に又は逐次的に行われる、請求項24に記載の方法。
- 複数の異なるタイプの細菌を死滅させる、請求項24に記載の方法。
- 前記侵入促進剤及び抗菌薬耐性を阻害する薬剤が請求項1から17のいずれか一項に記載の組成物で形成される、請求項23から26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細菌が、無生物材料の中又は上、無生物表面上などのヒト又は動物の体の外側に存在する、請求項23から27のいずれか一項に記載の方法。
- 抗菌薬耐性を阻害する複数の薬剤を含む部品のキット。
- 細菌を特定する手段、及び/又は細菌中の抗菌薬耐性決定因子を特定する手段をさらに含む、請求項29に記載の部品のキット。
- 1種以上の抗菌薬をさらに含む、請求項29又は30に記載の部品のキット。
- 好ましくは抗菌薬耐性を阻害する薬剤と組み合わせて、侵入促進剤をさらに含む、請求項29から31のいずれか一項に記載の部品のキット。
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