JP2018019723A - 工業的生体触媒作用のための操作されたトランスアミナーゼポリペプチド - Google Patents

工業的生体触媒作用のための操作されたトランスアミナーゼポリペプチド Download PDF

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Abstract

【課題】光学活性型のキラルアミン化合物を調製するための工業プロセスにおいて使用され得る操作されたトランスアミナーゼを提供する。
【解決手段】本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドを作製する方法、およびアミノアクセプター基質化合物（すなわち、ケト基含有化合物）のキラルアミン生成物化合物への生体触媒による変換にそれらのポリペプチドを使用する方法を提供する。
【選択図】なし

Description

この出願は、２０１３年２月２８日に出願された同時係属の米国仮出願連続番号６１／７７０，８１４（これは、全ての目的のためにその全体が援用される）に対する優先権を主張する。
１．技術分野
本開示は、薬学的およびファインケミカルアミン化合物の製造についての工業的プロセス条件下で有用な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドに関するものである。
２．配列表、表またはコンピュータプログラムの参照
配列表の公式の写しは、「ＣＸ２−１２９ＷＯ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイル名、２０１４年１月２９日という作成日および６４７，８９０キロバイトというサイズを有するＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して出願される配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書中に援用される。
３．背景
トランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１）は、アミノドナー化合物からアミノアクセプター化合物のケト基へのアミノ基、電子対およびプロトンの転移を触媒する。トランスアミナーゼ反応により、キラルアミン生成物化合物が形成され得る。スキーム１に示すように、アミノアクセプター化合物（Ｂ）（これは所望のキラルアミン生成物（Ｄ）のケト基質前駆体である）を、トランスアミナーゼの存在下でアミノドナー化合物（Ａ）と反応させる。トランスアミナーゼは、アミノドナー化合物（Ａ）の第１級アミン基がアミノアクセプター化合物（Ｂ）のケト基へ転移するのを触媒する。トランスアミナーゼ反応により、キラルアミン生成物化合物（Ｄ）（Ｒ１はＲ２と同じではないと想定する）およびケト基を有する新たなアミノアクセプター副産物（または「カルボニル副産物」）化合物（Ｃ）が生じる。
キラルアミン化合物は、広範囲の商業的に所望される、セファロスポリンまたはピロリジン誘導体などの化合物を調製するための中間体またはシントンとして製薬産業、農薬産業および化学産業で頻繁に使用される。典型的には、キラルアミン化合物のこれらの産業上の適用では、分子のただ１つの特定の立体異性型を使用することを含み、例えば、（Ｒ）または（Ｓ）エナンチオマーだけが、生理的に活性である。トランスアミナーゼは、高度に立体選択的であり、光学的に純粋なキラルアミン化合物の合成のための多くの潜在的な工業的用途を有する。
キラルアミン化合物を製造するためのトランスアミナーゼの使用の例としては、アミノ酸のエナンチオマー濃縮（例えば、Ｓｈｉｎら、２００１，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１７８２−１７８８；Ｉｗａｓａｋｉら、２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．２５：１８４３−１８４６；Ｉｗａｓａｋｉら、２００４，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６９：４９９−５０５，Ｙｕｎら、２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：２５２９−２５３４；およびＨｗａｎｇら、２００４，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３４：４２９−４２６を参照のこと）；プレガバリンの中間体および前駆体の調製（例えば、国際公開第２００８／１２７６４６号）；シクロパミンアナログの酵素的アミノ基転移（例えば、国際公開第２０１１／０１７５５１号）；β−アミノ酸の立体特異的合成およびエナンチオマー濃縮（例えば、国際公開第２００５／００５６３３号）；アミンのエナンチオマー濃縮（例えば、米国特許第４，９５０，６０６号；米国特許第５，３００，４３７号；および米国特許第５，１６９，７８０号）；アミノ酸および誘導体の製造（例えば、米国特許第５，３１６，９４３号；米国特許第４，５１８，６９２号；米国特許第４，８２６，７６６号；米国特許第６，１９７，５５８号；および米国特許第４，６００，６９２号）；ならびに薬学的化合物、シタグリプチン、リバスチグミンおよびベルナカラントの製造（例えば、２０１２年１０月２３日付、米国特許８，２９３，５０７ Ｂ２；Ｓａｖｉｌｅら、２０１０，“Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｒａｌ ａｍｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｋｅｔｏｎｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９（５９８９）：３０５−９；２０１１年１２月２２日公開の国際公開第２０１１／１５９９１０号；および２０１２年２月２３日公開の国際公開第２０１２／０２４１０４号を参照のこと）が挙げられる。
スキーム１の反応を触媒する能力を有する野生型トランスアミナーゼは、様々な微生物から単離されており、それらの微生物としては、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ ＨＴＣＣ２５１６、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＲＥＤ６５、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ．ＭＥＤ９２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．（ＮＧＲ２３４株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ（例えば、Ｓｈｉｎら、２００１，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１７８２−１７８８を参照のこと）、およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８（例えば、Ｉｗａｓａｋｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，６９：４９９−５０５、米国特許第７，１６９，５９２号を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの野生型トランスアミナーゼ遺伝子およびコードされるポリペプチドのいくつかは、配列決定されており、それらとしては、例えば、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿００２２５７８１３．１，ＧＩ：２０７７３９４２０）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ １７１０ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＡ４７７３８．１，ＧＩ：７６５７８２６３）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｔｒｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＭ９０２７１６．１，ＧＩ：１６３２５８０３２）、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥＡ３９１８３．１，ＧＩ：３２７２０７０６６）、およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＫ３９７５３．１，ＧＩ：３３６０８８３４１）が挙げられる。クラスＥＣ２．６．１．１８およびＥＣ２．６．１−１９の少なくとも２つの野生型トランスアミナーゼが、結晶化され、構造的に特徴付けられた（例えば、Ｙｏｎａｈａら、１９８３，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４７（１０）：２２５７−２２６５を参照のこと）。
（Ｒ）−選択的または（Ｓ）−選択的立体選択性（ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）を有するトランスアミナーゼが知られている。例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８由来の野生型トランスアミナーゼは、（Ｒ）−選択的であると考えられ、ある種の基質から（Ｒ）−アミン化合物を主として生成し（例えば、Ｉｗａｓａｋｉら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，６９：４９９−５０５，米国特許第７，１６９，５９２号を参照のこと）、またＶｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７由来の野生型トランスアミナーゼは、（Ｓ）−選択的であると考えられ、ある種の基質から（Ｓ）−アミン化合物を主として生成する（例えば、Ｓｈｉｎら、“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ａｍｉｎｅ：ｐｙｒｕｖａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７，”Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６１（５−６），４６３−４７１（２００３）を参照のこと）。
（Ｒ）−選択性、増強された溶媒安定性および熱安定性、ならびに広範囲のアミノアクセプター基質の変換についての他の改善された特性を有する天然に存在しないトランスアミナーゼは、野生型および他の操作されたトランスアミナーゼバックボーン配列の変異誘発および／または定向進化により生成されてきた（例えば、２０１２年１０月２３日付、米国特許８，２９３，５０７ Ｂ２；２０１１年１月１３日公開の国際公開２０１１／００５４７７Ａ１；２０１２年２月２３日公開の国際公開第２０１２／０２４１０４号；およびＳａｖｉｌｅら、２０１０、“Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｒａｌ ａｍｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｋｅｔｏｎｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９（５９８９）：３０５−９を参照のこと）。
国際公開第２００８／１２７６４６号 国際公開第２０１１／０１７５５１号 国際公開第２００５／００５６３３号
Ｓｈｉｎら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００１）６５：１７８２〜１７８８ Ｉｗａｓａｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．（２００３）２５：１８４３〜１８４６ Ｉｗａｓａｋｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００４）６９：４９９〜５０５
しかしながら、トランスアミナーゼは、一般的に、工業的に有用なプロセス条件（例えば、溶媒、温度）に対する不安定性、商業的に有用なアミノアクセプターおよび／またはアミノドナー基質についての不十分な認識および立体選択性、ならびに好ましくない反応平衡による低い生成物収率などの、キラルアミン化合物の調製における商業的適用にとって望ましくない特性を有する。したがって、光学活性型のキラルアミン化合物を調製するための工業プロセスにおいて使用され得る操作されたトランスアミナーゼが必要とされている。
４．要旨
本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、それらのポリペプチドを作製する方法、およびアミノアクセプター基質化合物（すなわち、ケト基含有化合物）のキラルアミン生成物化合物への生体触媒による変換にそれらのポリペプチドを使用する方法を提供する。本開示のトランスアミナーゼポリペプチドは、以前に操作されたトランスアミナーゼポリペプチド（配列番号２のアミノ酸配列）と比べて、１またはそれを超える残基差異を有し、それに関連して以前に操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較して高い溶媒安定性および熱安定性を有するように操作されている（例えば、２０１２年１０月２３日付、米国特許８，２９３，５０７ Ｂ２；２０１１年１月１３日公開のＰＣＴ公開国際公開２０１１００５４７７Ａ１、および２０１２年２月２３日公開のＰＣＴ公開国際公開第２０１２０２４１０４号を参照のこと）。それらのアミノ残基差異は、とりわけ、活性、立体選択性、安定性、発現および生成物の許容範囲（ｐｒｏｄｕｃｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）を含む、様々な酵素特性の改善をもたらす残基位置に配置されている。
特に、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、スキーム２で示すように、基質、４−オキソ−４−［３−（トリフルオロメチル）−５，６−ジヒドロ［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル］−１−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ブタン−２−オン（本明細書では「化合物（２）」と称す）からその対応するキラルアミン生成物化合物、（２Ｒ）−４−オキソ−４−［３−（トリフルオロメチル）−５，６−ジヒドロ［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル］−１−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ブタン−２−アミン（本明細書では、「化合物（１）」と称す）への効率的な変換のために操作されている。
「シタグリプチン」という名称でも知られている化合物（１）は、２型糖尿病の処置のために米国および他の国々で販売許可を受けた医薬品である、ＪＡＮＵＶＩＡ（登録商標）における有効成分である。
しかしながら、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの進化した構造的特色により、スキーム３で示すように、式（ＩＩ）の様々なケトン基質化合物（化合物（２）以外の化合物も含む）から式（Ｉ）のそれらの対応するキラルアミン生成物化合物（化合物（１）以外の化合物も含む）への生体触媒による変換も可能となっている。
［式中、
Ｚは、ＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ１は、Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール−Ｃ１−２アルキル、ヘテロアリール−Ｃ１−２アルキル、または必要に応じてＯ、ＳおよびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい５〜６員複素環系であって、この複素環は、非置換であるか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−４アルコキシおよびＣ１−４アルキル（ここで、アルキルおよびアルコキシは非置換であるか、または１〜５個のフッ素で置換されている）から独立して選択される１〜３個の置換基により置換されているものとし、；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して水素、Ｃ１−８アルキル、アリール、またはアリール−Ｃ１−２アルキルであるか；または
Ｒ２およびＲ３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、必要に応じてＯ、ＳおよびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい４〜７員複素環系を形成し、この複素環は、非置換であるか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−４アルコキシおよびＣ１−４アルキル（ここで、アルキルおよびアルコキシは非置換であるか、または１〜５個のフッ素で置換されている）から独立して選択される１〜３個の置換基により置換されており；この複素環系は、必要に応じて５〜６員飽和もしくは芳香族炭素環式環系またはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５〜６員飽和もしくは芳香族複素環系と縮合されていてもよく、この縮合環系は、非置換であるか、またはヒドロキシ、アミノ、フッ素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、およびトリフルオロメチルから選択される１〜２個の置換基で置換されているものとする］。
一部の実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、反対のエナンチオマーに対して少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率で＊の印を付けた立体中心に示された立体化学的立体配置を有する式（Ｉ）の化合物への式（ＩＩ）の化合物の生体触媒による変換を行うことができる。
一部の実施形態において、本開示は、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、そして（ａ）Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｒ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ；およびＸ２４１Ｒから選択される配列番号２との比較によるアミノ酸残基差異、および／または（ｂ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ３３Ｌ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１１７Ｇ；Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；およびＸ４１Ｋ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｈ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６０Ｖ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６８Ａ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２６Ｍ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３５Ｉ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９２Ｆ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２２４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９３Ｍ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８３Ｓ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｉ；およびＸ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、およびＸ２１５Ｇから選択される残基差異の組合せを有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。
本開示のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドの一部の実施形態において、アミノ酸配列は、Ｘ５Ｋ、Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ａ／Ｇ、Ｘ４４Ｑ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ４９Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ５５Ｌ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１０８Ｖ、Ｘ１１７Ｇ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５０Ａ／Ｆ、Ｘ１５２Ｓ／Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ１６４Ｐ、Ｘ１６５Ｎ、Ｘ１８２Ｔ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２１８Ｍ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２６７Ｖ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ、およびＸ３２８Ｉから選択される配列番号２との比較による１またはそれを超える残基差異をさらに含み得る。
一部の実施形態において、本開示は、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、そして（ａ）Ｇ３６Ｃ、Ｉ４１Ｃ、Ｉ４１Ｆ、Ｉ４１Ｋ、Ｉ４１Ｍ、Ｉ４１Ｎ、Ｉ４１Ｒ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｄ、Ｐ４８Ｅ、Ｐ４８Ｇ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｔ、Ａ５１Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｆ、Ｍ１２２Ｑ、Ｙ１４８Ｑ、Ｃ１５２Ｔ、Ｑ１５５Ａ、Ｑ１５５Ｉ、Ｑ１５５Ｋ、Ｑ１５５Ｔ、Ｑ１５５Ｖ、Ｃ２１５Ｈ、Ｃ２１５Ｌ、Ｙ２７３Ｈ、Ｌ３２５Ｍ、およびＡ２４１Ｒから選択される配列番号２との比較によるアミノ酸残基差異、または（ｂ）Ａ５Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｐ３３Ｌ、Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｇ；Ｐ３３Ｌ、Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ａ１０９Ｓ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｈ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ．およびＣ２１５Ｈ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｈ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｃ２１５Ｈ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｃ２１５Ｈ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｖ、およびＣ２１５Ｈ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５ＧおよびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｋ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＦ１６０Ｐ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｔ、Ｑ１５５Ｖ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ，Ｗ１５６Ｑ，Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｅ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＷ１５６Ｑ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｅ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｃ２１５Ｌ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＦ１６０Ｐ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｎ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＦ１６０Ｐ；Ｉ４１Ｎ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ；およびＷ１５６Ｑ；Ｉ４１Ｎ、Ｓ４９Ｔ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｆ１６０Ｐ、Ｄ１６５Ｎ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ａ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ａ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ５５Ｌ、Ｔ１２６Ａ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｌ２１８Ｍ、およびＡ２７０Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ６０Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｔ６８Ａ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｔ６９Ｓ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｎ７６Ｓ、Ｔ１２６Ａ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｓ１８２Ｔ、Ｌ２１８Ｍ、Ａ２７０Ｔ、およびＶ３２８Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｖ、Ｗ１５６Ｑ、およびＦ１６０Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ，Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｔ、Ｑ１５５Ｖ、Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｔ１２６Ｍ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｐ１３５Ｉ、Ｆ１３６Ｙ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｗ１９２Ｆ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＧ２２４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｙ、Ｃ２１５Ｇ、Ｓ２８２Ｖ、およびＧ２８４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｙ、Ｃ２１５Ｇ、およびＧ２８４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｙ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、Ｓ２８２Ｖ、およびＧ２８４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ａ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｌ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｇ１９３Ｍ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、Ｓ２８２Ｖ、およびＧ２８４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＴ２８３Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＧ２８４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｙ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；
Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｌ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＦ１６０Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ，Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｓ１８２Ｔ、Ｌ２１８Ｍ、およびＡ２７０Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｌ；およびＥ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｖ、およびＷ１５６Ｓから選択される残基差異の組合せを有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。
本開示のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドの一部の実施形態において、操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で化合物（２）の基質を化合物（１）の生成物に変換することができる。一部の実施形態において、操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で、配列番号２の活性の少なくとも１．２倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍またはそれより大きな活性で化合物（２）を化合物（１）に変換することができる。一部の実施形態において、操作されたポリペプチドは、適切な反応条件下で、配列番号２と比べて高い活性で化合物（２）を化合物（１）に変換することができ、この適切な反応条件は、少なくとも５０ｇ／Ｌの負荷での化合物（１）、１ｍＭ ＰＬＰ、５０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）、１．５Ｍイソプロピルアミン、ｐＨ１１、および５５℃を含むものとする。
本開示の一部の実施形態において、操作されたポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８，４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、および３０６の例示的な配列から選択される配列を含む。これらの例示的なポリペプチド配列はそれぞれ、本明細書で開示された配列番号２に対するアミノ酸差異の異なる組み合わせを含む（例えば、表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ参照）。一部の実施形態において、操作されたポリペプチドは、これらの例示的な配列のいずれか１つに対し少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有する配列を含み、さらにこれらの例示的なアミノ酸配列のいずれか１つで見い出されるように、配列番号２に対するアミノ酸差異の組み合わせを含む。一部の実施形態において、これらの例示的なアミノ酸配列のいずれか１つで見い出されるように、配列番号２に対するアミノ酸差異の組み合わせを含む本操作されたポリペプチドは、さらにＸ５Ｋ、Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ａ／Ｇ、Ｘ４４Ｑ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ４９Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ５５Ｌ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１０８Ｖ、Ｘ１１７Ｇ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５０Ａ／Ｆ、Ｘ１５２Ｓ／Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ１６４Ｐ、Ｘ１６５Ｎ、Ｘ１８２Ｔ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２１８Ｍ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２６７Ｖ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ、およびＸ３２８Ｉから選択される配列番号２と比較した場合の追加的アミノ酸差異；または操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの当該分野で開示された他のアミノ酸差異（例えば、２０１２年１０月２３日付、米国特許８，２９３，５０７ Ｂ２；２０１１年１月１３日公開の国際公開２０１１／００５４７７Ａ１；２０１２年２月２３日公開の国際公開第２０１２／０２４１０４号で開示されたアミノ酸差異を参照）を含み得る。
本開示の一部の実施形態において、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは固体支持体に固定され、必要に応じてその固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマーまたはポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂から選択されてもよい。
他の実施態様において、本開示は、本明細書で開示されたトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、本ポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、３７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、および３０５から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。
さらに、本開示は、本明細書で開示されたトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。したがって、一部の実施形態において、本開示は、本明細書で開示された操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、および必要に応じてさらに制御配列を含んでいてもよい発現ベクターを提供する。他の実施形態において、本開示は、本明細書で開示された操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。他の実施形態において、本開示は発現ベクターを含む宿主細胞を提供し、この発現ベクターは、本明細書で開示された操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むものとする。他の実施形態において、本開示は、本明細書で開示された操作されたポリペプチドの調製方法を提供し、この方法は、本ポリペプチドの発現に適切な条件下で宿主細胞を培養することを含むものとする。一部の実施形態において、操作されたポリペプチドの調製方法は、さらにポリペプチドの単離を含む。
本開示はまた、広範囲のキラルアミン化合物の調製のための本明細書で開示された操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを使用するためのプロセスを提供する。一部の実施形態において、本開示は、反対のエナンチオマーに対して少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率で、＊の印を付けた立体中心に示された立体化学的立体配置を有する構造式（Ｉ）：
の化合物を調製するための方法を提供し、式中、
Ｚは、ＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ１は、Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール−Ｃ１−２アルキル、ヘテロアリール−Ｃ１−２アルキル、または必要に応じてＯ、ＳおよびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい５〜６員複素環系であって、この複素環は、非置換であるか、または独立してオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−４アルコキシおよびＣ１−４アルキル（ここで、アルキルおよびアルコキシは非置換であるか、または１〜５個のフッ素で置換されている）から選択される１〜３個の置換基により置換されているものとし、；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して水素、Ｃ１−８アルキル、アリール、またはアリール−Ｃ１−２アルキルであるか；または
Ｒ２およびＲ３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、必要に応じてＯ、ＳおよびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい４〜７員複素環系を形成し、この複素環は、非置換であるか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−４アルコキシおよびＣ１−４アルキル（ここで、アルキルおよびアルコキシは非置換であるか、または１〜５個のフッ素で置換されている）から独立して選択される１〜３個の置換基により置換されており；この複素環系は、必要に応じて５〜６員飽和もしくは芳香族炭素環式環系またはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５〜６員飽和もしくは芳香族複素環系と縮合されていてもよく、この縮合環系は、非置換であるか、またはヒドロキシ、アミノ、フッ素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、およびトリフルオロメチルから選択される１〜２個の置換基で置換されているものとし、本プロセスは、構造式（ＩＩ）：
のプロキラルケトンを、好適な反応条件下で好適な有機溶媒中アミノ基ドナーの存在下において本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させる工程を含むものとする。
構造式（Ｉ）の化合物を調製するためのプロセスの一部の実施形態において、Ｒ１はベンジルであり、ベンジルのフェニル基は、非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシからなる群より選択される１〜３個の置換基で置換されている。本プロセスの一部の実施形態において、ＺはＮＲ２Ｒ３であり、このＮＲ２Ｒ３は、構造式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ４は、水素または非置換もしくは１〜５個のフッ素により置換されたＣ１−４アルキルである）
の複素環である。
構造式（Ｉ）の化合物を調製するためのプロセスの一部の実施形態において、式（ＩＩ）の化合物は特に化合物（２）を除外し、本方法により調製される式（Ｉ）の化合物は特に（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌ）化合物（１）を除外する。
一部の実施形態において、本開示は、反対の（Ｓ）−立体配置を有するエナンチオマーに対し少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率で、＊＊＊の印を付けた立体中心に（Ｒ）−立体配置を有する構造式（Ｉａ）：
（式中、
Ａｒは、非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから成る群から独立して選択される１〜５個の置換基で置換されたフェニルであり；および
Ｒ４は、水素または非置換もしくは１〜５個のフッ素により置換されたＣ１−４アルキルである）
の化合物を調製するためのプロセスであって、
構造式（ＩＩａ）：
のプロキラルケトンを、好適な反応条件下でアミノ基ドナーの存在下において本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させる工程を含むプロセスを提供する。式（Ｉａ）の化合物を調製するためのプロセスの一部の実施形態において、Ａｒは２，５−ジフルオロフェニルまたは２，４，５−トリフルオロフェニルから選択され、Ｒ４はトリフルオロメチルである。
構造式（Ｉａ）の化合物を調製するためのプロセスの一部の実施形態において、式（ＩＩａ）の化合物は特に化合物（２）を除外し、本方法により調製される式（Ｉａ）の化合物は特に化合物（１）を除外する。
一部の実施形態において、本開示は、化合物（１）
を調製するプロセスであって、化合物（２）
の基質を、好適な反応条件下でアミノ基ドナーの存在下において本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させる工程を含むプロセスを提供する。
一部の実施形態において、本開示はまた、化合物（３）、ゲミグリプチン
を調製するプロセスであって、化合物（４）の基質、または保護基で修飾された化合物（４）の基質
を、好適な反応条件下でアミノ基ドナーの存在下において本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させる工程を含むプロセスを提供する。
一部の実施形態では、本明細書で開示された操作されたポリペプチドを用いるプロセスが実施され得、式（Ｉ）のキラルアミン化合物、式（Ｉａ）の化合物、化合物（１）、または化合物（３）は、少なくとも９０％、９７％、９８％、９９％またはそれより大きいエナンチオマー過剰率で製造される。
式（Ｉ）の化合物、式（Ｉａ）の化合物、化合物（１）、または化合物（３）を調製するための操作されたポリペプチドを用いる本明細書で開示されたプロセスはいずれも、限定される訳ではないが、アミノドナー、ｐＨ、温度、緩衝剤、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、補助因子負荷、圧力、および反応時間の範囲を含む様々な好適な反応条件下で実施され得る。例えば、一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉａ）の化合物、化合物（１）、または化合物（３）の調製が実施され得、その好適な反応条件としては、（ａ）約１０〜２００ｇ／Ｌの基質化合物（例、化合物（２））の基質負荷；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約０．１〜３ＭのＩＰＭ濃度；（ｄ）約０．１〜１ｍＭのＰＬＰ補助因子濃度；（ｅ）約３０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ濃度；（ｆ）約９．５〜１１．５のｐＨ；および（ｇ）約４５℃〜６０℃の温度が含まれる。一部の実施形態において、適切な反応条件としては、（ａ）約５０ｇ／Ｌの基質化合物（例、化合物（２））；（ｂ）約２ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約５０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；（ｄ）約１Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｅ）約１ｍＭのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）；（ｆ）約ｐＨ１０；および（ｇ）約５０℃が含まれる。
一部の実施形態では、本明細書で開示された操作されたポリペプチドを用いるプロセスが実施され得、そのアミノ基ドナーは、イソプロピルアミン、アラニン、３−アミノ酪酸またはメチルベンジルアミンから選択される。一部の実施形態において、アミノ基ドナーはイソプロピルアミンである。
一部の実施形態では、本明細書で開示された操作されたポリペプチドを用いるプロセスが実施され得、そのプロセスは、さらに該反応から式（Ｉ）、式（Ｉａ）の生成物化合物、化合物（１）、または化合物（３）を単離する工程を含む。
一部の実施形態では、本明細書で開示された操作されたポリペプチドを用いるプロセスが実施され得、そのプロセスは、さらに式（Ｉ）の化合物、式（Ｉａ）の化合物、化合物（１）、または化合物（３）を薬学的に受容可能な塩に変換する工程を含む。一部の実施形態において、薬学的に受容可能な塩を形成するプロセスは、前記化合物を薬学的に受容可能な酸と好適な反応溶媒中で接触させるさらなる工程を含む。このプロセスの一部の実施形態において、薬学的に受容可能な酸はリン酸であり、薬学的に受容可能な塩は二水素リン酸塩である。一部の実施形態において、このプロセスは、薬学的に受容可能な塩を反応溶媒から結晶化させる工程をさらに含み得る。
上記で示したように、化合物（１）は、ＪＡＮＵＶＩＡ（登録商標）における有効薬学的成分であるシタグリプチンである。したがって、化合物（１）、および／またはその薬学的に受容可能な塩または酸を製造するための操作されたポリペプチドを用いる本明細書で開示されたプロセスは、ＪＡＮＵＶＩＡ（登録商標）または関連薬学的化合物を製造するための大きなプロセスで使用され得る。一部の実施形態において、本開示はまた、（２Ｒ）−４−オキソ−４−［３−（トリフルオロメチル）−５，６−ジヒドロ［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル］−１−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ブタン−２−アミンホスフェート（１：１）一水和物の調製プロセスを提供し、そのプロセスは、好適な反応条件下でアミノ基ドナーの存在下において化合物（２）の基質を本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させることにより基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換する工程を含むものとする。
同様に、本開示は、化合物（３）、または化合物（３）の薬学的に受容可能な塩もしくは酸の製造プロセスを提供し、そのプロセスは、好適な反応条件下でアミノ基ドナーの存在下において基質化合物（４）、または保護基で修飾された基質化合物（４）を本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させることにより、基質化合物（４）、または保護基で修飾された基質化合物（４）を、生成物化合物（３）に変換する工程を含むものとする。
操作されたポリペプチドの選択、それらの調製、基質の選択、および本プロセス実施のためのパラメータについてのさらなる指針は、以下のより詳細な説明および実施例でさらに記載されている。
一部の実施形態では、本願は例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、そして
（ａ）Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｒ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ；およびＸ２４１Ｒから選択される配列番号２との比較によるアミノ酸残基差異、または
（ｂ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ３３Ｌ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１１７Ｇ；Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｋ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｈ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６０Ｖ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６８Ａ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２６Ｍ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３５Ｉ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９２Ｆ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２２４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９３Ｍ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８３Ｓ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６ＹおよびＸ２１５Ｇから選択される残基差異の組合せ
を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目２）
前記アミノ酸配列が、さらにＸ５Ｋ、Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ａ／Ｇ、Ｘ４４Ｑ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ４９Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ５５Ｌ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１０８Ｖ、Ｘ１１７Ｇ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５０Ａ／Ｆ、Ｘ１５２Ｓ／Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ１６４Ｐ、Ｘ１６５Ｎ、Ｘ１８２Ｔ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２１８Ｍ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２６７Ｖ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ、およびＸ３２８Ｉから選択される、配列番号２との比較による１またはそれを超える残基差異を含む、項目１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目３）
配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、そして
（ａ）Ｇ３６Ｃ、Ｉ４１Ｃ、Ｉ４１Ｆ、Ｉ４１Ｋ、Ｉ４１Ｍ、Ｉ４１Ｎ、Ｉ４１Ｒ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｄ、Ｐ４８Ｅ、Ｐ４８Ｇ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｔ、Ａ５１Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｆ、Ｍ１２２Ｑ、Ｙ１４８Ｑ、Ｃ１５２Ｔ、Ｑ１５５Ａ、Ｑ１５５Ｉ、Ｑ１５５Ｋ、Ｑ１５５Ｔ、Ｑ１５５Ｖ、Ｃ２１５Ｈ、Ｃ２１５Ｌ、Ｙ２７３Ｈ、Ｌ３２５Ｍ、およびＡ２４１Ｒから選択される、配列番号２との比較によるアミノ酸残基差異；または
（ｂ）Ａ５Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｐ３３Ｌ、Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｇ；Ｐ３３Ｌ、Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ａ１０９Ｓ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｈ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＣ２１５Ｈ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｈ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｃ２１５Ｈ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｃ２１５Ｈ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｖ、およびＣ２１５Ｈ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５ＧおよびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｋ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＦ１６０Ｐ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｔ、Ｑ１５５Ｖ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ，Ｗ１５６Ｑ，Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｅ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＷ１５６Ｑ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｅ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｃ２１５Ｌ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＦ１６０Ｐ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｎ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＦ１６０Ｐ；Ｉ４１Ｎ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ；およびＷ１５６Ｑ；Ｉ４１Ｎ、Ｓ４９Ｔ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｆ１６０Ｐ、Ｄ１６５Ｎ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ａ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ａ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ５５Ｌ、Ｔ１２６Ａ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｌ２１８Ｍ、およびＡ２７０Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ６０Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｔ６８Ａ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｔ６９Ｓ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｎ７６Ｓ、Ｔ１２６Ａ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｓ１８２Ｔ、Ｌ２１８Ｍ、Ａ２７０Ｔ、およびＶ３２８Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｖ、Ｗ１５６Ｑ、およびＦ１６０Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ，Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｔ、Ｑ１５５Ｖ、Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｔ１２６Ｍ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｐ１３５Ｉ、Ｆ１３６Ｙ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｗ１９２Ｆ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＧ２２４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｙ、Ｃ２１５Ｇ、Ｓ２８２Ｖ、およびＧ２８４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｙ、Ｃ２１５Ｇ、およびＧ２８４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｙ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、Ｓ２８２Ｖ、およびＧ２８４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ａ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｌ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｇ１９３Ｍ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、Ｓ２８２Ｖ、およびＧ２８４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＴ２８３Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＧ２８４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｙ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｌ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ
、Ｑ１５５Ｔ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＦ１６０Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ，Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｓ１８２Ｔ、Ｌ２１８Ｍ、およびＡ２７０Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｌ；およびＥ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｖ、およびＷ１５６Ｓから選択される残基差異の組合せ
を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド。
（項目４）
前記操作されたポリペプチドが、好適な反応条件のもと、基質化合物（２）
を、生成物化合物（１）
に変換することができる、項目１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目５）
好適な反応条件のもと、化合物（２）を、配列番号２の活性の少なくとも１．２倍の活性で化合物（１）に変換することができる、項目４に記載の操作されたポリペプチド。
（項目６）
前記好適な反応条件が、少なくとも５０ｇ／Ｌの化合物（２）負荷、１ｍＭのＰＬＰ、５０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）、１．５Ｍのイソプロピルアミン、ｐＨ１１、および５５℃を含む、項目５に記載の操作されたポリペプチド。
（項目７）
前記アミノ酸配列が、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８，４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４，２５６，２５８，２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、および３０６から選択される配列を含む、項目１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目８）
前記ポリペプチドが固体支持体に固定化されている、項目１に記載の操作されたポリペプチド。
（項目９）
前記固体支持体が、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマーまたはポリメタクリレートを含むビーズまたは樹脂である、項目８に記載の操作されたポリペプチド。
（項目１０）
項目１〜７のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（項目１１）
さらに、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、３７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、および３０５から選択されるヌクレオチド配列を含む、項目１０に記載のポリヌクレオチド。
（項目１２）
項目１０または１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（項目１３）
少なくとも１つの制御配列を含む、項目１２に記載の発現ベクター。
（項目１４）
項目１０または１１に記載のポリヌクレオチドまたは項目１２または１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（項目１５）
項目１〜７のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチドを調製する方法であって、前記ポリペプチドの発現に好適な条件のもと、項目１４に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
（項目１６）
さらに前記ポリペプチドを単離する工程を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
反対のエナンチオマーに対して少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率で、 ＊ の印を付けた立体中心に示された立体化学的立体配置を有する構造式（Ｉ）：
の化合物を調製するためのプロセスであって、式中、
Ｚは、ＯＲ ２ またはＮＲ ２ Ｒ ３ であり；
Ｒ １ は、Ｃ １−８ アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール−Ｃ １−２ アルキル、ヘテロアリール−Ｃ １−２ アルキル、または必要に応じてＯ、ＳおよびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい５〜６員複素環系であって、この複素環は、非置換であるか、または独立してオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ １−４ アルコキシおよびＣ １−４ アルキルから選択される１〜３個の置換基により置換され、ここで、アルキルおよびアルコキシは非置換であるか、または１〜５個のフッ素で置換され；
Ｒ ２ およびＲ ３ は、それぞれ独立して水素、Ｃ １−８ アルキル、アリール、またはアリール−Ｃ １−２ アルキルであるか；または
Ｒ ２ およびＲ ３ は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、必要に応じてＯ、ＳおよびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい４〜７員複素環系を形成し、この複素環は、非置換であるか、またはオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ １−４ アルコキシおよびＣ １−４ アルキルから独立して選択される１〜３個の置換基により置換され、ここで、アルキルおよびアルコキシは非置換であるか、または１〜５個のフッ素で置換され；またこの複素環系は、必要に応じて５〜６員飽和もしくは芳香族炭素環式環系またはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５〜６員飽和もしくは芳香族複素環系と縮合されていてもよく、この縮合環系は、非置換であるか、またはヒドロキシ、アミノ、フッ素、Ｃ １−４ アルキル、Ｃ １−４ アルコキシ、およびトリフルオロメチルから選択される１〜２個の置換基で置換され、
前記プロセスは、構造式（ＩＩ）：
の化合物を、好適な反応条件下で好適な有機溶媒中アミノ基ドナーの存在下において項目１〜９のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチドと接触させる工程を含む、プロセス。
（項目１８）
Ｒ １ がベンジルであり、そのベンジルのフェニル基が非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシからなる群より選択される１〜３個の置換基により置換されている、項目１７に記載のプロセス。
（項目１９）
ＺがＮＲ ２ Ｒ ３ である、項目１７に記載のプロセス。
（項目２０）
ＮＲ ２ Ｒ ３ が、構造式（ＩＩＩ）：
の複素環であり、式中、Ｒ ４ は、水素または非置換もしくは１〜５個のフッ素により置換されたＣ １−４ アルキルである、項目１９に記載のプロセス。
（項目２１）
構造式（ＩＩ）の化合物が化合物（２）を除外し、また構造式（Ｉ）の化合物が化合物（１）を除外する、項目１７〜２０のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目２２）
反対の（Ｓ）−立体配置を有するエナンチオマーに対し少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率で、 ＊＊＊ の印を付けた立体中心に（Ｒ）−立体配置を有する構造式（Ｉａ）：
の化合物を調製するためのプロセスであって、式中、
Ａｒは、非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから成る群から独立して選択される１〜５個の置換基で置換されたフェニルであり；そして
Ｒ ４ は、水素または非置換もしくは１〜５個のフッ素により置換されたＣ １−４ アルキルであり、前記プロセスは、構造式（ＩＩａ）：
で示されるプロキラルケトンを、好適な反応条件下でアミノ基ドナーの存在下において、項目１〜９のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチドと接触させる工程を含む、プロセス。
（項目２３）
Ａｒが２，５−ジフルオロフェニルまたは２，４，５−トリフルオロフェニルであり、Ｒ ４ がトリフルオロメチルである、項目２２に記載のプロセス。
（項目２４）
Ａｒが２，４，５−トリフルオロフェニルである、項目２３に記載のプロセス。
（項目２５）
構造式（ＩＩａ）の化合物が化合物（２）を除外し、また構造式（Ｉａ）の化合物が化合物（１）を除外する、項目２２〜２４のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目２６）
化合物（１）
を調製するプロセスであって、化合物（２）
の基質を、好適な反応条件下でアミノ基ドナーの存在下において項目１〜９のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチドと接触させる工程を含む、プロセス。
（項目２７）
式（Ｉ）の化合物、式（Ｉａ）の化合物、または化合物（１）が、少なくとも９０％のエナンチオマー過剰率で製造される、項目１７〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目２８）
式（Ｉ）の化合物、式（Ｉａ）の化合物、または化合物（１）が、少なくとも９９％のエナンチオマー過剰率で製造される、項目１７〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目２９）
前記アミノ基ドナーが、イソプロピルアミン、アラニン、３−アミノ酪酸、またはメチルベンジルアミンから選択される、項目１７〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３０）
前記アミノ基ドナーがイソプロピルアミンであり、任意選択的に約０．１〜約３．０Ｍ、０．２〜約２．５Ｍ、約０．５〜約２Ｍまたは約１〜約２Ｍの濃度である、項目２９に記載のプロセス。
（項目３１）
前記好適な反応条件が、約ｐＨ９．５〜約ｐＨ１１．５のｐＨを含む、項目１７〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３２）
前記好適な反応条件が、約４５℃〜約６０℃の温度を含む、項目１７〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３３）
前記好適な反応条件が、約３０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）でのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、項目１７〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３４）
前記好適な反応条件が、約５ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌ、または約５０ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの負荷での前記基質化合物を含む、項目１７〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３５）
前記好適な反応条件が、約０．５ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、または約０．５ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌの濃度で前記操作されたポリペプチドを含む、項目１７〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３６）
前記好適な反応条件が、（ａ）約１０〜２００ｇ／Ｌの基質化合物（２）の基質負荷；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド濃度；（ｃ）約０．１〜３ＭのＩＰＭ濃度；（ｄ）約０．１〜１ｍＭのＰＬＰ補助因子濃度；（ｅ）約３０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ濃度；（ｆ）約９．５〜１１．５のｐＨ；および（ｇ）約４５℃〜６０℃の温度を含む、項目２６に記載のプロセス。
（項目３７）
前記好適な反応条件が、（ａ）約５０ｇ／Ｌの基質化合物（２）；（ｂ）約２ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約５０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；（ｄ）約１Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｅ）約１ｍＭのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）；（ｆ）約ｐＨ１０；および（ｇ）約５０℃を含む、項目２６に記載のプロセス。
（項目３８）
さらに前記反応から式（Ｉ）の化合物、式（Ｉａ）の化合物、または化合物（１）を単離する工程を含む、項目１７〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目３９）
さらに、好適な反応溶媒中で式（Ｉａ）の化合物、または化合物（１）を薬学的に受容可能な酸と接触させることにより、前記化合物を薬学的に受容可能な塩に変換する工程を含む、項目１７〜２６のいずれか１項に記載のプロセス。
（項目４０）
前記薬学的に受容可能な酸がリン酸であり、そして前記薬学的に受容可能な塩が二水素リン酸塩である、項目３９に記載のプロセス。
（項目４１）
さらに前記反応溶媒から前記薬学的に受容可能な塩を結晶化させる工程を含む、項目４０に記載のプロセス。
（項目４２）
（２Ｒ）−４−オキソ−４−［３−（トリフルオロメチル）−５，６−ジヒドロ［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル］−１−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ブタン−２−アミンホスフェート（１：１）一水和物を調製するためのプロセスであって、好適な反応条件下でアミノ基ドナーの存在下において、化合物（２）の基質を項目１〜９のいずれか１項に記載の操作されたポリペプチドと接触させることにより、基質化合物（２）
を生成物化合物（１）
に変換する工程を含む、プロセス。
（項目４３）
前記アミノ基ドナーがイソプロピルアミンである、項目４２に記載の方法。
５．詳細な説明
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の対象物を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」に対する言及は、１つより多いポリペプチドを含む。
同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、相互交換可能であり、限定していると意図されていない。
様々な実施形態の説明が、用語「〜を含む」を使用する場合、当業者は、いくつかの具体的な場合において、ある実施形態が、語法「〜から本質的になる」または「〜からなる」を使用して代わりに説明され得ることを理解するだろうということが理解されるべきである。
図面を含む前述の全般的な説明と以下の詳細な説明の両方が、例示的であって、単なる説明に過ぎず、本開示を限定するものでないことがさらに理解されるべきである。
本明細書中で使用される項の見出しは、単に構成上の目的のものであって、説明される主題を限定すると解釈されるべきでない。
５．１ 省略形
遺伝的にコードされるアミノ酸に対して使用される省略形は、従来のものであり、以下のとおりである：
３文字の省略形が使用されるとき、明確に「Ｌ」もしくは「Ｄ」が前に付かないか、またはその省略形が使用される文脈から明らかでない限り、アミノ酸は、α−炭素（Ｃα）に関してＬ−配置またはＤ−配置であり得る。例えば、「Ａｌａ」は、α−炭素に関する配置を明記せずにアラニンを指し示すのに対し、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、それぞれＤ−アラニンおよびＬ−アラニンを指し示す。１文字省略形が使用されるとき、大文字は、α−炭素に関してＬ−配置のアミノ酸を指し示し、小文字は、α−炭素に関してＤ−配置のアミノ酸を指し示す。例えば、「Ａ」は、Ｌ−アラニンを指し示し、「ａ」は、Ｄ−アラニンを指し示す。ポリペプチド配列が、一続きの１文字省略形または３文字省略形（またはそれらの混合物）で示されるとき、それらの配列は、通常の慣行に従ってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）への方向で示される。
遺伝的にコードするヌクレオシドに対して使用される省略形は、従来のものであり、以下のとおりである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。明確に描写されない限り、省略されたヌクレオチドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドであり得る。ヌクレオシドは、個別でまたは一括で、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドであると明記され得る。核酸配列が、一続きの１文字省略形として示されるとき、それらの配列は、通常の慣行に従って５’から３’への方向で示され、リン酸は示されない。
５．２ 定義
本開示について言及するとき、本明細書中の説明において使用される専門用語および科学用語は、別段明確に定義されない限り、当業者が通常理解している意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するよう意図されている。
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）、ユビキチン化など）に関係なく、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーのことを表すために本明細書中で交換可能に使用される。Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物が、この定義に含まれる。
「トランスアミナーゼ」または「アミノトランスフェラーゼ」は、アミンドナー化合物の第１級アミン由来のアミノ基（−ＮＨ２）、電子対、およびプロトンをアミンアクセプター化合物のカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）に転移させ、それによりアミンドナー化合物をその対応するカルボニル化合物に、またカルボニルアクセプター化合物をその対応する第１級アミン化合物に変換する（例えば、スキーム１参照）酵素的能力を有するポリペプチドを指すもので、本明細書では互換的に使用されている。本明細書で使用されているトランスアミナーゼは、天然に存在する（野生型）トランスアミナーゼならびに人為操作により生成された天然には存在しない操作されたポリペプチドを包含する。
「アミノ基ドナー」または「アミノドナー」は、アミノ基をアクセプターカルボニル化合物（すなわち、アミノ基アクセプター）に供与し、それによりカルボニル副産物となることができるアミノ基含有化合物を指すもので、本明細書では互換的に使用されている。アミノ基ドナーは、一般構造式
（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、独立して見なされるとき、非置換であるかまたは１またはそれを超える酵素的に非阻害性の基で置換されたアルキル、アルキルアリール基、またはアリール基である）を有する。Ｒ１は、構造またはキラリティがＲ２と同一または異なり得る。基Ｒ１およびＲ２は、一緒になって、非置換であるか、置換されているか、または他の環と縮合されている環を形成し得る。典型的なアミノ基ドナーには、キラルおよびアキラルアミノ酸、ならびにキラルおよびアキラルアミンがある。
「キラルアミン」とは、一般式Ｒα−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｒβのアミンのことを指し、本明細書中ではその最も広い意味で使用され、それは、水素原子に加えて、（ｉ）キラルな環構造を形成する二価の基、または（ｉｉ）構造もしくはキラリティが互いと異なる２つの置換基（水素以外）を有する第２級炭素原子に結合された第１級アミノ基の存在によって特徴付けられる、異なる官能基タイプおよび混合された官能基タイプの多種多様の脂肪族化合物および脂環式化合物を含む。キラルな環構造を形成する二価の基としては、例えば、２−メチルブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，４−ジイル、ヘキサン−１，４−ジイル、ヘキサン−１，５−ジイル、２−メチルペンタン−１，５−ジイルが挙げられる。第２級炭素原子上の２つの異なる置換基（上記のＲαおよびＲβ）もまた、非常に様々であり得、それらには、アルキル、アリールアルキル、アラルキル、アリール、ハロ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルキルオキシ、低級アルキルチオ、シクロアルキル、カルボキシ、カルバルキルオキシ（ｃａｒｂａｌｋｙｌｏｘｙ）、カルバモイル、モノ−およびジ−（低級アルキル）置換カルバモイル、トリフルオロメチル、フェニル、ニトロ、アミノ、モノ−およびジ−（低級アルキル）置換アミノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アルキルカルボキサミド、アリールカルボキサミドなど、ならびに前述のものによって置換されたアルキル、アリールアルキルまたはアリールが含まれる。
「カルボニル副産物」とは、アミノ基ドナー上のアミノ基がアミノ基転移反応でアミノ基アクセプターに転移されたときにアミノ基ドナーから形成されるカルボニル化合物をいう。カルボニル副産物は、一般構造式
（式中、Ｒ１およびＲ２はアミノ基ドナーについての上記の意味である）を有する。
「アミノアクセプター」および「アミンアクセプター」、「ケト基質」は、本明細書では互換的に使用されており、トランスアミナーゼが媒介する反応（例、スキーム１参照）においてアミノ基ドナーからアミノ基を受け入れるカルボニル基含有化合物をいう。本開示の文脈において、トランスアミナーゼについてのアミノアクセプター化合物としては、とりわけ、本明細書でさらに説明されているように、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩａ）の化合物、化合物（２）、および化合物（４）を挙げることができる。
本明細書で使用されている「補助因子」は、反応を触媒する際に酵素と組み合わされて作動する非タンパク質化合物をいう。本明細書で使用されている「補助因子」は、ビタミンＢ６ファミリー化合物ＰＬＰ、ＰＮ、ＰＬ、ＰＭ、ＰＮＰ、およびＰＭＰを包含するもので、補酵素と称されることもある。
「ピリドキサール−リン酸」、「ＰＬＰ」、「ピリドキサール−５’−リン酸」、「ＰＹＰ」および「Ｐ５Ｐ」は、トランスアミナーゼ反応において補助因子として作用する化合物のことを指すために本明細書中で交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、ピリドキサールリン酸は、ＣＡＳ番号［５４−４７−７］である構造１−（４’−ホルミル−３’−ヒドロキシ−２’−メチル−５’−ピリジル）メトキシホスホン酸によって定義される。ピリドキサール−５’−リン酸は、ピリドキソール（ビタミンＢ６としても知られる）のリン酸化および酸化によってインビボで生成され得る。トランスアミナーゼ酵素を使用するアミノ基転移反応において、アミノドナーのアミン基は、補助因子に転移されることにより、ケト副産物を生成する一方で、ピリドキサール−５’−リン酸は、ピリドキサミンリン酸に変換される。ピリドキサール−５’−リン酸は、異なるケト化合物（アミノアクセプター）との反応によって再生される。ピリドキサミンリン酸からアミノアクセプターへのアミン基の転移により、アミンが生成され、補助因子が再生される。いくつかの実施形態において、ピリドキサール−５’−リン酸は、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）およびそれらのリン酸化された対応物；ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）およびピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）を含むビタミンＢ６ファミリーの他のメンバーによって置き換えられ得る。
「コード配列」とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の一部のことを指す。
「天然に存在する」または「野生型」とは、天然に見られる形態のことを指す。例えば、天然に存在するまたは野生型のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、天然での供給源から単離され得る、ヒトの操作によって意図的に改変されていない、生物の中に存在する配列である。
「組換え」または「操作された」または「天然に存在しない」は、例えば、細胞、核酸またはポリペプチドに関して使用されるとき、他の形では天然に存在しないであろう様式で改変された、材料またはその材料の自然のもしくは天然の形態に対応する材料のことを指すか、またはそれと同一であるが、合成の材料からおよび／もしくは組換え手法を用いる操作によって生成されるかもしくは得られる。非限定的な例としては、とりわけ、天然（非組換え）の形態の細胞内で見られないかまたは異なるレベルで別途発現される天然の遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
「配列同一性のパーセンテージ」および「パーセンテージ相同性」は、ポリヌクレオチド間およびポリペプチド間の比較のことを指すために本明細書中で交換可能に使用され、最適にアラインメントされた２つの配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定されるものであり、ここで、その比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は、それらの２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。上記パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定することにより、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算することにより、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算され得る。あるいは、上記パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとアラインメントされる位置の数を決定することにより、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算することにより、配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算され得る。当業者は、２つの配列をアラインメントするために利用可能な確立されたアルゴリズムが数多く存在することを認識する。比較のための最適な配列のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のローカルホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または目視検査（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を広く参照のこと）によって行われ得る。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３８９−３４０２にそれぞれ記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされたとき、マッチするかまたはいくつかの正値の閾値スコアＴを満たす、クエリー配列中の長さＷのショートワードを同定することによってスコアの高い配列対（ＨＳＰ）を同定する工程を含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの最初の隣接ワードヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見つけ出すための検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）として作用する。次いで、このワードヒットを、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方の方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（マッチする残基対に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリング行列を使用して、累積スコアが計算される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その達成された最大値から数量Ｘだけ低下したとき；１つ以上のスコアが負である残基アラインメントの累積に起因して、累積スコアが０以下になるとき；またはいずれかの配列の末端に到達したとき、停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、１１というワード長（Ｗ）、１０という期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３というワード長（Ｗ）、１０という期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列をデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照のこと）。配列アラインメントおよび％配列同一性の例示的な決定は、提供されるデフォルトのパラメータを使用して、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）内のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用し得る。
「参照配列」とは、配列比較のための基準として使用される規定の配列のことを指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長またはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、またはその核酸もしくはポリペプチドの完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは各々、（１）それらの２つの配列の間で類似している配列（すなわち、完全な配列の一部）を含み得、（２）それらの２つの配列の間で非常に異なる配列をさらに含み得るので、２つ（以上）のポリヌクレオチド間またはポリペプチド間の配列比較は、配列が類似している局所的な領域を同定し、比較するために、代表的には、それらの２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較することによって行われる。いくつかの実施形態において、「参照配列」は、１次アミノ酸配列に基づき得、ここで、その参照配列は、その１次配列中に１つ以上の変更を有し得る配列である。例えば、「Ｘ９に対応する残基にヒスチジンを有する配列番号２に基づく参照配列」とは、配列番号２のＸ９における対応する残基（チロシンである）がヒスチジンに変更された参照配列のことを指す。
「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約２０個連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的なセグメントのことを指し、ここで、ある配列が、少なくとも２０個連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得、比較ウィンドウ内の配列の一部が、それらの２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比べて２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。その比較ウィンドウは、２０個連続した残基より長い場合があり、必要に応じて、３０、４０、５０、１００またはそれより長いウィンドウを含む。
所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列のナンバリングの文脈において使用されるときの「〜に対応する」、「〜に関して」または「〜と比較して」は、その所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されるときの特定の参照配列の残基のナンバリングのことを指す。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、その所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置によってではなく、参照配列に関して指し示される。例えば、操作されたトランスアミナーゼのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、それらの２つの配列間の残基のマッチを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列とアラインメントされ得る。これらの場合、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基のナンバリングは、それとアラインメントされた参照配列に関して行われる。
「アミノ酸差異」または「残基差異」とは、参照配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と比較して、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異のことを指す。アミノ酸差異の位置は、通常、本明細書中で「Ｘｎ」と称され、ここで、ｎは、その残基差異が基づいている参照配列中の対応する位置のことを指す。例えば、「配列番号２と比べてＸ１２位における残基差異」とは、配列番号２の１２位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差異のことを指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが、１２位にチロシンを有する場合、「配列番号２と比べてＸ１２位における残基差異」は、配列番号２の１２位に対応するポリペプチドの位置における、チロシン以外の任意の残基のアミノ酸置換のことを指す。本明細書中のほとんどの場合において、ある位置における具体的なアミノ酸残基差異は、「ＸｎＹ」と示され、ここで、「Ｘｎ」は、上に記載されたような対応する位置を特定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドに見られるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドと異なる残基）の１文字識別子である。いくつかの場合において（例えば、表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃにおいて）、本開示は、従来の表記法「ＡｎＢ」によって表される具体的なアミノ酸差異も提供し、ここで、Ａは、参照配列中の残基の１文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチド配列中の残基置換の１文字識別子である。場合によっては、本開示のポリペプチドは、参照配列に対する１またはそれを超えるアミノ酸残基差異を含み得、参照配列に対する残基差異が存在する特定された位置のリストにより示されている。一部の実施形態において、１より多いアミノ酸がポリペプチドの特定残基位置で使用され得るとき、使用され得る様々なアミノ酸残基は「／」により分けられている（例、Ｘ１９２Ａ／Ｘ１９２Ｇ）。本開示は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の一方／または両方を含む１またはそれを超えるアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を含む。
「保存的なアミノ酸置換」とは、ある残基が、類似の側鎖を有する異なる残基で置換されることを指し、ゆえに、代表的には、ポリペプチド中のアミノ酸が、同一または類似の規定のアミノ酸クラス内のアミノ酸で置換されることを含む。例として、これらに限定されないが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンで置換され得；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンで置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンで置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンで置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換され；疎水性アミノ酸または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性アミノ酸または親水性アミノ酸で置換される。例示的な保存的置換を、下記の表１に提供する。
「非保存的置換」とは、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸による、ポリペプチド中のアミノ酸の置換のことを指す。非保存的置換は、規定の群内ではなく、規定の群間のアミノ酸を使用し得、（ａ）その置換の領域内のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンの代わりのプロリン）、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響する。例として、これらに限定されないが、例示的な非保存的置換は、塩基性アミノ酸または脂肪族アミノ酸で置換される酸性アミノ酸；小さいアミノ酸で置換される芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換される親水性アミノ酸であり得る。
「欠失」とは、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の除去による、そのポリペプチドに対する改変のことを指す。欠失は、操作されたトランスアミナーゼ酵素の酵素活性を保持しつつおよび／または改善された特性を保持しつつ、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸または２０個以上のアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の１０％まで、またはそのアミノ酸の総数の２０％までの除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部の部分および／または末端の部分に向けられ得る。様々な実施形態において、欠失は、連続したセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。
「挿入」とは、参照ポリペプチドからの１つ以上のアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変のことを指す。いくつかの実施形態において、改善された操作されたトランスアミナーゼ酵素は、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入、ならびに他の改善されたトランスアミナーゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部の部分、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端におけるものであり得る。本明細書中で使用される挿入には、当該分野で公知であるような融合タンパク質が含まれる。その挿入は、天然に存在するポリペプチドにおいて、連続したアミノ酸のセグメントであり得るか、または１つ以上のアミノ酸によって分断され得る。
本明細書中で使用される「フラグメント」とは、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列がその配列中の対応する位置と同一である、ポリペプチドのことを指す。フラグメントは、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長またはそれを超えるアミノ酸長、および完全長トランスアミナーゼポリペプチドの最大７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％であり得る。
「単離されたポリペプチド」とは、天然に伴う他の夾雑物、例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドのことを指す。この用語は、天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から取り出されたかまたは精製されたポリペプチドを包含する。改善されたトランスアミナーゼ酵素は、細胞内に存在し得るか、細胞培地中に存在し得るか、または溶解産物もしくは単離された調製物などの様々な形態で調製され得る。したがって、いくつかの実施形態において、改善されたトランスアミナーゼ酵素は、単離されたポリペプチドであり得る。
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、ポリペプチド種が、存在する優勢な種である（すなわち、モル濃度または重量に基づいて、それが、その組成物中の他の任意の個別の高分子種よりも豊富である）組成物のことを指し、通常、対象の種が、モル基準または％重量基準で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成するとき、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なトランスアミナーゼ組成物は、モル基準または％重量基準で、その組成物中に存在するすべての高分子種の約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上および約９８％以上を構成する。いくつかの実施形態において、対象の種は、本質的な均一性（すなわち、従来の検出方法では、組成物中に夾雑物種を検出できない）にまで精製され、ここで、その組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、高分子種と見なされない。いくつかの実施形態において、単離された改善されたトランスアミナーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
「立体選択性」とは、化学反応または酵素反応において、１つの立体異性体が別の立体異性体よりも優先的に形成されることを指す。立体選択性は、一方の立体異性体の形成が他方よりも好まれる場合、部分的であり得るか、またはただ１つの立体異性体が形成される場合、完全であり得る。立体異性体が、エナンチオマーであるとき、立体選択性は、両方の合計における一方のエナンチオマーの割合（代表的には、パーセンテージとして報告される）であるエナンチオ選択性と称される。それは、通常、式［主要なエナンチオマー−少数のエナンチオマー］／［主要なエナンチオマー＋少数のエナンチオマー］に従って計算される、鏡像体過剰率（ｅ．ｅ．）として当該分野において別の方法で（代表的には、パーセンテージとして）報告される。立体異性体が、ジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、２つのジアステレオマーの混合物中の一方のジアステレオマーの割合（代表的には、パーセンテージとして報告される）である、ジアステレオ選択性と称され、通常、その代わりにジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として報告される。混合物が２種を超えるジアステレオマーを含む場合、ジアステレオマー過剰率よりもジアステレオマーの比率または「ジアステレオマー比」を報告するのが一般的である。鏡像体過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率（ｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ ｅｘｃｅｓｓ）の一種である。「高度に立体選択的」とは、基質を、対応するキラルアミン生成物に、少なくとも約８５％の立体異性体過剰率で変換することができるトランスアミナーゼポリペプチドをいう。
「改善された酵素特性」とは、参照トランスアミナーゼ（例えば、野生型トランスアミナーゼ酵素または改善され操作された別のトランスアミナーゼ）と比べて任意の酵素特性の改善を示すトランスアミナーゼポリペプチドのことを指す。改善が望ましい酵素特性としては、酵素活性（基質のパーセント変換に関して表現され得る）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性プロファイル、補助因子の要件、阻害剤（例えば、基質阻害または生成物阻害）に対する不応性、立体特異性および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
「高い酵素活性」とは、参照トランスアミナーゼ酵素と比べて、比活性（例えば、生成された生成物／時間／重量タンパク質）の増大または基質から生成物へのパーセント変換（例えば、特定の量のトランスアミナーゼを使用したときの特定の時間内での開始量の基質から生成物へのパーセント変換）の増大によって表され得る、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの改善された特性のことを指す。酵素活性を決定する例示的な方法は、実施例に提供される。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔといった従来の酵素特性を含む、酵素活性に関する任意の特性が、影響され得、その変化が、高い酵素活性をもたらし得る。酵素活性の改善は、そのトランスアミナーゼポリペプチドが由来した天然に存在するトランスアミナーゼまたは別の操作されたトランスアミナーゼよりも、対応する野生型トランスアミナーゼ酵素の約１．１倍の酵素活性から、２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍またはそれを超える酵素活性までであり得る。具体的な実施形態において、操作されたトランスアミナーゼ酵素は、親のトランスアミナーゼ酵素の酵素活性の１．５倍〜５０倍、１．５倍〜１００倍またはそれを超える範囲の改善された酵素活性を示す。トランスアミナーゼ活性は、標準的なアッセイのいずれか１つによって（例えば、反応物または生成物の分光光度的な特性の変化をモニターすることによって）計測され得る。いくつかの実施形態において、生成された生成物の量は、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）誘導体化後に、ＵＶ吸光度または蛍光検出と組み合わされた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離によって計測され得る。酵素活性の比較は、本明細書中で詳細にさらに記載されるように、規定の酵素調製物、所定の条件下での規定のアッセイおよび１つ以上の規定の基質を用いて行われる。通常、溶解産物を比較するとき、宿主細胞によって産生される酵素の量および溶解産物中に存在する酵素の量の変動を最小にするために、同一の発現系および同一の宿主細胞を使用して、細胞数およびアッセイされるタンパク質の量が決定される。
「変換」とは、基質から対応する生成物への酵素的変換のことを指す。「パーセント変換」とは、特定の条件下、ある時間内で生成物に変換される基質のパーセントのことを指す。したがって、トランスアミナーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質から生成物への「パーセント変換」として表現され得る。
「熱安定」とは、ある時間（例えば、０．５〜２４時間）にわたって高温（例えば、４０〜８０℃）に曝露された後に、野生型酵素と比べて類似の活性（例えば、６０％〜８０％超）を維持するトランスアミナーゼポリペプチドのことを指す。
「溶媒安定」とは、ある時間（例えば、０．５〜２４時間）にわたって様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に曝露された後に、野生型酵素と比べて類似の活性（例えば、６０％〜８０％超）を維持するトランスアミナーゼポリペプチドのことを指す。
「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われた後、様々であるがより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」とは、標的ＤＮＡが、標的ポリヌクレオチドに対する約９０％超の同一性とともに、その標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的な核酸に結合することを可能にする条件のことを指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、４２℃の５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションの後の、４２℃の０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳでの洗浄に等価な条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」とは、規定のポリヌクレオチド配列に対する溶液条件下で測定されたときの熱融解温度Ｔｍからの約１０℃以下の条件のことを広く指す。いくつかの実施形態において、高ストリンジェンシー条件とは、６５℃の０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定なハイブリッドを形成するそれらの核酸配列だけのハイブリダイゼーションを可能にする条件のことを指す（すなわち、ハイブリッドが、６５℃の０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中で安定でない場合、それは、本明細書中で企図されるような高ストリンジェンシー条件下では安定でないだろう）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃の５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ’ｓ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳに等価な条件におけるハイブリダイゼーションの後の、６５℃の０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳでの洗浄によって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃の０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中でのハイブリダイズに等価な条件でのハイブリダイズおよび６５℃の０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣでの洗浄である。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件ならびに中程度にストリンジェントな条件は、上で引用された参考文献に記載されている。
「コドンが最適化された」とは、コードされるタンパク質が目的の生物においてより効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを特定の生物において優先的に使用されるコドンに変更することを指す。ほとんどのアミノ酸が、「同義語」または「同義の」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点で遺伝暗号は縮重しているが、特定の生物のコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）は、ランダムではなく、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、低コピー数のタンパク質と比べて高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの集合したタンパク質コード領域に関して、より高い場合がある。いくつかの実施形態において、トランスアミナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な生成のためにコドンが最適化される場合がある。
「調節配列」は、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有益なすべての構成要素を含むと本明細書中でいわれる。各調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然であり得るか、または外来性であり得る。そのような調節配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低でも、調節配列は、プロモーターならびに転写および翻訳の停止シグナルを含む。調節配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と調節配列とのライゲーションを容易にする具体的な制限酵素認識部位を導入する目的でリンカーとともに提供され得る。
「作動可能に連結された」は、調節配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示するかまたは制御するように、その調節配列が、目的のポリヌクレオチドに対する位置に適切に配置された（すなわち、機能的な関係性で）配置として本明細書中で定義される。
「プロモーター配列」とは、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列のことを指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写調節配列を含む。プロモーターは、変異体プロモーター、切断型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含む、最適な宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞と同種または異種である細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得られることがある。
「アルキル」は、直鎖または分枝状の、１〜１８個の炭素原子、特に１〜８個の炭素原子、より特定すれば１〜６個の炭素原子の基をいう。特定された数の炭素原子を伴うアルキルは括弧で示され、例えば、（Ｃ１−Ｃ４）アルキルは１〜４個の炭素原子のアルキルをいう。
「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含むが、必要に応じて１つより多い二重結合を含んでいてもよい直鎖または分枝状の、２〜１２個の炭素原子の基をいう。
「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含むが、必要に応じて１つより多い三重結合を含んでいてもよく、また必要に応じて１またはそれを超える二重結合部分を含んでいてもよい直鎖または分枝状の、２〜１２個の炭素原子の基をいう。
「アリール」は、単環を有する（例、フェニル）か、または多環式縮合環を有する（例、ナフチルまたはアントリル）５〜１４個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環式基をいう。多環式縮合環については、環の少なくとも１つは芳香族である。代表的なアリールには、フェニル、ピリジル、ナフチルなどがある。
「アリールアルキル」は、アリール部分で置換されたアルキルをいう。代表的なアリールアルキル基には、ベンジル、フェネチルなどがある。
「アリールアルケニル」は、アリール基で置換された本明細書で定義されたアルケニルをいう。
「アリールアルキニル」は、アリール基で置換された本明細書で定義されたアルキニルをいう。
「ヘテロアリール」は、環内に酸素、窒素および硫黄から選択される１〜４個の環ヘテロ原子を含む５〜１４個の環原子の芳香族複素環基をいう。ヘテロアリール基は、単環（例、ピリジルまたはフリル）または多環式縮合環（例、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有し得る。多環式縮合環については、環の少なくとも１つは芳香族である。
「ヘテロアリールアルキル」は、本明細書で定義されたヘテロアリール部分で置換されたアルキルをいう。
「ヘテロアリールアルケニル」は、本明細書で定義されたヘテロアリール基で置換されたアルケニルをいう。
「ヘテロアリールアルキニル」は、本明細書で定義されたヘテロアリール部分で置換されたアルキニルをいう。
「シクロアルキル」は、単環式環または多環式縮合環を有する３〜１２個の炭素原子の環状アルキル基をいう。代表的なシクロアルキル基には、例を挙げると、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル、１−メチルシクロプロピル、２−メチルシクロペンチル、２−メチルシクロオクチルなどの単環構造、またはアダマンチルなどの架橋環系を含む多環構造がある。
「複素環」および互換的には「ヘテロシクロアルキル」は、単環または多環式縮合環、環内に窒素、硫黄または酸素から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する３〜１４個の環原子を有する飽和または不飽和基をいう。複素環基は、単環（例、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または多環式縮合環（例、インドリニル、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル）を有し得る。代表的な複素環およびヘテロアリールには、限定される訳ではないが、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどがある。
「シクロアルキルアルキル」は、本明細書で定義されたシクロアルキル部分で置換されたアルキルをいう。
「シクロアルキルアルケニル」は、本明細書で定義されたシクロアルキル部分で置換されたアルケニルをいう。
「シクロアルキルアルキニル」は、本明細書で定義されたシクロアルキル部分で置換されたアルキニルをいう。
「ヘテロシクロアルキルアルキル」は、本明細書で定義されたヘテロシクロアルキル部分で置換されたアルキルをいう。
「ヘテロシクロアルケニル」は、本明細書で定義されたヘテロシクロアルキル部分で置換されたアルケニルをいう。
「ヘテロシクロアルキルアルキニル」は、本明細書で定義されたヘテロシクロアルキル部分で置換されたアルキニルをいう。
「アルコキシ」または「アルキルオキシ」は基アルキル−Ｏ−をいい、ここで、アルキル基は前記で定義されており、同じく前記で定義された必要に応じて置換されていてもよいアルキル基を含む。
「アミノ」は基−ＮＨ２をいう。置換アミノは、基−ＮＨＲ’，ＮＲ’Ｒ’およびＮＲ’Ｒ’Ｒ’をいい、ここで各Ｒ’は互いに独立して置換または非置換アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、アルキルオキシ、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルキルオキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから選択される。典型的なアミノ基には、限定されるが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル−オキシ−スルファミノなどがある。
「カルボキシ」は、−ＣＯＯＨをいう。
「カルボニル」は−Ｃ（Ｏ）−をいい、様々な置換基を有することにより、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステルおよびケトンを含む種々のカルボニル基を形成し得る。
「ヒドロキシ」は−ＯＨをいう。
「シアノ」は−ＣＮをいう。
「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードをいう。
「スルホニル」は−ＳＯ２−をいう。置換スルホニルは−ＳＯ２Ｒ’をいい、ここでＲ’は下記の好適な置換基である。
例えば縮合アリールまたは縮合ヘテロアリールにおける「縮合」または「縮合環」は、２またはそれを超える環が少なくとも２個の環原子を共通して有するように連結された２またはそれを超える環をいう。縮合アリールは、環の少なくとも１つがアリールである縮合環をいう。縮合ヘテロアリールは、環の少なくとも１つがヘテロアリールである縮合環をいう。
別段特定されない限り、「置換された」とは、前述の基の中の水素によって占有される位置を、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルキルオキシ、置換アルキルオキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルキルオキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキルオキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルキルオキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ（ａｍｉｄｏｘｉｍｏ）、ヒドロキサモイル（ｈｙｄｒｏｘａｍｏｙｌ）、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、複素環、（複素環）オキシおよび（複素環）アルキルによって例証されるがこれらに限定されない置換基での置き換えをいい；好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。開殻の原子価（ｏｐｅｎ ｖａｌｅｎｃｅ）が、これらの置換基上に存在する場合、それらは、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールおよび／または複素環基でさらに置換され得ること、これらの開殻の原子価が、炭素上に存在する場合、それらは、ハロゲンおよび酸素、窒素または硫黄に結合された置換基によってさらに置換され得ること、ならびに複数のそのような開殻の原子価が存在する場合、これらの基はつなぎ合わされることにより、結合の直接的な形成または新しいヘテロ原子、好ましくは、酸素、窒素もしくは硫黄との結合の形成によって、環を形成し得ることが、理解される。水素を置換基で置き換えることが、許容できない不安定性を本発明の分子にもたらさず、その他の点で化学的に妥当であるならば、上記の置換を行うことができることがさらに理解される。
「随意の」または「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が、生じてもよいし生じなくてもよいこと、ならびにその記載が、その事象または状況が生じる場合およびその事象または状況が生じない場合を含むことを意味する。当業者は、１つ以上の随意の置換基を含むと記載される任意の分子に関して、立体的に実際的であるおよび／または合成的にあり得る化合物だけが含まれると意味されることを理解するだろう。「必要に応じて置換される」は、１つの用語の化学基または一連の化学基におけるその後のすべての修飾語について言及する。例えば、用語「必要に応じて置換されるアリールアルキル」において、その分子の「アルキル」部分および「アリール」部分は、置換されてもよいし置換されなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されるアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」の場合、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール基は、他のものとは無関係に、置換されてもよいし置換されなくてもよい。
「保護基」とは、ある分子の中の反応性の官能基に付着されたとき、官能基の反応性をマスクするか、減少させるかまたは妨げる原子の群のことを指す。代表的には、保護基は、合成の経過中に望むとおりに選択的に除去され得る。保護基の例は、Ｗｕｔｓ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｅ，“Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”４ｔｈ Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）およびＨａｒｒｉｓｏｎら、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．１−８，１９７１−１９９６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹに見られる。保護基を有し得る官能基としては、ヒドロキシ、アミノおよびカルボキシ基が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なアミノ保護基としては、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（「ＣＢＺ」）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）、トリメチルシリル（「ＴＭＳ」）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（「ＳＥＳ」）、トリチル基および置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（「ＦＭＯＣ」）、ニトロ−ベラトリルオキシカルボニル（「ＮＶＯＣ」）などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的なヒドロキシル保護基には、限定される訳ではないが、ヒドロキシル基がアシル化されている（例、メチルおよびエチルエステル、酢酸基もしくはプロピオン酸基またはグリコールエステル）か、またはアルキル化されているもの、例えばベンジルおよびトリチルエーテル、ならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテル（例、ＴＭＳまたはＴＩＰＰＳ基）およびアリルエーテルなどが含まれる。他の保護基は、本明細書で示した参考文献で見い出され得る。
「脱離基」は、概して化学反応において別の原子または部分によって置き換えられることが可能な任意の原子または部分のことを指す。より詳細には、脱離基とは、求核剤（例えば、アミン、チオール、アルコールまたはシアニド）によって容易に置き換えられるおよび置換される原子または部分のことを指す。そのような脱離基は、周知であり、それらには、カルボキシレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）、およびアルキルオキシ基が含まれる。脱離基の非限定的な特徴および例は、例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｆｒａｎｃｉｓ Ｃａｒｅｙ（１９９２），３２８−３３１頁；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ａｎｄｒｅｗ ＳｔｒｅｉｔｗｉｅｓｅｒおよびＣｌａｙｔｏｎ Ｈｅａｔｈｃｏｃｋ（１９８１），１６９−１７１頁；ならびにＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ｊｏｈｎ ＭｃＭｕｒｒｙ，Ｂｒｏｏｋｓ／Ｃｏｌｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００），３９８頁および４０８頁に見られ；これらのすべてが参照により本明細書中に援用される。
「好適な反応条件」とは、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドが、基質を所望のアミノ生成物化合物に変換することができる（例えば、化合物（２）から化合物（１）への変換）、生体触媒反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補助因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝剤、共溶媒などの範囲）のことを指す。例示的な「好適な反応条件」は、本開示において提供され、実施例によって説明される。
「化合物負荷」または「酵素負荷」におけるような「負荷」とは、反応の開始時における反応混合物中のある成分の濃度または量のことを指す。
生体触媒によって媒介されるプロセスの文脈における「基質」とは、その生体触媒による作用を受ける化合物または分子のことを指す。例えば、本明細書中に開示されるプロセスにおけるトランスアミナーゼ生体触媒に対する例示的な基質は、化合物（２）であり、その調製については２００８年２月５日付、米国特許７，３２６，７０８ Ｂ２に記載されている。
生体触媒によって媒介されるプロセスの文脈における「生成物」とは、その生体触媒の作用の結果生じる化合物または分子のことを指す。例えば、本明細書中に開示されるプロセスにおけるトランスアミナーゼ生体触媒の例示的な生成物は、化合物（１）である。
５．３ トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド
本開示は、一部の実施形態において、薬学的有効成分シタグリプチンである化合物（１）が含まれ得る、構造式（Ｉ）のキラルアミン生成物を製造するための構造式（ＩＩ）のアミノアクセプター基質化合物の選択的アミノ基転移（スキーム３参照）に有用なトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド（本明細書では、「操作されたトランスアミナーゼポリペプチド」とも称す）を提供する。したがって、一実施態様において、本開示は、スキーム２で示すように基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換することができるトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドに関するものである。さらに、本開示は、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む関連したベクターおよび宿主細胞、該操作されたポリペプチドを製造する方法、ならびに好適な反応条件を含む、該操作されたポリペプチドを使用する方法を提供する。
本開示の操作されたポリペプチドは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＡＫ３９７５３．１，ＧＩ：３３６０８８３４１）の野生型トランスアミナーゼポリペプチドと比較して、また本開示の操作されたポリペプチドの定向進化のための出発バックボーン配列として使用された、配列番号２の参照用の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較して改善された酵素特性（増大した立体選択性など）を有するように操作された天然には存在しないトランスアミナーゼである。配列番号２の参照用の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８の野生型トランスアミナーゼに対して以下の２８のアミノ酸差異を有する：Ｓ８Ｐ、Ｙ６０Ｆ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ６２Ｔ、Ｖ６５Ａ、Ｖ６９Ｔ、Ｄ８１Ｇ、Ｍ９４Ｉ、Ｉ９６Ｌ、Ｆ１２２Ｍ、Ｓ１２４Ｔ、Ｓ１２６Ｔ、Ｇ１３６Ｆ、Ｙ１５０Ｓ、Ｖ１５２Ｃ、Ａ１６９Ｌ、Ｖ１９９Ｉ、Ａ２０９Ｌ、Ｇ２１５Ｃ、Ｇ２１７Ｎ、Ｓ２２３Ｐ、Ｌ２６９Ｐ、Ｌ２７３Ｙ、Ｔ２８２Ｓ、Ａ２８４Ｇ、Ｐ２９７Ｓ、Ｉ３０６Ｖ、およびＳ３２１Ｐ。
本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、ある一定の工業的に関連した条件のもと化合物（２）から化合物（１）への効率的な変換のために配列番号２の定向進化により生成されたもので、配列番号２の参照用の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと比較したところによると１またはそれを超える残基差異を有する。これらの残基差異は、様々な酵素特性の改善、特に高められた活性、高められた立体選択性、高められた安定性、ならびに高められた基質および／または生成物濃度の許容範囲（例、低減された生成物阻害）と関連している。したがって、一部の実施形態において、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、好適な反応条件のもと配列番号２の参照ポリペプチドの活性と比較して少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍またはそれを超えて高められた活性で基質化合物（２）を化合物（１）に変換することができる。一部の実施形態において、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、好適な反応条件のもと、約４８時間、約３６時間、約２４時間またはさらにはそれより短時間の反応時間で、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の変換パーセントで化合物（２）の基質を化合物（１）に変換することができる。一部の実施形態において、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、好適な反応条件のもと、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるエナンチオマー過剰率で化合物（２）を化合物（１）に変換することができる。
本開示は、偶数番号が付された配列識別子の配列番号４〜３０６のアミノ酸配列を含む多くの例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。これらの例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２と比較して化合物（２）から化合物（１）への変換についての改善された特性と関連した以下の１またはそれを超える残基差異を含むアミノ酸配列を含む：（ａ）Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｒ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ；およびＸ２４１Ｒ；および／または（ｂ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ３３Ｌ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１１７Ｇ；Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；およびＸ４１Ｋ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｈ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６０Ｖ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６８Ａ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２６Ｍ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３５Ｉ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９２Ｆ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２２４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９３Ｍ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８３Ｓ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｉ；およびＸ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、およびＸ２１５Ｇから選択される配列番号２と比較した場合の残基差異の組合せ。
場合によっては、例示的な操作されたポリペプチドが、Ｘ５Ｋ、Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ａ／Ｇ、Ｘ４４Ｑ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ４９Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ５５Ｌ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１０８Ｖ、Ｘ１１７Ｇ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５０Ａ／Ｆ、Ｘ１５２Ｓ／Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ１６４Ｐ、Ｘ１６５Ｎ、Ｘ１８２Ｔ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２１８Ｍ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２６７Ｖ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ、およびＸ３２８Ｉから選択される配列番号２との比較による１またはそれを超える残基差異をさらに含むアミノ酸配列を有する。Ｃ２１５Ｇ。場合によっては、例示的な操作されたポリペプチドが、Ｇ３６Ｃ、Ｉ４１Ｃ、Ｉ４１Ｆ、Ｉ４１Ｋ、Ｉ４１Ｍ、Ｉ４１Ｎ、Ｉ４１Ｒ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｄ、Ｐ４８Ｅ、Ｐ４８Ｇ、Ｐ４８Ｋ、Ｐ４８Ｔ、Ａ５１Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｆ、Ｍ１２２Ｑ、Ｙ１４８Ｑ、Ｃ１５２Ｔ、Ｑ１５５Ａ、Ｑ１５５Ｉ、Ｑ１５５Ｋ、Ｑ１５５Ｔ、Ｑ１５５Ｖ、Ｃ２１５Ｈ、Ｃ２１５Ｌ、Ｙ２７３Ｈ、Ｌ３２５Ｍ、およびＡ２４１Ｒ；または（ｂ）Ａ５Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｐ３３Ｌ、Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｇ；Ｐ３３Ｌ、Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ａ１０９Ｓ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｐ３３Ｌ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｈ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ．およびＣ２１５Ｈ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｋ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｈ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｃ２１５Ｈ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｃ２１５Ｈ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＡ２４１Ｒ；Ｇ３６Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｖ、およびＣ２１５Ｈ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５ＧおよびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｋ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＦ１６０Ｐ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｃ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｔ、Ｑ１５５Ｖ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ，Ｗ１５６Ｑ，Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｉ４１Ｆ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｅ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＷ１５６Ｑ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｅ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｃ２１５Ｌ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｌ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＦ１６０Ｐ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｉ４１Ｋ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｉ４１Ｎ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＦ１６０Ｐ；Ｉ４１Ｎ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ；およびＷ１５６Ｑ；Ｉ４１Ｎ、Ｓ４９Ｔ、Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｆ１６０Ｐ、Ｄ１６５Ｎ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ａ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ａ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ａ４４Ｑ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｐ４８Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｅ１１７Ｇ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ４９Ｔ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ５５Ｌ、Ｔ１２６Ａ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｌ２１８Ｍ、およびＡ２７０Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ６０Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｔ６８Ａ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｔ６９Ｓ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｎ７６Ｓ、Ｔ１２６Ａ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｓ１８２Ｔ、Ｌ２１８Ｍ、Ａ２７０Ｔ、およびＶ３２８Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｉ１０８Ｖ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｖ、Ｗ１５６Ｑ、およびＦ１６０Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｅ１１７Ｇ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ，Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｍ１２２Ｑ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｔ、Ｑ１５５Ｖ、Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｔ１２６Ｍ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｐ１３５Ｉ、Ｆ１３６Ｙ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｗ１９２Ｆ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＧ２２４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｙ、Ｃ２１５Ｇ、Ｓ２８２Ｖ、およびＧ２８４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｉ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｙ、Ｃ２１５Ｇ、およびＧ２８４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｆ１３６Ｙ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、Ｓ２８２Ｖ、およびＧ２８４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ａ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｌ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、Ｃ２１５Ｇ、およびＡ２４１Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、Ｗ１５６Ｑ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｇ１９３Ｍ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ
５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、Ｓ２８２Ｖ、およびＧ２８４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＴ２８３Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＧ２８４Ｉ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｙ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＣ２１５Ｈ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｆ１６０Ｐ、Ｃ２１５Ｌ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｗ１５６Ｑ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｒ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｆ１６０Ｐ、およびＣ２１５Ｌ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｃ２１５Ｇ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｓ１５０Ｆ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＩ２６７Ｖ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｉ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｋ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｌ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、およびＱ１５５Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＦ１６０Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｑ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＷ１５６Ｓ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ，Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、Ｓ１８２Ｔ、Ｌ２１８Ｍ、およびＡ２７０Ｔ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｇ；Ｅ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｔ、およびＣ２１５Ｌ；およびＥ４２Ｇ、Ｓ５４Ｐ、Ｃ１５２Ｓ、Ｑ１５５Ｖ、およびＷ１５６Ｓから選択される残基差異の組合せから選択される配列番号２との比較による１またはそれを超える残基差異をさらに含むアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態において、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、好適な反応条件のもと配列番号２の参照ポリペプチドの基質許容範囲と比較して基質の存在についての高められた許容範囲で化合物（２）を化合物（１）に変換することができる。したがって、一部の実施形態において、操作されたポリペプチドは、好適な反応条件のもと、約７２時間、約４８時間、約３６時間、約２４時間またはさらにはそれより短時間の反応時間で、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の変換パーセントで、少なくとも約１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、約３０ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌ、約５０ｇ／Ｌ、約７０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌの基質負荷濃度の存在下、化合物（２）の基質を化合物（１）に変換することができる。
上記の操作されたポリペプチドの改善された特性が得られる好適な反応条件は、ポリペプチド、基質、アミンドナー、補助因子、緩衝剤、共溶媒の濃度または量、ｐＨ、および／または温度および反応時間を含む条件に関して決定され得る。一部の実施形態において、好適な反応条件は、下記および実施例に記載のＨＴＰ、ＳＦＰまたはＤＳＰアッセイ条件を含む。
本開示の例示的な天然には存在しない操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの構造および機能に関する情報を、下記表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示す。奇数番号が付された配列識別子（すなわち、配列番号）は、偶数番号が付された配列番号により提供されるアミノ酸（ａａ）配列をコードするヌクレオチド（ｎｔ）配列を示し、これらの配列は、この開示に添えた電子配列表ファイルで提供される（これらについては、参照により援用する）。アミノ酸残基差異は、配列番号２の参照ポリペプチド配列との比較に基づいており、その遺伝子配列を、ある一定の工業的に有用な反応条件下での化合物（２）から化合物（１）への変換において高められた活性を有する操作されたポリペプチドの定向進化のための出発点として使用した。各操作されたポリペプチドの活性は、高スループット（ＨＴＰ）アッセイ（一次スクリーニングとして）を用いて、また場合によっては、２次的振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）および／または下流加工（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）（ＤＳＰ）粉末アッセイを用いて決定された。表２Ａに提供されたＨＴＰアッセイ値は、表に示されたアッセイ反応条件に従って９６ウェルプレート形式において大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の透明な細胞溶解産物を用いて決定された。ＳＦＰおよびＤＳＰ酵素調製物は、操作されたポリペプチドのより精製された粉末調製物を提供する。表２ＢにおけるＳＦＰアッセイ値は、表に示された反応条件を用い、５ｍＬバイアル形式で操作されたポリペプチドのＳＦＰを用いて決定された。表２ＣにおけるＤＳＰアッセイ値は、表に示された反応条件を用い、５ｍＬバイアル形式で操作されたポリペプチドのＤＳＰ粉末を用いて決定された。ＨＴＰ、ＳＦＰおよびＤＳＰ調製物およびアッセイのさらなる詳細は実施例に記載されている。
表２Ａ〜２Ｃに示されているように、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子のトランスアミナーゼ活性を有する例示的な操作されたポリペプチドは、配列番号２との比較による以下の残基差異のうちの１またはそれを超えて含む：Ｘ５Ｋ、Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ａ／Ｇ、Ｘ４４Ｑ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ４９Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ５５Ｌ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１０８Ｖ、Ｘ１１７Ｇ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５０Ａ／Ｆ、Ｘ１５２Ｓ／Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ１６４Ｐ、Ｘ１６５Ｎ、Ｘ１８２Ｔ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２１８Ｍ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２６７Ｖ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ、およびＸ３２８Ｉ。表２Ａ〜２Ｃ（および実施例１）で開示された配列番号４〜３０６の例示的な操作されたポリペプチドの特性に基づくと、化合物（２）から化合物（１）への変換についての高められた活性、高められた熱、溶媒、および／またはｐＨ安定性などの改善された酵素特性は、配列番号２との比較による少なくとも以下の残基差異と関連している。一部の実施形態において、本開示は、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ならびに（ａ）Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｒ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ；およびＸ２４１Ｒから選択される配列番号２との比較によるアミノ酸残基差異、および／または（ｂ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ３３Ｌ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１１７Ｇ；Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；およびＸ４１Ｋ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｈ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６０Ｖ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６８Ａ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２６Ｍ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３５Ｉ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９２Ｆ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２２４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９３Ｍ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８３Ｓ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｉ；およびＸ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、およびＸ２１５Ｇから選択される残基差異の組み合わせを有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。
当業者にとって明らかなように、前述の残基位置および各残基位置についての特異的アミノ酸残基を個々に、または様々な組み合わせとして使用することにより、とりわけ酵素活性、基質／生成物優先性、立体選択性、基質／生成物の許容範囲、および高められた温度、溶媒および／またはｐＨなどの様々な条件下での安定性を含む、所望の改善された特性を有するトランスアミナーゼポリペプチドを合成することができる。
本明細書で提供されている指針に照らすと、さらに、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチドはいずれも、例えば、表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃにおける他のポリペプチドおよびそこに記載された他の残基位置からの様々なアミノ酸差異の新たな組み合わせで付加することによる進化の後続ラウンドにより、他の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを合成するための出発アミノ酸配列として使用され得ると考えられる。それより前の進化のラウンドを通して未変化のまま維持されていた位置にアミノ酸差異を含ませることにより、さらなる改善を生み出すことができる。
したがって、一部の実施形態において、本開示は、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。また一部の実施形態において、本開示は、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、ならびに（ａ）Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｒ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ；およびＸ２４１Ｒから選択される配列番号２との比較によるアミノ酸残基差異、および／または（ｂ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ３３Ｌ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１１７Ｇ；Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；およびＸ４１Ｋ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｈ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６０Ｖ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６８Ａ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２６Ｍ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３５Ｉ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９２Ｆ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２２４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９３Ｍ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８３Ｓ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｉ；およびＸ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、およびＸ２１５Ｇから選択される残基差異の組み合わせを有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。
一部の実施形態において、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子から選択された参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える同一性、ならびに（ａ）から選択される１またはそれを超えるアミノ酸残基差異を有するアミノ酸配列アミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本開示は、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性ならびに（ａ）Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｒ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ；およびＸ２４１Ｒから選択される配列番号２との比較によるアミノ酸残基差異、および／または（ｂ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ３３Ｌ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１１７Ｇ；Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；およびＸ４１Ｋ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｈ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６０Ｖ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６８Ａ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２６Ｍ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３５Ｉ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９２Ｆ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２２４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９３Ｍ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８３Ｓ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｉ；およびＸ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、およびＸ２１５Ｇから選択される残基差異の組み合わせを有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。
一部の実施形態において、参照配列は、配列番号４、４０、６２、６４、７０、７８、１２２、１３０、１６０、１７８、および１９２から選択される。一部の実施形態において、参照配列は配列番号４である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号４０である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号６２である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号６４である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号７０である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号７８である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号１２２である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号１３０である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号１６０である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号１７８である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号１９２である。
一部の実施形態において、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子を有する配列の１つと少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性、ならびに配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子を有する配列のいずれか１つに存在する配列番号２との比較によるアミノ酸残基差異の組み合わせを有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子から選択されるアミノ酸配列を含む。
上記で特定した残基位置に加えて、本明細書で開示されている操作されたトランスアミナーゼポリペプチドはいずれも、他の残基位置、すなわちＸ５、Ｘ３３、Ｘ３６、Ｘ４１、Ｘ４２、Ｘ４４、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ５１、Ｘ５４、Ｘ５５、Ｘ７６、Ｘ１０８、Ｘ１１７、Ｘ１２２、Ｘ１２６、Ｘ１４８、Ｘ１５０、Ｘ１５２、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１６０、Ｘ１６４、Ｘ１６５、Ｘ１８２、Ｘ２１５、Ｘ２１８、Ｘ２４１、Ｘ２６７、Ｘ２７０、Ｘ２７３、Ｘ３２５、およびＸ３２８以外の残基位置に配列番号２の参照ポリペプチド配列に対する残基差異をさらに含むことができる。これらの他の残基位置における残基差異は、ポリペプチドのトランスアミナーゼ活性を変えることなくアミノ酸配列の追加的変異をもたらし得る。したがって、一部の実施形態において、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子を有するポリペプチドから選択される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのいずれか１つのアミノ酸残基差異に加えて、該配列は、配列番号２との比較による他のアミノ酸残基位置に１−２、１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−８、１−９、１−１０、１−１１、１−１２、１−１４、１−１５、１−１６、１−１８、１−２０、１−２２、１−２４、１−２６、１−３０、１−３５、１−４０、１−４５、１−５０、１−５５、または１−６０残基差異をさらに含み得る。一部の実施形態において、参照配列との比較によるアミノ酸残基差異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０残基位置であり得る。一部の実施形態において、他のアミノ酸残基位置での残基差異は、配列番号２の野生型ポリペプチドまたは配列番号２の操作されたポリペプチドの参照配列と比較した保存的置換および／または非保存的置換を含み得る。
配列番号２の野生型配列に対する他の位置でのアミノ酸残基差異および酵素機能に対するこれらの差異の影響は、２０１２年１０月２３日付、米国特許８，２９３，５０７ Ｂ２、２０１１年１月１３日公開の、ＰＣＴ公開国際公開２０１１００５４７７Ａ１、および２０１２年２月２３日公開の、ＰＣＴ公開国際公開第２０１２０２４１０４号（これらはそれぞれ参照で援用する）で開示された他の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドについて記載されている。したがって、一部の実施形態において、配列番号２の野生型配列との比較によるアミノ酸差異の１つ以上もまた、Ｘ２；Ｘ４；Ｘ５；Ｘ７；Ｘ８；Ｘ９；Ｘ１０；Ｘ１１；Ｘ１４；Ｘ１８；Ｘ２２；Ｘ２５；Ｘ２６；Ｘ２７；Ｘ２８；Ｘ３０；Ｘ３７；Ｘ３８；Ｘ４１；Ｘ４４；Ｘ４８；Ｘ４９；Ｘ５０；Ｘ５５；Ｘ５８；Ｘ６０；Ｘ６５；Ｘ８１；Ｘ８２；Ｘ９４；Ｘ９６Ｌ；Ｘ１０２；Ｘ１０８；Ｘ１２０；Ｘ１３５；Ｘ１３７；Ｘ１３８；Ｘ１４１；Ｘ１４２；Ｘ１４６；Ｘ１４８；Ｘ１６３；Ｘ１６３；Ｘ１６４；Ｘ１６９；Ｘ１７１；Ｘ１７８；Ｘ１８１；Ｘ１８２；Ｘ２０４；Ｘ２０９；Ｘ２１０；Ｘ２１１；Ｘ２１３；Ｘ２１５；Ｘ２１７；Ｘ２１８；Ｘ２２３；Ｘ２２５；Ｘ２３０；Ｘ２４２；Ｘ２４５；Ｘ２５２；Ｘ２６５；Ｘ２９２；Ｘ２９７；Ｘ３０２；Ｘ３０６；Ｘ３２１；Ｘ３２８およびＸ３２９から選択される残基位置で本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドに導入され得る。特に、前述の位置におけるアミノ酸残基を選ぶ場合、以下のものから選択され得る：Ｘ２Ｋ／Ｑ／Ｓ；Ｘ４Ｉ／Ｙ；Ｘ５Ｋ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｖ；Ｘ７Ａ；Ｘ８Ｐ／Ｔ；Ｘ９Ｎ／Ｑ／Ｓ；Ｘ１０Ｖ；Ｘ１１Ｋ；Ｘ１４Ｒ；Ｘ１８Ｃ；Ｘ２２Ｉ；Ｘ２５Ｑ；Ｘ２６Ｈ；Ｘ２７Ｔ；Ｘ２８Ｐ；Ｘ３０Ｍ／Ｑ；Ｘ３７Ｒ；Ｘ３８Ｇ；Ｘ４１Ｈ／Ｓ／Ｆ；Ｘ４４Ｑ／Ｖ；Ｘ４８Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｑ／Ｖ；Ｘ４９Ｔ；Ｘ５０Ｌ；Ｘ５５Ｖ／Ｌ；Ｘ５８Ｌ；Ｘ６０Ｆ；Ｘ６５Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇ／Ｓ；Ｘ８１Ｇ；Ｘ８２Ｓ；Ｘ９４Ｉ／Ｌ；Ｘ９６Ｌ；Ｘ１０２Ｌ／Ｋ；Ｘ１０８Ｖ；Ｘ１２０Ｙ；Ｘ１３５Ｑ；Ｘ１３７Ｔ／Ｉ；Ｘ１３８Ｋ／Ｐ；Ｘ１４１Ｌ；Ｘ１４２Ｒ／Ｔ；Ｘ１４６Ｒ；Ｘ１４８Ａ／Ｆ；Ｘ１６３Ｈ／Ｖ；Ｘ１６４Ｐ／Ｖ／Ａ；Ｘ１６９Ｌ；Ｘ１７１Ａ；Ｘ１７８Ｓ；Ｘ１８１Ｇ；Ｘ１８２Ｔ；Ｘ２０４Ａ；Ｘ２０９Ｌ／Ｃ／Ｄ／Ｅ；Ｘ２１０Ｓ；Ｘ２１１Ｉ；Ｘ２１３Ｐ；Ｘ２１５Ｆ／Ｙ／Ｃ；Ｘ２１７Ｎ／Ｓ；Ｘ２１８Ｍ；Ｘ２２３Ｉ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｐ；Ｘ２２５Ｙ；Ｘ２３０Ｖ；Ｘ２４２Ｔ；Ｘ２４５Ｓ；Ｘ２５２Ｆ；Ｘ２６５Ｔ；Ｘ２９２Ｔ；Ｘ２９７Ｓ；Ｘ３０２Ａ；Ｘ３０６Ｌ；Ｘ３２１Ｐ；Ｘ３２８Ｉ；およびＸ３２９Ｈ。残基位置でのアミノ酸残基の選択に関するさらなる指針は引用した参考文献で見ることができる。
上記で議論されるように、例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを生成するための出発バックボーンとして使用される配列番号２の操作されたポリペプチド配列はまた、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＫ３９７５３．１，ＧＩ：３３６０８８３４１）の天然に存在するトランスアミナーゼに対して以下の２８アミノ酸差異：Ｓ８Ｐ、Ｙ６０Ｆ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ６２Ｔ、Ｖ６５Ａ、Ｖ６９Ｔ、Ｄ８１Ｇ、Ｍ９４Ｉ、Ｉ９６Ｌ、Ｆ１２２Ｍ、Ｓ１２４Ｔ、Ｓ１２６Ｔ、Ｇ１３６Ｆ、Ｙ１５０Ｓ、Ｖ１５２Ｃ、Ａ１６９Ｌ、Ｖ１９９Ｉ、Ａ２０９Ｌ、Ｇ２１５Ｃ、Ｇ２１７Ｎ、Ｓ２２３Ｐ、Ｌ２６９Ｐ、Ｌ２７３Ｙ、Ｔ２８２Ｓ、Ａ２８４Ｇ、Ｐ２９７Ｓ、Ｉ３０６Ｖ、およびＳ３２１Ｐを有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドである。したがって、一部の実施形態において、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子を有する配列のいずれか１つから選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、次の位置：Ｘ８；Ｘ６０；Ｘ６１；Ｘ６２；Ｘ６５；Ｘ８１；Ｘ９４；Ｘ９６；Ｘ１２２；Ｘ１２４；Ｘ１３６；Ｘ１６９；Ｘ１９９；Ｘ２０９；Ｘ２１５；Ｘ２１７；Ｘ２２３；Ｘ２６９；Ｘ２７３；Ｘ２８２；Ｘ２８４；Ｘ２９７；Ｘ３０６；およびＸ３２１の１つ以上に配列番号２との比較による残基差異を含まないアミノ酸配列を有する。
一部の実施形態において、本開示はまた、機能的トランスアミナーゼ活性および／または操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの改善された特性を保持する本明細書記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのいずれかのフラグメントを含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。したがって、一部の実施形態において、本開示は、トランスアミナーゼ活性（例えば、好適な反応条件のもと化合物（２）を化合物（１）に変換することができる）を有するポリペプチドフラグメントを提供し、この場合該フラグメントは、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチドなどの本開示の操作されたポリペプチドの完全長アミノ酸配列の少なくとも約８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％を含む。
一部の実施形態において、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列など、本明細書記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列のいずれか１つとの比較において欠失を含むアミノ酸配列を有し得る。したがって、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの全ての各実施形態について、アミノ酸配列は、トランスアミナーゼポリペプチドのアミノ酸総数の最大１０％、アミノ酸総数の最大１０％、アミノ酸総数の最大２０％、またはアミノ酸総数の最大３０％である、１またはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、３またはそれを超えるアミノ酸、４またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、または２０またはそれを超えるアミノ酸の欠失を含み得、この場合、本明細書記載の操作されたトランスアミナーゼの関連した機能的活性および／または改善された特性は維持されるものとする。一部の実施形態において、欠失は、１−２、１−３、１−４、１−５、１−６、１−７、１−８、１−９、１−１０、１−１５、１−２０、１−２１、１−２２、１−２３、１−２４、１−２５、１−３０、１−３５、１−４０、１−４５、１−５０、１−５５、または１−６０アミノ酸残基を含み得る。一部の実施形態において、欠失の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０アミノ酸残基であり得る。一部の実施形態において、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５または３０アミノ酸残基の欠失を含み得る。
一部の実施形態において、本開示は、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子を有する例示的な操作されたポリペプチド配列など、本明細書記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチド配列のいずれか１つとの比較において挿入を含むアミノ酸配列を有する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを提供する。したがって、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドの全ての各実施形態について、該挿入は、１またはそれを超えるアミノ酸、２またはそれを超えるアミノ酸、３またはそれを超えるアミノ酸、４またはそれを超えるアミノ酸、５またはそれを超えるアミノ酸、６またはそれを超えるアミノ酸、８またはそれを超えるアミノ酸、１０またはそれを超えるアミノ酸、１５またはそれを超えるアミノ酸、または２０またはそれを超えるアミノ酸を含み得、この場合、本明細書記載の操作されたトランスアミナーゼの関連した機能的活性および／または改善された特性は維持されるものとする。該挿入は、トランスアミナーゼポリペプチドのアミノもしくはカルボキシ末端、または内側部分に対するものであり得る。
一部の実施形態において、本開示は、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子を有する配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供するが、ただし、このアミノ酸配列は、２０１２年１０月２３日付、米国特許８，２９３，５０７ Ｂ２、２０１１年１月１３日公開の、ＰＣＴ公開国際公開２０１１００５４７７Ａ１、２０１２年２月２３日公開の、ＰＣＴ公開国際公開第２０１２０２４１０４号および２０１２年９月７日付、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／５４３００号（これらはそれぞれ参照で援用する）に開示された例示的な操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのいずれとも同一ではない（すなわち、これらを除外する）ものとする。
一部の実施形態において、本開示のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドはまた、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）の基質化合物、化合物（２）、および／または化合物（４）を、それぞれ式（Ｉ）、式（Ｉａ）の対応するアミン生成物化合物、化合物（１）および／または化合物（３）に変換することができる。一部の実施形態において、本操作されたポリペプチドは、好適な反応条件下での、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）の基質化合物、および／または化合物（２）から式（Ｉ）、式（Ｉａ）の対応するアミン生成物化合物、および／または化合物（１）への変換において配列番号２の操作されたポリペプチドの活性および／または安定性と比べて改善された活性および／または安定性を有する。特に、かかる化合物の工業規模での製造に有用な反応条件。
上記実施形態において、操作されたポリペプチドに好適な反応条件は、表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに記載されたものである。したがって、一部の実施形態において、好適な反応条件は、（ａ）式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）の基質化合物、化合物（２）または化合物（４）について約１０〜２００ｇ／Ｌの基質負荷；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの操作されたポリペプチドの濃度；（ｃ）約０．１〜３ＭのＩＰＭ濃度；（ｄ）約０．１〜１ｍＭのＰＬＰ補助因子濃度；（ｅ）約３０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ濃度；（ｆ）約９．５〜１１．５のｐＨ；ならびに（ｇ）約４５℃〜６０℃の温度を含む。一部の実施形態において、好適な反応条件は、（ａ）約５０ｇ／Ｌの式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）の基質化合物、化合物（２）または化合物（４）；（ｂ）約２ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約５０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；（ｄ）約１Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｅ）約１ｍＭのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）；（ｆ）約ｐＨ１０；ならびに（ｇ）約５０℃を含む。これらの反応条件およびトランスアミナーゼポリペプチドの使用についての指針は、中でも表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ、および実施例で提供されている。
一部の実施形態において、本開示のポリペプチドは、操作されたポリペプチドが、例えば、限定するわけではないが、抗体タグ（例、ｍｙｃエピトープ）、精製配列（例、金属への結合のためのＨｉｓタグ）、および細胞局在化シグナル（例、分泌シグナル）などによって、他のポリペプチドに融合されている、融合ポリペプチドの形態であり得る。したがって、本明細書記載の操作されたポリペプチドは、他のポリペプチドとの融合を伴って、または伴わずに使用され得る。
本明細書中に記載される操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、遺伝的にコードされるアミノ酸に限定されないことが理解されるべきである。したがって、遺伝的にコードされるアミノ酸に加えて、本明細書中に記載されるポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸および／またはコードされない合成のアミノ酸を全体的にまたは部分的から構成され得る。本明細書中に記載されるポリペプチドを構成し得る一般的に遭遇するある特定のコードされないアミノ酸としては、遺伝的にコードされるアミノ酸のＤ−立体異性体；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルアラニン（ｓｔｙｒｙｌｋａｌａｎｉｎｅ）（ｓＡｌａ）；アウトリルアラニン（ａｕｔｈｒｙｌａｌａｎｉｎｅ）（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（ｐｈｅｎｙｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリジン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）、アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）、ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に記載されるポリペプチドを構成し得るさらなるコードされないアミノ酸は、当業者に明らかだろう（例えば、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，ＣＲＣ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，ａｔ ｐｐ．３−７０およびそれらの中で引用されている参考文献（これらのすべてが、参照により援用される）に提供されている様々なアミノ酸を参照のこと）。これらのアミノ酸は、Ｌ−配置またはＤ−配置であり得る。
当業者は、側鎖保護基を有するアミノ酸または残基もまた、本明細書中に記載されるポリペプチドを構成し得ることを認識するだろう。そのような保護されたアミノ酸（この場合、芳香族のカテゴリーに属する）の非限定的な例（保護基が括弧内に列挙される）としては：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中に記載されるポリペプチドを構成し得る立体構造的に制約される非コードアミノ酸としては、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ−配置）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、操作されたポリペプチドは、固体支持体（例えば、膜、樹脂、固体キャリアまたは他の固相材料）上に提供され得る。固体支持体は、有機ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド）ならびにそのコポリマーおよびグラフトから構成され得る。固体支持体は、無機でもあり得る（例えば、ガラス、シリカ、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属、例えば、金または白金）。固体支持体の形状は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤するまたは膨潤しない特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル、くぼみの形態、または他の容器、うつわ、特徴もしくは場所で形成され得る。
一部の実施形態において、トランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、それらが配列番号２の参照ポリペプチドに対してそれらの改善された活性、エナンチオ選択性、立体選択性、および／または他の改善された特性を保持するように、固体支持体に結合または固定化される。かかる実施形態において、固定化されたポリペプチドは、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）の基質化合物、化合物（２）、および／または化合物（４）から、式（Ｉ）、式（Ｉａ）の対応するアミン生成物化合物、化合物（１）および／または化合物（３）への生体触媒による変換を促進し得、反応完了後（例、ポリペプチドが固定化されているビーズを保持することにより）容易に保持され、次いで後続反応で再使用または再循環される。かかる固定化酵素プロセスにより、さらなる効率およびコスト低減が可能となる。したがって、さらに、本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを用いる方法はいずれも固体支持体に結合または固定化された同じトランスアミナーゼポリペプチドを用いて実施され得ると考えられる。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、非共有結合または共有結合により結合され得る。固体支持体（例、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）へ酵素をコンジュゲーションおよび固定化する様々な方法は当該分野では周知である。特に、ＰＣＴ公開の国際公開２０１２／１７７５２７ Ａ１、化合物（２）を化合物（１）に変換することができる固定化された操作されたトランスアミナーゼポリペプチド（配列番号２の参照ポリペプチドを含む）、およびポリペプチドが疎水性相互作用または共有結合により物理的に樹脂に結合され、少なくとも１００％まで有機溶媒を含む溶媒系で安定している固定化ポリペプチドの調製方法。酵素を固体支持体（例、樹脂、膜、ビーズ、ガラスなど）にコンジュゲーションおよび固定化する他の方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｙｉら、“Ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ω−ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ ＪＳ１７ ｏｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｂｅａｄｓ，”Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４２（５）：８９５−８９８（２００７年５月）；Ｍａｒｔｉｎら、“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｅ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ（Ｓ）−ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｏｒ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７６（４）：８４３−８５１（２００７年９月）；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ω−ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｓ ｂｙ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｓｏｌ−ｇｅｌ／ｃｅｌｉｔｅ ｍａｔｒｉｘ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ，６３：３９−４４（２０１０年４月）；Ｔｒｕｐｐｏら、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ＣＡＬ−Ｂ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｋｅｙ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｔｏ Ｏｄａｎａｃａｔｉｂ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，オンラインで公開：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｏｐ２００１５７ｃ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２００８）；Ｍａｔｅｏら、“Ｅｐｏｘｙ ｓｅｐａｂｅａｄｓ：ａ ｎｏｖｅｌ ｅｐｏｘｙ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｖｉａ ｖｅｒｙ ｉｎｔｅｎｓｅ ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １８（３）：６２９−３４（２００２）；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃ．Ｍ．Ｎｉｅｍｅｙｅｒ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００４）（これらの各開示は、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
本開示の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを固定化するために有用な固体支持体としては、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマーまたはポリメタクリレートを含む、ビーズまたは樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の操作されたトランスアミナーゼを固定化するために有用な例示的な固体支持体としては、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ ＣおよびＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）（以下の異なるタイプのＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、ポリペプチドが位置的に異なる場所に配置されているアレイ形態で提供され得る。一部の実施形態において、位置的に異なる場所は、９６−ウェルプレートなどの固体支持体におけるウェルである。複数の支持体は、ロボットによる試薬の送達のために、または検出方法および／もしくは検出機器によってアドレス可能な、様々な場所でアレイ上に構成され得る。かかるアレイは、ポリペプチドによる変換について様々な基質化合物を試験するのに使用され得る。
一部の実施形態において、本明細書記載の操作されたポリペプチドは、キット形態で提供され得る。キット中のポリペプチドは、個別に存在するか、または複数のポリペプチドとして存在し得る。該キットは、酵素反応を実施するための試薬、ポリペプチドの活性を評価するための基質、ならびに生成物を検出するための試薬をさらに備え得る。該キットはまた、試薬ディスペンサーおよびキットの使用説明書を含み得る。一部の実施形態において、本開示のキットは、異なるアドレス可能な位置に複数の異なる操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを含むアレイを備え、その異なるポリペプチドは、参照配列の異なる改変体であり、それぞれが、少なくとも１つの異なる改善された酵素特性を有する。複数の操作されたポリペプチドを備える上記アレイおよびそれらの使用方法は公知である（例えば、国際公開第２００９／００８９０８Ａ２号参照）。
５．４ 操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの調製に有用なポリヌクレオチド、制御配列、発現ベクター、および宿主細胞
別の実施態様において、本開示は、本明細書記載のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を制御する１またはそれを超える異種調節配列に作動し得るように連結することにより、該ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドが作製され得る。操作されたトランスアミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を適切な宿主細胞に導入することにより、対応する操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを発現させることができる。
当業者に明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識により、主題のタンパク質配列をコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの説明が提供される。同じアミノ酸が代替のコドンまたは同義コドンによってコードされる遺伝暗号の縮重により、そのすべてが本明細書で開示された改善されたトランスアミナーゼ酵素をコードする極めて多数の核酸を作製することが可能になる。したがって、特定のアミノ酸配列が同定されたことで、当業者は、そのタンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１またはそれを超えるコドンの配列を単純に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製することができる。この点において、本開示は、可能性のあるコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって作製され得るポリヌクレオチドの可能性のあるすべての各バリエーションを明確に企図するもので、そのようなバリエーションはすべて、表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに提示され、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子の配列として参照により本明細書中に援用される配列表に開示された例示的な操作されたポリペプチドのアミノ酸配列を含む、本明細書で開示された任意のポリペプチドについて具体的に開示されたとみなされるべきである。本明細書で記載されているように、一部の実施形態では、配列番号４、４０、６２、６４、７０、７８、１２２、１３０、１６０、１７８、および１９２から選択される１またはそれを超えるアミノ酸配列をコードする配列が、ポリヌクレオチドの実施形態から排除される。
様々な実施形態において、コドンは、好ましくは、そのタンパク質が産生されている宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌において遺伝子を発現させるために使用され；酵母において使用される好ましいコドンは、酵母における発現のために使用され；哺乳動物において使用される好ましいコドンは、哺乳動物細胞における発現のために使用される。いくつかの実施形態において、天然の配列が好ましいコドンを含み得るので、また、好ましいコドンを使用することが、すべてのアミノ酸残基にとって必要でないことがあるので、すべてのコドンが、トランスアミナーゼのコドン使用頻度を最適化するために置き換えられる必要があるわけではない。その結果として、トランスアミナーゼ酵素をコードするコドンが最適化されたポリヌクレオチドは、完全長コード領域のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％超に好ましいコドンを含み得る。
一部の実施形態において、該ポリヌクレオチドは、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子から選択される参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼポリペプチドをコードするもので、該ポリペプチドは、トランスアミナーゼ活性ならびに本明細書記載の１またはそれを超える改善された特性、例えば配列番号２のポリペプチドと比べて高められた活性で化合物（２）を生成物化合物（１）に変換する能力を有する。一部の実施形態において、参照配列は、配列番号４、４０、６２、６４、７０、７８、１２２、１３０、１６０、１７８、および１９２から選択される。一部の実施形態において、参照配列は配列番号４である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号４０である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号６２である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号６４である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号７０である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号７８である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号１２２である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号１３０である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号１６０である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号１７８である。一部の実施形態において、参照配列は配列番号１９２である。
一部の実施形態において、該ポリヌクレオチドは、上記同一性パーセントを有し、（ａ）から選択される配列番号２との比較による１またはそれを超えるアミノ酸残基差異を有するアミノ酸配列を含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、本開示は、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性ならびに（ａ）Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｒ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ；およびＸ２４１Ｒから選択される配列番号２との比較によるアミノ酸残基差異、および／または（ｂ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ３３Ｌ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１１７Ｇ；Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；およびＸ４１Ｋ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｈ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６０Ｖ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６８Ａ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２６Ｍ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３５Ｉ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９２Ｆ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２２４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９３Ｍ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８３Ｓ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｉ；およびＸ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、およびＸ２１５Ｇから選択される残基差異の組み合わせを有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。
一部の実施形態において、該ポリヌクレオチドは、上記同一性パーセントを有し、Ｘ５Ｋ、Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ａ／Ｇ、Ｘ４４Ｑ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ４９Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ５５Ｌ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１０８Ｖ、Ｘ１１７Ｇ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５０Ａ／Ｆ、Ｘ１５２Ｓ／Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ１６４Ｐ、Ｘ１６５Ｎ、Ｘ１８２Ｔ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２１８Ｍ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２６７Ｖ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ、およびＸ３２８Ｉから選択される配列番号２との比較による１またはそれを超える残基差異を有するアミノ酸配列を含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする。
一部の実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチドは、配列番号３〜３０５の奇数番号が付された配列識別子から選択される配列を含む。一部の実施形態において、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号３、３９、６１、６３、６９、７７、１２１、１２９、１５９、１７７、および１９１から選択される。
一部の実施形態において、本開示は、中程度にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件など、規定された条件下で、本開示の操作されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチド配列（またはその相補体）とハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、該ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下で配列番号３〜３０５の奇数番号が付された配列識別子を有する配列から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズすることができ、本明細書記載の１またはそれを超える改善された特性をもつトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドがコードされる。一部の実施形態において、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる該ポリヌクレオチドは、（ａ）から選択される配列番号２との比較による１またはそれを超えるアミノ酸残基差異を有するアミノ酸配列を含む操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、本開示は、配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性ならびに（ａ）Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｒ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ；およびＸ２４１Ｒから選択される配列番号２との比較によるアミノ酸残基差異、および／または（ｂ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２６７Ｖ；Ｘ３３Ｌ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１１７Ｇ；Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；およびＸ４１Ｋ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１０９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ３３Ｌ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｈ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｖ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４１Ｆ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ４８Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｈ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６０Ｖ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６８Ａ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ６９Ｓ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２２Ｑ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｔ、Ｘ１５５Ｖ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１２６Ｍ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３５Ｉ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９２Ｆ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２２４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｉ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１３６Ｙ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｐ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１７１Ｉ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２４１Ｒ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ１９３Ｍ、およびＸ２１５Ｇ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２８２Ｖ、およびＸ２８４Ｉ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８３Ｓ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｑ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２８４Ｉ；およびＸ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｘ１５６Ｙ、およびＸ２１５Ｇから選択される残基差異の組み合わせを有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供する。
一部の実施形態において、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる該ポリヌクレオチドは、上記同一性パーセントを有し、Ｘ５Ｋ、Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ａ／Ｇ、Ｘ４４Ｑ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ４９Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ５５Ｌ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１０８Ｖ、Ｘ１１７Ｇ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５０Ａ／Ｆ、Ｘ１５２Ｓ／Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ１６４Ｐ、Ｘ１６５Ｎ、Ｘ１８２Ｔ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２１８Ｍ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２６７Ｖ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ、およびＸ３２８Ｉから選択される配列番号２との比較による１またはそれを超える残基差異を有するトランスアミナーゼポリペプチドをコードする。
一部の実施形態において、該ポリヌクレオチドは、本明細書記載のポリペプチドをコードするが、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチドとヌクレオチドレベルで約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％またはそれを超える配列同一性を有する。一部の実施形態において、参照ポリヌクレオチド配列は、配列番号３〜３０５の奇数番号が付された配列識別子を有する配列から選択される。
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、発現、さらなる制御配列を伴う、または伴わない適切な発現での挿入、および該ポリペプチドの発現および産生に適した宿主細胞への形質転換を改善するためのコドン最適化によるさらなる配列改変を含め、そのポリペプチドの発現をもたらすように種々の方法で操作され得る。
発現ベクターに応じて、ベクターに挿入する前に、単離されたポリヌクレオチドを操作することが、望ましい場合があるか、または必要である場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための手法は、当該分野で周知である。指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．ｅｄ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９８，２０１０年改訂、に提供されている。
本明細書で開示されたポリヌクレオチドは、使用される特定の細胞産生系によってはプロモーター配列をさらに含み得る。細菌性宿主細胞の場合、本開示の核酸構築物の転写を誘導するのに好適なプロモーターとしては、特に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物のベータ−ラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７−３７３１）から得られるプロモーター、ならびにｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１−２５）がある。糸状菌宿主細胞について、本開示の核酸構築物の転写を誘導するのに好適なプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの酸安定性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのトリオースホスフェートイソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）に対する遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの中性アルファ−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのトリオースホスフェートイソメラーゼに対する遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの変異体プロモーター、切断型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。酵母宿主では、有用なプロモーターは、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、出芽酵母のガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、出芽酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）および出芽酵母の３−ホスホグリセリン酸キナーゼに対する遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞に対する他の有用なプロモーターは、Ｒｏｍａｎｏｓらによる、１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３−４８８に記載されている。
調節配列は、転写を終結するための、宿主細胞によって認識される配列である好適な転写ターミネーター配列でもあり得る。そのターミネーター配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適な宿主細胞において機能的である任意のターミネーターが、本開示において使用され得る。例えば、糸状菌宿主細胞に対する例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのアルファ−グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼに対する遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞に対する例示的なターミネーターは、出芽酵母のエノラーゼ、出芽酵母のシトクロムＣ（ＣＹＣ１）および出芽酵母のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素に対する遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞に対する他の有用なターミネーターは、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２，前出によって記載されている。
制御配列はまた、宿主細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である好適なリーダー配列でもあり得る。そのリーダー配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択した宿主細胞において機能的である任意のリーダー配列が、使用され得る。例示的な細菌性リーダー配列は、ｐｅｌＢリーダー配列（Ｌｅｉら、１９８７、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（９）：４３７９−４３８３）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのｄｓｂＡ、ｄｓｂＣ、Ｂｃｅ、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２のリーダー配列（米国特許第７，６１８，７９９号）を使用し得る。糸状菌宿主細胞に対する例示的なリーダー配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのトリオースホスフェートイソメラーゼに対する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に対する好適なリーダーは、出芽酵母のエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、出芽酵母の３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、出芽酵母のアルファ−因子および出芽酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）に対する遺伝子から得られる。
調節配列は、核酸配列の３’末端に作動可能に連結される配列であり、かつ転写されたとき、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である、ポリアデニル化配列でもあり得る。最適な宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列が、本開示において使用され得る。糸状菌宿主細胞に対する例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍのトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのアルファ−グルコシダーゼに対する遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞に対する有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ １５：５９８３−５９９０によって記載されている。例示的な哺乳動物ポリアデニル化配列は、Ｚｈａｎｇら、２００５、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３３：Ｄ１１６〜Ｄ１２０に見出され得る。
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向づける、シグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み枠で天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を本質的に含み得る。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来のシグナルペプチドコード領域を含み得る。コード配列が、天然においてシグナルペプチドコード領域を含まない場合、外来のシグナルペプチドコード領域が必要とされ得る。
あるいは、ポリペプチドの分泌を増強するために、外来のシグナルペプチドコード領域は単純に天然のシグナルペプチドコード領域を置き換え得る。しかしながら、発現されたポリペプチドを選択した宿主細胞の分泌経路に方向づける任意のシグナルペプチドコード領域が使用され得る。細菌宿主細胞に対する効果的なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ１１８３７のマルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのｐｒｓＡに対する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ５７：１０９−１３７によって記載されている。糸状菌宿主細胞に対する効果的なシグナルペプチドコード領域は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓのセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａのリパーゼに対する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域であり得る。酵母宿主細胞に対する有用なシグナルペプチドは、出芽酵母のアルファ−因子および出芽酵母のインベルターゼに対する遺伝子に由来し得る。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Ｒｏｍａｎｏｓら、１９９２、上記によって記載される。
調節配列は、ポリペプチドのアミノ末端に配置されたアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもあり得る。結果として生じるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または場合によってはチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、そのプロポリペプチド由来のプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断によって、成熟した活性なポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、出芽酵母のアルファ−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａのラクターゼ（ＷＯ９５／３３８３６）に対する遺伝子から得られることがある。シグナルペプチド領域とプロペプチド領域の両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域が、ポリペプチドのアミノ末端の隣に配置され、シグナルペプチド領域が、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に配置される。
宿主細胞の増殖に関連してポリペプチドの発現の制御を可能にする制御配列を付加することが望ましい場合もある。制御系の例は、化学的刺激または物理的刺激（制御化合物の存在を含む）に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにするものである。原核生物宿主細胞において、好適な制御配列としては、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞において、好適な制御系としては、例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌において、好適な制御配列としては、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらは、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの場合、本開示のポリペプチドをコードする核酸配列は、調節配列と作動し得るように連結される。
別の態様において、本開示は、導入される宿主タイプに応じた、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドまたはその改変体をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、および１つ以上の発現制御領域（例えば、プロモーターおよびターミネーター、複製起点など）にも関する。上に記載された様々な核酸配列および調節配列は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列を好都合な制限酵素認識部位に挿入または置換することを可能にする１つ以上のそのような部位を含み得る組換え発現ベクターを生成するように、共につなぎ合わされ得る。あるいは、本開示の核酸配列は、核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を、発現にとって適切なベクターに挿入することによって、発現され得る。発現ベクターを作製する際、コード配列は、コード配列が、発現にとって適切な調節配列と作動可能に連結されるように、ベクター内に配置される。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に便利に供され得る任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらし得る。ベクターの選択は、代表的には、ベクターが導入される宿主細胞とベクターの適合性に依存し得る。ベクターは、直鎖状または閉環状のプラスミドであり得る。発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の実体、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体として存在するベクターであり得、その複製は、染色体の複製とは無関係である。そのベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含み得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体とともに複製されるベクターであり得る。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または２つ以上のベクターもしくはプラスミド（それらが合わせて、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含む）あるいはトランスポゾンが、使用され得る。
本開示の発現ベクターは、形質転換された細胞を容易に選択することを可能にする１つ以上の選択マーカーを含み得る。選択マーカーは、その産物が、殺生物剤抵抗性またはウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養素要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌の選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、クロラムフェニコール耐性またはテトラサイクリン耐性）を付与するマーカーである。酵母宿主細胞に対する好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞において使用するための実施形態は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子を含む。
本開示の発現ベクターはまた、宿主細胞ゲノムへのベクターの組込みまたはゲノムとは関係無く細胞におけるベクターの自律複製を可能にするエレメント（複数も可）を含み得る。宿主細胞ゲノムへの組込みのため、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列または相同的または非相同的組換えによるゲノムへのベクター組込みのためのベクターの任意の他のエレメントに依存し得る。
別法として、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同的組換えによる組込みを誘導するための追加の核酸配列を含み得る。その追加的核酸配列は、染色体（複数も可）における正確な場所（複数も可）において宿主細胞ゲノムへベクターを組み込ませることができる。正確な場所での組込みの可能性を高めるため、好ましくは組込みエレメントは、相同的組換えの確率を高めるため対応する標的配列と高度に相同性である、１００〜１００００塩基対、好ましくは４００〜１００００塩基対、および最も好ましくは８００〜１００００塩基対など、十分な数の核酸を含むべきである。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノムにおける標的配列と相同性である任意の配列であり得る。さらに、組込みエレメントは、非コード性核酸配列またはコード性核酸配列であり得る。他方、ベクターは、非相同的組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
自律複製のため、ベクターは、さらに問題の宿主細胞においてベクターを自律複製させ得る複製起点を含み得る。細菌性の複製起点の例は、Ｐ１５Ａ ｏｒｉまたはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７（このプラスミドはＰ１５Ａ ｏｒｉを有する）または大腸菌での複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓでの複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、またはｐＡＭβ１の複製起点である。酵母宿主細胞で使用される複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組み合わせ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組み合わせである。複製起点は、宿主細胞において温度感受性の様式で機能させる変異を有するものであり得る（例、Ｅｈｒｌｉｃｈ、１９７８、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１４３３参照）。
１コピーより多くの本開示の核酸配列を宿主細胞へ挿入することにより、遺伝子産物の生産を増やすことができる。核酸配列のコピー数の増加は、少なくとも１つの追加コピーの配列を宿主細胞ゲノムへ組み込むことにより、または核酸配列と共に増幅可能な選択可能マーカー遺伝子を含ませることにより達成され得、この場合選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピー、およびそれによる核酸配列の追加のコピーを含む細胞は、適切な選択可能作用物質の存在下で細胞を培養することにより選択され得る。
本開示の実施形態で有用な多くの発現ベクターは市販されている。好適な商業的発現ベクターには、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓからのｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクターがあり、これは、哺乳類宿主細胞における発現のためのＣＭＶプロモーターおよびｈＧＨポリアデニル化部位ならびに大腸菌における増幅のためのｐＢＲ３２２複製起点およびアンピシリン耐性マーカーを含む。他の好適な発現ベクターは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ラジョラ、カリフォルニア）から市販されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶ、およびｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙから誘導されるプラスミドである（Ｌａｔｈｅら、１９８７、Ｇｅｎｅ ５７：１９３−２０１）。
例示的な発現ベクターは、ｌａｃＩレプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターを含むプラスミドｐＣＫ１１０９００Ｉへ改善されたトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを作動し得るように連結することにより調製され得る。この発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。
別の実施態様において、本開示は、本開示の改善されたトランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供するもので、該ポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるトランスアミナーゼ酵素発現のための１またはそれを超える制御配列に作動し得るように連結されている。本開示の発現ベクターによりコードされるポリペプチドの発現で使用される宿主細胞は当該分野では周知であり、限定される訳ではないが、細菌細胞（例えば、大腸菌、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの細胞）；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母）またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；および植物細胞が挙げられる。例示的な宿主細胞は、大腸菌Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）である。上記宿主細胞に適切な培養培地および成長条件は当該分野では周知である。
トランスアミナーゼを発現させるためのポリヌクレオチドは、当該分野では公知の様々な方法により細胞へ導入され得る。技術としては、特にエレクトロポレーション、遺伝子銃、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合がある。細胞へポリヌクレオチドを導入する様々な方法は、当業者には明白なものである。
５．６ 操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの生成方法
一部の実施形態において、本開示の改善された操作されたポリヌクレオチドおよび操作されたポリペプチドを作製するため、アミノ基転移反応を触媒する天然に存在するトランスアミナーゼ酵素をＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８から得る（誘導する）。一部の実施形態では、親ポリヌクレオチド配列を、特定された宿主細胞におけるトランスアミナーゼの発現を高めるようにコドン最適化する。Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８の野生型ポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列については報告されている（例えば、Ｉｗａｓａｋｉら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００６、６９：４９９−５０５参照）。また、この親配列に基づく操作されたトランスアミナーゼの調製は、米国特許公開２０１０／０２８５５４１Ａ１および公開された国際出願ＷＯ２０１０／０９９５０１に記載されている。
操作されたトランスアミナーゼは、上で論じたように、天然に存在するトランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを変異誘発および／または定向進化法に供することによって、得ることができる。例示的な定向進化技術は、Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号に記載されているような、変異誘発および／またはＤＮＡシャフリングである。使用され得る他の定向進化手順としては、とりわけ、付着伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え（Ｚｈａｏら、１９９８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２５８−２６１）、変異誘発ＰＣＲ（Ｃａｌｄｗｅｌｌら、１９９４，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．３：Ｓ１３６−Ｓ１４０）およびカセット変異誘発（Ｂｌａｃｋら、１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：３５２５−３５２９）が挙げられる。本明細書中の目的にとって有用な変異誘発および定向進化法は、例えば、以下にも記載されている：Ｌｉｎｇら、１９９７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−７８；Ｄａｌｅら、１９９６，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−７４；Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３−１２０１；Ｃａｒｔｅｒ，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；Ｋｒａｍｅｒら、１９８４，Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７；Ｗｅｌｌｓら、１９８５，Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、１９９９，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ３：２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：２５９−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５：４３６−４３８；Ｚｈａｎｇら、１９９７，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：４５−４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４：３１５−３１９；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；およびＷＯ０１／７５７６７および米国特許第６，５３７，７４６号。すべての刊行物および特許が、参照により本明細書中に援用される。
変異誘発処理後に得られたクローンは、所望の改善された酵素特性を有する操作されたトランスアミナーゼについてスクリーニングされ得る。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、例えば生成物アミンのＯＰＡ誘導体化後のＨＰＬＣ分析など、標準的生化学技術を用いて実施され得る。
例えば、所望の改善された酵素特性が、熱安定性である場合、酵素活性は、酵素調製物を規定の温度に供した後に、熱処理の後に残っている酵素活性の量を計測して、計測され得る。次いで、トランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むクローンが、単離され、配列決定されることにより、ヌクレオチド配列の変化（もしあれば）が同定され、宿主細胞において酵素を発現するために使用される。
操作されたポリペプチドの配列が、公知である場合、その酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成法に従って、標準的な固相法によって調製され得る。いくつかの実施形態において、最大約１００塩基のフラグメントは、個々に合成され、次いで、つなぎ合わせる（例えば、酵素的もしくは化学的なライゲーション（ｌｉｔｉｇａｔｉｏｎ）法、またはポリメラーゼに媒介される方法によって）ことにより、任意の所望の連続した配列が形成され得る。例えば、本開示のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、通常、自動化された合成方法で実施されるように、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１，Ｔｅｔ Ｌｅｔｔ ２２：１８５９−６９によって記載された従来のホスホルアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら、１９８４，ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１−０５によって記載された方法を使用する、化学合成によって、調製され得る。ホスホルアミダイト法によると、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置において、合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、適切なベクターにクローニングされる。加えて、本質的に任意の核酸が、種々の商業的供給源のいずれかから取得され得る。
一部の実施形態において、本開示はまた、好適な反応条件のもと化合物（２）を化合物（１）に変換することができる操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを調製または製造するための方法であって、ポリペプチドの発現に好適な培養条件下で操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本ポリペプチドを調製する方法は、さらにポリペプチドの単離を含む。操作されたポリペプチドは、適切な細胞（上記）で発現され、特にリゾチーム処理、音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを初めとする、タンパク質精製に使用される周知技術のいずれか１つまたはそれ以上を用いて宿主細胞および／または培養培地から単離（または回収）され得る。ポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技術としては、特に逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の操作されたポリペプチドの精製条件は、一部、実効電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの因子により変わることがあり、当業者には明白なものである。
５．７ 操作されたトランスアミナーゼ酵素の使用方法およびそれにより調製される化合物
別の実施態様において、本明細書で開示された操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、基質化合物（２）またはその構造アナログを化合物（１）の生成物または対応する構造アナログに変換するプロセスにおいて使用され得る。一般的に、化合物（１）の構造アナログは、構造式（Ｉ）および構造式（Ｉａ）内に包含される。
一部の実施形態において、本明細書で開示された操作されたポリペプチドは、キラルアミン化合物を調製するプロセスで使用され得る。一部の実施形態において、本開示は、反対のエナンチオマーに対して少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率で、＊の印を付けた立体中心に示された立体化学的立体配置を有する構造式（Ｉ）：
の化合物を調製するための方法を提供し、式中、
Ｚは、ＯＲ２またはＮＲ２Ｒ３であり；
Ｒ１は、Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリール−Ｃ１−２アルキル、ヘテロアリール−Ｃ１−２アルキル、または必要に応じてＯ、ＳおよびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい５〜６員複素環系であって、この複素環は、非置換であるか、または独立してオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−４アルコキシおよびＣ１−４アルキル（ここで、アルキルおよびアルコキシは非置換であるか、または１〜５個のフッ素で置換されている）から選択される１〜３個の置換基により置換されているものとし、；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して水素、Ｃ１−８アルキル、アリール、またはアリール−Ｃ１−２アルキルであるか；または
Ｒ２およびＲ３は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、必要に応じてＯ、ＳおよびＮから選択されるさらなるヘテロ原子を含んでいてもよい４〜７員複素環系を形成し、この複素環は、非置換であるか、または独立してオキソ、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１−４アルコキシおよびＣ１−４アルキル（ここで、アルキルおよびアルコキシは非置換であるか、または１〜５個のフッ素で置換されている）から選択される１〜３個の置換基により置換されており；この複素環系は、必要に応じて５〜６員飽和もしくは芳香族炭素環式環系またはＯ、ＳおよびＮから選択される１〜２個のヘテロ原子を含む５〜６員飽和もしくは芳香族複素環系と縮合されていてもよく、この縮合環系は、非置換であるか、またはヒドロキシ、アミノ、フッ素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、およびトリフルオロメチルから選択される１〜２個の置換基で置換されているものとし、本プロセスは、構造式（ＩＩ）：
のプロキラルケトン基質化合物を、好適な反応条件下で好適な有機溶媒中アミノ基ドナーの存在下において本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させる工程を含むものとする。本プロセスの一部の実施形態において、Ｒ１はベンジルであり、ベンジルのフェニル基は、非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシからなる群より選択される１〜３個の置換基で置換されている。
式（Ｉ）の化合物を調製するための本プロセスの一部の実施形態において、ＺはＮＲ２Ｒ３であり、このＮＲ２Ｒ３は、構造式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ４は、水素または非置換もしくは１〜５個のフッ素により置換されたＣ１−４アルキルである）
の複素環である。
構造式（Ｉ）の化合物を調製するための本プロセスの一部の実施形態において、式（ＩＩ）の化合物は特に化合物（２）を除外し、本方法により調製される式（Ｉ）の化合物は特に（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌ）化合物（１）を除外する。
一部の実施形態において、本開示のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、反対の（Ｓ）−立体配置を有するエナンチオマーに対し少なくとも７０％のエナンチオマー過剰率で、＊＊＊の印を付けた立体中心に（Ｒ）−立体配置を有する構造式（Ｉａ）：
［式中、Ａｒは、非置換であるか、またはフッ素、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシから成る群から独立して選択される１〜５個の置換基で置換されたフェニルであり；および
Ｒ４は、水素または非置換もしくは１〜５個のフッ素により置換されたＣ１−４アルキルである］
の化合物を調製するためのプロセスで使用され得；該プロセスは、構造式（ＩＩａ）：
のプロキラルケトン基質化合物を、好適な反応条件下でアミノ基ドナーの存在下において本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させる工程を含む。式（Ｉａ）の化合物を調製するためのプロセスの一部の実施形態において、Ａｒは２，５−ジフルオロフェニルまたは２，４，５−トリフルオロフェニルから選択され、Ｒ４はトリフルオロメチルである。
構造式（Ｉａ）の化合物を調製するためのプロセスの一部の実施形態において、式（ＩＩａ）の化合物は特に化合物（２）を除外し、本方法により調製される式（Ｉａ）の化合物は特に化合物（１）を除外する。
一部の実施形態において、本開示は、化合物（１）、シタグリプチン
を調製するプロセスであって、化合物（２）
の基質を、好適な反応条件下でアミノ基ドナーの存在下において本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させる工程を含むプロセスを提供する。
本開示はまた、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドが、シタグリプチンの構造アナログである他のキラルアミン化合物の調製に使用され得ることを想定する。ゲミグリプチンは、シタグリプチンと同じクラスのジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）阻害剤における経口血糖降下剤（ｏｒａｌ ａｎｔｉ−ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ ａｇｅｎｔ）である。ゲミグリプチンは、化合物（３）：
の構造を有するキラルアミン化合物である。
ゲミグリプチンは、シタグリプチン（化合物（１））と類似した構造を有し、式（Ｉ）の構造で示される同じ種類に含まれる。したがって、一実施形態において、本開示は、化合物（３）を調製するプロセスであって、化合物（４）のケト基質、または保護基で修飾された化合物（４）
を、好適な反応条件下でアミノ基ドナーの存在下において本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させる工程を含むプロセスを提供する。
本明細書で記載し、実施例で説明するように、本開示は、限定される訳ではないが、ｐＨ、温度、緩衝剤、溶媒系、基質負荷、基質化合物立体異性体の混合物、ポリペプチド負荷、補助因子負荷、圧力、および反応時間の範囲を含む、本明細書におけるプロセスで使用され得る好適な反応条件の範囲を想定する。本明細書記載の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを用いる基質化合物から生成物化合物への生体触媒による変換のためのプロセスを実施するためのさらなる好適な反応条件は、限定される訳ではないが、濃度、ｐＨ、温度の実験反応条件、溶媒条件下での操作されたトランスアミナーゼポリペプチドと基質化合物の接触、および、例えば本明細書で提供されている実施例に記載された方法を用いることによる生成物化合物の検出を含む常用的実験により容易に最適化され得る。
上記のように、本開示のプロセスで使用されるトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、一般的に配列番号２〜３０６の偶数番号が付された配列のいずれか１つから選択された参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、またある操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、（ａ）Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｍ／Ｒ、Ｘ４８Ｋ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｒ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ２１５Ｇ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、およびＸ３２５Ｍから選択された配列番号２との比較による１またはそれを超えるアミノ酸残基差異；および／または（ｂ）：（ｉ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；（ｉｉ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＲ１６４Ｐ；（ｉｉｉ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、およびＸ１５５Ｔ；（ｉｖ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、およびＸ２６７Ｖ；（ｖ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｌ、Ｗ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；（ｖｉ）Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｔ、Ｘ２１５Ｇ、およびＸ２６７Ｖ；（ｖｉｉ）Ｘ３３Ｌ；Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１１７Ｇ；Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｉ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇ；および（ｖｉｉｉ）Ｘ４１Ｋ、Ｘ４２Ｇ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ１５０Ｆ、Ｘ１５２Ｓ、Ｘ１５５Ｋ、Ｘ１５６Ｑ、およびＣ２１５Ｇから選択された配列番号２との比較による残基差異の組み合わせを有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、上記の同一性パーセントならびにＸ５Ｋ、Ｘ３３Ｌ、Ｘ３６Ｃ、Ｘ４１Ｃ／Ｆ／Ｋ／Ｍ／Ｎ／Ｒ、Ｘ４２Ａ／Ｇ、Ｘ４４Ｑ、Ｘ４８Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｔ、Ｘ４９Ｔ、Ｘ５１Ｋ、Ｘ５４Ｐ、Ｘ５５Ｌ、Ｘ７６Ｓ、Ｘ１０８Ｖ、Ｘ１１７Ｇ、Ｘ１２２Ｆ／Ｑ、Ｘ１２６Ａ、Ｘ１４８Ｑ、Ｘ１５０Ａ／Ｆ、Ｘ１５２Ｓ／Ｔ、Ｘ１５５Ａ／Ｉ／Ｋ／Ｌ／Ｔ／Ｖ、Ｘ１５６Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ｘ１６０Ｐ、Ｘ１６４Ｐ、Ｘ１６５Ｎ、Ｘ１８２Ｔ、Ｘ２１５Ｇ／Ｈ／Ｌ、Ｘ２１８Ｍ、Ｘ２４１Ｒ、Ｘ２６７Ｖ、Ｘ２７０Ｔ、Ｘ２７３Ｈ、Ｘ３２５Ｍ、およびＸ３２８Ｉから選択される配列番号２との比較による１またはそれを超える残基差異を有するトランスアミナーゼポリペプチドをコードする。
式（ＩＩ）の化合物から式（Ｉ）の化合物への変換、式（ＩＩａ）の化合物から式（Ｉａ）の化合物への変換、化合物（２）から化合物（１）への変換、および／または化合物（４）から化合物（３）への変換（それらの様々なアナログを含むものとする）における本明細書で開示された操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの改善された活性、安定性、および／または立体選択性により、より低濃度の操作されたポリペプチドでより高い変換パーセンテージが達成され得るプロセスが提供され、また生成物化合物（例、化合物（１））の精製および生成物化合物の下流にある化合物の精製のための後続工程で除去される必要があり得る残留タンパク質の量も低減される。本プロセスの一部の実施形態において、好適な反応条件は、約０．１〜約４０ｇ／Ｌ、約０．５〜約２０ｇ／Ｌ、約１．０〜約１０ｇ／Ｌ、約２〜約５ｇ／Ｌ、約４０ｇ／Ｌまたはそれ未満、約２０ｇ／Ｌまたはそれ未満、約１５ｇ／Ｌまたはそれ未満、約１０ｇ／Ｌまたはそれ未満、約５ｇ／Ｌまたはそれ未満、約３ｇ／Ｌまたはそれ未満、約２ｇ／Ｌまたはそれ未満、約１．５ｇ／Ｌまたはそれ未満、約１．０ｇ／Ｌまたはそれ未満、約０．７５ｇ／Ｌまたはそれ未満の操作されたポリペプチド濃度を含む。
反応混合物中の基質化合物は、例えば、生成物化合物の所望の量、酵素活性に対する基質濃度の影響、反応条件下での酵素の安定性、および基質から生成物へのパーセント変換を考慮して、変動させることができる。本方法のいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、少なくとも約０．５〜約２００ｇ／Ｌ、１〜約２００ｇ／Ｌ、５〜約１５０ｇ／Ｌ、約１０〜約１００ｇ／Ｌまたは約５０〜約１００ｇ／Ｌの基質化合物負荷を含む。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約３０ｇ／Ｌ、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、少なくとも約７５ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌもしくは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、またはなおもそれより多い基質化合物負荷を含む。本明細書中に提供される基質負荷に対する値は、化合物（２）の分子量に基づくが、しかしながら、等価なモル量の化合物（２）の様々な水和物および塩もまた、そのプロセスにおいて使用され得ることも企図される。さらに、式（ＩＩ）、式（ＩＩａ）によって網羅される基質化合物およびの化合物（４）もまた、化合物（２）に対して使用される量に照らして、適切な量で使用され得る。
本明細書記載のプロセスにおいて、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、生成物化合物を形成するためにアミノドナーを使用する。一部の実施形態において、反応条件におけるアミノドナーは、イソプロピルアミン（本明細書中で「ＩＰＭ」とも称される）、プトレシン、Ｌ−リジン、α−フェネチルアミン、Ｄ−アラニン、Ｌ−アラニンもしくはＤ，Ｌ−アラニンまたはＤ，Ｌ−オルニチンから選択される化合物を含む。いくつかの実施形態において、アミノドナーは、ＩＰＭ、プトレシン、Ｌ−リジン、Ｄ−またはＬ−アラニンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、アミノドナーは、ＩＰＭである。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、少なくとも約０．１〜約３．０Ｍ、０．２〜約２．５Ｍ、約０．５〜約２Ｍまたは約１〜約２Ｍの濃度で存在するアミノドナー、特に、ＩＰＭを含む。いくつかの実施形態において、アミノドナーは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１、１．５、２、２．５または３Ｍの濃度で存在する。
本プロセスに好適な反応条件はまた、典型的には反応混合物中に補助因子の存在を含む。操作されたトランスアミナーゼは典型的にはビタミンＢ６ファミリーの構成員を使用するため、反応条件は、ピリドキサール−５’−リン酸（ピリドキサール−リン酸、ＰＬＰ、Ｐ５Ｐとしても知られる）、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）、ならびにそれらのリン酸化された対応物；ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）およびピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）から選択される補助因子を含み得る。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の、ＰＬＰ、ＰＮ、ＰＬ、ＰＭ、ＰＮＰおよびＰＭＰから選択される補助因子の存在を含み得る。いくつかの実施形態において、補助因子はＰＬＰである。したがって、一部の実施形態において、好適な反応条件は、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の、補助因子、ＰＬＰの存在を含み得る。一部の実施形態において、反応条件は、約１０ｇ／Ｌまたはそれ未満、約５ｇ／Ｌまたはそれ未満、約２．５ｇ／Ｌまたはそれ未満、約１．０ｇ／Ｌまたはそれ未満、約０．５ｇ／Ｌまたはそれ未満、もしくは約０．２ｇ／Ｌまたはそれ未満のＰＬＰ濃度を含む。
本プロセスのいくつかの実施形態（例、全細胞または溶解産物を使用する場合）において、補助因子は、天然には細胞抽出物中に存在し、補充される必要はない。上記プロセスのいくつかの実施形態（例、部分精製トランスアミナーゼ酵素、または精製トランスアミナーゼ酵素を使用）において、本プロセスは、さらに酵素反応混合物に補助因子を添加する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、補助因子は、反応の開始時に加えられ、かつ／またはさらなる補助因子が、反応中に加えられる。
アミノ基転移反応の経過中、反応混合物のｐＨは、変化し得る。反応混合物のｐＨは、所望のｐＨでまたは所望のｐＨ範囲内で維持され得る。これは、反応の前および／または反応の経過中に酸または塩基を加えることによって行われ得る。あるいは、ｐＨは、緩衝剤を使用することによって調節され得る。したがって、いくつかの実施形態において、反応条件は、緩衝剤を含む。所望のｐＨ範囲を維持するのに好適な緩衝剤は、当該分野で公知であり、それらとしては、例として、これらに限定されないが、ホウ酸塩、炭酸塩、リン酸塩、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝剤などが挙げられる。いくつかの実施形態において、緩衝剤は、ＴＥＡである。上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、ＴＥＡの緩衝溶液を含み、ここで、そのＴＥＡの濃度は、約０．０１〜約０．４Ｍ、０．０５〜約０．４Ｍ、０．１〜約０．３Ｍまたは約０．１〜約０．２Ｍである。いくつかの実施形態において、反応条件は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．３または０．４ＭのＴＥＡ濃度を含む。いくつかの実施形態において、反応条件は、好適な溶媒として、緩衝剤が存在しない水を含む。
上記プロセスの実施形態において、反応条件は、好適なｐＨを含み得る。上記で示したように、所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲は、酸もしくは塩基、適切な緩衝剤または緩衝剤と酸もしくは塩基の添加との組み合わせを使用することによって維持され得る。反応混合物のｐＨは、反応の前および／または反応の経過中に制御され得る。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、約８〜約１２．５の溶液ｐＨ、約８〜約１２のｐＨ、約９．０〜約１１．５のｐＨ、または約９．５〜約１１．０のｐＨを含む。いくつかの実施形態において、反応条件は、約８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２または１２．５の溶液ｐＨを含む。
本明細書中のプロセスの実施形態では、例えば、より高い温度における反応速度の増加、反応の十分な持続時間のための酵素の活性、およびさらに下記で記載するとおり、基質ジアステレオマーのエピマー化速度の増加を考慮して（動的速度論的分割（ｄｙｎａｍｉｃ ｋｉｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）のため）、好適な温度が、その反応条件のために使用され得る。例えば、本開示の操作されたポリペプチドは、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチド、および配列番号２の操作されたポリペプチドと比較して高い安定性を有し、そのおかげで、反応についての高められた変換率および改善された基質溶解度特性のためのより高い温度において、本開示の操作されたポリペプチドを使用することが可能である。したがって、いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、約１０℃〜約７０℃、約１０℃〜約６５℃、約１５℃〜約６０℃、約２０℃〜約６０℃、約２０℃〜約５５℃、約３０℃〜約５５℃、または約４０℃〜約５０℃の温度を含む。いくつかの実施形態において、好適な反応条件は、約１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃または７０℃の温度を含む。いくつかの実施形態において、酵素反応中の温度は、反応の経過全体にわたってある温度で維持され得る。一部の実施形態において、酵素反応中の温度は、反応の経過中に温度プロファイルに対して調整され得る。
上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、トランスアミナーゼ酵素の不活性化を制限するように作用し得る、還元型の補助因子であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の存在をさらに含み得る（例えば、ｖａｎ Ｏｐｈｅｍら、１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：２８７９−８８を参照のこと）。ＮＡＤＨが存在するそのような実施形態において、補助因子再生系（例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびグルコースデヒドロゲナーゼまたはギ酸デヒドロゲナーゼおよびホルメート）が、反応媒質中でＮＡＤＨを再生するために使用され得る。
操作されたトランスアミナーゼを用いる本プロセスは、一般的に、溶媒中で行われる。好適な溶媒としては、水、水性の緩衝溶液、有機溶媒、および／または共溶媒系（一般に、水性溶媒および有機溶媒を含む）が挙げられる。水性溶媒（水または水性共溶媒系）は、ｐＨが緩衝され得るか、または緩衝されないものであり得る。いくつかの実施形態において、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドを用いる上記プロセスは、一般的に、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン性液体（例、１−エチル−４メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェートなど）を含む水性共溶媒系において行われる。水性共溶媒系の有機溶媒成分は、水性成分と混和性であり、単一の液相を提供し得るか、または水性成分と部分的に混和性もしくは不混和性であり、２つの液相を提供し得る。例示的な水性共溶媒系は、水および１またはそれを超える有機溶媒を含む。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、それがトランスアミナーゼ酵素を完全に不活性化することのないように選択される。適切な共溶媒系は、本明細書中に記載されるアッセイなどの酵素活性アッセイを使用して、候補溶媒系において目的の規定された基質を用いて特定の操作されたトランスアミナーゼ酵素の酵素活性を計測することによって、容易に特定され得る。本プロセスの一部の実施形態では、好適な反応条件は、水性共溶媒を含み、ここで、その共溶媒は、約１％〜約８０％（ｖ／ｖ）、約１〜約７０％（ｖ／ｖ）、約２％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約５％〜約４０％（ｖ／ｖ）、１０％〜約４０％（ｖ／ｖ）、１０％〜約３０％（ｖ／ｖ）、または約１０％〜約２０％（ｖ／ｖ）の濃度でＤＭＳＯを含む。上記プロセスのいくつかの実施形態において、好適な反応条件は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％（ｖ／ｖ）の濃度でＤＭＳＯを含む水性共溶媒を含む。
好適な反応条件は、基質化合物からその対応する生成物化合物への生体触媒による変換をもたらす反応パラメータの組み合わせを含み得る。したがって、本プロセスの一部の実施形態において、反応パラメータの組み合わせは、（ａ）約１０〜２００ｇ／Ｌの基質化合物（例、化合物（２））の基質負荷；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド濃度；（ｃ）約０．１〜３ＭのＩＰＭ濃度；（ｄ）約０．１〜１ｍＭのＰＬＰ補助因子濃度；（ｅ）約３０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ濃度；（ｆ）約９．５〜１１．５のｐＨ；および（ｇ）約４５℃〜６０℃の温度を含む。
一部の実施形態において、反応パラメータの組み合わせは、（ａ）約５０ｇ／Ｌの基質化合物（例、化合物（２））；（ｂ）約２ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約５０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；（ｄ）約１Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｅ）約１ｍＭのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）；（ｆ）約ｐＨ１０；および（ｇ）約５０℃を含む。
一部の実施形態において、反応パラメータの組み合わせは、（ａ）約５０ｇ／Ｌの基質化合物（例、化合物（２））；（ｂ）約１ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約５０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；（ｄ）約１Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｅ）約１ｍＭのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）；（ｆ）約ｐＨ１１；および（ｇ）約５５℃を含む。
一部の実施形態において、反応パラメータの組み合わせは、（ａ）約５０ｇ／Ｌの基質化合物（例、化合物（２））；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約５０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；（ｄ）約２Ｍのイソプロピルアミン（ＩＰＭ）；（ｅ）約１ｍＭのピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）；（ｆ）約ｐＨ１１．５；および（ｇ）約５５℃を含む。
さらなる例示的な反応条件には、表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ、ならびに実施例１に提示されたアッセイ条件がある。
本明細書記載のアミノ基転移反応を行う際に、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、部分精製酵素もしくは精製酵素、その酵素をコードする遺伝子（複数も可）で形質転換された細胞全体、ならびに／またはそのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解産物において反応混合物に加えられ得る。操作されたトランスアミナーゼ酵素をコードする遺伝子（複数も可）で形質転換された細胞全体またはその細胞抽出物、溶解産物、および単離された酵素は、固体（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）または半固体（例えば、粗ペースト）を含む種々の異なる形態で使用され得る。細胞抽出物または細胞溶解産物は、沈殿（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など）に続く脱塩手順（例えば、限外濾過、透析など）の後の凍結乾燥によって、部分的に精製され得る。いずれの細胞調製物も、公知の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド）を使用する架橋または固相材料（例えば、樹脂、ビーズ、例えばキトサン、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ、ＳＥＰＡＢＥＡＤなど）への固定化によって安定化され得る。
本明細書記載のアミノ基転移反応の一部の実施形態において、反応は、本明細書記載の好適な反応条件下で実施され、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは固体支持体に固定化される。アミノ基転移反応の実施のために操作されたトランスアミナーゼを固定化するのに有用な固体支持体としては、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、オクタデシル官能基を有するスチレン／ＤＶＢコポリマーまたはポリメタクリレートを含む、ビーズまたは樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な固体支持体としては、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ ＣおよびＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）（以下の異なるタイプのＳＥＰＡＢＥＡＤ：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
操作されたポリペプチドが分泌ポリペプチドの形態で発現され得る一部の実施形態では、分泌ポリペプチドを含む培養培地が本明細書におけるプロセスで使用され得る。
一部の実施形態において、固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥されたもの、噴霧乾燥されたものなど）、溶液、エマルジョン、懸濁物などを含む種々の異なる形態で、反応に提供され得る。反応物は、当業者に公知の方法および装置を用いて、容易に凍結乾燥され得るか、または噴霧乾燥され得る。例えば、タンパク質溶液は、少量のアリコートで−８０℃において凍結され、次いで、予冷された凍結乾燥チャンバーに加えられた後、真空が適用され得る。
一部の実施形態において、反応物の添加順序は重要ではない。反応物は、共に同時に溶媒（例えば、単相の溶媒、二相の水性共溶媒系など）に加えられてもよいし、あるいは、反応物のいくつかが、別々に加えられ、いくつかが、異なる時点において共に加えられてもよい。例えば、補助因子、トランスアミナーゼおよびトランスアミナーゼ基質が、最初に溶媒に加えられ得る。改善された混合効率のために、水性共溶媒系が使用されるとき、トランスアミナーゼおよび補助因子が、最初に水相に加えられ、混合され得る。次いで、有機相が加えられ、混合された後、トランスアミナーゼ基質が加えられ得る。あるいは、トランスアミナーゼ基質は、有機相において予め混合された後、水相に加えられてもよい。
いくつかの実施形態において、上記プロセスは、アミノ基が式（ＩＩ）、（ＩＩａ）の基質化合物、化合物（２）または化合物（４）に転移されるときにアミノ基ドナーから形成されるカルボニル副産物の除去工程をさらに含み得る。そのようなその場での除去は、正反応が優勢になり、次いで、より多くの基質が生成物に変換されるように、逆反応の速度を低下させることができる。カルボニル副産物の除去は、いくつかの方法で行われ得る。アミノ基ドナーが、アラニンなどのアミノ酸である場合、カルボニル副産物であるケト酸は、過酸化物との反応によって除去され得る（例えば、参照により本明細書中に援用される米国特許公開２００８／０２１３８４５Ａ１を参照のこと）。使用され得る過酸化物としては、とりわけ、過酸化水素；ペルオキシ酸（過酸）（例えば、過酢酸（ＣＨ３ＣＯ３Ｈ）、トリフルオロ過酢酸およびメタクロロペルオキシ安息香酸）；有機過酸化物（例えば、ｔ−ブチル過酸化物（（ＣＨ３）３ＣＯＯＨ））；または他の選択的酸化剤（例えば、過ルテニウム酸テトラプロピルアンモニウム、ＭｎＯ２、ＫＭｎＯ４、四酸化ルテニウムおよび関連する化合物）が挙げられる。あるいは、ピルベートの除去は、乳酸デヒドロゲナーゼを使用して、平衡状態を生成物アミンにシフトさせることによる、ラクテートへの還元によって達成され得る（例えば、Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら、２００８，Ａｄｖ．Ｓｙｎ．Ｃａｔａｌ．３５０：２７６１−２７６６を参照のこと）。ピルベートの除去は、ピルビン酸デカルボキシラーゼを使用することによる、二酸化炭素アセトアルデヒドへのその脱炭酸によっても達成され得る（例えば、Ｈｏｅｈｎｅら、２００８，Ｃｈｅｍ ＢｉｏＣｈｅｍ ９：３６３−３６５を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、アミノドナーの選択によって、水より高い蒸気圧を有するカルボニル副産物（例えば、揮発性の有機カルボニル化合物などの低沸点の副生成物）がもたらされる場合、そのカルボニル副産物は、反応溶液を非反応性ガスとともに噴霧することによって、または真空を適用して反応の圧力を低下させ、気相中に存在するカルボニル副産物を除去することによって、除去され得る。非反応性ガスは、反応成分と反応しない任意のガスである。様々な非反応性ガスとしては、窒素ガスおよび貴ガス（例えば、不活性ガス）が挙げられる。いくつかの実施形態において、非反応性ガスは、窒素ガスである。いくつかの実施形態において、上記プロセスにおいて使用されるアミノドナーは、アミノ基アクセプターにアミノ基を転移する際にカルボニル副産物であるアセトンを形成するイソプロピルアミン（ＩＰＭ）である。このアセトンは、窒素ガスとともに噴霧することによって、または反応溶液に真空を適用して、冷却器または他の冷却トラップなどのアセトントラップによってアセトンを気相から除去することによって、除去され得る。あるいは、アセトンは、ケトレダクターゼを使用してイソプロパノールに還元することによって除去され得る。
カルボニル副産物が除去される上記プロセスのいくつかの実施形態において、対応するアミノ基ドナーは、アミノ基ドナーを補充するためおよび／または反応のｐＨを維持するために、アミノ基転移反応中に加えられ得る。アミノ基ドナーの補充は、平衡状態を生成物形成にシフトさせ、それにより、基質から生成物への変換も増加させる。したがって、アミノ基ドナーがＩＰＭであり、アセトン生成物がその場で除去される、いくつかの実施形態において、本プロセスは、アセトン除去中に失われたアミノ基ドナーを補充するためおよび反応のｐＨを維持する（例、約８．５〜約ｐＨ１１．５）ために、ＩＰＭをその溶液に加える工程をさらに含み得る。
一部の実施形態では、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドを用いた、アミノアクセプター基質化合物からキラルアミン生成物化合物への生体触媒による変換を含む本プロセスは、薬学的に受容可能な塩または酸、薬学的に受容可能な製剤の形成、生成物の後処理、抽出、単離、精製、および／または結晶化の工程をさらに含み得、これらはそれぞれある一定範囲の条件下で実施され得る。
一部の実施形態において、本明細書で開示された操作されたポリペプチドを用いる本プロセスであって、該反応から式（Ｉ）の化合物、式（Ｉａ）の化合物、化合物（１）または化合物（３）を単離する工程をさらに含むプロセスが実施され得る。
一部の実施形態において、本明細書で開示された操作されたポリペプチドを用いる本プロセスであって、式（Ｉ）の化合物、式（Ｉａ）の化合物、化合物（１）または化合物（３）を、好適な反応溶媒中で薬学的に受容可能な酸と接触させることにより、前記化合物を薬学的に受容可能な塩に変換する工程をさらに含むプロセスが実施され得る。本プロセスの一部の実施形態において、薬学的に受容可能な酸はリン酸であり、薬学的に受容可能な塩は二水素リン酸塩である。一部の実施形態において、本プロセスは、反応溶媒から薬学的に受容可能な塩を結晶化させる工程をさらに含み得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示された操作されたポリペプチドを用いる本プロセスであって、アミノ基ドナーが、イソプロピルアミン、アラニン、３−アミノ酪酸またはメチルベンジルアミンから選択されるプロセスが実施され得る。一部の実施形態において、アミノ基ドナーはイソプロピルアミンである。
上記で示したように、化合物（１）は、ＪＡＮＵＶＩＡ（登録商標）における薬学的有効成分のシタグリプチンである。したがって、化合物（１）および／またはその薬学的に受容可能な酸または塩を製造するために操作されたポリペプチドを用いる本明細書で開示されたプロセスは、ＪＡＮＵＶＩＡ（登録商標）または関連薬学的化合物を製造するためのより大きなプロセスで使用され得る。一部の実施形態において、本開示はまた、（２Ｒ）−４−オキソ−４−［３−（トリフルオロメチル）−５，６−ジヒドロ［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７（８Ｈ）−イル］−１−（２，４，５−トリフルオロフェニル）ブタン−２−アミンホスフェート（１：１）一水和物の調製のためのプロセスであって、好適な反応条件のもとアミノ基ドナーの存在下で化合物（２）の基質を本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させることにより、基質化合物（２）を生成物化合物（１）に変換する工程を含むプロセスを提供する。
一部の実施形態において、さらに本開示は、化合物（３）、または化合物（３）の薬学的に受容可能な塩または酸の調製のためのプロセスであって、好適な反応条件のもとアミノ基ドナーの存在下で化合物（４）の基質または保護基で修飾された化合物（４）の基質を本明細書で開示された操作されたポリペプチドと接触させることによる、基質化合物（４）または保護基で修飾された化合物（４）の基質を生成物化合物（３）に変換する工程を含むプロセスを提供する。
上で開示されたプロセスにより生成された生体触媒反応混合物からアミノ化生成物化合物または閉環化合物を抽出するため、単離するため、それらの塩を形成するため、精製するため、および／または結晶化するための方法、手法およびプロトコルは、当業者に公知であり、かつ／または通例の実験によって達成される。さらに、例示的な方法が、下記の実施例に提供される。
本開示の様々な特徴および実施形態が、例示的であって限定すると意図されない、以下の代表的な実施例において例示される。
６．実施例
実施例１：操作されたポリペプチドの合成、最適化およびスクリーニング
Ａ．遺伝子の取得および最適化
配列番号２の参照の操作されたポリペプチドをコードするコドン最適化され、操作されたトランスアミナーゼ遺伝子（配列番号１）を、配列番号４〜３０６の偶数番号が付された配列識別子のトランスアミナーゼ活性を有する操作されたポリペプチド（それぞれ、基質化合物（２）を、それ自体および／または配列番号２の参照配列に対して改善された酵素特性で生成物化合物（１）に変換することができる）をコードする遺伝子を生成させる定向進化のための出発バックボーンとして使用した。本開示の配列番号１の遺伝子および配列番号２のポリペプチドは、２０１２年１０月２３日付、米国特許８，２９３，５０７ Ｂ２の配列番号１０９および１１０に対応する。配列番号２の操作されたトランスアミナーゼポリペプチドは、野生型Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＫＮＫ１６８ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＫ３９７５３．１，ＧＩ：３３６０８８３４１）に対して以下の２８アミノ酸差異を有する：Ｓ８Ｐ、Ｙ６０Ｆ、Ｌ６１Ｙ、Ｈ６２Ｔ、Ｖ６５Ａ、Ｖ６９Ｔ、Ｄ８１Ｇ、Ｍ９４Ｉ、Ｉ９６Ｌ、Ｆ１２２Ｍ、Ｓ１２４Ｔ、Ｓ１２６Ｔ、Ｇ１３６Ｆ、Ｙ１５０Ｓ、Ｖ１５２Ｃ、Ａ１６９Ｌ、Ｖ１９９Ｉ、Ａ２０９Ｌ、Ｇ２１５Ｃ、Ｇ２１７Ｎ、Ｓ２２３Ｐ、Ｌ２６９Ｐ、Ｌ２７３Ｙ、Ｔ２８２Ｓ、Ａ２８４Ｇ、Ｐ２９７Ｓ、Ｉ３０６Ｖ、およびＳ３２１Ｐ。ｐＣＫ１１０９００ベクター系（例えば、米国特許出願公開２００６／０１９５９４７Ａ１を参照のこと）における配列番号１のクローニングおよび後続の大腸菌Ｗ３１１０ｆｈｕＡにおける発現は、２０１２年１０月２３日付、米国特許８，２９３，５０７ Ｂ２に記載されている通りであった。簡単に述べると、大腸菌Ｗ３１１０は、ｌａｃプロモーターの制御下において、そのトランスアミナーゼポリペプチドを細胞内タンパク質として発現する。そのポリペプチドは主として細胞質ゾルの可溶性活性酵素として蓄積する。本明細書で開示された遺伝子配列配列番号１の操作された誘導体を生成するための、遺伝子合成の後にヒットをスクリーニングし、配列決定することによって、変異体ライブラリーを繰り返し作製することによる標準的な定向進化の方法。一次スクリーニングに使用したＨＴＰアッセイを、これらの大腸菌Ｗ３１１０細胞の発現からの透明な細胞溶解産物を用いて実施した（表２Ａおよび下記参照）。
Ｂ．ＨＴＰアッセイ
ｐＨ８．５で０．１ＭのＴＥＡ緩衝液、１ｇ／Ｌのリゾチーム、および０．５ｇ／Ｌの硫酸ポリミキシンＢ、および０．２５ｍＭのＰＬＰを含有する２００μＬの溶解緩衝液を加え、次いで室温で２時間振とうする（２５０ｒｐｍで）ことにより、操作されたポリペプチドを発現する大腸菌細胞を溶解した。一般的なＨＴＰ活性アッセイ条件は、５０ｇ／Ｌの基質化合物（２）、１または１．２ｍＭのＰＬＰ、５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、２０μＬまたは４０μＬの透明な細胞溶解産物（発現された操作されたポリペプチドを含有）、１．５Ｍまたは２ＭのＩＰＭ、ｐＨ１１またはｐＨ１１．５、ならびに４時間または１８時間２００ｒｐｍおよび５５℃での振とうであった。１ｍＬのアセトニトリルを添加し、５分間振とうすることによりアッセイ反応をクエンチし、プレートを１８℃で１０分間４０００ｘｇで遠心分離した。比溶解およびアッセイ反応条件を表２Ａに示す。
Ｃ．ＳＦＰ調製物およびアッセイ
一次スクリーニングのためのＨＴＰアッセイに加えて、いくつかの場合に、操作されたトランスアミナーゼポリペプチドの振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）調製物を用いて、二次スクリーニングを５ｍＬ規模で実施した。振とうフラスコ粉末（ＳＦＰ）は、およそ３０％の総タンパク質を含み、従って、ＨＴＰアッセイにおいて使用される細胞溶解産物と比べて、操作された酵素のより精製された調製物を提供する。
ＳＦＰを調製するため、目的の操作されたトランスアミナーゼをコードするプラスミドを含む大腸菌の単一の微生物コロニーを、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール（ＣＡＭ）および１％グルコースを含む５０ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉブロスに接種した。２５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃の恒温器内で一晩（少なくとも１６時間）、細胞を増殖させた。その培養物を、１０００ｍＬフラスコ内で、３０μｇ／ｍｌＣＡＭおよび１００ｍＭのピリドキシンを含む２５０ｍＬの２ｘＹＴ培地（Ｄｉｆｃｏ）中に、０．１という６００ｎｍの光学濃度（ＯＤ６００）に希釈し、３０℃で増殖させた。培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８になったら、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（「ＩＰＴＧ」）を１ｍＭという最終濃度まで加えることによって、操作されたトランスアミナーゼ遺伝子の発現を誘導した。次いで、インキュベーションを一晩（少なくとも１６時間）続けた。遠心分離（５０００ｒｐｍ、３０分、５℃）によって細胞を採取し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、１００μＭのピリドキサール５’リン酸を含む、１２ｍＬの冷（４℃）５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ８．５に再懸濁し、４℃で維持しつつ、１６ｋｐｓｉでワンショット粉砕機（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｔｄ）に１回通した。遠心分離（１００００ｒｐｍ、４０分、５℃）によって細胞残屑を除去した。透明の溶解産物上清を集め、−８０℃で保管した。凍結された透明の溶解産物の凍結乾燥により、粗トランスアミナーゼポリペプチドの乾燥した振とうフラスコ粉末が得られる。あるいは、細胞ペレット（洗浄の前または後）は、４℃または−８０℃で保存され得る。
一般的なＳＦＰアッセイは、５ｍＬの総体積中以下の出発反応混合物を含んでいた：５０ｇ／Ｌの化合物（２）の基質、０．５、１または２ｇ／Ｌの操作されたポリペプチドＳＦＰ、１または１．２ｍＭのＰＬＰ、１Ｍまたは２ＭのＩＰＭ、５０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、および０．０５ＭのＴＥＡ緩衝液。ＳＦＰ反応条件は、ｐＨ１０および５０℃；ｐＨ１１．５および５５℃；またはｐＨ１１．５および６０℃であった。磁気撹拌棒による２５０ｒｐｍでの撹拌を伴いＳＦＰアッセイ反応時間は２または２４時間であった。
ＳＦＰアッセイについての一般的プロトコルは次の通りであった。ストック溶液（プレミックス）を以下のとおり実験のセットごとに毎日調製した：０．５ｍＬの１０または１２ｍＭのＰＬＰ（滅菌水中）に対し、０．８２ｍＬのＩＰＭ、２．５ｍＬのＤＭＳＯ、および５０ｇ／Ｌ濃度での基質化合物（２）。プレミックス溶液のｐＨを３７％ＨＣｌで調節した。２５、５０または１００ｇ／Ｌの操作されたポリペプチドストック溶液を、１２．５、２５または５０ｍｇの該ポリペプチドのＳＦＰを０．５ｍＬのＴＥＡ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．５）に溶解することにより調製した。
各実験について、４．９ｍＬのプレミックスストック溶液を、ガラス製ねじ口式バイアルに加えた。バイアルをきつく閉め、２５０ｒｐｍで磁気撹拌しながら５０、５５または６０℃に加熱した。１００μＬの酵素粉末溶液（０．２Ｍボレート中、ｐＨ１０．５）を反応混合物に加えた。バイアルをきつく閉め、２または２４時間撹拌しながら反応を続行させた。２または２４時間後２０ｍＬのアセトニトリルを加えることにより反応をクエンチした。
Ｄ．ＤＳＰ調製物およびアッセイ
操作されたトランスアミナーゼポリペプチドのＤＳＰ粉末は、５ｍＭのピリドキサールＨＣｌを供給培地および発酵槽培地に添加する標準的なバイオプロセス法に従って、短時間バッチ発酵の後、流加プロセスとして調製された。簡潔には、ＩＰＴＧを１ｍＭという最終濃度まで加えることによって、トランスアミナーゼポリペプチドの発現を誘導した。発酵の後、細胞を採取し、１００ｍＭのＴＥＡ緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁し、次いで、トランスアミナーゼポリペプチドの均質化によって機械的に破砕した。細胞残屑および核酸を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて凝集させ、懸濁物を遠心分離によって清澄化した。得られた透明の上清を、タンジェンシャルクロスフロー限外濾過膜を用いて濃縮することにより、塩および水を除去した。次いで、濃縮され、部分的に精製された酵素濃縮物を、凍結乾燥機において乾燥させてＤＳＰ粉末を得、これを容器（例えば、ポリエチレン）に包装した。
操作されたポリペプチドＤＳＰの最終アッセイ濃度がわずか０．５ｇ／Ｌまたは１．０ｇ／Ｌであるという唯一の差異を伴うが、ＳＦＰ活性アッセイについて上で記載したのと同じ方法を用いて、ＤＳＰ活性アッセイを５ｍＬ規模で実施した。
Ｅ．アッセイのＨＰＬＣ分析
上記されたようにＨＴＰ、ＳＦＰまたはＤＳＰアッセイを実施した後、アセトニトリルでクエンチしたアッセイ反応溶液からの試料を分析することにより、化合物（２）の基質から化合物（１）の生成物への変換パーセントならびに生成物の立体異性体純度（すなわち、ｅ．ｅ．％）を決定した（例えば米国特許８，２９３，５０７ Ｂ２の実施例４に記載された標準アキラルおよびキラルＨＰＬＣ分析方法を用いた（また、Ｓａｖｉｌｅら、２０１０、“Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｃｈｉｒａｌ ａｍｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｋｅｔｏｎｅｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ，” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９（５９８９）：３０５−９およびＳｕｐｐｏｒｔｉｎｇ Ｏｎｌｉｎｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓも参照）を使用した）。
簡単に述べると、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ８カラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、５μｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣを用い、４５：５５の１０ｍＭのＮＨ４Ａｃ／ＭｅＣＮを溶離剤として用いて、１．５ｍｌ／分の流量および４０℃のカラム温度で、化合物（２）の基質から化合物（１）への変換パーセントを決定した。保持時間：基質化合物（２）＝１．７分；化合物（１）＝１．４分。溶離液中の基質および生成物を、経路長１ｃｍで２１０ｎｍまたは２６８ｎｍでのピーク面積として決定した。
Ｄａｉｃｅｌ Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ−Ｈカラム（４．６ｘ１５０ｍｍ、５μｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣを用い、６０：４０：０．１：０．１のＥｔＯＨ／ヘプタン／ジエチルアミン／水を溶離剤として用いて、０．８ｍｌ／分の流量および３５℃のカラム温度で、化合物（１）の立体異性体純度を決定した。保持時間：基質化合物（２）＝６．３分；（Ｓ）−エナンチオマー生成物化合物＝８．４分；化合物（１）＝１０．８分。基質および生成物を、経路長１ｃｍで２１０ｎｍまたは２６８ｎｍでのピーク面積として決定した。
Ｆ．結果
本開示のトランスアミナーゼ活性を有する特定の操作されたポリペプチドのＨＴＰ、ＳＦＰおよびＤＳＰ調製物の比活性、安定性および立体純度アッセイの結果を、表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに提示する。
本願において引用されたすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、各個別の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、すべての目的のために参照により援用されると個別に示されたのと同程度に、すべての目的のために、それらの全体が参照により援用される。
様々な具体的な実施形態が、例示され、説明されてきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われ得ることが認識されるだろう。

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  1. 明細書中に記載の発明。
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