JP2018023328A

JP2018023328A - テアデノールの製造方法

Info

Publication number: JP2018023328A
Application number: JP2016158222A
Authority: JP
Inventors: 滋樹吉田; Shigeki Yoshida; 均宮崎; Hitoshi Miyazaki
Original assignee: ARAHATAEN KK; Kanematsu Seicha Co Ltd; Osada-Seicha Co Ltd; University of Tsukuba NUC
Current assignee: ARAHATAEN KK; Kanematsu Seicha Co Ltd; Osada-Seicha Co Ltd; University of Tsukuba NUC
Priority date: 2016-08-10
Filing date: 2016-08-10
Publication date: 2018-02-15

Abstract

【課題】テアデノールを容易に大量生産する技術を提供する。【解決手段】エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地でアスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物を培養する工程を備える、テアデノールの製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、テアデノールの製造方法に関する。

テアデノールは微生物発酵茶葉から単離されたポリフェノール誘導体であり、アディポネクチン分泌促進作用、プロテインチロシンホスファターゼＢ発現抑制作用等の生理活性を有することが知られている（例えば、特許文献１を参照。）。テアデノールには、下記式（１）で表されるテアデノールＡと、その立体異性体であり、下記式（２）で表されるテアデノールＢが存在する。

特開２０１１−８４５６０号公報

テアデノールは、メタボリックシンドロームの予防又は改善に効果があると期待される。しかしながら、発酵茶におけるテアデノールの含有量は低いため、その生理活性を有効利用するためには、テアデノール含量を増加させた飲料やサプリメントの開発が必要となる。しかしながら、微量のテアデノールを製造する手法は知られているものの、テアデノールを大量に製造する技術は確立されていない。そこで、本発明は、テアデノールを容易に大量生産する技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地でアスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物を培養する工程を備える、テアデノールの製造方法。
［２］前記液体培地が茶粉末を更に含有する、［１］に記載のテアデノールの製造方法。
［３］前記培養する工程がバッチ培養で行われ、１０〜２０日間継続される、［１］又は［２］に記載のテアデノールの製造方法。
［４］テアデノールＡの製造方法であって、エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地でアスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物を培養して得られた培地をろ過してろ液を得る工程と、疎水性カラムに前記ろ液を通過させ、前記疎水性カラムにテアデノールＡを含む化合物を吸着させる工程と、テアデノールＡを含む化合物が吸着した前記疎水性カラムを４０〜５５（ｖ／ｖ）％エタノールで洗浄する工程と、洗浄後の前記疎水性カラムに６０〜８０（ｖ／ｖ）％エタノールを通過させ、前記疎水性カラムからテアデノールＡを溶出する工程と、を備える、製造方法。
［５］テアデノールＢの製造方法であって、エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地でアスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物を培養して得られた培地をろ過してろ液を得る工程と、疎水性カラムに前記ろ液を通過させ、前記疎水性カラムにテアデノールＢを含む化合物を吸着させる工程と、テアデノールＢを含む化合物が吸着した前記疎水性カラムを８０（ｖ／ｖ）％以上９０（ｖ／ｖ）％未満のエタノールで洗浄する工程と、洗浄後の前記疎水性カラムに９０〜１００（ｖ／ｖ）％エタノールを通過させ、前記疎水性カラムからテアデノールＢを溶出する工程と、を備える、製造方法。

本発明によれば、テアデノールを容易に大量生産する技術を提供することができる。

（ａ）は、アスペルギルス属に属する微生物を液体培養した培地のＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。（ｂ）は、市販の微生物発酵茶の抽出物のＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。実験例６において、液体培地中の各成分の変化を示すグラフである。テアデノールＡ及びテアデノールＢの精製スキームを説明する図である。

［テアデノールの製造方法］
１実施形態において、本発明は、エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地でアスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物を培養する工程を備える、テアデノールの製造方法を提供する。本明細書では、テアデノールＡ及びテアデノールＢを総称してテアデノールという。

（液体培地）
茶葉の発酵は固体培養による発酵であるといえる。また、アスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物は、麹に代表されるように、固体培養することが通常である。しかしながら、実施例において後述するように、発明者らは固体培養ではテアデノールを製造することが困難であることを見出した。発明者らは更に、液体培地を用いた液体培養によりテアデノールを効率よく製造することができることを見出した。また、液体培養はスケールアップが容易であり、実施例において後述するように、不純物が少ないという利点もある。

本実施形態の製造方法で用いる培地は、液体培地であり、エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する。テアデノールＡは微生物によりエピガロカテキンガレートから生合成されると考えられている。また、テアデノールＢは、微生物によりガロカテキンガレートから生合成されると考えられている。

実施例において後述するように、エピガロカテキンガレートを含有する培地をオートクレーブ滅菌すると、エピガロカテキンガレートの一部がガロカテキンガレートに変換される。本実施形態において、ガロカテキンガレートを含有する液体培地とは、培地成分としてガロカテキンガレートを添加した培地であってもよく、エピガロカテキンガレートを含有する培地をオートクレーブ滅菌したことによりガロカテキンガレートが生成した培地であってもよい。

液体培地中のエピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレートの含有量は、例えば０．１〜１０（ｗ／ｖ）％であってもよく、例えば、２．５〜１０（ｗ／ｖ）％であってもよい。実施例において後述するように、液体培地中のエピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレートの含有量が上記の範囲であると、テアデノールの産生量が向上する傾向にある。

糖としては、アスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物の栄養源となるものであれば特に制限されず、例えば、スクロース、ブドウ糖、ラクトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。

液体培地は茶粉末を更に含有することが好ましい。実施例において後述するように、茶粉末を含有する液体培地を用いることにより、テアデノールの産生量が顕著に向上する。

茶粉末は加熱されたものであってもよく、生茶の粉末であってもよい。茶粉末としては、緑茶の粉砕物（抹茶）、生茶の粉砕物、発酵茶の粉砕物等が挙げられる。

液体培地中の茶粉末の含有量は、例えば０．１〜５（ｗ／ｖ）％であってもよく、例えば、０．５〜１．５（ｗ／ｖ）％であってもよい。実施例において後述するように、液体培地中の茶粉末の含有量が上記の範囲であると、テアデノールの産生量が向上する傾向にある。

茶粉末を培地に添加することによりテアデノールの産生量が顕著に向上する理由は明らかではないが、発明者らは、茶粉末に含まれる成分が、微生物の特定の酵素の発現を上昇させ、その結果、テアデノールの産生量が向上するものと推測している。

（アスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物）
アスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物としては、上述した液体培地を発酵してテアデノールを産生する微生物であれば特に制限されない。例えば、アスペルギルス属ＰＫ−１株（ＦＥＲＭＰ−２１２８０）、アスペルギルス属ＡＯ−１株（ＮＢＲＳ４２１４）、アスペルギルス属ＳＫ−１株（ＮＢＲＳ４１２２）、ユーロチウム属ＫＡ−１株（ＦＥＲＭＰ−２１２９１）等が挙げられる。

（培養形態及び培養期間）
本実施形態の製造方法において、アスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物の培養形態は特に制限されず、連続培養であってもよいし、バッチ培養であってもよい。培養形態がバッチ培養である場合、培養期間は、１０〜２０日間であることが好ましく、１４〜１９日間であることがより好ましい。

実施例において後述するように、液体培養がバッチ培養で行われる場合、培養期間が上記の範囲であると、テアデノールの産生量が向上する傾向にある。

（テアデノールＡの製造方法）
１実施形態において、本発明は、テアデノールＡの製造方法であって、エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地でアスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物を培養して得られた培地をろ過してろ液を得る工程と、疎水性カラムに前記ろ液を通過させ、前記疎水性カラムにテアデノールＡを含む化合物を吸着させる工程と、テアデノールＡを含む化合物が吸着した前記疎水性カラムを４０〜５５（ｖ／ｖ）％エタノールで洗浄する工程と、洗浄後の前記疎水性カラムに６０〜８０（ｖ／ｖ）％エタノールを通過させ、前記疎水性カラムからテアデノールＡを溶出する工程と、を備える、製造方法を提供する。

疎水性カラムとしては、テアデノールＡを吸着することができるものであれば特に制限されず、例えば、セファデックスＬＨ−２０、ダイアイオンＰ−２０、ブチルトヨパール６５０等を担体とするカラムが挙げられる。

疎水性カラムから溶出したテアデノールＡは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により更に精製してもよい。ここで使用するカラムとしては、例えば、ＯＤＳカラム（オクタデシルシリル基で表面が修飾された多孔性シリカゲルカラム、Ｃ１８カラム）、ＯＤＰカラム（オクタデシルシリル基で表面が修飾された多孔性ポリマーカラム）、Ｃ８カラム（オクチルシリル基で表面が修飾された多孔性シリカゲルカラム）等が挙げられる。

本実施形態の製造方法によるテアデノールＡの製造は、後述するテアデノールＢの製造方法と組み合わせて行うと、テアデノールＡ及びテアデノールＢの双方を製造することができるため効率的である。

（テアデノールＢの製造方法）
１実施形態において、本発明は、テアデノールＢの製造方法であって、エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地でアスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物を培養して得られた培地をろ過してろ液を得る工程と、疎水性カラムに前記ろ液を通過させ、前記疎水性カラムにテアデノールＢを含む化合物を吸着させる工程と、テアデノールＢを含む化合物が吸着した前記疎水性カラムを８０（ｖ／ｖ）％以上９０（ｖ／ｖ）％未満のエタノールで洗浄する工程と、洗浄後の前記疎水性カラムに９０〜１００（ｖ／ｖ）％エタノールを通過させ、前記疎水性カラムからテアデノールＢを溶出する工程と、を備える、製造方法を提供する。

本実施形態の製造方法において、疎水性カラムとしては上述したテアデノールＡの製造方法におけるものと同様のものを用いることができる。

本実施形態の製造方法によるテアデノールＢの製造は、上述したテアデノールＡの製造方法と組み合わせて行うと効率的である。具体的には、上述したテアデノールＡの製造方法において、テアデノールＡを溶出した後の疎水性カラムには、テアデノールＢを含む化合物が吸着している。そこで、このカラムを、本実施形態の製造方法における、テアデノールＢを含む化合物が吸着した疎水性カラムとして用い、８０（ｖ／ｖ）％以上９０（ｖ／ｖ）％未満、好ましくは８０〜８５（ｖ／ｖ）％未満のエタノールで洗浄し、続いて、９０〜１００（ｖ／ｖ）％エタノールを通過させてテアデノールＢを溶出するとよい。

疎水性カラムから溶出したテアデノールＢは、ＨＰＬＣ等により更に精製してもよい。ここで使用するカラムとしては、上述したテアデノールＡの製造方法におけるものと同様のものを用いることができる。

次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

［実験例１］
（固体培養によるテアデノールの製造）
エピガロカテキンガレートを含有し、コムギフスマ又は結晶セルロースを支持体に用いた固体培地を用いて、アスペルギルス属に属する微生物（ＦＡＲＭＡＰ−２１２８０株、リバソン株式会社）を培養し、テアデノールが生産されるか否かを検討した。その結果、固体培養によってはテアデノールの産生が認められなかった。アスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物は、固体培養で発酵することが通常であるが、上記の結果から、固体培養ではテアデノールを大量生産することは困難であると考えられた。

［実験例２］
（液体培養によるテアデノールの製造１）
液体培養によるテアデノールの製造を試みた。まず、エピガロカテキンガレート１６ｍｇを水２０ｍＬに溶解し、１２１℃で１５分間オートクレーブ処理することにより滅菌した。なお、この過程でエピガロカテキンガレートの一部がガロカテキンガレートに変換された。

続いて、溶液の温度が室温にまで下がった後に、上記の溶液にアスペルギルス属に属する微生物（ＦＡＲＭＡＰ−２１２８０株）を接種し、ロータリー式振とう機を用いて６０ｒｐｍ、暗所、２５℃で２週間培養した。しかしながら、本実験例の培養では、微生物の増殖が認められず、テアデノールの産生も認められなかった。

［実験例３］
（液体培養によるテアデノールの製造２）
液体培養によるテアデノールの製造を試みた。培地として、エピガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地を使用した。糖としてはスクロースを使用した。培地中のエピガロカテキンガレートの濃度を変化させて実験を行った。

より具体的には、エピガロカテキンガレートを、０．１、１．０、２．０、５．０又は７．０（ｗ／ｖ）％含有し、スクロースを０．５（ｗ／ｖ）％含有し、その他の成分として、ＮａＮＯ_３０．３（ｗ／ｖ）％、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．１（ｗ／ｖ）％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０５（ｗ／ｖ）％、ＫＣｌ０．０５（ｗ／ｖ）％、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．００１（ｗ／ｖ）％含有する液体培地を使用した。培地のｐＨはＨＣｌの添加によりｐＨ６．０に調整した。

続いて、培地を１２１℃で１５分間オートクレーブ処理することにより滅菌した。なお、この過程でエピガロカテキンガレートの一部がガロカテキンガレートに変換された。続いて、培地の温度が室温にまで下がった後に、培地にアスペルギルス属に属する微生物（ＦＡＲＭＡＰ−２１２８０株）を接種し、ロータリー式振とう機を用いて１２０ｒｐｍ、暗所、２５℃で３週間培養した。

培養開始から２、４、６、９、１２、１５、１７、１９及び２１日目に、培地の一部を回収し、ＨＰＬＣにより、テアデノールＡ及びテアデノールＢの濃度を測定した。

表１に、培養１９日目における培地中のテアデノール濃度の測定結果を示す。表１中、「ＥＧＣＧ」はエピガロカテキンガレートを表す。表中のテアデノールの濃度は３回の測定結果の平均値±標準偏差である。

その結果、エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地でアスペルギルス属に属する微生物を培養することによって、テアデノールが産生されることが明らかとなった。

［実験例４］
（液体培養によるテアデノールの製造３）
液体培養によるテアデノールの製造を試みた。培地として、エピガロカテキンガレート、糖及び茶粉末を含有する液体培地を使用した。茶粉末としては、市販の抹茶を使用した。糖としてはスクロースを使用した。培地中のエピガロカテキンガレートの濃度を５（ｗ／ｖ）％に固定し、茶粉末の濃度を変化させて実験を行った。

より具体的には、茶粉末を０．５、１．０、１．５又は２．０（ｗ／ｖ）％、エピガロカテキンガレートを５．０（ｗ／ｖ）％、スクロースを０．５（ｗ／ｖ）％含有し、その他の成分として、ＮａＮＯ_３０．３（ｗ／ｖ）％、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．１（ｗ／ｖ）％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０５（ｗ／ｖ）％、ＫＣｌ０．０５（ｗ／ｖ）％、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．００１（ｗ／ｖ）％含有する液体培地を使用した。培地のｐＨはＨＣｌの添加によりｐＨ６．０に調整した。

続いて、培地を１２１℃で１５分間オートクレーブ処理することにより滅菌した。なお、この過程でエピガロカテキンガレートの一部がガロカテキンガレートに変換される。続いて、培地の温度が室温にまで下がった後に、培地にアスペルギルス属に属する微生物（ＦＡＲＭＡＰ−２１２８０株）を接種し、ロータリー式振とう機を用いて１２０ｒｐｍ、暗所、２５℃で３週間培養した。

表２に、培養１９日目における培地中のテアデノール濃度の測定結果を示す。表中のテアデノールの濃度は３回の測定結果の平均値±標準偏差である。

実験例３の結果との比較から、培地に茶粉末を添加することにより、テアデノールの産生量が顕著に増加することが明らかとなった。

［実験例５］
（液体培養で製造したテアデノールの解析）
液体培養で製造したテアデノールを解析した。具体的には、実験例４において、茶粉末を１．０（ｗ／ｖ）％含有する液体培地でアスペルギルス属に属する微生物（ＦＡＲＭＡＰ−２１２８０株）を１９日間培養して得られた培地中の成分をＨＰＬＣで解析した。

また、比較のために、市販の微生物発酵茶（商品名「山吹撫子」、リバソン株式会社）の抽出物をＨＰＬＣで解析した。具体的には、まず、微生物発酵茶を粉砕し、０．５ｇを３０ｍＬの８０（ｖ／ｖ）％エタノールで室温、８時間抽出した。続いて、抽出物をフィルターでろ過した後、ろ液を４℃で保存した。また、フィルターろ過の残渣を３０ｍＬの８０（ｖ／ｖ）％エタノールで更に室温、８時間抽出した。抽出物をフィルターでろ過し、ろ液を上記のろ液と混合して、ＨＰＬＣで解析した。

図１（ａ）は、アスペルギルス属に属する微生物を液体培養した培地のＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。また、図１（ｂ）は、市販の微生物発酵茶の抽出物のＨＰＬＣ解析の結果を示すグラフである。

図１（ａ）及び（ｂ）において、保持時間約１６分に認められるピークがテアデノールＡのピークであり、保持時間約１７．５分に認められるピークがテアデノールＢのピークである。

その結果、アスペルギルス属に属する微生物を液体培養した培地では、精製処理を行っていないにもかかわらず、テアデノール以外の夾雑物が非常に少ないことが明らかとなった。この結果は、本方法により非常に容易にテアデノールを大量生産できることを示す。一方、市販の微生物発酵茶の抽出物には、テアデノール以外の夾雑物が大量に存在していることが明らかとなった。

［実験例６］
（液体培養によるテアデノールの製造４）
液体培養によるテアデノールの製造における、培地中のエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、テアデノールＡ及びテアデノールＢの濃度の変化を検討した。

具体的には、実験例４において、茶粉末を１．０（ｗ／ｖ）％含有する液体培地でアスペルギルス属に属する微生物（ＦＡＲＭＡＰ−２１２８０株）を培養したサンプルを用い、培養開始から２、４、６、９、１２、１５、１７、１９及び２１日目に回収した培地の一部をＨＰＬＣで解析して各成分の濃度を測定した。

図２は、培地中の各成分の変化を示すグラフである。その結果、培地中のカテキン（エピガロカテキンガレート及びガロカテキンガレート）は、培養開始から２日目までにほとんど完全に消失することが明らかとなった。

そして、培養開始から４日目以降にテアデノールＡ及びテアデノールＢの濃度が上昇していくことが明らかとなった。また、テアデノールＡ及びテアデノールＢの濃度は、培養開始後１９日目で最大に達することが明らかとなった。

［実験例７］
（テアデノールＡ及びテアデノールＢの精製）
液体培養で製造したテアデノールＡ及びテアデノールＢを精製した。まず、茶粉末を１．０（ｗ／ｖ）％、エピガロカテキンガレートを５．０（ｗ／ｖ）％、スクロースを０．５（ｗ／ｖ）％含有し、その他の成分として、ＮａＮＯ_３０．３（ｗ／ｖ）％、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．１（ｗ／ｖ）％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０５（ｗ／ｖ）％、ＫＣｌ０．０５（ｗ／ｖ）％、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．００１（ｗ／ｖ）％含有する液体培地（ｐＨ６．０）１００ｍＬに、アスペルギルス属に属する微生物（ＦＡＲＭＡＰ−２１２８０株）を接種し、この培養フラスコ１２本をロータリー式振とう機を用いて１２０ｒｐｍ、暗所、２５℃で１９日間培養した。

続いて、培地をフィルターでろ過し、ろ液を回収した。このろ液には、テアデノールＡが０．９１ｇ、テアデノールＢが１．０５ｇ含まれていた。続いて、ろ液からテアデノールＡ及びテアデノールＢを精製した。図３は、精製スキームを説明する図である。

まず、培地をろ過したろ液を、疎水性担体であるセファデックスＬＨ−２０（ＧＥヘルスケア・ジャパン社製）を充填したカラム（内径３．５ｃｍ×長さ４４ｃｍ）に導入し、テアデノールＡ及びテアデノールＢを含む化合物を吸着させた。

続いて、上記のカラムに０（ｖ／ｖ）％エタノール（水）を４００ｍＬ導入し、洗浄した。続いて、上記のカラムに２０（ｖ／ｖ）％エタノールを４００ｍＬ導入し、洗浄した。続いて、上記のカラムに４０（ｖ／ｖ）％エタノールを４００ｍＬ導入し、洗浄した。

続いて、上記のカラムに６０（ｖ／ｖ）％エタノールを４００ｍＬ導入し、テアデノールＡを溶出した。この溶出液には、０．５２ｇのテアデノールＡが含まれていた。得られた溶出液をＯＤＳカラム（オクタデシルシリル基で表面が修飾された多孔性シリカゲルカラム、Ｃ１８カラム）を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、テアデノールＡの標品０．２７ｇを得た。

続いて、テアデノールＡを溶出後の上記のセファデックスＬＨ−２０カラムに８０（ｖ／ｖ）％エタノールを４００ｍＬ導入し、洗浄した。続いて、上記のカラムに１００（ｖ／ｖ）％エタノールを４００ｍＬ導入し、テアデノールＢを溶出した。この溶出液には、０．６５ｇのテアデノールＢが含まれていた。得られた溶出液をＯＤＳカラムを用いた逆相ＨＰＬＣにより精製し、テアデノールＢの標品０．４５ｇを得た。

Claims

エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地でアスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物を培養する工程を備える、テアデノールの製造方法。
前記液体培地が茶粉末を更に含有する、請求項１に記載のテアデノールの製造方法。
前記培養する工程がバッチ培養で行われ、１０〜２０日間継続される、請求項１又は２に記載のテアデノールの製造方法。
テアデノールＡの製造方法であって、
エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地でアスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物を培養して得られた培地をろ過してろ液を得る工程と、
疎水性カラムに前記ろ液を通過させ、前記疎水性カラムにテアデノールＡを含む化合物を吸着させる工程と、
テアデノールＡを含む化合物が吸着した前記疎水性カラムを４０〜５５（ｖ／ｖ）％エタノールで洗浄する工程と、
洗浄後の前記疎水性カラムに６０〜８０（ｖ／ｖ）％エタノールを通過させ、前記疎水性カラムからテアデノールＡを溶出する工程と、
を備える、製造方法。
テアデノールＢの製造方法であって、
エピガロカテキンガレート又はガロカテキンガレート及び糖を含有する液体培地でアスペルギルス属又はユーロチウム属に属する微生物を培養して得られた培地をろ過してろ液を得る工程と、
疎水性カラムに前記ろ液を通過させ、前記疎水性カラムにテアデノールＢを含む化合物を吸着させる工程と、
テアデノールＢを含む化合物が吸着した前記疎水性カラムを８０（ｖ／ｖ）％以上９０（ｖ／ｖ）％未満のエタノールで洗浄する工程と、
洗浄後の前記疎水性カラムに９０〜１００（ｖ／ｖ）％エタノールを通過させ、前記疎水性カラムからテアデノールＢを溶出する工程と、
を備える、製造方法。