JP2017537910A - 安定な液体ワクシニアウイルス処方物 - Google Patents

安定な液体ワクシニアウイルス処方物 Download PDF

Info

Publication number
JP2017537910A
JP2017537910A JP2017529010A JP2017529010A JP2017537910A JP 2017537910 A JP2017537910 A JP 2017537910A JP 2017529010 A JP2017529010 A JP 2017529010A JP 2017529010 A JP2017529010 A JP 2017529010A JP 2017537910 A JP2017537910 A JP 2017537910A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mva
virus
liquid formulation
formulation
less
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2017529010A
Other languages
English (en)
Other versions
JP6655618B2 (ja
JP2017537910A5 (ja
Inventor
メリナ、シャスル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Transgene SA
Original Assignee
Transgene SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Transgene SA filed Critical Transgene SA
Publication of JP2017537910A publication Critical patent/JP2017537910A/ja
Publication of JP2017537910A5 publication Critical patent/JP2017537910A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6655618B2 publication Critical patent/JP6655618B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本発明は、保存中に安定なポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスの液体処方物に関する。このような安定な液体処方物は、ａ）ポックスウイルス、好ましくは、ワクシニアウイルス、ｂ）薬学上許容可能なバッファー、ｃ）一価の塩、ｄ）薬学上許容可能な二糖または糖アルコール、およびｅ）薬学上許容可能なキレート剤を含んでなり、前記処方物のｐＨは６．５〜８．５の間に含まれる。

Description

本発明は、ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスの液体保存のための安定な液体処方物の分野にある。本発明は、ａ）ポックスウイルス、好ましくは、ワクシニアウイルス、ｂ）薬学上許容可能なバッファー、ｃ）一価の塩、ｄ）薬学上許容可能な二糖または糖アルコール、およびｅ）薬学上許容可能なキレート剤を含んでなり、そのｐＨが６．５〜８．５の間に含まれる液体処方物に関する。
ポックスウイルスは、特異な形態、大きなＤＮＡゲノムおよび複製部位が細胞質であることを特徴とする、２００〜３００ｎｍの間に含まれる直径を有する複合なエンベロープを有するウイルスである。２株のワクシニアウイルス（ＶＶ）：コペンハーゲンワクシニアウイルス株(GOEBEL et al., 1990, Virol. 179, 247-266および517-563；JOHNSON et al., 1993, Virol. 196, 381-401)、ワイス株(OSBORNE JD et al. Vaccine. 2007 Dec 17;25(52):8807-32)および改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）株(ANTOINE et al., 1998, Virol. 244:365-396)を含むオルソポックスウイルスのいくつかのメンバーのゲノムがマッピングされ配列が決定されている。ＶＶは、約２００のタンパク質（そのうちおよそ１００はウイルスのアセンブリに関与する）をコードする約１９２ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。ＭＶＡは、ワクシニアウイルスアンカラ株をニワトリ胚線維芽細胞上で５００回を越えて継代することにより作製された高弱毒化ワクシニアウイルス株である(MAYR et al., 1975, Infection 3:6-16)。ＭＶＡウイルスは、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）にＩ−７２１番として寄託されている。ＭＶＡ ゲノムの全配列の決定とコペンハーゲンＶＶゲノムとの比較により、ウイルスゲノムに見られる変異の正確な同定、ならびに７箇所の欠失（Ｉ〜ＶＩＩ）およびＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の断片化に至る多くの突然変異の定義が可能となる(Open Reading Frame) (ANTOINE et al., 1998, Virology 244:365-396)。
ＭＶＡは、痘瘡に対する予防ワクチンとして使用され、組換えＭＶＡは現在、癌（特に、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、前立腺癌、結腸直腸癌）、ウイルス（特に、Ｂ型またはＣ型肝炎、ＨＩＶ）、細菌（特に、結核）および寄生虫疾患（特に、マラリア）を含む多くのタイプの標的に対する予防的および治療的ワクチン接種に関する多くの前臨床および臨床試験の対象となっている（GOMEZ et al. Current Gene Therapy, 2008, 8:97-120参照）。
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスもまた、前臨床および臨床開発下にある（KIRN et al. Nat Rev Cancer, 2009 Jan, 9(1):64-71参照）。
両場合とも、生ワクシニアウイルスが使用される。
生ワクシニアウイルスの予防用または治療用ワクチンは一般に生産および精製直後に患者に投与されるのではなく、従って、その効力を損失することなく数日、数週間またはさらには数か月間保存する必要がある。
総ての生ウイルスと同様に、生ワクシニアウイルスは本来不安定であり、ワクシニアウイルスはエンベロープウイルス（エンベロープウイルスは非エンベロープウイルスよりも安定生が低いことが知られている、BURKE CJ et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999, 16(1):1-83;およびREXROAD et al. Cell Preservation Technology. June 2002, 1(2):91-104参照）は、サイズが大きく（２００〜３００ｎｍのれんが型）、大きなゲノムを有し、特にＵＶ損傷を受けやすいことが知られている、LYTLE et al. J. Virol. 2005, 79(22):14244参照、という事実によって不安定性がさらに増大する。さらに、ワクシニアウイルスエンベロープは、他のエンベロープウイルスよりもいっそう複雑である。従って、ワクシニアウイルスの安定化は特に難しい。
ワクシニアウイルスを安定化させる試みがなされている。ほとんどの場合、凍結乾燥処方物が提案されている(BURKE CJ et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999, 16(1):1-83)。実際に、凍結乾燥を行うとウイルス力価にいくらかの低下が起こることがあるが、ひと度凍結乾燥させると、凍結乾燥状態では低温と化合物間の動きや相互作用が無いことで凍結乾燥ウイルスは液体状態中のウイルスよりも全般的に安定となる。例えば、ＥＰ１４１８９４２には、実質的に純粋なワクシニアウイルス、二糖類、薬学上許容可能なポリマーおよびリン酸バッファーでないバッファーを含んでなる、凍結乾燥用のワクシニアウイルス処方物が開示されている。ＷＯ２０１４／０５３５７１には、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）またはその誘導体、少なくとも１種類の糖（特に、スクロース）、少なくとも２種類の異なるアミノ酸（特に、グルタミン酸ナトリウムおよびＬ−アルギニン）、少なくとも２種類の製薬上許容可能な塩（特に、ＮａＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４およびＫＨ２ＰＯ４）を含んでなる他の凍結乾燥ＭＶＡ処方物が開示され、この場合、前記塩の少なくとも１種類はリン酸塩、場合により、製薬上許容可能なバッファー（特に、トリス）である。
しかしながら、凍結乾燥は高くつき、特殊な装置を必要とし、凍結乾燥処方物は投与前に再構成する必要がある。さらに、凍結乾燥は、特に高ウイルス力価ではいくらかのウイルス凝集をもたらし得る凍結工程を含み、これは注射投与には適切でない。従って、安定な液体ワクシニアウイルス処方物を利用可能とすることが極めて有用である。
液体状態でワクシニアウイルスを安定化させるためのこれまでの試みは、ほとんどの場合で、５０℃で１時間より短い時間の後に１ｌｏｇ１０を越えるｌｏｇ低下が見られたことから、あまり成功していない（BURKE CJ et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999, 16(1):1-83参照）。
Ｅｖａｎｓらは、塩（一般に、ＮａＣｌ）、糖（ほとんどの場合、スクロース）、フリーラジカル酸化の阻害剤（特に、ＥＤＴＡ、エタノールまたはＥＤＴＡ／エタノールの組合せ）、非イオン界面活性剤および二価の塩を含んでなる、ｐＨ６〜ｐＨ８の間に緩衝された安定な液体アデノウイルス（非エンベロープＤＮＡウイルス）処方物を開示している（EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75；および米国特許第７，４５６，００９号参照）。好ましい処方物はまた一般に、ヒスチジンも含んでなる。安定性の必須要素として特定されているパラメーターには、フリーラジカル酸化の阻害剤（特に、ＥＤＴＡ、エタノール、およびＥＤＴＡ／エタノールの組合せ、および／またはヒスチジン）の存在、および非イオン界面活性剤の存在が含まれる。二価の塩の存在もまた、アデノウイルス安定性を増大させるために重要であるとして特定されている。
乳頭腫ウイルスに関して、安定化目的の非イオン界面活性剤の有用性も報告されている（SHI et al. J Pharm Sci. 2005 Jul, 94(7):1538-51参照）。
ＵＳ２００７／０１６１０８５では、インフルエンザウイルス（エンベロープＲＮＡウイルス）の安定化のための種々の液体処方物が試験された。最も安定な処方物には、アルギニンおよびゼラチンが含まれた。この研究では、ＥＤＴＡはインフルエンザウイルスの安定性に効果がないことが示された。アルギニンおよびゼラチンに加えて、少量の界面活性剤が有益であることが判明した。
米国特許第７，９１４，９７９号は、スクロースなどの非還元糖を含んでなる、エンベロープを有するニューカッスル病ウイルスの安定化のための処方物に関するものである。好ましい組成物はまた、リシンおよびアルギニンから選択されるアミノ酸を含有する。これに対し、ＥＤＴＡは、安定性にマイナスの効果を持つことが示され、処方物から除くことが好ましいことが示された。
ＷＯ２０１４／０２９７０２では、４種類のイヌウイルス：２種類の小型および中型非エンベロープウイルス（イヌパルボウイルスおよび２型イヌアデノウイルス）およびパラミクソウイルス科の２種類のエンベロープウイルス（イヌジステンパーウイルスおよびイヌパラインフルエンザウイルス）の安定化に関して、種々のタイプの処方物が試験された。結果は、エンベロープウイルスは非エンベロープウイルスよりも安定化が難しいこと、および最適な処方物は同じパラミクソウイルス科の２種類のエンベロープウイルス（イヌジステンパーウイルスとイヌパラインフルエンザウイルス）であってさえも、ウイルス間で著しく異なることを示す。加えて、実施例１には、スクロース（特に、１７〜２５％の濃度）およびアミノ酸（アルギニンおよびメチオニンなど）は有効な安定剤であるが、フリーラジカルスカベンジャー（ＥＤＴＡなど）は、安定性にはいくらか寄与する可能性があるものの、安定性プロフィールを大きく変化させることはないことが示される。
上記従来技術の説明は、多くの安定剤候補が当技術分野で知られること、また、それらの安定化効果は安定化させる特定のウイルスによって大幅に異なることから、特定のウイルスに対して安定な液体処方物を設計することは難しい課題であることを示している。加えて、上記で説明したように、そのエンベロープ特性、その大きさ、およびそのＤＮＡゲノムのために、ワクシニアウイルスは安定化が特に難しく、特に液体状態ではそうである。
本発明に関して、本発明者らは、約５℃（すなわち、５℃±３℃）以上の液体状態でワクシニアウイルスの安定性を維持するのに好適な液体処方物を特定した。このような処方物の必須要素は、薬学上許容可能なバッファー、一価の塩、薬学上許容可能な二糖または糖アルコール、薬学上許容可能なキレート剤の存在、および６．５〜８．５の間のｐＨである。Ｃ２−Ｃ３アルコールの付加的存在は、液体処方物の安定性をさらに改善する。
よって、第１の態様において、本発明は、
ａ）ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルス、
ｂ）薬学上許容可能なバッファー、
ｃ）一価の塩、
ｄ）薬学上許容可能な二糖または糖アルコール、および
ｅ）薬学上許容可能なキレート剤
を含んでなるか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる、そのｐＨが６．５〜８．５である液体処方物に関する。
本発明者らはまた驚くことに、ＥＤＴＡなどのキレート剤の存在がワクシニアウイルスをＵＶ損傷から保護することを見出した。よって、本発明はまた、ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスをＵＶ損傷に対して安定化させるためのキレート剤の使用に関する。
一価の塩の存在の有益な効果。０ｍＭまたは５０ｍＭのＮａＣｌとともにトリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭを含有するｐＨ８．０の処方物中、＋３７℃で７、１４または２８日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは粒子形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＰＦＵ／ｍＬ）で表す。 ＥＤＴＡまたはＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの存在の有益な効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ２処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ならびに種々の濃度のＥＤＴＡ（５０、２５０、５００および１０００μＭ）および場合によりＥｔＯＨ １％ｖ／ｖを含有するｐＨ７．５の処方物中、＋３７℃で７、１４または２８日後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 ＥｔＯＨまたはＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの存在の有益な効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ２処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ならびに種々の濃度のＥｔＯＨ（０．５；１；２または４％ｖ／ｖ）および場合によりＥＤＴＡ（５０または１０００μＭ）を含有するｐＨ７．５の処方物中、＋３７℃で７、１４または２８日後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの存在の有益な効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ２処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ならびに種々の濃度のＥＤＴＡ（５０、１５０、または２５０μＭ）およびＥｔＯＨ（０．５；１．５；または２．５％ｖ／ｖ）を含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４または２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または２、３もしくは６か月後；または（Ｃ）５℃で３５日、または３、６、１２、１８、もしくは２４か月後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。（Ｄ）＋３７℃で７日後の感染低下、＋３７℃で２８日後の感染低下、および＋５℃で２４か月後の感染低下の複合解析に基づくＥＤＴＡ（μＭ）およびＥｔＯＨ（％）濃度に関する望ましさ曲線。特定の望ましさ値が得られるＥＤＴＡおよびＥｔＯＨ濃度の値を表す曲線を示す。より高い望ましさ値をもたらすＥＤＴＡおよびＥｔＯＨが好ましい。 ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの存在の有益な効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ２処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ならびに種々の濃度のＥＤＴＡ（５０、１５０、または２５０μＭ）およびＥｔＯＨ（０．５；１．５；または２．５％ｖ／ｖ）を含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４または２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または２、３もしくは６か月後；または（Ｃ）５℃で３５日、または３、６、１２、１８、もしくは２４か月後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。（Ｄ）＋３７℃で７日後の感染低下、＋３７℃で２８日後の感染低下、および＋５℃で２４か月後の感染低下の複合解析に基づくＥＤＴＡ（μＭ）およびＥｔＯＨ（％）濃度に関する望ましさ曲線。特定の望ましさ値が得られるＥＤＴＡおよびＥｔＯＨ濃度の値を表す曲線を示す。より高い望ましさ値をもたらすＥＤＴＡおよびＥｔＯＨが好ましい。 ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの存在の有益な効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ２処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ならびに種々の濃度のＥＤＴＡ（５０、１５０、または２５０μＭ）およびＥｔＯＨ（０．５；１．５；または２．５％ｖ／ｖ）を含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４または２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または２、３もしくは６か月後；または（Ｃ）５℃で３５日、または３、６、１２、１８、もしくは２４か月後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。（Ｄ）＋３７℃で７日後の感染低下、＋３７℃で２８日後の感染低下、および＋５℃で２４か月後の感染低下の複合解析に基づくＥＤＴＡ（μＭ）およびＥｔＯＨ（％）濃度に関する望ましさ曲線。特定の望ましさ値が得られるＥＤＴＡおよびＥｔＯＨ濃度の値を表す曲線を示す。より高い望ましさ値をもたらすＥＤＴＡおよびＥｔＯＨが好ましい。 ＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの存在の有益な効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ２処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ならびに種々の濃度のＥＤＴＡ（５０、１５０、または２５０μＭ）およびＥｔＯＨ（０．５；１．５；または２．５％ｖ／ｖ）を含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４または２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または２、３もしくは６か月後；または（Ｃ）５℃で３５日、または３、６、１２、１８、もしくは２４か月後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。（Ｄ）＋３７℃で７日後の感染低下、＋３７℃で２８日後の感染低下、および＋５℃で２４か月後の感染低下の複合解析に基づくＥＤＴＡ（μＭ）およびＥｔＯＨ（％）濃度に関する望ましさ曲線。特定の望ましさ値が得られるＥＤＴＡおよびＥｔＯＨ濃度の値を表す曲線を示す。より高い望ましさ値をもたらすＥＤＴＡおよびＥｔＯＨが好ましい。 低濃度のグルタミン酸Ｎａの有益な効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５を含有する対照ＤＳ処方物中；トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ２処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ０〜１０ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、およびＥｔＯＨ ０．５％ｖ／ｖを含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４、または２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または３、６もしくは１２か月後；（Ｃ）＋５℃で２、３、６、１２、１８、２４または３０か月後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 低濃度のグルタミン酸Ｎａの有益な効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５を含有する対照ＤＳ処方物中；トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ２処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ０〜１０ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、およびＥｔＯＨ ０．５％ｖ／ｖを含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４、または２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または３、６もしくは１２か月後；（Ｃ）＋５℃で２、３、６、１２、１８、２４または３０か月後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 低濃度のグルタミン酸Ｎａの有益な効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５を含有する対照ＤＳ処方物中；トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ２処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ０〜１０ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、およびＥｔＯＨ ０．５％ｖ／ｖを含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４、または２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または３、６もしくは１２か月後；（Ｃ）＋５℃で２、３、６、１２、１８、２４または３０か月後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 スクロースの有益な効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、および種々の濃度のスクロース（１．２５；２．５；５、７．５および１０％（ｗ／ｖ））を含有するｐＨ８．０の処方物中、＋３７℃で７または１４日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは粒子形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＰＦＵ／ｍＬ）で表す。 ポリソルベートの有益でない影響および有害でさえある影響。（Ａ）および（Ｂ）トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ５、１０または２０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ５０または７５ｍＭ、および種々の濃度のポリソルベート８０（０．００５；０．０２、もしくは１％ｖ／ｖ）またはポリソルベート４０（１％ｖ／ｖ）を含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋２５℃で３、７、２８もしくは６０日後；または（Ｂ）＋５℃で１、２、３、６、１２、１８、もしくは２４か月後のＭＶＡ−ＨＰＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。（Ｃ）ヒト連続細胞株で生産され、トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）を含有する対照処方物中、または１５０μｇ／ｍＬのポリソルベート８０をさらに含有する処方物中、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後に少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワクシニアウイルス（ＶＶ）ワイス株の感染低下。 ポリソルベートの有益でない影響および有害でさえある影響。（Ａ）および（Ｂ）トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ５、１０または２０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ５０または７５ｍＭ、および種々の濃度のポリソルベート８０（０．００５；０．０２、もしくは１％ｖ／ｖ）またはポリソルベート４０（１％ｖ／ｖ）を含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋２５℃で３、７、２８もしくは６０日後；または（Ｂ）＋５℃で１、２、３、６、１２、１８、もしくは２４か月後のＭＶＡ−ＨＰＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。（Ｃ）ヒト連続細胞株で生産され、トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）を含有する対照処方物中、または１５０μｇ／ｍＬのポリソルベート８０をさらに含有する処方物中、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後に少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワクシニアウイルス（ＶＶ）ワイス株の感染低下。 ポリソルベートの有益でない影響および有害でさえある影響。（Ａ）および（Ｂ）トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ５、１０または２０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ５０または７５ｍＭ、および種々の濃度のポリソルベート８０（０．００５；０．０２、もしくは１％ｖ／ｖ）またはポリソルベート４０（１％ｖ／ｖ）を含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋２５℃で３、７、２８もしくは６０日後；または（Ｂ）＋５℃で１、２、３、６、１２、１８、もしくは２４か月後のＭＶＡ−ＨＰＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。（Ｃ）ヒト連続細胞株で生産され、トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）を含有する対照処方物中、または１５０μｇ／ｍＬのポリソルベート８０をさらに含有する処方物中、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後に少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワクシニアウイルス（ＶＶ）ワイス株の感染低下。 ＭｇＣｌ２の有益でない影響および高濃度ではむしろ有害な影響。（Ａ）トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、および種々の量のＭｇＣｌ２（０Ｍ；０．５Ｍ；または１Ｍ）を含有するｐＨ８．０の処方物中、＋３７℃で１４日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは粒子形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＰＦＵ／ｍＬ）で表す。（Ｂ）ヒト連続細胞株で生産され、トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）を含有する対照処方物中、または１０００ｍＭ ＭｇＣｌ２をさらに含有する処方物中、＋３７℃で７または１４日後に少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワクシニアウイルス（ＶＶ）ワイス株の感染低下。 ＭｇＣｌ２の有益でない影響および高濃度ではむしろ有害な影響。（Ａ）トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、および種々の量のＭｇＣｌ２（０Ｍ；０．５Ｍ；または１Ｍ）を含有するｐＨ８．０の処方物中、＋３７℃で１４日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは粒子形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＰＦＵ／ｍＬ）で表す。（Ｂ）ヒト連続細胞株で生産され、トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）を含有する対照処方物中、または１０００ｍＭ ＭｇＣｌ２をさらに含有する処方物中、＋３７℃で７または１４日後に少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワクシニアウイルス（ＶＶ）ワイス株の感染低下。 アルギニンの有益でない影響およびむしろ有害な影響。（Ａ）トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、および種々の量のアルギニン（０、３０、５０、１００または２００ｍＭ）を含有するｐＨ８．０の処方物中、＋３７℃で３、７、１４、または２８日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは粒子形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＰＦＵ／ｍＬ）で表す。（Ｂ）ヒト連続細胞株で生産され、トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）を含有する対照処方物中、または５０ｍＭのアルギニンをさらに含有する処方物中、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後に少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワクシニアウイルス（ＶＶ）ワイス株の感染低下。 アルギニンの有益でない影響およびむしろ有害な影響。（Ａ）トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、および種々の量のアルギニン（０、３０、５０、１００または２００ｍＭ）を含有するｐＨ８．０の処方物中、＋３７℃で３、７、１４、または２８日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは粒子形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＰＦＵ／ｍＬ）で表す。（Ｂ）ヒト連続細胞株で生産され、トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）を含有する対照処方物中、または５０ｍＭのアルギニンをさらに含有する処方物中、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後に少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワクシニアウイルス（ＶＶ）ワイス株の感染低下。 アミノ酸混合物の有益でない影響。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ８．０、および種々の量のアミノ酸混合物（０または１％（ｗ／ｖ））を含有する処方物中、＋３７℃で３、７、１４、または２８日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは粒子形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＰＦＵ／ｍＬ）で表す。 ヒスチジンの有益でない影響。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５を含有する対照ＤＳ処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、およびヒスチジン１０ｍＭを含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋２５℃で３、７、１４、２８もしくは６０日後；または（Ｂ）＋５℃で１、２、３、６、１２、１８、もしくは２４か月後のＭＶＡ−ＨＰＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 ヒスチジンの有益でない影響。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５を含有する対照ＤＳ処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、およびヒスチジン１０ｍＭを含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋２５℃で３、７、１４、２８もしくは６０日後；または（Ｂ）＋５℃で１、２、３、６、１２、１８、もしくは２４か月後のＭＶＡ−ＨＰＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 ｐＨの効果。トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭおよびＥｔＯＨ ０．５％（ｖ／ｖ）を含有する種々のｐＨ値（６．０；７．０；７．５；８．０および９．０）の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４もしくは２８日後、または（Ｂ）＋５℃で２８日、または３、６もしくは１２か月後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 ｐＨの効果。トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭおよびＥｔＯＨ ０．５％（ｖ／ｖ）を含有する種々のｐＨ値（６．０；７．０；７．５；８．０および９．０）の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４もしくは２８日後、または（Ｂ）＋５℃で２８日、または３、６もしくは１２か月後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 ウイルス濃度の効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０．５％ｖ／ｖを含有するｐＨ７．５の処方物（Ｉｎｖ）中、（Ａ）＋３７℃で７、１４、または２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または３もしくは７か月後；または（Ｃ）５℃で２、６、１２もしくは１８か月後の、種々の初期濃度（１．０ １０８ＰＦＵ／ｍＬ；５．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬ；１．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬ；または５．０ １０６ＰＦＵ／ｍＬ）のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 ウイルス濃度の効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０．５％ｖ／ｖを含有するｐＨ７．５の処方物（Ｉｎｖ）中、（Ａ）＋３７℃で７、１４、または２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または３もしくは７か月後；または（Ｃ）５℃で２、６、１２もしくは１８か月後の、種々の初期濃度（１．０ １０８ＰＦＵ／ｍＬ；５．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬ；１．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬ；または５．０ １０６ＰＦＵ／ｍＬ）のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 ウイルス濃度の効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照ＤＳ処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ２．５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０．５％ｖ／ｖを含有するｐＨ７．５の処方物（Ｉｎｖ）中、（Ａ）＋３７℃で７、１４、または２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または３もしくは７か月後；または（Ｃ）５℃で２、６、１２もしくは１８か月後の、種々の初期濃度（１．０ １０８ＰＦＵ／ｍＬ；５．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬ；１．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬ；または５．０ １０６ＰＦＵ／ｍＬ）のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 異なる異種遺伝子を発現する３種類の異なるＭＶＡウイルスに対する本発明による最適化処方物のバリデーション。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有する、ＭＶＡ−ＨＰＶに関してはｐＨ７．５、ＭＶＡ−ＨＣＶおよびＭＶＡ−ＭＵＣ１に関してはｐＨ８．０の対照ＤＳ処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０．５％ｖ／ｖを含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４、もしくは２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または２、３もしくは６か月後；または（Ｃ）＋５℃で２、３、６、１２、１８、２４もしくは３０か月後のＭＶＡ−ＨＣＶ、ＭＶＡ−ＭＵＣ１およびＭＶＡ−ＨＰＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 異なる異種遺伝子を発現する３種類の異なるＭＶＡウイルスに対する本発明による最適化処方物のバリデーション。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有する、ＭＶＡ−ＨＰＶに関してはｐＨ７．５、ＭＶＡ−ＨＣＶおよびＭＶＡ−ＭＵＣ１に関してはｐＨ８．０の対照ＤＳ処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０．５％ｖ／ｖを含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４、もしくは２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または２、３もしくは６か月後；または（Ｃ）＋５℃で２、３、６、１２、１８、２４もしくは３０か月後のＭＶＡ−ＨＣＶ、ＭＶＡ−ＭＵＣ１およびＭＶＡ−ＨＰＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 異なる異種遺伝子を発現する３種類の異なるＭＶＡウイルスに対する本発明による最適化処方物のバリデーション。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有する、ＭＶＡ−ＨＰＶに関してはｐＨ７．５、ＭＶＡ−ＨＣＶおよびＭＶＡ−ＭＵＣ１に関してはｐＨ８．０の対照ＤＳ処方物中；またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０．５％ｖ／ｖを含有するｐＨ７．５の処方物中、（Ａ）＋３７℃で７、１４、もしくは２８日後；（Ｂ）＋２５℃で２８日、または２、３もしくは６か月後；または（Ｃ）＋５℃で２、３、６、１２、１８、２４もしくは３０か月後のＭＶＡ−ＨＣＶ、ＭＶＡ−ＭＵＣ１およびＭＶＡ−ＨＰＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 種々の方法により生産／精製されたワクシニアウイルスの種々の株に対する本発明による最適化処方物のバリデーション。（Ａ）ニワトリ胚細胞（ＭＶＡ−ＨＣＶ／ＣＥＣ）で、または不死化鳥類細胞株（ＭＶＡ−ＨＣＶ／鳥類細胞株）の細胞で生産されたＭＶＡ−ＨＣＶ；ニワトリ胚細胞（ＭＶＡ−ＦＣＵ１／ＣＥＣ）で生産されたＭＶＡ−ＦＣＵ１およびニワトリ胚細胞で生産された；対照原体（トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中のまたは本発明による最適化処方物（トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０．５％、ｐＨ７．５）中に処方されたコペンハーゲン−ＦＣＵ１（コペンハーゲン−ＦＣＵ１／ＣＥＣ）の、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後の感染低下。（Ｂ）ヒト連続細胞株で生産され、対照原体（トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．５）中、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製された、または本発明による２種類の最適化処方物（トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ ２００または５００ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０．５％、ｐＨ７．５）中に処方されたワクシニアウイルス（ＶＶ）ワイス株の、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後の感染低下。 種々の方法により生産／精製されたワクシニアウイルスの種々の株に対する本発明による最適化処方物のバリデーション。（Ａ）ニワトリ胚細胞（ＭＶＡ−ＨＣＶ／ＣＥＣ）で、または不死化鳥類細胞株（ＭＶＡ−ＨＣＶ／鳥類細胞株）の細胞で生産されたＭＶＡ−ＨＣＶ；ニワトリ胚細胞（ＭＶＡ−ＦＣＵ１／ＣＥＣ）で生産されたＭＶＡ−ＦＣＵ１およびニワトリ胚細胞で生産された；対照原体（トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ７．５）中のまたは本発明による最適化処方物（トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０．５％、ｐＨ７．５）中に処方されたコペンハーゲン−ＦＣＵ１（コペンハーゲン−ＦＣＵ１／ＣＥＣ）の、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後の感染低下。（Ｂ）ヒト連続細胞株で生産され、対照原体（トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．５）中、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製された、または本発明による２種類の最適化処方物（トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌ ２００または５００ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０．５％、ｐＨ７．５）中に処方されたワクシニアウイルス（ＶＶ）ワイス株の、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後の感染低下。 最初に試験した安定剤の、同じ系列または別の系列の他の化合物による置き換え。（Ａ）表１９に定義された種々の処方物中のＭＶＡ−ＭＵＣ１の、＋３７℃で７、１４、２１または２８日後の感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。（Ｂ）および（Ｃ）＋３７℃で１４日後（Ｂ）または２８日後（Ｃ）に、新しく試験した候補等価物を最初に試験した安定剤または別の新しく試験した候補等価物で置き換える影響の、ＮｅｍｒｏｄＷ（登録商標）ソフトウエアを用いた統計分析。各ラインは、候補等価物Ｙを含有する処方物から最初に試験した安定剤Ｘまたは新しく試験した別の候補等価物を含有する処方物への変化（Ｙ＝＞Ｘ）、ならびに関連のバーおよび値を表す。値が正である場合、それは最初に試験した安定剤または新しく試験した他の候補Ｘが候補等価物ＹよりもＭＶＡ−ＭＵＣ１をより良く安定化させることを意味する。これに対して、負の値は、候補等価物Ｙが最初に試験した安定剤または他の候補等価物ＸよりもＭＶＡ−ＭＵＣ１をより良く安定化させることを意味する。絶対値が高いほど、ＹをＸで置き換える効果が高い。特に、バーが破線を越えると、その置き換えはＭＶＡ−ＭＵＣ１の安定性に有意な影響を持つと考えられる。（Ｄ）表１９に定義される種々の処方物中、＋５℃で２８、９０および１８０日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 最初に試験した安定剤の、同じ系列または別の系列の他の化合物による置き換え。（Ａ）表１９に定義された種々の処方物中のＭＶＡ−ＭＵＣ１の、＋３７℃で７、１４、２１または２８日後の感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。（Ｂ）および（Ｃ）＋３７℃で１４日後（Ｂ）または２８日後（Ｃ）に、新しく試験した候補等価物を最初に試験した安定剤または別の新しく試験した候補等価物で置き換える影響の、ＮｅｍｒｏｄＷ（登録商標）ソフトウエアを用いた統計分析。各ラインは、候補等価物Ｙを含有する処方物から最初に試験した安定剤Ｘまたは新しく試験した別の候補等価物を含有する処方物への変化（Ｙ＝＞Ｘ）、ならびに関連のバーおよび値を表す。値が正である場合、それは最初に試験した安定剤または新しく試験した他の候補Ｘが候補等価物ＹよりもＭＶＡ−ＭＵＣ１をより良く安定化させることを意味する。これに対して、負の値は、候補等価物Ｙが最初に試験した安定剤または他の候補等価物ＸよりもＭＶＡ−ＭＵＣ１をより良く安定化させることを意味する。絶対値が高いほど、ＹをＸで置き換える効果が高い。特に、バーが破線を越えると、その置き換えはＭＶＡ−ＭＵＣ１の安定性に有意な影響を持つと考えられる。（Ｄ）表１９に定義される種々の処方物中、＋５℃で２８、９０および１８０日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 最初に試験した安定剤の、同じ系列または別の系列の他の化合物による置き換え。（Ａ）表１９に定義された種々の処方物中のＭＶＡ−ＭＵＣ１の、＋３７℃で７、１４、２１または２８日後の感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。（Ｂ）および（Ｃ）＋３７℃で１４日後（Ｂ）または２８日後（Ｃ）に、新しく試験した候補等価物を最初に試験した安定剤または別の新しく試験した候補等価物で置き換える影響の、ＮｅｍｒｏｄＷ（登録商標）ソフトウエアを用いた統計分析。各ラインは、候補等価物Ｙを含有する処方物から最初に試験した安定剤Ｘまたは新しく試験した別の候補等価物を含有する処方物への変化（Ｙ＝＞Ｘ）、ならびに関連のバーおよび値を表す。値が正である場合、それは最初に試験した安定剤または新しく試験した他の候補Ｘが候補等価物ＹよりもＭＶＡ−ＭＵＣ１をより良く安定化させることを意味する。これに対して、負の値は、候補等価物Ｙが最初に試験した安定剤または他の候補等価物ＸよりもＭＶＡ−ＭＵＣ１をより良く安定化させることを意味する。絶対値が高いほど、ＹをＸで置き換える効果が高い。特に、バーが破線を越えると、その置き換えはＭＶＡ−ＭＵＣ１の安定性に有意な影響を持つと考えられる。（Ｄ）表１９に定義される種々の処方物中、＋５℃で２８、９０および１８０日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 最初に試験した安定剤の、同じ系列または別の系列の他の化合物による置き換え。（Ａ）表１９に定義された種々の処方物中のＭＶＡ−ＭＵＣ１の、＋３７℃で７、１４、２１または２８日後の感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。（Ｂ）および（Ｃ）＋３７℃で１４日後（Ｂ）または２８日後（Ｃ）に、新しく試験した候補等価物を最初に試験した安定剤または別の新しく試験した候補等価物で置き換える影響の、ＮｅｍｒｏｄＷ（登録商標）ソフトウエアを用いた統計分析。各ラインは、候補等価物Ｙを含有する処方物から最初に試験した安定剤Ｘまたは新しく試験した別の候補等価物を含有する処方物への変化（Ｙ＝＞Ｘ）、ならびに関連のバーおよび値を表す。値が正である場合、それは最初に試験した安定剤または新しく試験した他の候補Ｘが候補等価物ＹよりもＭＶＡ−ＭＵＣ１をより良く安定化させることを意味する。これに対して、負の値は、候補等価物Ｙが最初に試験した安定剤または他の候補等価物ＸよりもＭＶＡ−ＭＵＣ１をより良く安定化させることを意味する。絶対値が高いほど、ＹをＸで置き換える効果が高い。特に、バーが破線を越えると、その置き換えはＭＶＡ−ＭＵＣ１の安定性に有意な影響を持つと考えられる。（Ｄ）表１９に定義される種々の処方物中、＋５℃で２８、９０および１８０日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 最適化処方物によるＭＶＡウイルスのＵＶ損傷からの保護。（Ａ）トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照処方物中、またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭおよびＥｔＯＨ ０．５％（ｖ／ｖ）を含有するｐＨ７．５の最適化処方物中、光の不在下、ＰＳＭ光（ＩＳＯ １０９７７による３２０〜４００ｎｍ ＵＶ光のシミュレーション）下またはＩＣＨ光（ICH Q1B Photostability Testing of New Drug Substances and Products）下、＋２５℃で１、２、３、７、１４、２１または２８日後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。（Ｂ）トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照処方物中、またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、およびＥＤＴＡ １５０μＭおよび／またはＥｔＯＨ ０．５％（ｖ／ｖ）を含有するｐＨ７．５の処方物中、光の不在下またはＩＣＨ光(ICH Q1B Photostability Testing of New Drug Substances and Products)下、＋２５℃で２、３、７、９、１４、または２１日後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 最適化処方物によるＭＶＡウイルスのＵＶ損傷からの保護。（Ａ）トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照処方物中、またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭおよびＥｔＯＨ ０．５％（ｖ／ｖ）を含有するｐＨ７．５の最適化処方物中、光の不在下、ＰＳＭ光（ＩＳＯ １０９７７による３２０〜４００ｎｍ ＵＶ光のシミュレーション）下またはＩＣＨ光（ICH Q1B Photostability Testing of New Drug Substances and Products）下、＋２５℃で１、２、３、７、１４、２１または２８日後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。（Ｂ）トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭを含有するｐＨ７．５の対照処方物中、またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、およびＥＤＴＡ １５０μＭおよび／またはＥｔＯＨ ０．５％（ｖ／ｖ）を含有するｐＨ７．５の処方物中、光の不在下またはＩＣＨ光(ICH Q1B Photostability Testing of New Drug Substances and Products)下、＋２５℃で２、３、７、９、１４、または２１日後のＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 種々の濃度の成分を含む数種の処方物の安定化効果。種々の濃度の成分を含む数種の処方物（表２０参照）中、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後のＭＶＡ−ＭＵＣ１の感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。 偽牛痘ウイルスに対する安定化効果。トリス−ＨＣｌ １０ｍＭ、スクロース５％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ １０ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ８．０）を含有する対照組成物中、またはトリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）、グルタミン酸Ｎａ ５ｍＭ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０．５％ｖ／ｖを含有するｐＨ７．５の本発明による処方物中、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後の偽牛痘ウイルスの感染低下。感染性ウイルスは感染ゲノム（ＩＧ）／ｍＬで測定し、感染低下はｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）で表す。
発明の具体的説明
安定な液体処方物
上記で説明したように、本発明者らは、約＋５℃以上、液体状態でポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスの安定性を維持するのに好適な液体処方物を特定した。このような処方物は、薬学上許容可能なバッファー、一価の塩、薬学上許容可能な二糖または糖アルコール、薬学上許容可能なキレート剤を含んでなり；およびｐＨは６．５〜８．５の間であるべきである。
よって、本発明は、
ａ）ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルス、
ｂ）薬学上許容可能なバッファー、
ｃ）一価の塩、
ｄ）薬学上許容可能な二糖または糖アルコール、および
ｅ）薬学上許容可能なキレート剤
を含んでなるか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる、そのｐＨが６．５〜８．５である液体処方物に関する。
本発明による液体処方物は、水性処方物である。
「含んでなる("Comprising" and"comprise(s)")」は、その材料、生成物、処方物、組成物およびが言及された成分または工程を含むが他を排除しないことを意味するものとする。「から本質的になる("Consisting essentially of" or "consist(s) essentially of")」は、生成物、処方物、組成物および方法を定義するために使用する場合、本質的に重要な他の成分または工程を排除することを意味するものとする。よって、例えば、列挙された成分から本質的になる処方物は、微量の混入物および薬学上許容可能な担体を排除するものではない。「からなる("Consisting of" or "consist(s) of")は、他の成分または工程の微量とは言えない要素を排除することを意味するものとする。
安定性
本発明による処方物は液体であり、コストと時間のかかる凍結乾燥工程を必要としない、かつ、事前の再構成の必要なくそのまま投与できるという利点を有する。
ウイルスなどの生物材料の、特に液体状態での安定化は、ウイルスがその処方物の総ての成分と、ならびに容器とも相互作用できるために簡単ではなく、これによりウイルス力価の損失のリスクが高まる。
しかしながら、本発明は、液体状態で安定で、これらの難点の克服を可能とするウイルス処方物を提供する。特に、
・本発明による液体処方物中の感染性ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルス力価の損失は、＋３７℃で少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、少なくとも３週間、またはさらには少なくとも４週間の保存中に、好ましくは、感染性ウイルス１ｌｏｇ１０未満である、
・本発明による液体処方物中の感染性ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルス力価の損失は、＋２５℃で少なくとも４週間、好ましくは少なくとも３か月、または少なくとも６か月の保存中に、好ましくは、感染性ウイルス１ｌｏｇ１０未満である、かつ／または
・本発明による液体処方物中の感染性ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルス力価の損失は、約＋５℃（すなわち、＋５℃±３℃）で少なくとも１２か月、好ましくは少なくとも１８か月、少なくとも２４か月、少なくとも３０か月、またはさらには少なくとも３６か月の保存中に、好ましくは、感染性ウイルス０．３ｌｏｇ１０（感染力の５０％の損失に相当する）未満である。
０日目および以降の任意の日の感染性ワクシニアウイルス力価は、ｍＬ当たりの感染ゲノム（ＩＧ）の数（ＩＧ／ｍＬ）を測定するか、またはＢＨＫ−２１細胞のプラークアッセイ（感染性ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルス力価はその後ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）（ＰＦＵ／ｍＬ）で表される）を使用するかのいずれかにより決定され得る。ｍＬ当たりの感染ゲノムの数（ＩＧ／ｍＬ）の測定は、この方法がより迅速かつより正確であることから好ましいものであり得る。ｍＬ当たりの感染ゲノム（ＩＧ）の数（ＩＧ／ｍＬ）を測定するためまたはＢＫＨ−２１細胞におけるプラークアッセイのための詳細なプロトコールは、実施例に開示されている。
ポックスウイルス
本発明による処方物は、ポックスウイルスを含んでなる。
前記ポックスウイルスは、以下の科から選択され得る：オルソポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス）、パラポックスウイルス（例えば、ウシ丘疹性口炎ウイルス、オーフウイルス、偽牛痘ウイルス）、スイポックスウイルス（例えば、豚痘ウイルス）、ヤタポックスウイルス（例えば、ヤバ様病ウイルス）、アビポックスウイルス（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）およびレポリポックスウイルス(Leporipoxvirux)（粘液腫ウイルス）。前記ポックスウイルスは特に、オルソポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス）およびパラポックスウイルス（例えば、ウシ丘疹性口炎ウイルス、オーフウイルス、偽牛痘ウイルス）から選択され得る。特に好ましいポックスウイルスは、ワクシニアウイルスおよび偽牛痘ウイルスである。
好ましい実施態様では、前記ポックスウイルスはオルソポックスウイルス、より好ましくはワクシニアウイルス（ＶＶ）である。
本発明者らは、ワクシニアウイルスの液体状態での安定性は、処方物中のワクシニアウイルス粒子の濃度とともに高まることを見出した（実施例４参照）。結果として、ポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス、特に、ＭＶＡ、ワイスまたはコペンハーゲンワクシニアウイルス）は、好ましくは、本発明による液体処方物中に少なくとも１０７ＰＦＵ／ｍＬ、好ましくは少なくとも２．１０７ＰＦＵ／ｍＬ、少なくとも３．１０７ＰＦＵ／ｍＬ、少なくとも４．１０７ＰＦＵ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも５．１０７ＰＦＵ／ｍＬ、またはさらには少なくとも１０８ＰＦＵ／ｍＬの力価で存在する。ポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）の安定性は、処方物中のポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）粒子の濃度とともに高まるので、処方物中のポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）粒子の最大濃度に関して特に制限はない。しかしながら、実用上の理由で、ポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は一般に、本発明による液体処方物中に、多くて１０１２ＰＦＵ／ｍＬ、多くて１０１１ＰＦＵ／ｍＬ、またはさらには多くて１０１０ＰＦＵ／ｍＬの力価で含まれる。特に、ポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は、本発明による液体処方物中に、１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１２ＰＦＵ／ｍＬ、１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１１ＰＦＵ／ｍＬ、１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１０ＰＦＵ／ｍＬ、１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０９ＰＦＵ／ｍＬ、１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０９ＰＦＵ／ｍＬ、１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０８ＰＦＵ／ｍＬ、１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０８ＰＦＵ／ｍＬ、２．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１２ＰＦＵ／ｍＬ、２．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１１ＰＦＵ／ｍＬ、２．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１０ＰＦＵ／ｍＬ、２．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０９ＰＦＵ／ｍＬ、２．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０９ＰＦＵ／ｍＬ、２．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０８ＰＦＵ／ｍＬ、２．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０８ＰＦＵ／ｍＬ、３．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１２ＰＦＵ／ｍＬ、３．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１１ＰＦＵ／ｍＬ、３．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１０ＰＦＵ／ｍＬ、３．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０９ＰＦＵ／ｍＬ、３．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０９ＰＦＵ／ｍＬ、３．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０８ＰＦＵ／ｍＬ、３．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０８ＰＦＵ／ｍＬ、４．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１２ＰＦＵ／ｍＬ、４．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１１ＰＦＵ／ｍＬ、４．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１０ＰＦＵ／ｍＬ、４．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０９ＰＦＵ／ｍＬ、４．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０９ＰＦＵ／ｍＬ、４．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０８ＰＦＵ／ｍＬ、４．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０８ＰＦＵ／ｍＬ、５．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１２ＰＦＵ／ｍＬ、５．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１１ＰＦＵ／ｍＬ、５．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１０ＰＦＵ／ｍＬ、特に、５．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０９ＰＦＵ／ｍＬ、５．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０９ＰＦＵ／ｍＬ、５．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０８ＰＦＵ／ｍＬ、５．１０７ＰＦＵ／ｍＬ〜１０８ＰＦＵ／ｍＬ、１０８ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１２ＰＦＵ／ｍＬ、１０８ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１１ＰＦＵ／ｍＬ、１０８ＰＦＵ／ｍＬ〜１０１０ＰＦＵ／ｍＬ、１０８ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０９ＰＦＵ／ｍＬ、１０８ＰＦＵ／ｍＬ〜１０９ＰＦＵ／ｍＬ、１０８ＰＦＵ／ｍＬ〜５．１０８ＰＦＵ／ｍＬの力価で含まれてよい。
ポックスウイルスは好ましくは、ヒト投与後に十分に忍容されるように宿主細胞タンパク質および宿主細胞ＤＮＡを低減するために精製または半精製される。さらに、いくつかの不純物は、注射後のヒトアレルギー反応の起源であり得る。このような半精製または精製プロセスは当技術分野で慣例であり、ウイルス自体、生産細胞、使用する培養培地、酵素および製造および精製工程中に導入されるその他の成分（例えば、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ、塩など）のような種々のパラメーターの関数として変動し得る。例えば、ウイルスがニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）などの初代細胞で生産される場合には、卵オボアルブミンおよび抗生物質などの不純物が一般に存在し、一方、宿主細胞核酸およびタンパク質は、カモ細胞株およびヒト細胞株などの不死化細胞株で生産されたウイルス調製物の通常の夾雑物である。一般的な指針としては、宿主細胞ＤＮＡは１０ｎｇ／用量（規制基準参照）未満に、および宿主細胞タンパク質は１５０μｇ／用量未満に低減することが奨励される。半精製または精製ウイルス調製物を得るために好適な技術の代表例としては、限定されるものではないが、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション、酵素的消化、クロマトグラフィー、前面濾過(frontal filtration)などが挙げられる。従って、好ましい実施態様では、ポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は少なくとも半精製され、５〜５００μｇ／用量の宿主細胞タンパク質および１０ｎｇ／用量未満の宿主細胞ＤＮＡを含んでなる。
本発明者らは、本発明による液体処方物がワクシニアウイルスの３種類の異なる株：ＭＶＡ、ワイス、およびコペンハーゲンを安定化できることを見出した（実施例４参照）。よって、ワクシニアウイルスの種々の株が本発明による液体処方物を用いて安定化され得る。特に、前記ワクシニアウイルスは、エルストリー、ウエスタンリザーブ、ワイス、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＣＢＯＨ、パリ、コペンハーゲン、および改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）株から選択され得る。前記ワクシニアウイルスは好ましくは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ワイス、およびコペンハーゲン株から選択され得る。好ましい実施態様では、本処方物中に存在するワクシニアウイルスは、ＭＶＡウイルス、特に、ＭＶＡ ５７５（ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７）またはＭＶＡ−ＢＮ（ＥＣＡＣＣ Ｖ０００８３００８）である。別の好ましい実施態様では、本処方物中に存在するワクシニアウイルスはワイスワクシニアウイルスである。別の好ましい実施態様では、本処方物中に存在するワクシニアウイルスは、コペンハーゲンワクシニアウイルスである。
本発明による処方物中に含まれるポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスは、野生型、弱毒型、または組換え型ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスであり得る用語「組換えポックスウイルス」は、そのゲノムに組み込まれた少なくとも１つの外因性配列を含んでなるポックスウイルスを意味する。本明細書で使用する場合、「外因性配列」は、親ポックスウイルス中に本来存在しない核酸を意味する。
本発明による処方物中に含まれるポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は組換え型であり、外因性配列は、対象とするいずれの外因性配列であってもよい。
第１の好ましい実施態様では、組換えポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は、直接的または間接的細胞傷害機能を有する分子をコードする外因性配列を含んでなる。「直接的または間接的」細胞傷害性により、本発明者らは、外因性配列によりコードされる分子がそれ自体毒性であり得るか（例えば、毒素；サイトカイン、またはリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼなどの酵素）、またはそれが代謝されて毒性生成物を形成し得ること、またはそれが他の何かに作用して毒性生成物を形成し得ることを意味する。好ましい実施態様では、外因性配列によりコードされる分子は、リシンまたはシュードモナス外毒素Ａなどの毒素であり得る。リシンｃＤＮＡの配列は、LAMB et al (Eur. J. Biochem., 1985, 148:265-270)に開示されている。別の好ましい実施態様では、外因性配列によりコードされる分子はサイトカインであり得る。このようなサイトカインは、特に、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）、または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）から選択され得る。別の好ましい実施態様では、直接的または間接的細胞傷害機能を有する分子をコードする外因性配列は自殺遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、比較的非毒性のプロドラッグを毒性薬物に変換することができるタンパク質をコードする。例えば、酵素シトシンデアミナーゼは、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に変換し(MULLEN et al., 1922, PNAS 89:33)；単純ヘルペス酵素チミジンキナーゼは、細胞を抗ウイルス薬ガンシクロビル（ＧＣＶ）またはアシクロビル処置に感受性とする(MOOLTEN, 1986, Cancer Res. 46:5276; EZZEDINE et al., 1991, New Biol 3:608)。例えば、大腸菌(E. coli)またはサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)など、いずれの生物のシトシンデアミナーゼも使用可能である。よって、本発明の好ましい実施態様では、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ活性を有するタンパク質、より好ましくは、参照により本明細書の一部とされる特許出願ＷＯ９９／５４４８１、ＷＯ２００５／００７８５７、ＷＯ２００９／０６５５４６およびＷＯ２００９／０６５５４７に開示されているＦＣＵ １タンパク質またはＦＣＵ １−８タンパク質をコードする。これに関して、本発明による液体処方物中に含まれる好ましい組換えワクシニアウイルスは、
−ＭＶＡ−ＦＣＵ １（ＷＯ９９／５４４８１参照）、ＴＧ４０２３とも呼ばれる；
−ＭＶＡ−ＦＣＵ １−８（ＷＯ２００５／００７８５７参照）；および
−ＶＶ−ＦＣＵ １、前記ワクシニアウイルス（ＶＶ）は、より詳しくは、欠陥型Ｉ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子、欠陥型Ｊ２Ｒ遺伝子（ＷＯ２００９／０６５５４６およびＷＯ２００９／０６５５４７参照）を含んでなる、
である。
第２の好ましい実施態様では、組換えワクシニアウイルスは、標的ＲＮＡまたはＤＮＡを切断することができるリボザイムをコードする外因性遺伝子を含んでなる。切断される標的ＲＮＡもしくはＤＮＡは、細胞の機能に不可欠であり、かつ、その切断が細胞死をもたらすＲＮＡまたはＤＮＡであり得るか、または切断されるＲＮＡもしくはＤＮＡは、望ましくないタンパク質、例えば、癌遺伝子産物をコードし、かつ、このＲＮＡもしくはＤＮＡの切断が細胞の癌化を防ぎ得るＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。
第３の好ましい実施態様では、組換えポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は、 アンチセンスＲＮＡをコードする外因性配列を含んでなる。「アンチセンスＲＮＡ」により、本発明者らは、あるタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子もしくは細胞内のプレｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡもしくはｒＲＮＡなどの他のＲＮＡ分子とハイブリダイズしてそれからの発現に干渉するか、またはある遺伝子とハイブリダイズしてそれかの発現に干渉するＲＮＡ分子を意味する。
第４の好ましい実施態様では、組換えポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は、標的細胞の欠陥遺伝子の機能を補完する外因性配列を含んでなる。ヒトを含む哺乳動物には、欠陥遺伝子により引き起こされる数千の受け継がれる遺伝病がある。このような遺伝病の例としては、ＣＦＴＲ遺伝子に突然変異があることが知られている嚢胞性線維症；ジストロフィン遺伝子に突然変異があることを知られているデュシェンヌ型筋ジストロフィー；ＨｂＡ遺伝子に突然変異があることを知られている鎌形赤血球病が挙げられる。多くのタイプの癌は欠陥遺伝子、特に、原癌遺伝子および突然変異を受けた腫瘍抑制遺伝子によって引き起こされる。原癌遺伝子の例はｒａｓ、ｓｒｃ、ｂｃｌなどであり、腫瘍抑制遺伝子の例はｐ５３およびＲｂである。
第５の好ましい実施態様では、組換えポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする外因性配列を含んでなる。ＴＡＡは、同じ組織種の非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞で高頻度または高密度で検出される分子を意味する。ＴＡＡの例としては、限定されるものではないが、ＣＥＡ、ＭＡＲＴ１、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＧＰ−１００、ＭＵＣ１（参照により本明細書の一部とされるＷＯ９２／０７０００、ＷＯ９５／０９２４１およびROCHLITZ et al. J Gene Med. 2003 Aug;5(8):690-9参照）、ＭＵＣ２、点突然変異ｒａｓ癌遺伝子、正常または点突然変異ｐ５３、過剰発現ｐ５３、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、Ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２、ＢＲＣＡ Ｉ、ＢＲＣＡ ＩＩ、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、サバイビングおよびＬＲＰが挙げられる。より好ましい実施態様によれば、ＴＡＡはＭＵＣ１である。
第６の好ましい実施態様では、組換えポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は、抗原をコードする外因性遺伝子を含んでなる。本明細書で使用する場合、「抗原」は、抗体が結合し得るリガンドを意味し、抗原はそれ自体免疫原性である必要はない。好ましくは、抗原は、以下のものに由来する。
・ウイルス
例えば、抗原は、
・ＨＩＶ−１（例えば、ｇｐ １２０またはｇｐ １６０）、
・ネコ免疫不全ウイルスのいずれも、
・ヒトまたは動物ヘルペスウイルス、例えば、ｇＤもしくはその誘導体、またはＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７などの前初期タンパク質、
・サイトメガロウイルス（例えば、ｇＢまたはその誘導体）、
・水痘帯状疱疹ウイルス（例えば、ｇｐｌ、ＩｌまたはＩＩＩ）、
・肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原またはその誘導体、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ；ＷＯ２００４／１１１０８２参照；優先的には、遺伝子型１ｂ 株ｊａ由来の非構造ＨＣＶタンパク質）、およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、
・呼吸器合胞体ウイルス、
・ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ；ＷＯ９０／１０４５９、ＷＯ９５／０９２４１、ＷＯ９８／０４７０５、ＷＯ９９／０３８８５およびＷＯ２００７／１２１８９４参照；ＨＰＶ１６株由来のＥ６およびＥ７タンパク質が好ましい；LIU et al., 2004 Oct 5, Proc Natl Acad Sci U S A, 101 Suppl 2:14567-71もまた参照）、または
・インフルエンザウイルス。
・細菌病原体、例えば、サルモネラ菌属、ナイセリア、ボレリア（例えば、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢまたはその誘導体）、クラミジア、ボルデテラ（例えば、Ｐ．６９、ＰＴおよびＦＨＡ）、またはマイコバクテリア（特に、結核菌(mycobacterium tuberculosis)およびウシ結核菌(mycobacterium bovis)、ＷＯ２０１４／００９４３８およびＷＯ２０１４／００９４３３参照）、
・マラリア原虫またはトキソプラズマなどの寄生虫
より好ましい実施態様によれば、抗原は、ＨＣＶ、ＨＰＶ、またはマイコバクテリア（特に、結核菌およびウシ結核菌）、特に、上述のものの抗原から選択される。これに関して、本発明による液体処方物中に存在する好ましい組換えワクシニアウイルスは、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５Ｂ ＨＣＶ抗原をコードする、ＴＧ４０４０とも呼ばれるＭＶＡ−ＨＣＶ（ＷＯ２００４／１１１０８２参照）である。
当然のことながら、本発明による液体処方物中に存在する組換えポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は２以上の外因性配列を含んでなることができ、各外因性配列は２以上の分子をコードすることができる。
例えば、同じ組換えポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）内で
・例えば、ＴＡＡ（従前に記載した通り）または抗原（従前に記載した通り）をコードする、外因性配列(exogenous sequenced)、および
・サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２としてのＩＬ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；インターフェロン（ＩＦＮ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ））をコードする外因性配列
を会合させることが有用であり得る。
これに関して、本発明による液体処方物中に存在する好ましい組換えワクシニアウイルスは、
・ＭＵＣ１ ＴＡＡおよびヒトＩＬ−２をコードするＴＧ４０１０とも呼ばれるＭＶＡ−［ＭＵＣ１−ＩＬ２］（ＷＯ９２／０７０００およびＷＯ９５／０９２４１参照）；および
・非発癌ＨＰＶ−１６ Ｅ６およびＥ７ポリペプチドおよびヒトＩＬ−２をコードするＴＧ４００１とも呼ばれるＭＶＡ−［ＨＰＶ−ＩＬ２］（ＷＯ９０／１０４５９、ＷＯ９５／０９２４１、ＷＯ９８／０４７０５、ＷＯ９９／０３８８５、ＷＯ２００７／１２１８９４参照）
である。
同じポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）ベクター中での２つの外因性配列の有用な会合の別の例は、
・上記の総てのものを含む対象とする外因性配列（特に、自殺遺伝子、サイトカイン、ＴＡＡ、または病原体抗原）と
・選択マーカーをコードする外因性配列
を含んでなるポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）ベクターである。このような選択マーカーは、特に、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼなどの容易にアッセイされ得る酵素から選択できる。
これに関して、本発明による液体処方物中に存在する好ましい組換えワクシニアウイルスは、Ｊ２Ｒ遺伝子に関して欠陥型であり、かつ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする外因性配列を含んでなるワクシニアウイルス（好ましくは、ワイス株）である（KIM JH et al., 2006 Sep, Mol Ther., 14(3):361-70およびBREITBACH CJ et al., 2011, Curr Pharm Biotechnol. Vol 12. No 12参照）。
ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスを調製および精製するための方法は、当業者に公知である。例えば、ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスを調製および精製するためのプロセスは、参照により本明細書の一部とされるＷＯ２００７／１４７５２８およびＷＯ２０１０／１３０７５３に開示されている。
ワクシニアウイルスは、特にまず、
ａ）パッケージング細胞の培養物を調製すること；
ｂ）パッケージング細胞培養物にワクシニアウイルスを感染させること；
ｃ）感染させたパッケージング細胞を後代ワクシニアウイルスが生産されるまで培養すること、および
ｄ）生産されたワクシニアウイルスを培養上清および／またはパッケージング細胞から回収すること
により増幅させることができる。
工程ａ）では、好適なパッケージング細胞は、増幅させるワクシニアウイルスのタイプによって異なる。
ＭＶＡは、厳格に宿主制限され、初代鳥類細胞（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞もしくはＣＥＦ）または不死化鳥類細胞株、特に、
・テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含んでなるノバリケン(Cairina moschata)不死化鳥類細胞株（ＷＯ２００７／０７７２５６に開示されているEuropean Collection of Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に受託番号０８０６０５０２として寄託された細胞株Ｔ３−１７４９０およびＥＣＡＣＣに受託番号０８０６０５０１として寄託された細胞株Ｔ６−１７４９０参照）、
・ＷＯ２００９／００４０１６に開示されているＥ１Ａ核酸配列およびテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含んでなるノバリケン不死化鳥類細胞株、
・米国特許第５，８７９，９２４号に開示されている、１０日齢のＥａｓｔ Ｌａｎｓｉｎｇ Ｌｉｎｅ（ＥＬＬ−Ｏ）卵に由来する自然不死化ニワトリ細胞株であるＤＦ１細胞株、
・ＷＯ２００５／００７８４０に開示されている、増殖因子およびフィーダー層からの段階的隔離により胚性幹細胞から誘導されるＥｂｘニワトリ細胞株、
・カモ胚永久細胞株であるＤＥＣ ９９細胞株(IVANOV et al. Experimental Pathology and Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences)
のいずれかの鳥類細胞で増幅させることができる。
他のワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス株については、鳥類初代細胞（例えば、ＣＥＦ−「ニワトリ胚線維芽細胞」、ＣＥＣ、すなわち「ニワトリ胚細胞」とも呼ばれる）および鳥類細胞株の他、Ｈｅｌａ、ＢＨＫ−２１、ＭＲＣ−５、ＨＥＫ−２９３、およびＶｅｒｏ細胞を含め、多くの他の非鳥類細胞株が増幅に利用可能である。好ましい実施態様では、ＭＶＡ以外のワクシニアウイルスがＨｅｌａ細胞で増幅される。
パッケージング細胞は好ましくは、動物またはヒト起源の生成物を含まない化学的に定義された培地を用い、動物またはヒト由来生成物不含の培地で培養される。特に、増殖因子が存在し得る場合は、それらは好ましくは、動物材料から精製されずに組換え生産される。適当な動物不含培地は、選択されるパッケージング細胞に応じて当業者により容易に選択することができる。このような培地は市販されている。特に、ＣＥＦがパッケージング細胞として使用される場合、それらはＶＰ−ＳＦＭ細胞培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養することができる。ＣＥＦはまた好ましくは、感染前に１〜５日の間、より好ましくは１〜２日の間、いっそうより好ましくは２日培養される。ＣＥＦはさらに好ましくは、＋３０℃〜＋３７℃の間に含まれる温度で培養される。非鳥類不死化細胞株の細胞が使用される場合には、それらは好ましくは、感染前に２〜７日の間培養される。多数の非鳥類不死化細胞が必要とされる場合には、細胞の総数を増やすために２〜７日の数回の継代を行ってよい。非鳥類不死化細胞はさらに好ましくは、＋３６℃および＋３８℃の間に含まれる温度、より好ましくは約＋３７℃で培養される。
工程ｂ）では、パッケージング細胞は、パッケージング細胞の生産的感染を可能とするための適当な条件（特に、適当な多重感染度（ＭＯＩ）を使用）下でポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）に感染させる。特に、ワクシニアウイルスがＭＶＡ（特に、ＷＯ９０／１０４５９、ＷＯ９２／０７０００、ＷＯ９５／０９２４１、ＷＯ９８／０４７０５、ＷＯ９９／０３８８５、ＷＯ２００４／１１１０８２、ＷＯ２００７／１２１８９４、ＷＯ２０１４／００９４３８およびＷＯ２０１４／００９４３３に開示されるもの）であって、ＣＥＦを用いて増幅される場合には、それを、ＣＥＦを含有する細胞培養容器に好ましくは、０．００１〜０．１の間、より好ましくは０．０３〜０．０７の間に含まれる、いっそうより好ましくは約０．０５のＭＯＩで播種すればよい。他のワクシニアウイルス株、特に、ワイスおよびコペンハーゲン株（特に、ＷＯ２００７／０３０６６８、ＷＯ２００８／１１３０７８、ＷＯ２００９／０６５５４６、ＷＯ２００９／０６５５４７に開示されているもの）などの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスでは、ワクシニアウイルスは、パッケージング細胞を含有する細胞培養容器に好ましくは０．０００１〜０．１の間に含まれる、より好ましくは約０．０００１のＭＯＩで播種すればよい。感染工程はまた、好ましくは、動物またはヒト起源の生成物を含まない化学的に定義された培地を用い、動物またはヒト由来生成物不含の培地（パッケージング細胞の培養に用いたもの同じであっても異なっていてもよい）で行われる。ＣＥＦ中のＭＶＡでは、工程ｂ）で使用する培養培地は好ましくは、基本培地、特に、基本培地イーグル細胞培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
工程ｃ）において、その後、感染パッケージング細胞を、当業者に周知の適当な条件下で、後代ポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）が生産されるまで培養する。感染パッケージング細胞の培養はまた、好ましくは、動物またはヒト起源の生成物を含まない化学的に定義された培地を用い、動物またはヒト由来生成物不含の培地（パッケージング細胞の培養および／または感染工程に用いたもの同じであっても異なっていてもよい）でも行われる。ＣＥＦ上で増幅されるＭＶＡでは、ＣＥＦは特に、基本培地、特に、基本培地イーグル細胞培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、＋３３℃〜＋３７℃の間の温度で１〜４日間培養することができる。非鳥類不死化細胞株で生産される他のワクシニアウイルス株では、工程ｃ）は、特に、＋３５℃〜＋３８℃の間で１〜４日間行うことができる。
工程ｄ）では、工程ｃ）で生産されたポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）を培養上清および／またはパッケージング細胞から回収する。ポックスウイルス（特に、 ワクシニアウイルス）をパッケージング細胞から（およびまた場合により培養上清からも）回収する場合、工程ｄ）はパッケージング細胞膜の破壊を可能とする工程によって先行され得る。この工程は、パッケージング細胞からのポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）の遊離をもたらす。パッケージング細胞膜の破壊は、限定されるものではないが、凍結／解凍、低張溶解、音波処理、顕微溶液化、または高速ホモジナイゼーションを含む、当業者に周知の種々の技術によって誘導することができる。
次に、ポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は、
・パッケージング細胞のＤＮＡを除去するための少なくとも１種類のヌクレアーゼによる処理、
・パッケージング細胞のタンパク質を除去するための少なくとも１種類のプロテアーゼによる処理、
・超遠心分離（特に、塩化セシウム勾配による）、濾過（特に、深層濾過）またはクロマトグラフィー（特に、イオン交換クロマトグラフィー）を用いたポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）の夾雑物からの分離
などの当技術分野で周知の精製工程を用いてさらに精製することができる。
本発明の好ましい実施態様では、処方物中に存在するワクシニアウイルスは、ＣＥＦ上で増幅されたＭＶＡウイルス（特に、ＷＯ９０／１０４５９、ＷＯ９２／０７０００、ＷＯ９５／０９２４１、ＷＯ９８／０４７０５、ＷＯ９９／０３８８５、ＷＯ２００４／１１１０８２、ＷＯ２００７／１２１８９４、ＷＯ２０１４／００９４３８およびＷＯ２０１４／００９４３３に開示されているもの）、より好ましくは、ＣＥＦ上で増幅され、かつ、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する工程を受けなかったＭＶＡウイルス（特に、ＷＯ９０／１０４５９、ＷＯ９２／０７０００、ＷＯ９５／０９２４１、ＷＯ９８／０４７０５、ＷＯ９９／０３８８５、ＷＯ２００４／１１１０８２、ＷＯ２００７／１２１８９４、ＷＯ２０１４／００９４３８およびＷＯ２０１４／００９４３３に開示されているもの）である。
別の好ましい実施態様では、処方物中に存在するワクシニアウイルスは、不死化鳥類細胞株（テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含んでなるノバリケン不死化鳥類細胞株、Ｅ１Ａ核酸配列とテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含んでなるノバリケン不死化鳥類細胞株、ＤＦ１細胞株、Ｅｂｘ細胞株、またはＤＥＣ ９９細胞株を含む）上で増幅されたＭＶＡウイルス（特に、ＷＯ９０／１０４５９、ＷＯ９２／０７０００、ＷＯ９５／０９２４１、ＷＯ９８／０４７０５、ＷＯ９９／０３８８５、ＷＯ２００４／１１１０８２、ＷＯ２００７／１２１８９４、ＷＯ２０１４／００９４３８およびＷＯ２０１４／００９４３３に開示されているもの）、より好ましくは、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を受けなかった不死化鳥類細胞株（上述のものを含む）上で増幅されたＭＶＡウイルス（特に、ＷＯ９０／１０４５９、ＷＯ９２／０７０００、ＷＯ９５／０９２４１、ＷＯ９８／０４７０５、ＷＯ９９／０３８８５、ＷＯ２００４／１１１０８２、ＷＯ２００７／１２１８９４、ＷＯ２０１４／００９４３８およびＷＯ２０１４／００９４３３に開示されているもの）である。
別の好ましい実施態様では、処方物中に存在するワクシニアウイルスは、Ｈｅｌａ細胞で増幅されたワイスまたはコペンハーゲンワクシニアウイルス（特に、ＷＯ２００７／０３０６６８、ＷＯ２００８／１１３０７８、ＷＯ２００９／０６５５４６、ＷＯ２００９／０６５５４７に開示されているもの）、より好ましくは、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を受けなかったＨｅｌａ細胞で増幅されたワイスまたはコペンハーゲンワクシニアウイルス（特に、ＷＯ２００７／０３０６６８、ＷＯ２００８／１１３０７８、ＷＯ２００９／０６５５４６、ＷＯ２００９／０６５５４７に開示されているもの）である。
ｐＨおよびバッファー
本発明による液体処方物は、６．５〜８．５の間に含まれるｐＨを有する。特に、本発明による液体処方物は、６．５〜８．４の間、６．５〜８．３の間、６．５〜８．２の間、６．５〜８．１の間、６．５〜８．０の間、６．５〜７．９の間、６．５〜７．８の間、６．５〜７．７の間、６．５〜７．６の間、６．５〜７．５の間、６．６〜８．５の間、６．６〜８．４の間、６．６〜８．３の間、６．６〜８．２の間、６．６〜８．１の間、６．６〜８．０の間、６．６〜７．９の間、６．６〜７．８の間、６．６〜７．７の間、６．６〜７．６の間、６．６〜７．５の間、６．７〜８．５の間、６．７〜８．４の間、６．７〜８．３の間、６．７〜８．２の間、６．７〜８．１の間、６．７〜８．０の間、６．７〜７．９の間、６．７〜７．８の間、６．７〜７．７の間、６．７〜７．６の間、６．７〜７．５の間、６．８〜８．５の間、６．８〜８．４の間、６．８〜８．３の間、６．８〜８．２の間、６．８〜８．１の間、６．８〜８．０の間、６．８〜７．９の間、６．８〜７．８の間、６．８〜７．７の間、６．８〜７．６の間、６．８〜７．５の間、６．９〜８．５の間、６．９〜８．４の間、６．９〜８．３の間、６．９〜８．２の間、６．９〜８．１の間、６．９〜８．０の間、６．９〜７．９の間、６．９〜７．８の間、６．９〜７．７の間、６．９〜７．６の間、６．９〜７．５の間、７〜８．５の間、７〜８．４の間、７〜８．３の間、７〜８．２の間、７〜８．１の間、７〜８の間、７〜７．９の間、７〜７．８、の間、７〜７．７の間、７〜７．６の間、７〜７．５の間、７．１〜８．５の間、７．１〜８．４の間、７．１〜８．３の間、７．１〜８．２の間、７．１〜８．１の間、７．１〜８の間、７．１〜７．９の間、７．１〜７．８の間、７．１〜７．７の間、７．１〜７．６の間、７．１〜７．５の間、７．２〜８．５の間、７．２〜８．４の間、７．２〜８．３の間、７．２〜８．２の間、７．２〜８．１の間、７．２〜８の間、７．２〜７．９の間、７．２〜７．８の間、７．２〜７．７の間、７．２〜７．６の間、７．２〜７．５の間、７．３〜８．５の間、７．３〜８．４の間、７．３〜８．３の間、７．３〜８．２の間、７．３〜８．１の間、７．３〜８の間、７．３〜７．９の間、７．３〜７．８の間、７．３〜７．７の間、７．３〜７．６の間、７．３〜７．５の間、７．４〜８．５の間、７．４〜８．４の間、７．４〜８．３の間、７．４〜８．２の間、７．４〜８．１の間、７．４〜８の間、７．４〜７．９の間、７．４〜７．８の間、７．４〜７．７の間、７．４〜７．６の間、７．４〜７．５の間、７．５〜８．５の間、７．５〜８．４の間、７．５〜８．３の間、７．５〜８．２の間、７．５〜８．１の間、７．５〜８の間、７．５〜７．９の間、７．５〜７．８の間、７．５〜７．７の間、または７．５〜７．６の間に含まれるｐＨを有し得る。好ましくは、本発明による液体処方物は、７〜８の間、より詳しくは、７．５に近い、特に、７．２〜７．８の間、７．３〜７．７の間、７．４〜７．６の間に含まれる、または約７．５のｐＨを有する。
このｐＨを維持するために、本発明による液体処方物は、その処方物のｐＨで緩衝能を有するバッファーを含んでなる。このようなバッファーは当業者に周知であり、特に、以下のバッファー：
・トリス−ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン−ＨＣｌ）、
・トリス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン）、
・ＨＥＰＥＳ（４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、
・Ｎａ２ＨＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４の混合物またはＮａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４の混合物を含んでなるリン酸バッファー、
・ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−アミノエタンスルホン酸）、
・ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、
・ＭＯＰＳＯ（３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、
・ビス−トリス−プロパン（１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］プロパン）、
・ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）２−アミノエタンスルホン酸）、
・ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、
・ＴＥＳ（２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、
・ＤＩＰＳＯ（３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパン−１−スルホン酸）、
・ＭＯＢＳ（４−（Ｎ−モルホリノ）ブタンスルホン酸）、
・ＴＡＰＳＯ（３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、
・ＨＥＰＰＳＯ（４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−１−（２−ヒドロキシ）−プロパンスルホン酸）、
・ＰＯＰＳＯ（２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸）、
・ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、
・ＥＰＰＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸）、および
・トリシン（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン）
を含む。
好ましくは、前記バッファーは、トリス−ＨＣｌ、トリス、トリシン、ＨＥＰＥＳおよびＮａ２ＨＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４の混合物またはＮａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４の混合物を含んでなるリン酸バッファーから選択される。より好ましくは、前記バッファーは、トリス−ＨＣｌ、トリス、またはトリシンバッファーから選択され、より好ましくは、前記バッファーは、トリス−ＨＣｌまたはトリスバッファーであり、いっそうより好ましくは、前記バッファーは、トリス−ＨＣｌバッファーである。
前記バッファー（特に、上述のもの、特に、トリス−ＨＣｌ）は、好ましくは、１０〜５０ｍＭの濃度で存在する。それは特に、１０〜４５ｍＭ、１０〜４０ｍＭ、１０〜３５ｍＭ、１０〜３０ｍＭ、１０〜２５ｍＭ、１０〜２０ｍＭ、１０〜１５ｍＭ、１５〜５０ｍＭ、１５〜４５ｍＭ、１５〜４０ｍＭ、１５〜３５ｍＭ、１５〜３０ｍＭ、１５〜２５ｍＭ、１５〜２０ｍＭ、２０〜５０ｍＭ、２０〜４５ｍＭ、２０〜４０ｍＭ、２０〜３５ｍＭ、２０〜３０ｍＭ、２０〜２５ｍＭ、２５〜５０ｍＭ、２５〜４５ｍＭ、２５〜４０ｍＭ、２５〜３５ｍＭ、２５〜３０ｍＭ、３０〜５０ｍＭ、３０〜４５ｍＭ、３０〜４０ｍＭ、３０〜３５ｍＭ、３５〜５０ｍＭ、３５〜４５ｍＭ、３５〜４０ｍＭ、４０〜５０ｍＭ、４０〜４５ｍＭ、または４５〜５０ｍＭの濃度で存在し得る。好ましくは、前記バッファー（特に、上述のもの、特に、トリス−ＨＣｌ）は、好ましくは、１０〜４０ｍＭ、特に、１０〜３０ｍＭの濃度で存在する。
一価の塩
本発明による液体処方物は、一価の塩を含んでなる。この一価の塩は、適当な浸透圧を保証すると考えられる。加えて、前記一価の塩はまた、処方物中に存在し得るプロテアーゼの阻害特性を有し、従って、安定性を改善するとも考えられる。このようなプロテアーゼには、パッケージング細胞を破壊する場合およびまた、処方物中に存在するワクシニアウイルスがプロテアーゼの使用を含む方法により精製され、前記の付加されたプロテアーゼの痕跡が残留する場合に遊離する細胞プロテアーゼが含まれる。プロテアーゼに対する有意な一価の塩濃度の阻害作用が当技術分野で報告されている(TOUGU V et al. Eur J Biochem. 1994 Jun , 222(2):475-81)。例えば、Ｐｉｅｒｃｅトリプシンプロテアーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に関して、製造者は説明書で、＞１００ｍＭ ＮａＣｌのような高い一価の塩濃度はトリプシン活性を妨げることを示している。
前記一価の塩は、特に、ＮａＣｌおよびＫＣｌから選択することができ、好ましくは、前記一価の塩はＮａＣｌである。
前記一価の塩（特に、ＮａＣｌ）は好ましくは１０〜１０００ｍＭの濃度で存在する。それは特に、１０〜９５０ｍＭ、１０〜９００ｍＭ、１０〜８５０ｍＭ、１０〜８００ｍＭ、１０〜７５０ｍＭ、１０〜７００ｍＭ、１０〜６５０ｍＭ、１０〜６００ｍＭ、１０〜５５０ｍＭ、１０〜５００ｍＭ、１０〜４５０ｍＭ、１０〜４００ｍＭ、１０〜３５０ｍＭ、１０〜３００ｍＭ、１０〜２５０ｍＭ、１０〜２００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、１０〜９０ｍＭ、１０〜８０ｍＭ、１０〜７５ｍＭ、１０〜７０ｍＭ、１０〜６０ｍＭ、１０〜５０ｍＭ、１０〜４０ｍＭ、１０〜３０ｍＭ、１０〜２５ｍＭ、１０〜２０ｍＭ、２０〜１０００ｍＭ、２０〜９５０ｍＭ、２０〜９００ｍＭ、２０〜８５０ｍＭ、２０〜８００ｍＭ、２０〜７５０ｍＭ、２０〜７００ｍＭ、２０〜６５０ｍＭ、２０〜６００ｍＭ、２０〜５５０ｍＭ、２０〜５００ｍＭ、２０〜４５０ｍＭ、２０〜４００ｍＭ、２０〜３５０ｍＭ、２０〜３００ｍＭ、２０〜２５０ｍＭ、２０〜２００ｍＭ、２０〜１５０ｍＭ、２０〜１００ｍＭ、２０〜９０ｍＭ、２０〜８０ｍＭ、２０〜７５ｍＭ、２０〜７０ｍＭ、２０〜６０ｍＭ、２０〜５０ｍＭ、２０〜４０ｍＭ、２０〜３０ｍＭ、２０〜２５ｍＭ、２５〜１０００ｍＭ、２５〜９５０ｍＭ、２５〜９００ｍＭ、２５〜８５０ｍＭ、２５〜８００ｍＭ、２５〜７５０ｍＭ、２５〜７００ｍＭ、２５〜６５０ｍＭ、２５〜６００ｍＭ、２５〜５５０ｍＭ、２５〜５００ｍＭ、２５〜４５０ｍＭ、２５〜４００ｍＭ、２５〜３５０ｍＭ、２５〜３００ｍＭ、２５〜２５０ｍＭ、２５〜２００ｍＭ、２５〜１５０ｍＭ、２５〜１００ｍＭ、２５〜９０ｍＭ、２５〜８０ｍＭ、２５〜７５ｍＭ、２５〜７０ｍＭ、２５〜６０ｍＭ、２５〜５０ｍＭ、２５〜４０ｍＭ、２５〜３０ｍＭ、３０〜１０００ｍＭ、３０〜９５０ｍＭ、３０〜９００ｍＭ、３０〜８５０ｍＭ、３０〜８００ｍＭ、３０〜７５０ｍＭ、３０〜７００ｍＭ、３０〜６５０ｍＭ、３０〜６００ｍＭ、３０〜５５０ｍＭ、３０〜５００ｍＭ、３０〜４５０ｍＭ、３０〜４００ｍＭ、３０〜３５０ｍＭ、３０〜３００ｍＭ、３０〜２５０ｍＭ、３０〜２００ｍＭ、３０〜１５０ｍＭ、３０〜１００ｍＭ、３０〜９０ｍＭ、３０〜８０ｍＭ、３０〜７５ｍＭ、３０〜７０ｍＭ、３０〜６０ｍＭ、３０〜５０ｍＭ、３０〜４０ｍＭ、４０〜１０００ｍＭ、４０〜９５０ｍＭ、４０〜９００ｍＭ、４０〜８５０ｍＭ、４０〜８００ｍＭ、４０〜７５０ｍＭ、４０〜７００ｍＭ、４０〜６５０ｍＭ、４０〜６００ｍＭ、４０〜５５０ｍＭ、４０〜５００ｍＭ、４０〜４５０ｍＭ、４０〜４００ｍＭ、４０〜３５０ｍＭ、４０〜３００ｍＭ、４０〜２５０ｍＭ、４０〜２００ｍＭ、４０〜１５０ｍＭ、４０〜１００ｍＭ、４０〜９０ｍＭ、４０〜８０ｍＭ、４０〜７５ｍＭ、４０〜７０ｍＭ、４０〜６０ｍＭ、４０〜５０ｍＭ、５０〜１０００ｍＭ、５０〜９５０ｍＭ、５０〜９００ｍＭ、５０〜８５０ｍＭ、５０〜８００ｍＭ、５０〜７５０ｍＭ、５０〜７００ｍＭ、５０〜６５０ｍＭ、５０〜６００ｍＭ、５０〜５５０ｍＭ、５０〜５００ｍＭ、５０〜４５０ｍＭ、５０〜４００ｍＭ、５０〜３５０ｍＭ、５０〜３００ｍＭ、５０〜２５０ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、５０〜１５０ｍＭ、５０〜１００ｍＭ、５０〜９０ｍＭ、５０〜８０ｍＭ、５０〜７５ｍＭ、５０〜７０ｍＭ、５０〜６０ｍＭ、６０〜１０００ｍＭ、６０〜９５０ｍＭ、６０〜９００ｍＭ、６０〜８５０ｍＭ、６０〜８００ｍＭ、６０〜７５０ｍＭ、６０〜７００ｍＭ、６０〜６５０ｍＭ、６０〜６００ｍＭ、６０〜５５０ｍＭ、６０〜５００ｍＭ、６０〜４５０ｍＭ、６０〜４００ｍＭ、６０〜３５０ｍＭ、６０〜３００ｍＭ、６０〜２５０ｍＭ、６０〜２００ｍＭ、６０〜１５０ｍＭ、６０〜１００ｍＭ、６０〜９０ｍＭ、６０〜８０ｍＭ、６０〜７５ｍＭ、６０〜７０ｍＭ、７０〜１０００ｍＭ、７０〜９５０ｍＭ、７０〜９００ｍＭ、７０〜８５０ｍＭ、７０〜８００ｍＭ、７０〜７５０ｍＭ、７０〜７００ｍＭ、７０〜６５０ｍＭ、７０〜６００ｍＭ、７０〜５５０ｍＭ、７０〜５００ｍＭ、７０〜４５０ｍＭ、７０〜４００ｍＭ、７０〜３５０ｍＭ、７０〜３００ｍＭ、７０〜２５０ｍＭ、７０〜２００ｍＭ、７０〜１５０ｍＭ、７０〜１００ｍＭ、７０〜９０ｍＭ、７０〜８０ｍＭ、７０〜７５ｍＭ、７５〜１０００ｍＭ、７５〜９５０ｍＭ、７５〜９００ｍＭ、７５〜８５０ｍＭ、７５〜８００ｍＭ、７５〜７５０ｍＭ、７５〜７００ｍＭ、７５〜６５０ｍＭ、７５〜６００ｍＭ、７５〜５５０ｍＭ、７５〜５００ｍＭ、７５〜４５０ｍＭ、７５〜４００ｍＭ、７５〜３５０ｍＭ、７５〜３００ｍＭ、７５〜２５０ｍＭ、７５〜２００ｍＭ、７５〜１５０ｍＭ、７５〜１００ｍＭ、７５〜９０ｍＭ、７５〜８０ｍＭ、８０〜１０００ｍＭ、８０〜９５０ｍＭ、８０〜９００ｍＭ、８０〜８５０ｍＭ、８０〜８００ｍＭ、８０〜７５０ｍＭ、８０〜７００ｍＭ、８０〜６５０ｍＭ、８０〜６００ｍＭ、８０〜５５０ｍＭ、８０〜５００ｍＭ、８０〜４５０ｍＭ、８０〜４００ｍＭ、８０〜３５０ｍＭ、８０〜３００ｍＭ、８０〜２５０ｍＭ、８０〜２００ｍＭ、８０〜１５０ｍＭ、８０〜１００ｍＭ、８０〜９０ｍＭ、９０〜１０００ｍＭ、９０〜９５０ｍＭ、９０〜９００ｍＭ、９０〜８５０ｍＭ、９０〜８００ｍＭ、９０〜７５０ｍＭ、９０〜７００ｍＭ、９０〜６５０ｍＭ、９０〜６００ｍＭ、９０〜５５０ｍＭ、９０〜５００ｍＭ、９０〜４５０ｍＭ、９０〜４００ｍＭ、９０〜３５０ｍＭ、９０〜３００ｍＭ、９０〜２５０ｍＭ、９０〜２００ｍＭ、９０〜１５０ｍＭ、９０〜１００ｍＭ、１００〜１０００ｍＭ、１００〜９５０ｍＭ、１００〜９００ｍＭ、１００〜８５０ｍＭ、１００〜８００ｍＭ、１００〜７５０ｍＭ、１００〜７００ｍＭ、１００〜６５０ｍＭ、１００〜６００ｍＭ、１００〜５５０ｍＭ、１００〜５００ｍＭ、１００〜４５０ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、１００〜３５０ｍＭ、１００〜３００ｍＭ、１００〜２５０ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、１００〜１５０ｍＭ、１５０〜１０００ｍＭ、１５０〜９５０ｍＭ、１５０〜９００ｍＭ、１５０〜８５０ｍＭ、１５０〜８００ｍＭ、１５０〜７５０ｍＭ、１５０〜７００ｍＭ、１５０〜６５０ｍＭ、１５０〜６００ｍＭ、１５０〜５５０ｍＭ、１５０〜５００ｍＭ、１５０〜４５０ｍＭ、１５０〜４００ｍＭ、１５０〜３５０ｍＭ、１５０〜３００ｍＭ、１５０〜２５０ｍＭ、１５０〜２００、２００〜１０００ｍＭ、２００〜９５０ｍＭ、２００〜９００ｍＭ、２００〜８５０ｍＭ、２００〜８００ｍＭ、２００〜７５０ｍＭ、２００〜７００ｍＭ、２００〜６５０ｍＭ、２００〜６００ｍＭ、２００〜５５０ｍＭ、２００〜５００ｍＭ、２００〜４５０ｍＭ、２００〜４００ｍＭ、２００〜３５０ｍＭ、２００〜３００ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２５０〜１０００ｍＭ、２５０〜９５０ｍＭ、２５０〜９００ｍＭ、２５０〜８５０ｍＭ、２５０〜８００ｍＭ、２５０〜７５０ｍＭ、２５０〜７００ｍＭ、２５０〜６５０ｍＭ、２５０〜６００ｍＭ、２５０〜５５０ｍＭ、２５０〜５００ｍＭ、２５０〜４５０ｍＭ、２５０〜４００ｍＭ、２５０〜３５０ｍＭ、２５０〜３００ｍＭ、３００〜１０００ｍＭ、３００〜９５０ｍＭ、３００〜９００ｍＭ、３００〜８５０ｍＭ、３００〜８００ｍＭ、３００〜７５０ｍＭ、３００〜７００ｍＭ、３００〜６５０ｍＭ、３００〜６００ｍＭ、３００〜５５０ｍＭ、３００〜５００ｍＭ、３００〜４５０ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、３００〜３５０ｍＭ、３５０〜１０００ｍＭ、３５０〜９５０ｍＭ、３５０〜９００ｍＭ、３５０〜８５０ｍＭ、３５０〜８００ｍＭ、３５０〜７５０ｍＭ、３５０〜７００ｍＭ、３５０〜６５０ｍＭ、３５０〜６００ｍＭ、３５０〜５５０ｍＭ、３５０〜５００ｍＭ、３５０〜４５０ｍＭ、３５０〜４００ｍＭ、４００〜１０００ｍＭ、４００〜９５０ｍＭ、４００〜９００ｍＭ、４００〜８５０ｍＭ、４００〜８００ｍＭ、４００〜７５０ｍＭ、４００〜７００ｍＭ、４００〜６５０ｍＭ、４００〜６００ｍＭ、４００〜５５０ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、４００〜４５０ｍＭ、４５０〜１０００ｍＭ、４５０〜９５０ｍＭ、４５０〜９００ｍＭ、４５０〜８５０ｍＭ、４５０〜８００ｍＭ、４５０〜７５０ｍＭ、４５０〜７００ｍＭ、４５０〜６５０ｍＭ、４５０〜６００ｍＭ、４５０〜５５０ｍＭ、または４５０〜５００ｍＭの濃度で存在し得る。
ＭＶＡ（特に、ＷＯ９０／１０４５９、ＷＯ９２／０７０００、ＷＯ９５／０９２４１、ＷＯ９８／０４７０５、ＷＯ９９／０３８８５、ＷＯ２００４／１１１０８２、ＷＯ２００７／１２１８９４、ＷＯ２０１４／００９４３８およびＷＯ２０１４／００９４３３に開示されているもの）は一般に初代鳥類細胞で増幅され、この場合、初代細胞は危険と見なされないので、初代鳥類細胞タンパク質の排除のためのプロテアーゼ処理は必要でない。よって、ＭＶＡでは、より一般には、処方物中に存在するポックスウイルス（好ましくは、ワクシニアウイルス）が少なくとも１種類のプロテアーゼによる処理を含まない方法によって精製された場合には、前記一価の塩（特に、ＮａＣｌ）は、比較的低濃度で、特に、１０〜２００ｍＭ、１０〜１５０ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、１０〜９０ｍＭ、１０〜８０ｍＭ、１０〜７５ｍＭ、２０〜２００ｍＭ、２０〜１５０ｍＭ、２０〜１００ｍＭ、２０〜９０ｍＭ、２０〜８０ｍＭ、２０〜７５ｍＭ、２５〜２００ｍＭ、２５〜１５０ｍＭ、２５〜１００ｍＭ、２５〜９０ｍＭ、２５〜８０ｍＭ、２５〜７５ｍＭ、３０〜２００ｍＭ、３０〜１５０ｍＭ、３０〜１００ｍＭ、３０〜９０ｍＭ、３０〜８０ｍＭ、３０〜７５ｍＭ、４０〜２００ｍＭ、４０〜１５０ｍＭ、４０〜１００ｍＭ、４０〜９０ｍＭ、４０〜８０ｍＭ、４０〜７５ｍＭ、５０〜２００ｍＭ、５０〜１５０ｍＭ、５０〜１００ｍＭ、５０〜９０ｍＭ、５０〜８０ｍＭ、５０〜７５ｍＭ、６０〜２００ｍＭ、６０〜１５０ｍＭ、６０〜１００ｍＭ、６０〜９０ｍＭ、６０〜８０ｍＭ、６０〜７５ｍＭ、７０〜２００ｍＭ、７０〜１５０ｍＭ、７０〜１００ｍＭ、７０〜９０ｍＭ、７０〜８０ｍＭ、または７０〜７５ｍＭの濃度、より好ましくは７５ｍＭに近い濃度、例えば、５０〜１００ｍＭ、６０〜９０ｍＭ、７０〜８０ｍＭ、または約７５ｍＭで存在し得る。
ポックスウイルスの他の株、特に、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、例えば、ワイスまたはコペンハーゲンワクシニアウイルス（特に、ＷＯ２００７／０３０６６８、ＷＯ２００８／１１３０７８、ＷＯ２００９／０６５５４６、ＷＯ２００９／０６５５４７に開示されているもの）は一般に、種々の不死化細胞株で増幅される。これらの細胞株のいくつかは癌遺伝子を含んでいる場合があり、この場合には、生産細胞のＤＮＡおよびタンパク質の排除または少なくとも劇的低減が保健機関により要求される。この目的で、精製プロセスは一般に、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む。残留するプロテアーゼの痕跡は、特に液体処方物では、ワクシニアウイルスの安定性に有害な影響を持つ場合がある。これに関して、本発明者らは、前記一価の塩（特に、ＮａＣｌ）の濃度を上昇させるとワクシニアウイルスの安定性の改善がもたらされることを見出した。理論に縛られるものではないが、前記一価の塩（特に、ＮａＣｌ）の濃度の上昇は、残留するプロテアーゼの痕跡に阻害効果を持つと考えられる。
従って、処方物中に存在するポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）が、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製された場合、前記一価の塩（特に、ＮａＣｌ）は、好ましくは、１００〜１０００ｍＭ、１００〜９５０ｍＭ、１００〜９００ｍＭ、１００〜８５０ｍＭ、１００〜８００ｍＭ、１００〜７５０ｍＭ、１００〜７００ｍＭ、１００〜６５０ｍＭ、１００〜６００ｍＭ、１００〜５５０ｍＭ、１００〜５００ｍＭ、１００〜４５０ｍＭ、１００〜４００ｍＭ、１００〜３５０ｍＭ、１００〜３００ｍＭ、１００〜２５０ｍＭ、１００〜２００ｍＭ、１５０〜１０００ｍＭ、１５０〜９５０ｍＭ、１５０〜９００ｍＭ、１５０〜８５０ｍＭ、１５０〜８００ｍＭ、１５０〜７５０ｍＭ、１５０〜７００ｍＭ、１５０〜６５０ｍＭ、１５０〜６００ｍＭ、１５０〜５５０ｍＭ、１５０〜５００ｍＭ、１５０〜４５０ｍＭ、１５０〜４００ｍＭ、１５０〜３５０ｍＭ、１５０〜３００ｍＭ、１５０〜２５０ｍＭ、１５０〜２００、２００〜１０００ｍＭ、２００〜９５０ｍＭ、２００〜９００ｍＭ、２００〜８５０ｍＭ、２００〜８００ｍＭ、２００〜７５０ｍＭ、２００〜７００ｍＭ、２００〜６５０ｍＭ、２００〜６００ｍＭ、２００〜５５０ｍＭ、２００〜５００ｍＭ、２００〜４５０ｍＭ、２００〜４００ｍＭ、２００〜３５０ｍＭ、２００〜３００ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２５０〜１０００ｍＭ、２５０〜９５０ｍＭ、２５０〜９００ｍＭ、２５０〜８５０ｍＭ、２５０〜８００ｍＭ、２５０〜７５０ｍＭ、２５０〜７００ｍＭ、２５０〜６５０ｍＭ、２５０〜６００ｍＭ、２５０〜５５０ｍＭ、２５０〜５００ｍＭ、２５０〜４５０ｍＭ、２５０〜４００ｍＭ、２５０〜３５０ｍＭ、２５０〜３００ｍＭ、３００〜１０００ｍＭ、３００〜９５０ｍＭ、３００〜９００ｍＭ、３００〜８５０ｍＭ、３００〜８００ｍＭ、３００〜７５０ｍＭ、３００〜７００ｍＭ、３００〜６５０ｍＭ、３００〜６００ｍＭ、３００〜５５０ｍＭ、３００〜５００ｍＭ、３００〜４５０ｍＭ、３００〜４００ｍＭ、３００〜３５０ｍＭ、３５０〜１０００ｍＭ、３５０〜９５０ｍＭ、３５０〜９００ｍＭ、３５０〜８５０ｍＭ、３５０〜８００ｍＭ、３５０〜７５０ｍＭ、３５０〜７００ｍＭ、３５０〜６５０ｍＭ、３５０〜６００ｍＭ、３５０〜５５０ｍＭ、３５０〜５００ｍＭ、３５０〜４５０ｍＭ、３５０〜４００ｍＭ、４００〜１０００ｍＭ、４００〜９５０ｍＭ、４００〜９００ｍＭ、４００〜８５０ｍＭ、４００〜８００ｍＭ、４００〜７５０ｍＭ、４００〜７００ｍＭ、４００〜６５０ｍＭ、４００〜６００ｍＭ、４００〜５５０ｍＭ、４００〜５００ｍＭ、４００〜４５０ｍＭ、４５０〜１０００ｍＭ、４５０〜９５０ｍＭ、４５０〜９００ｍＭ、４５０〜８５０ｍＭ、４５０〜８００ｍＭ、４５０〜７５０ｍＭ、４５０〜７００ｍＭ、４５０〜６５０ｍＭ、４５０〜６００ｍＭ、４５０〜５５０ｍＭ、または４５０〜５００ｍＭの濃度で存在する。例えば、前記一価の塩は、２００ｍＭに近い濃度、例えば、１００〜３００ｍＭ、１５０〜２５０ｍＭ、または約２００ｍＭで存在し得る。あるいは、前記一価の塩は、５００ｍＭに近い濃度、例えば、２５０〜７５０ｍＭ、４００〜６００ｍＭ、または約５００ｍＭで存在し得る。さらに別の実施態様では、前記一価の塩は、７５０ｍＭに近い濃度、例えば、５００〜１０００ｍＭ、７００〜８００ｍＭ、または約７５０ｍＭで存在し得る。
二糖または糖アルコール
本発明による液体処方物は、薬学上許容可能な二糖または糖アルコールを含んでなる。
この薬学上許容可能な二糖または糖アルコールは凍結保護性があり、約＋５℃などの低い保存温度でポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）を保護する。加えて、このような薬学上許容可能な二糖または糖アルコールは液体処方物の粘度を高め、これによりポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）と潜在的に有害な化合物の間の相互作用を制限し得る。
薬学上許容可能な二糖または糖アルコールは特に、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、およびソルビトールから選択され得る。好ましくは、前記薬学上許容可能な二糖または糖アルコールはスクロースである。
薬学上許容可能な二糖または糖アルコール（特に、上述のもの、特に、スクロース）は好ましくは、５〜２０％（ｗ／ｖとして表される重量ｇ／容量Ｌ）の濃度で存在する。特に、それは５〜１９％（ｗ／ｖ）、５〜１８％（ｗ／ｖ）、５〜１７％（ｗ／ｖ）、５〜１６％（ｗ／ｖ）、５〜１５％（ｗ／ｖ）、５〜１４％（ｗ／ｖ）、５〜１３％（ｗ／ｖ）、５〜１２％（ｗ／ｖ）、５〜１１％（ｗ／ｖ）、５〜１０％（ｗ／ｖ）、６〜２０％（ｗ／ｖ）、６〜１９％（ｗ／ｖ）、６〜１８％（ｗ／ｖ）、６〜１７％（ｗ／ｖ）、６〜１６％（ｗ／ｖ）、６〜１５％（ｗ／ｖ）、６〜１４％（ｗ／ｖ）、６〜１３％（ｗ／ｖ）、６〜１２％（ｗ／ｖ）、６〜１１％（ｗ／ｖ）、６〜１０％（ｗ／ｖ）、７〜２０％（ｗ／ｖ）、７〜１９％（ｗ／ｖ）、７〜１８％（ｗ／ｖ）、７〜１７％（ｗ／ｖ）、７〜１６％（ｗ／ｖ）、７〜１５％（ｗ／ｖ）、７〜１４％（ｗ／ｖ）、７〜１３％（ｗ／ｖ）、７〜１２％（ｗ／ｖ）、７〜１１％（ｗ／ｖ）、７〜１０％（ｗ／ｖ）、８〜２０％（ｗ／ｖ）、８〜１９％（ｗ／ｖ）、８〜１８％（ｗ／ｖ）、８〜１７％（ｗ／ｖ）、８〜１６％（ｗ／ｖ）、８〜１５％（ｗ／ｖ）、８〜１４％（ｗ／ｖ）、８〜１３％（ｗ／ｖ）、８〜１２％（ｗ／ｖ）、８〜１１％（ｗ／ｖ）、８〜１０％（ｗ／ｖ）、９〜２０％（ｗ／ｖ）、９〜１９％（ｗ／ｖ）、９〜１８％（ｗ／ｖ）、９〜１７％（ｗ／ｖ）、９〜１６％（ｗ／ｖ）、９〜１５％（ｗ／ｖ）、９〜１４％（ｗ／ｖ）、９〜１３％（ｗ／ｖ）、９〜１２％（ｗ／ｖ）、９〜１１％（ｗ／ｖ）、または９〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し得る。好ましくは、前記薬学上許容可能な二糖または糖アルコール（特に、上述のもの、特に、スクロース）は好ましくは、１０％（ｗ／ｖ）に近い濃度、例えば、５〜１５％（ｗ／ｖ）、６〜１４％（ｗ／ｖ）、７〜１３％（ｗ／ｖ）、８〜１２％（ｗ／ｖ）、９〜１１％（ｗ／ｖ）、または約１０％で存在する。
キレート剤
本発明による液体処方物は、薬学上許容可能なキレート剤、特に、薬剤キレートジカチオンを含んでなる。
前記薬学上許容可能なキレート剤が液体状態のポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）の安定性を高める理由は、実際には理解されていない。事実上、背景技術の節で説明したように、ウイルス安定性に対するＥＤＴＡの効果は異なるウイルス間で著しく異なり、ＥＤＴＡが有益であるウイルスとＥＤＴＡが有益でないまたは有害な影響さえあるウイルスの明確な分類は容易に行うことができない。特に、アデノウイルス（非エンベロープＤＮＡウイルス、EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75；および米国特許第７，４５６，００９号参照）では著しく有益な効果が見られたものの、インフルエンザウイルス（エンベロープＲＮＡウイルス、ＵＳ２００７／０１６１０８５参照）、イヌパルボウイルス（非エンベロープＤＮＡウイルス）、２型イヌアデノウイルス（非エンベロープＤＮＡウイルス）、イヌジステンパーウイルス（エンベロープＲＮＡパラミクソウイルス）およびイヌパラインフルエンザウイルス（エンベロープＲＮＡパラミクソウイルス）では著しく有益な効果は見られなかった（ＷＯ２０１４／０２９７０２参照）。最後に、ニューカッスルウイルス（エンベロープＲＮＡパラミクソウイルス、米国特許第７，９１４，９７９号参照）では有害な影響が見られた。
しかしながら、実験の節に示されるように、前記薬学上許容可能なキレート剤は、本発明による液体処方物中でのポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）の安定化に不可欠な役割を持つ。
薬学上許容可能なキレート剤は、特に、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、および２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）から選択され得、好ましくは、前記薬学上許容可能なキレート剤はＥＤＴＡである。
薬学上許容可能なキレート剤（特に、上述のもの、特に、ＥＤＴＡ）は好ましくは、少なくとも５０μＭの濃度で存在する。特に、それは、５０〜１０００μＭ、５０〜７５０μＭ、５０〜５００μＭ、５０〜４００μＭ、５０〜３００μＭ、５０〜２５０μＭ、５０〜２００μＭ、５０〜１５０μＭ；５０〜１００μＭ、５０〜７５μＭ、７５〜１０００μＭ、７５〜７５０μＭ、７５〜５００μＭ、７５〜４００μＭ、７５〜３００μＭ、７５〜２５０μＭ、７５〜２００μＭ、７５〜１５０μＭ；７５〜１００μＭ、１００〜１０００μＭ、１００〜７５０μＭ、１００〜５００μＭ、１００〜４００μＭ、１００〜３００μＭ、１００〜２５０μＭ、１００〜２００μＭ、１００〜１５０μＭ；１５０〜１０００μＭ、１５０〜７５０μＭ、１５０〜５００μＭ、１５０〜４００μＭ、１５０〜３００μＭ、１５０〜２５０μＭ、１５０〜２００μＭの濃度で存在し得る。前記薬学上許容可能なキレート剤（特に、上述のもの、特に、ＥＤＴＡ）は特に、１５０μＭに近い濃度、例えば、５０〜２５０μＭ、１００〜２００μＭ、または約１５０μＭで存在し得る。しかしながら、安定性に有害な影響が見られなかったことから、より高濃度が存在してもよく、低濃度でもよい。
任意選択の付加的成分
本発明による液体処方物は、ワクシニアウイルスに対して安定化効果を持つ付加的化合物をさらに含んでなってもよい。
Ｃ ２ −Ｃ ３ アルコール
６．５〜８．５の間のｐＨを有することが可能な薬学上許容可能なバッファー、一価の塩、薬学上許容可能な二糖または糖アルコール、および薬学上許容可能なキレート剤の存在は液体状態のワクシニアウイルスに対する安定化に不可欠であることが判明したが、本発明者らはまた、低濃度のＣ２−Ｃ３アルコールの付加的存在が、ワクシニアウイルスの安定化には必要でないが、液体状態のワクシニアウイルスの安定性をさらに改善するためにキレート剤の存在と相乗作用することを見出した。これに対して、同じＣ２−Ｃ３アルコールの濃度が高すぎると液体状態のワクシニアウイルスの安定性に有害な影響を持つ。よって、本発明による液体処方物は好ましくは、０．０５〜５％（容量／容量またはｖ／ｖ）濃度のＣ２−Ｃ３アルコールをさらに含んでなる。アデノウイルスなどの非エンベロープウイルスの場合とは対照的に、ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスはエンベロープウイルスであって、極性溶媒の添加がエンベロープを変化させないと思われることから、この所見は全く予期されないものであった。
前記Ｃ２−Ｃ３アルコールは特に、エタノールおよびイソプロパノールから選択され得、好ましくは前記Ｃ２−Ｃ３アルコールはエタノールである。
前記Ｃ２−Ｃ３アルコール（特に、上述のもの、特に、エタノール）は、特に、０．０５〜５％（ｖ／ｖ）、０．０５〜４％（ｖ／ｖ）、０．０５〜３％（ｖ／ｖ）、０．０５〜２％（ｖ／ｖ）、０．０５〜１％（ｖ／ｖ）、０．０５〜０．９％（ｖ／ｖ）、０．０５〜０．８％（ｖ／ｖ）、０．０５〜０．７％（ｖ／ｖ）、０．０５〜０．６％（ｖ／ｖ）、０．０５〜０．５％（ｖ／ｖ）、０．１〜５％（ｖ／ｖ）、０．１〜４％（ｖ／ｖ）、０．１〜３％（ｖ／ｖ）、０．１〜２％（ｖ／ｖ）、０．１〜１％（ｖ／ｖ）、０．１〜０．９％（ｖ／ｖ）、０．１〜０．８％（ｖ／ｖ）、０．１〜０．７％（ｖ／ｖ）、０．１〜０．６％（ｖ／ｖ）、０．１〜０．５％（ｖ／ｖ）、０．２〜５％（ｖ／ｖ）、０．２〜４％（ｖ／ｖ）、０．２〜３％（ｖ／ｖ）、０．２〜２％（ｖ／ｖ）、０．２〜１％（ｖ／ｖ）、０．２〜０．９％（ｖ／ｖ）、０．２〜０．８％（ｖ／ｖ）、０．２〜０．７％（ｖ／ｖ）、０．２〜０．６％（ｖ／ｖ）、０．２〜０．５％（ｖ／ｖ）、０．３〜５％（ｖ／ｖ）、０．３〜４％（ｖ／ｖ）、０．３〜３％（ｖ／ｖ）、０．３〜２％（ｖ／ｖ）、０．３〜１％（ｖ／ｖ）、０．３〜０．９％（ｖ／ｖ）、０．３〜０．８％（ｖ／ｖ）、０．３〜０．７％（ｖ／ｖ）、０．３〜０．６％（ｖ／ｖ）、０．３〜０．５％（ｖ／ｖ）、０．４〜５％（ｖ／ｖ）、０．４〜４％（ｖ／ｖ）、０．４〜３％（ｖ／ｖ）、０．４〜２％（ｖ／ｖ）、０．４〜１％（ｖ／ｖ）、０．４〜０．９％（ｖ／ｖ）、０．４〜０．８％（ｖ／ｖ）、０．４〜０．７％（ｖ／ｖ）、０．４〜０．６％（ｖ／ｖ）、０．４〜０．５％（ｖ／ｖ）、０．５〜５％（ｖ／ｖ）、０．５〜４％（ｖ／ｖ）、０．５〜３％（ｖ／ｖ）、０．５〜２％（ｖ／ｖ）、０．５〜１％（ｖ／ｖ）、０．５〜０．９％（ｖ／ｖ）、０．５〜０．８％（ｖ／ｖ）、０．５〜０．７％（ｖ／ｖ）、または０．５〜０．６％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し得る。好ましくは、前記Ｃ２−Ｃ３アルコール（特に、上述のもの、特に、エタノール）は、２％（ｖ／ｖ）を越えない（特に、上記に開示した任意の範囲、多くて２％というより高い値）、より好ましくは、０．５％（ｖ／ｖ）に近い濃度、例えば、０．１〜１％（ｖ／ｖ）、０．１〜０．９％（ｖ／ｖ）、０．２〜０．８％（ｖ／ｖ）、０．３〜０．７％（ｖ／ｖ）、０．４〜０．６％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは、約０．５％（ｖ／ｖ）で存在する。
グルタミン酸ナトリウム
その安定化効果はあまり顕著ではないが、本発明による液体処方物はまた、１０ｍＭ未満の濃度、例えば、０〜１０ｍＭ、０〜９ｍＭ、０〜８ｍＭ、０〜７．５ｍＭ、０〜７ｍＭ、０〜６．５ｍＭ、０〜６ｍＭ、０〜５．５ｍＭ、０〜５ｍＭ、１〜１０ｍＭ、１〜９ｍＭ、１〜８ｍＭ、１〜７．５ｍＭ、１〜７ｍＭ、１〜６．５ｍＭ、１〜６ｍＭ、１〜５．５ｍＭ、１〜５ｍＭ、２〜１０ｍＭ、２〜９ｍＭ、２〜８ｍＭ、２〜７．５ｍＭ、２〜７ｍＭ、２〜６．５ｍＭ、２〜６ｍＭ、２〜５．５ｍＭ、２〜５ｍＭ、２．５〜１０ｍＭ、２．５〜９ｍＭ、２．５〜８ｍＭ、２．５〜７．５ｍＭ、２．５〜７ｍＭ、２．５〜６．５ｍＭ、２．５〜６ｍＭ、２．５〜５．５ｍＭ、２．５〜５ｍＭ、３〜１０ｍＭ、３〜９ｍＭ、３〜８ｍＭ、３〜７．５ｍＭ、３〜７ｍＭ、３〜６．５ｍＭ、３〜６ｍＭ、３〜５．５ｍＭ、３〜５ｍＭ、３．５〜１０ｍＭ、３．５〜９ｍＭ、３．５〜８ｍＭ、３．５〜７．５ｍＭ、３．５〜７ｍＭ、３．５〜６．５ｍＭ、３．５〜６ｍＭ、３．５〜５．５ｍＭ、３．５〜５ｍＭ、４〜１０ｍＭ、４〜９ｍＭ、４〜８ｍＭ、４〜７．５ｍＭ、４〜７ｍＭ、４〜６．５ｍＭ、４〜６ｍＭ、４〜５．５ｍＭ、４〜５ｍＭ、４．５〜１０ｍＭ、４．５〜９ｍＭ、４．５〜８ｍＭ、４．５〜７．５ｍＭ、４．５〜７ｍＭ、４．５〜６．５ｍＭ、４．５〜６ｍＭ、４．５〜５．５ｍＭ、４．５〜５ｍＭ、５〜１０ｍＭ、５〜９ｍＭ、５〜８ｍＭ、５〜７．５ｍＭ、５〜７ｍＭ、５〜６．５ｍＭ、５〜６ｍＭ、または５〜５．５ｍＭのグルタミン酸ナトリウムも含んでなってよい。
特に、本発明者らは、特にＭＶＡに関して、約５ｍＭ濃度のグルタミン酸ナトリウムの存在が最適であることを見出した。グルタミン酸ナトリウムが本発明による液体処方物中に存在する場合、従って、それは、好ましくは、５ｍＭに近い濃度、例えば、２．５〜７．５ｍＭ、３〜７ｍＭ、３．５〜６．５ｍＭ、４〜６ｍＭ、４．５〜５．５ｍＭ、より好ましくは、約５ｍＭで存在する。
潜在的に排除される化合物
界面活性剤
非イオン性界面活性剤は、液体状態の種々のウイルスの安定化を誘導することが示されている（EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75、米国特許第４５６，００９号、SHI et al. J Pharm Sci. 2005 Jul, 94(7):1538-51、米国特許出願第２００７／０１６１０８５号参照）。
しかしながら、ワクシニアウイルスについて、本発明者らは、非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリソルベート８０としても知られる）などの界面活性剤の低濃度での存在は有益な効果を持たず、０．０２％ｖ／ｖを越える濃度または０．００５％ｖ／ｖを越える濃度でさえワクシニアウイルスの安定性に有害であることを見出した（実施例１参照）。
ポリソルベート、またはより一般には非イオン性界面活性剤またはいずれの界面活性剤であっても、本発明による液体組成物中に存在する場合、それは０．１％未満、好ましくは０．０５％（ｖ／ｖ）未満、０．０４％（ｖ／ｖ）未満、０．０３％（ｖ／ｖ）未満、０．０２％（ｖ／ｖ）未満、０．０１％（ｖ／ｖ）未満、０．００９％（ｖ／ｖ）未満、０．００８％（ｖ／ｖ）未満、０．００７％（ｖ／ｖ）未満、０．００６％（ｖ／ｖ）未満、０．００５％（ｖ／ｖ）未満、０．００４％（ｖ／ｖ）未満、０．００３％（ｖ／ｖ）未満、０．００２％（ｖ／ｖ）未満、またはさらには０．００１％（ｖ／ｖ）未満の濃度で存在するべきである。
本発明による液体組成物の別の好ましい実施態様では、液体組成物はポリソルベートを不含であり、またはより一般には非イオン界面活性剤を不含であり、またはさらにより一般にはいずれの界面活性剤も不含である。
好ましい実施態様では、本発明による液体処方物は界面活性剤を不含であるか、または０．１％未満、好ましくは０．０５％（ｖ／ｖ）未満、０．０４％（ｖ／ｖ）未満、０．０３％（ｖ／ｖ）未満、０．０２％（ｖ／ｖ）未満、０．０１％（ｖ／ｖ）未満、０．００９％（ｖ／ｖ）未満、０．００８％（ｖ／ｖ）未満、０．００７％（ｖ／ｖ）未満、０．００６％（ｖ／ｖ）未満、０．００５％（ｖ／ｖ）未満、０．００４％（ｖ／ｖ）未満、０．００３％（ｖ／ｖ）未満、０．００２％（ｖ／ｖ）未満、もしくはさらには０．００１％（ｖ／ｖ）未満の濃度の界面活性剤しか含まない。
二価の塩
ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２などの二価の塩は、液体状態の種々のウイルスの安定化を誘導することが見出されている（EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75および米国特許第７，４５６，００９号参照）。このような場合、二価の陽イオンは液体処方物中に少なくとも０．５ｍＭ、好ましくは少なくとも１ｍＭの濃度で存在した。
しかしながら、本発明者らは、二価の塩の存在はワクシニアウイルスの安定性にあまり高い効果を持たず（実施例１参照）、むしろより高濃度では（少なくとも７５ｍＭ）有害な影響を持つことを見出した。よって、本発明による液体処方物は、ＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２、またはより一般には二価の塩を不含であり得る。
しかしながら、二価の陽イオンは低濃度ではワクシニアウイルスの安定性に有害な影響を持たないと思われるので、このような二価の陽イオンは、本発明による液体処方物中に、特に低濃度で存在してもよい。このような二価の陽イオン（特に、ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２）が本発明による液体処方物中に存在する場合、それらはやはり１００ｍＭ未満、好ましくは９０ｍＭ未満、未満８０ｍＭ、７５ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４５ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３５ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２５ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、９ｍＭ未満、８ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、３ｍＭ未満、２ｍＭ未満、より好ましくは１ｍＭ未満、０．９ｍＭ未満、０．８ｍＭ未満、０．７ｍＭ未満、０．６ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満の濃度で存在する。
好ましい実施態様では、本発明による液体処方物は二価の塩を不含であるか、または１００ｍＭ未満、好ましくは９０ｍＭ未満、８０ｍＭ未満、７５ｍＭ未満、７０ｍＭ未満、６０ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４５ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３５ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２５ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１５ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、９ｍＭ未満、８ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、５ｍＭ未満、４ｍＭ未満、３ｍＭ未満、２ｍＭ未満、より好ましくは１ｍＭ未満、０．９ｍＭ未満、０．８ｍＭ未満、０．７ｍＭ未満、０．６ｍＭ未満、０．５ｍＭ未満の濃度の二価の塩しか含まない。
グルタミン酸以外のアミノ酸
アミノ酸、特に、ヒスチジン、アルギニンまたはメチオニンは、液体状態の種々のウイルスの安定化を誘導することが見出されている（EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75、米国特許第７，４５６，００９号、米国特許出願第２００７／０１６１０８５号、米国特許第７，９１４，９７９号、ＷＯ２０１４／０２９７０２、ＷＯ２０１４／０５３５７１参照）。安定性を高めるために液体処方物中にヒスチジンが存在する場合、ヒスチジンは一般に少なくとも５ｍＭ、好ましくは少なくとも１０ｍＭの濃度で存在する（EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75、米国特許第７，４５６，００９号、ＷＯ２０１４／０２９７０２参照）。安定性を高めるために液体処方物中にアルギニンが存在する場合、アルギニンは一般に少なくとも５０ｍＭ（米国特許出願第２００７／０１６１０８５号、少なくとも１％ｗ／ｖアルギニンは少なくとも約５７．４ｍＭに相当する）、場合によって好ましくは少なくとも１５０ｍＭ、特に、約３００ｍＭ（ＷＯ２０１４／０２９７０２参照）の濃度で存在する。安定性を高めるために液体処方物中にメチオニンが存在する場合、メチオニンは一般に少なくとも２５ｍＭ、好ましくは約６７ｍＭの濃度で存在する（ＷＯ２０１４／０２９７０２参照）。
しかしながら、本発明者らは、グルタミン酸以外のアミノ酸（一般にアルギニン、ヒスチジンまたはアミノ酸）の存在はワクシニアウイルスの安定性に有益な効果を持たないことを見出した（実施例１参照）。
よって、本発明による液体処方物はヒスチジン不含である。その代わりにまたはそれに加えて、本発明による液体処方物はアルギニン不含であり得る。その代わりにまたはそれに加えて、本発明による液体処方物はメチオニン不含であり得る。特に、本発明による液体処方物はアルギニンおよびメチオニン不含であるか、またはさらにはヒスチジン、アルギニンおよびメチオニン不含であり得る。より一般には、本発明による液体処方物は、グルタミン酸以外のアミノ酸を不含であり得る。
しかしながら、このようなグルタミン酸ナトリウム以外のアミノ酸は有益な効果を持たないまでも、有害な影響を持つことは見出されず、従って、本発明による液体処方物中に、特に、低濃度で存在してもよい。
ヒスチジンが本発明による液体処方物中に存在する場合、それはやはり好ましくは１０ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、８ｍＭ未満、７．５ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、またはさらには５ｍＭ未満の濃度で存在する。
同様に、アルギニンが本発明による液体処方物中に存在する場合、それはやはり好ましくは、３００ｍＭ未満、好ましくは１５０ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、７５ｍＭ未満、またはさらには５０ｍＭ未満の濃度で存在する。
また、メチオニンが本発明による液体処方物中に存在する場合、それはやはり好ましくは６０ｍＭ未満、好ましくは５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、またはさらには２５ｍＭ未満の濃度で存在する。
より一般には、グルタミン酸ナトリウム以外の１以上のアミノ酸が本発明による液体処方物中に存在する場合、それ／それらは好ましくは、濃度の３００ｍＭ未満、好ましくは１５０ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、７５ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２５ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、９ｍＭ未満、８ｍＭ未満、７．５ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、またはさらには５ｍＭ未満の濃度で存在する。
好ましい実施態様では、本発明による液体処方物はヒスチジンを不含であるか、または１０ｍＭ未満、好ましくは９ｍＭ未満、８ｍＭ未満、７．５ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、またはさらには５ｍＭ未満の濃度のヒスチジンしか含まない。
好ましい実施態様では、本発明による液体処方物はアルギニンを不含であるか、または３００ｍＭ未満、好ましくは１５０ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、７５ｍＭ未満、またはさらには５０ｍＭ未満の濃度のアルギニンしか含まない。
好ましい実施態様では、本発明による液体処方物はメチオニンを不含であるか、または６０ｍＭ未満、好ましくは５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、またはさらには未満２５ｍＭの濃度のメチオニンしか含まない。
好ましい実施態様では、本発明による液体処方物はグルタミン酸ナトリウム以外のアミノ酸を不含であるか、または３００ｍＭ未満、好ましくは１５０ｍＭ未満、１００ｍＭ未満、７５ｍＭ未満、５０ｍＭ未満、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、２５ｍＭ未満、２０ｍＭ未満、１０ｍＭ未満、９ｍＭ未満、８ｍＭ未満、７．５ｍＭ未満、７ｍＭ未満、６ｍＭ未満、またはさらには５ｍＭ未満の濃度の、グルタミン酸ナトリウム以外のアミノ酸しか含まない。
尿素
本発明者らはまた、尿素がワクシニアウイルスの安定性に有益な効果を持たないことをも見出した（実施例１参照）。
よって、本発明による液体処方物は好ましくは尿素不含であり得る。
高分子量ポリマー
凍結乾燥させたウイルス処方物は一般に、デキストランまたはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの高分子量ポリマーを含有し、これらは凍結乾燥中に塊状物の形成を助ける（ＥＰ１４１８９４２およびＷＯ２０１４／０５３５７１参照）。
しかしながら、このような高分子量ポリマーは、液体状態のおよび本発明による液体処方物中のワクシニアウイルスの安定性に有用でなく、従って、このような高分子量ポリマーは不含であり得る。本発明による液体処方物中に存在する場合、それらは好ましくは１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは７．５ｇ／Ｌ未満、５ｇ／Ｌ未満、２．５ｇ／Ｌ未満、またはさらには１ｇ／Ｌ未満の濃度で存在する。
よって、好ましい実施態様では、本発明による液体処方物はデキストラン、ＰＶＰまたはより一般には高分子量ポリマーを不含であるか、または１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは７．５ｇ／Ｌ未満、５ｇ／Ｌ未満、２．５ｇ／Ｌ未満、またはさらには１ｇ／Ｌ未満の濃度のデキストラン、ＰＶＰまたはより一般には高分子量ポリマーしか含まない。
動物またはヒト由来安定剤
血清またはゼラチンなどの動物またはヒト由来安定剤は、生ウイルスの安定化のために長い間使用されてきた（米国特許出願第２００７／０１６１０８５号参照）。しかしながら、動物またはヒト起源のこのような動物またはヒト由来安定剤は、ウイルスまたは非従来型因子の潜在的混入のために潜在的に健康リスクを含む。
このような動物またはヒト由来安定剤は、本発明による液体処方物中のワクシニアウイルスの安定性には必要でなく、従って、本発明による液体処方物は好ましくは、血清またはゼラチンなどの動物またはヒト由来安定を不含である。
好ましい処方物
本発明による処方物の各必須要素または任意選択要素の系列に属す種々の具体的化合物を、上記でこの要素に特に関連する節に記載した。本発明に関して、特定の要素に関する適当な化合物の各リストおよび特定の要素に関して開示されている各具体的化合物は、一般的な他の任意の要素、前記の他の要素に関する適当な化合物のリストまたは前記の他の要素に関して開示されている任意の具体的化合物と組み合わせてもよい。
特に、本発明による処方物の必須要素または任意選択要素の好ましい実施態様は、一般的な他の任意の要素または前記の他の要素の好ましい実施態様と組み合わせてもよい。
本発明による特に好ましい処方物には、以下の表１に記載されている要素を含んでなる、から本質的になる、またはからなる処方物が含まれる。
ＵＶ損傷に対してワクシニアウイルスを安定化させるための薬学上許容可能なキレート剤の使用
ワクシニアウイルスはＵＶ損傷を特に受けやすい（LYTLE et al. J. Virol. 2005, 79(22):14244参照）。
驚くことに、本発明者らは、ＥＤＴＡはワクシニアウイルスに対してＵＶ損傷からの保護効果を有することを見出した（実施例６参照）。よって、本発明はまた、ＵＶ損傷に対してポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）を安定化させるための薬学上許容可能なキレート剤の使用に関する。
ＵＶ損傷に対するポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）の安定化のためには、キレート剤は好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、および２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）から選択され、好ましくは、前記薬学上許容可能なキレート剤はＥＤＴＡである。
ＵＶ損傷に対してポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）を安定化させるために薬学上許容可能なキレート剤を使用する場合、前記ポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）は好ましくは液体組成物中にあり、前記薬学上許容可能なキレート剤（特に、 上述のもの、特に、ＥＤＴＡ）は好ましくは、少なくとも５０μＭ、好ましくは、５０〜１０００μＭ、５０〜７５０μＭ、５０〜５００μＭ、５０〜４００μＭ、５０〜３００μＭ、５０〜２５０μＭ、５０〜２００μＭ、５０〜１５０μＭ；５０〜１００μＭ、５０〜７５μＭ、７５〜１０００μＭ、７５〜７５０μＭ、７５〜５００μＭ、７５〜４００μＭ、７５〜３００μＭ、７５〜２５０μＭ、７５〜２００μＭ、７５〜１５０μＭ；７５〜１００μＭ、１００〜１０００μＭ、１００〜７５０μＭ、１００〜５００μＭ、１００〜４００μＭ、１００〜３００μＭ、１００〜２５０μＭ、１００〜２００μＭ、１００〜１５０μＭ；１５０〜１０００μＭ、１５０〜７５０μＭ、１５０〜５００μＭ、１５０〜４００μＭ、１５０〜３００μＭ、１５０〜２５０μＭ、または１５０〜２００μＭの濃度で存在する。
いっそうより好ましくは、ＵＶ損傷に対してポックスウイルス（特に、ワクシニアウイルス）を安定化させるためには、本発明による液体処方物（上記に開示されている通り）が使用される。
以下の例は単に本発明を説明することを意図する。
実施例１：候補安定化化合物のスクリーニング
液体処方物中、＋５℃でのＭＶＡウイルスを安定化させるための種々の候補化合物の効果は、他の種類のウイルスの安定化効果を有することが従来技術から知られている化合物に基づいて試験した。
材料および方法
ウイルス
以下のＭＶＡウイルスを使用した：
・１〜４ １０８ＰＦＵ／ｍＬの初期目標濃度に希釈したＭＵＣ１腫瘍関連抗原およびインターロイキン２を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＭＵＣ１（ＴＧ４０１０）（ＷＯ９２／０７０００およびＷＯ９５／０９２４１参照）。
・１〜４ １０７ＰＦＵ／ｍＬの初期目標濃度に希釈したＨＣＶ遺伝子型１ｂ株ｊａ由来の非構造ＨＣＶタンパク質（ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５Ｂ）を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＨＣＶ（ＴＧ４０４０）（ＷＯ２００４／１１１０８２参照）。
・０．５〜２ １０８ＰＦＵ／ｍＬの初期目標濃度に希釈したヒト乳頭腫ウイルスＥ６およびＥ７抗原およびインターロイキン２を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＨＰＶ（ＴＧ４００１）（ＷＯ９０／１０４５９、ＷＯ９５／０９２４１、ＷＯ９８／０４７０５、ＷＯ９９／０３８８５、ＷＯ２００７／１２１８９４参照）。
これら３種類のＭＶＡウイルスをニワトリ胚線維芽細胞で生産し、感染したＣＥＦ培養物の回収、機械的手段による(my mechanical means)細胞の破壊、およびプロテアーゼによる処理の工程を含まない種々の精製工程を含んでなる方法により回収および精製した。
ヒト連続細胞株で生産され、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワイス株の組換えワクシニアウイルス（ＶＶワイス）もまた、２ １０８〜２ １０９ＰＦＵ／ｍＬの初期目標力価で使用した。
供試処方物
供試処方物を以下の表２〜１１に示す。
・一価の塩の存在の有益な効果：
・ＥＤＴＡ、ＥｔＯＨまたはＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの存在の有益な効果：
・低濃度のグルタミン酸Ｎａの有益な効果：
・低濃度のスクロースの有益な効果：
・ポリソルベートの有益でない影響および有害でさえある影響：
○ＭＶＡウイルス：
○ＶＶワイス:
・ＭｇＣｌ２の有益でない影響：
○ＭＶＡウイルス：
○ＶＶワイス：
・アルギニンの有益でない影響：
○ＭＶＡウイルス：
○ＶＶワイス：
・アミノ酸混合物の有益でない影響：
・ヒスチジンの有益でない影響：
安定性の分析
安定性は＋３７℃（±２℃）、＋２５℃（±２℃）、および／または＋５℃（±３℃）で分析した（結果の節を参照）。
＋３７℃（±２℃）（加速化安定性試験）で、サンプルを相対湿度７５％に維持し、少なくとも２８日間（７日目と１４日目に中間測定）感染低下を測定することにより安定性を分析した。
＋２５℃（±２℃）（加速化安定性試験）で、サンプルを相対湿度６０％に維持し、少なくとも６か月間（約１か月目と２か月目および３か月目に中間測定）感染低下を測定することにより安定性を分析した。
＋５℃（±３℃）（目標保存温度試験）で、サンプルを相対湿度の制御なく維持し、少なくとも２４か月間（約１か月目と、３、６、１２、１８および２４か月目に中間測定）感染低下を測定することにより安定性を分析した。
感染低下は、測定時のｍＬ当たりの感染ゲノムの数または粒子形成単位（ＩＧ／ｍＬまたはＰＦＵ／ｍＬ）を、０日目のＩＧ初期数／ｍＬまたはＰＦＵ／ｍＬに対して差し引くことにより計算し、常用対数（ｌｏｇ１０（ＩＧ／ｍＬまたはＰＦＵ／ｍＬ））として表し、本明細書ではｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬまたはＰＦＵ／ｍＬ）と略した。
感染力価の測定
所与の時点での感染力価は、ｍＬ当たりの感染ゲノム（ＩＧ）の数（ＩＧ／ｍＬ）を測定することまたはＢＨＫ−２１細胞でのプラークアッセイを使用すること（その後、感染性ワクシニアウイルス力価はｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）（ＰＦＵ／ｍＬ）で表される）のいずれかによって測定され得る。ここでは、ｍＬ当たりの感染ゲノムの数（ＩＧ／ｍＬ）の測定が、この方法がより迅速かつより正確であることから好ましかった。しかしながら、ＢＨＫ−２１細胞でのプラークアッセイを用いた場合に特異なデータが示されるわけではなく、ＢＨＫ−２１細胞でのプラークアッセイを用いてもいくつかの時点で感染力価が測定され、それらの結果は感染ゲノム法を用いて得られた結果と一致することが常に判明したことを記載しておくべきである。
ｍＬ当たりの感染ゲノムの数（ＩＧ／ｍＬ）の測定は次のようにして行う：
・Ｄ日：感染および細胞播種
ウイルスサンプルを、９６ウェル培養プレート（１００μＬ／ウェル）にて、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ培養培地を連続希釈する。
ＢＨＫ−２１細胞を培養培地（ＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ）に採取し、ウイルス希釈液を含有する９６ウェルプレートに１：１００の比率で播種する（１００μＬ／ウェル）。
次に、培養プレートを＋３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間＋／−４時間インキュベートする。
・Ｄ＋１日：感染細胞の溶解
感染２０〜２８時間後に、上清を廃棄し、細胞単層をＰＢＳで２回洗浄する。プロテイナーゼＫを含有する１００μＬの溶解バッファーを各ウェルに加える。このプレートを＋５６°で少なくとも３０分（４２０分まで）インキュベートした後、プロテイナーゼＫを不活化するために＋９５℃で５分間加熱する。
・Ｄ＋１日からＤ＋３０日まで（−２０℃）：ｑＰＣＲ分析
細胞溶解液を水で４９倍希釈し、ワクシニアウイルスゲノムの分泌ケモカイン結合タンパク質（ＳＣＢＰ）領域を標的とする特異的プライマーおよびプローブセットを用いてｑＰＣＲを行う。
試験サンプルの感染ゲノム数（ＩＧ／ｍＬ）は、感染力価（ＰＦＵ／ｍＬ）（標準的プラーク形成単位アッセイを用いて確定）において較正したウイルス標品を用いた平行線検定（ＰＬＡ）法により定量する。
この方法は、感染ゲノム（ＩＧ／ｍＬ）を少なくとも１．１０５ ＩＧ／ｍＬの値で測定することができる。
ＢＨＫ−２１細胞でのプラークアッセイを用いた感染力価の測定は次のようにして行う：
１．細胞の伸展
宿主細胞ＢＨＫ−２１をＤＭＥＭ中、単層として増殖させた。コンフルエント時に細胞を１０ｍＬ ＰＢＳで洗浄した後、トリプシンで処理した。トリプシンを除去した後、細胞を３７℃で１０％ＳＦＶを含む１０ｍＬ ＤＭＥＭに再懸濁させた。
その後、細胞懸濁液をホモジナイズし、マルチウェルプレートに分注した（プレートの６ウェルのそれぞれに２ｍＬ）。次に、前記プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
２．細胞の感染
細胞伸展の約１日後に、工程１のＢＨＫ−２１細胞を含んでなる各ウェルにウイルス懸濁液のアリコートを加えた。必要に応じて、前記懸濁液をまず、当業者に周知の方法に従って、ＰＢＳ、陽イオン１００×および１％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で連続希釈した。場合に応じて、工程１のＢＨＫ−２１細胞に加えたウイルス懸濁液は、凍結乾燥の前の液体ウイルス含有組成物か再構成したウイルス含有組成物（すなわち、凍結乾燥後、種々の時点および温度）かのいずれかであった。
次に、培養培地を除去し、室温で６０分撹拌した後、２ｍＬの感染培地（ＤＭＥＭ＋５％ ＦＣＳ）を各ウェルに分注した。その後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
３．細胞の固定
培地を除去した後、細胞をＰＢＳ（約１ｍＬ／ウェル）で洗浄した。その後、１ｍＬのメタノール／アセトン（５０／５０）溶液を加え、得られた混合物を室温で穏やかに撹拌した。
次に、これらのプレートを室温で放置して乾燥させた。
４．検出および力価決定
ウイルス力価の決定は、周知のペルオキシダーゼ反応に従い、ペルオキシダーゼと組み合わせた抗ワクチン抗体および抗ウサギ抗体を用いて行った。より厳密には、反応前に、抗ワクチン抗体をＰＢＳ＋２％ＦＣＳで１００倍希釈した。その後、５００μＬの前記抗体を各ウェルに加え、３７℃で約３０分間インキュベートした後、１ｍＬ ＰＢＳ＋１％トリトンＸ−１００で３回洗浄した。
ペルオキシダーゼと組み合わせた抗ウサギ抗体との反応も、反応前に前記抗体をＰＢＳ＋２％ＦＣＳで２００倍希釈すること以外は同様に行った。
ＤＡＢ溶液は、１５ｍＬのトリス−ＨＣＬ ０．０５Ｍ中に市販のＤＡＢ錠剤１個を溶かすことにより調製した。次に、得られた溶液を２μｍの濾過装置ＮＡＬＧＥＮＥで濾過し、得られた濾過溶液を１５μＬの３０％Ｈ２Ｏ２水溶液に加えた。ひと度調製されれば、１ｍＬのＤＡＢ溶液を各ウェルに加え、褐色が現れるまで放置した。次に、この有色溶液を取り出し、結果を視覚的に解釈する。
その後、下式：
［ウイルスプラーク数の平均×４］×希釈倍率＝ＰＦＵ数／ｍＬ
を用いて感染力価をＰＦＵ／ｍＬで計算した。
これらの各方法は、１回の決定につき約±０．３０ｌｏｇ１０という同等の変動を有する。しかしながら、両方法の変動は決定回数（すなわち、試験する反復数）を増やすと小さくなる。二重決定（二反復サンプルの使用）の場合では、変動は±０．２５ｌｏｇ１０と予想される。三重決定（三反復サンプルの使用）の場合では、変動は±０．２０ｌｏｇ１０と予想される。総ての例において、ｍＬ当たりの感染ゲノムの数（ＩＧ）（ＩＧ／ｍＬ）を測定する場合には単回の決定を行い、ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）（ＰＦＵ／ｍＬ）の決定は三反復で行った。
結果
一価の塩の必要性
ＭＶＡ−ＭＵＣ１の安定性を、トリス−ＨＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ｐＨ８．０を含有し、かつ、０ｍＭまたは５０ｍＭいずれかのＮａＣｌを含有する処方物（上記表２を参照）中で試験した。
３７℃で７、１４、または２８日後の感染低下を図１に示す。これら２つの供試処方物に極めて安定であるものはなく、結果は、５０ｍＭのＮａＣｌの添加が１４日目（ほぼ２ｌｏｇの低下に対して約１ｌｏｇの低下）および２８日目（６ｌｏｇを越える低下に対して約３ｌｏｇの低下）に安定性を有意に高めることを明らかに示す。
従って、処方物へのＮａＣｌの添加は、安定性を有意に高める。
ＥＤＴＡ、低濃度のＥｔＯＨまたはＥＤＴＡ／ＥｔＯＨの有益な効果
トリス−ＨＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ＮａＣｌを含有するｐＨ７．５の処方物中、＋３７℃および＋５℃でのＭＶＡ−ＨＣＶの安定性に対するＥＤＴＡの影響を、種々の濃度のＥＤＴＡを用いて試験した（表３参照）。結果を図２に示す。
＋３７℃（加速化安定性試験）で、ＥＤＴＡを含有する処方物は総て、７日目および１４日目に１ｌｏｇ未満の感染低下、２８日日目に１．５ｌｏｇ未満の感染低下を示す。著しく対照的に、ＥＤＴＡ不含の処方物（対照ＤＳおよび対照ＤＳ２）は、極めて弱い安定性プロフィールを示した（それぞれ７日目、１４日目および２８日目で約１、２．５および４ｌｏｇの感染低下）。使用したＥＤＴＡの濃度（５０μＭ〜１０００μＭ）は、安定化効果に影響を及ぼすとは思われない。２８日目に、ＥＤＴＡに加えてＥｔＯＨを含有する処方物にはさらなる安定化が見られる（図２参照）。
トリス−ＨＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ＮａＣｌを含有するｐＨ７．５の処方物中、＋３７℃および＋５℃でのＭＶＡ−ＨＣＶの安定性に対するエタノール（ＥｔＯＨ）の影響を、種々の濃度のＥｔＯＨを用いて試験した（表３参照）。結果を図３に示す。
３７℃（加速化安定性試験）で、ＥｔＯＨを含有する処方物は総て、７日目および１４日目に、ＥｔＯＨ不含の対照よりも有意に低い感染低下を示す。加えて、ＥｔＯＨ濃度が低いほど安定化が高いという傾向がいくらか見て取れる。著しく対照的に、ＥｔＯＨ不含の処方物（対照ＤＳおよび対照ＤＳ２）は、安定性プロフィールを示した（それぞれ７日目、１４日目および２８日目で約１、２．５および４ｌｏｇの感染低下）。さらに、ＥｔＯＨに加えてＥＤＴＡを含有する処方物は、ＥｔＯＨのみを含有するものよりも有意に低い感染低下を示す（図３参照）。
従って、ＥＤＴＡおよびＥｔＯＨを用いた基本試験は、両化合物が独立に液体処方物中のＭＶＡ−ＨＣＶの安定性を高め、ＥＤＴＡの安定化効果はＥｔＯＨの安定化効果よりも高いことを示す。さらに、両化合物の組合せは安定性をさらに高める。
種々のＥＤＴＡ（５０〜２５０μＭ）およびＥｔＯＨ（０．５〜２．５％）濃度を含有する処方物（表４参照）中、＋３７℃、２５℃および５℃でのＭＶＡ−ＨＣＶの安定性を確認するためにさらなる実験を行った。結果を図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに示す。総ての供試温度で、総ての処方物に良好な安定性が見られた。特に、ＥＤＴＡおよびＥｔＯＨを含有する総ての処方物で、感染低下は３７℃で２８日後に１ｌｏｇに近く（図４Ａ参照）、＋５℃で１２か月後の感染低下は０．３未満であった。＋５℃で、さらに、ＥＤＴＡおよびＥｔＯＨを含有する処方物のほとんどは、１８か月および２４か月後に０．３ｌｏｇ１０未満の感染低下を示す。対照的に、ＥＤＴＡおよびＥｔＯＨ不含の対照ＤＳおよびＤＳ２処方物の安定性は、特に３７℃および２５℃で極めて急速に低下した（例えば、３７℃で７日目および２５℃で２８日目に約１ｌｏｇの感染低下）。
＋３７℃（７日目および２８日目）および＋５℃（２４か月目）の両方で見られた結果に基づいて最適ＥＤＴＡおよびＥｔＯＨ濃度を定義するため、ＥＤＴＡおよびエタノールの量に応じた処方物の設計空間を定義する実験マトリックスを使用することによる、＋３７℃および＋５℃で得られた結果の別の表示を図４Ｄに示す。この図では、ＥＤＴＡ濃度（μＭ）をｘ軸、ＥｔＯＨ濃度（％）をｙ軸として表す。次に、処方物の望ましさに対する曲線をこの２次元領域に示し、望ましさの値が高いほどより良好な処方物となる。
図４Ｄは、最良の処方物が５０〜１５０μＭのＥＤＴＡおよび０．５〜１％ｖ／ｖのＥｔＯＨで得られることを示す。
この分析に基づけば、１５０μＭのＥＤＴＡおよび０．５％ｖ／ｖのＥｔＯＨを用いた最適処方物が定義された。
低濃度のグルタミン酸ナトリウムの有益な効果
トリス−ＨＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ＮａＣｌを含有するｐＨ７．５の処方物中、＋３７℃および＋２５℃でのＭＶＡ−ＨＣＶの安定性に対するグルタミン酸Ｎａの影響を、０〜１０ｍＭの種々の濃度のグルタミン酸Ｎａの含有または不含で試験した（表５参照）。結果をそれぞれ図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示す。
＋３７℃で、少なくとも５ｍＭのグルタミン酸Ｎａを含有する３種類の処方物は２８日目に１未満の感染低下を示すが、０ｍＭまたは２．５ｍＭのグルタミン酸Ｎａを含有する２種類の処方物は、１より大きいが１に近い感染低下を示す。これは、グルタミン酸Ｎａは高い安定化効果は持たないが、５〜１０ｍＭの間の低濃度のグルタミン酸Ｎａは若干の安定化効果を持ち売ることを示す。加えて、図５Ａは、７．５および１０ｍＭのグルタミン酸Ｎａを含む処方物は５ｍＭのグルタミン酸Ｎａを含む処方物よりもわずかに低い安定性を有することから、最適濃度は５ｍＭ前後であることを示唆する（図５Ａ）。
＋２５℃では、１２か月目の感染低下から、グルタミン酸Ｎａは小さな安定化効果を持ち、約５ｍＭの濃度が最適であることが確認される（図５Ｂ）。
＋５℃では、１２か月〜３０か月の感染低下から、グルタミン酸Ｎａは小さな安定化効果を持ち、約５ｍＭの濃度が最適であることが確認される（図５Ｃ）。
＋５℃で得られた結果は、１２か月での感染低下は非常に小さいのでグルタミン酸Ｎａの有益な効果を証明することは困難であることを示す。実際に、他の化合物、特に、ＥＤＴＡおよびＥｔＯＨが処方物中に存在することは安定化効果を説明し得るが、グルタミン酸Ｎａの小さな効果は、この低温では証明が難しい。しかしながら、これは＋２５および＋３７℃というより高い温度で見られた小さな効果および約５ｍＭの最適濃度を否定するものではない。
低濃度のスクロースの有益な効果
トリス−ＨＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ＮａＣｌを含有するｐＨ８．０の処方物中、＋３７℃でのＭＶＡ−ＭＵＣ１の安定性に対するスクロースの影響を、種々の濃度のスクロースを用いて試験した（表６参照）。結果を図６に示し、スクロース濃度は安定性レベルに有意な影響を及ぼさないことを示す。
ポリソルベート８０またはポリソルベート４０の有益でない影響および有害でさえある影響
トリス−ＨＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ＮａＣｌを含有するｐＨ７．５の処方物中、＋２５℃および＋５℃でのＭＶＡ−ＨＰＶの安定性に対するポリソルベート８０またはポリソルベート４０の影響（表７参照）を、他のウイルスに対して安定化効果を持つことが示されている（EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75、米国特許第７，４５６，００９号、SHI et al. J Pharm Sci. 2005 Jul, 94(7):1538-51、米国特許出願第２００７／０１６１０８５号参照）種々の濃度のポリソルベート８０またはポリソルベート４０を用いて試験した。結果を図７Ａおよび７Ｂに示す。
＋２５℃および＋５℃で、どのポリソルベート濃度もポリソルベート不含の対照処方物に比べて安定性を増強可能でなく、従って、安定化効果は見られない。
これに対して、両温度で、少なくとも０．０２％ｖ／ｖのポリソルベート濃度に関して脱安定化効果が特記でき、これはポリソルベートの使用濃度とともに増大する。＋５℃では、０．００５％ｖ／ｖという極めて低濃度であってもいくらかの脱安定化効果をもたらす。
従って、ポリソルベートは安定化効果を持たず、少なくとも０．０２％ｖ／ｖの濃度はむしろ脱安定化効果を持つと結論づけなければならない。従って、ポリソルベートは好ましくは、ワクシニアウイルスの液体処方物では排除するか、または極めて低濃度での存在とすべきである。
同様に、ヒト連続細胞株で生産され、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワクシニアウイルスワイス株の、トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）を含有する対照処方物中、または１５０μｇ／ｍＬポリソルベート８０をさらに含有する処方物中での安定性を、＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後に試験した。結果は図７Ｃに示し、このワクシニアウイルス株でもまた、ポリソルベートは安定性にプラスの効果を持たないことを明らかに示す。
ＭｇＣｌ ２ の有益でない影響および高濃度では有害でさえある影響
トリス−ＨＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ＮａＣｌを含有するｐＨ８．０の処方物中、１４日間、＋３７℃でのＭＶＡ−ＭＵＣ１の安定性に対するＭｇＣｌ２の影響（表８参照）を、他のウイルスに対して安定化効果を持つことが示されている（EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75および米国特許第７，４５６，００９号参照）種々の濃度のＭｇＣｌ２を用いてまたは用いずに試験した。結果を図８に示し、ＭｇＣｌ２はＭＶＡ安定性に対して有益でない影響を持ち、少なくとも０．５Ｍの濃度でＭＶＡの安定性に対して有害な影響さえ持つことを明らかに示す。
従って、ＭｇＣｌ２は好ましくは、ワクシニアウイルスの液体処方物では排除するか、または低濃度での存在とすべきである。
本発明による最適化処方物はキレート剤（特に、二価陽イオンキレート剤、より好ましくは、ＥＤＴＡ）を含有し、従って、これらはポックスウイルス、より詳しくは、ワクシニアウイルスの安定性に対するＭｇＣｌ２の有益性の低い効果を妨げ得るという理由で、このことはなおさらその通りである。
本発明による処方物におけるＭｇＣｌ２の有害な影響のさらなる証拠は、以下の実施例５に示される（図１６も参照）。
同様に、ヒト連続細胞株で生産され、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワクシニアウイルスワイス株の、トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）を含有する対照処方物中、または１０００ｍＭ（１Ｍ）ＭｇＣｌ２をさらに含有する処方物中での安定性を、＋３７℃で７または１４日後に試験した。結果を図８Ｂに示し、このワクシニアウイルス株についても、ＭｇＣｌ２は安定性にプラスの効果を持たないことを明らかに示す。
アルギニンの有益でない影響およびむしろ有害な影響
トリス−ＨＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ＮａＣｌを含有するｐＨ８．０の処方物中、＋３７℃でのＭＶＡ−ＭＵＣ１の安定性に対するアルギニンの影響（表９参照）を、他のウイルスに対して安定化効果を持つことが示されている（米国特許出願第２００７／０１６１０８５参照）種々の濃度のアルギニンを用いてまたは用いずに試験した。結果を図９に示し、アルギニンはＭＶＡの安定性に対して有益でない影響を持つことを明らかに示す。これに対して、３７℃で２８日後では、アルギニンの存在は、特に高濃度では、むしろ有害である。
従って、アルギニンは好ましくは、ワクシニアウイルスの液体処方物では排除するか、または低濃度での存在とすべきである。
同様に、ヒト連続細胞株で生産され、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワクシニアウイルスワイス株の、トリス−ＨＣｌ ３０ｍＭ、スクロース１０％（ｗ／ｖ）を含有する対照処方物中、または５０ｍＭアルギニンをさらに含有する処方物中での安定性を＋３７℃で７、１４、２１、または２８日後に試験した。結果を図９Ｂに示し、このワクシニアウイルス株についても、アルギニンは安定性にプラスの効果を持たないことを明らかに示す。
アミノ酸混合物の有益でない影響
トリス−ＨＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ＮａＣｌを含有するｐＨ８．０の処方物中、＋３７℃および＋２５℃でのＭＶＡ−ＭＵＣ１の安定性に対するアミノ酸混合物の影響（表１０参照）を、前記アミノ酸混合物を用いてまたは用いずに試験した。結果を図１０に示し、アミノ酸混合物の存在はＭＶＡの安定性に有意な効果を持たないことを明らかに示す。
アミノ酸混合物はワクシニアウイルスの液体処方物中に存在してもよいが、明らかに不可欠ではなく、存在する必要はない。
ヒスチジンの有益でない影響およびむしろ有害な影響
トリス−ＨＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ＮａＣｌを含有するｐＨ７．５の処方物中、＋２５℃および＋５℃でのＭＶＡ−ＨＰＶの安定性に対するヒスチジンの影響を、他のウイルスに対して安定化効果を持つことが示されている濃度（EVANS et al. J Pharm Sci. 2004 Oct, 93(10):2458-75、米国特許第７，４５６，００９号、米国特許出願第２００７／０１６１０８５号、米国特許第７，９１４，９７９号、ＷＯ２０１４／０２９７０２、ＷＯ２０１４／０５３５７１参照）である１０ｍＭのヒスチジンを用いてまたは用いずに試験した（表１１参照）。結果を図１１Ａおよび１１Ｂに示す。
＋２５℃または５℃でヒスチジンの安定化効果は見られなかった。これに対し、両温度で脱安定化効果の傾向が見て取れる。
従って、ヒスチジンは好ましくは、ワクシニアウイルスの液体処方物では排除するか、または極めて低濃度での存在とすべきである。
結論
上記の結果は、以下のことを明らかに示す：
・以下の化合物は液体処方物中でのワクシニアウイルスの安定性に対して有意な有益効果を持つ：
○一価の塩、例えば、ＮａＣｌ。
○低パーセンテージの二糖、例えば、スクロース。このような成分は低温保護性があり、従って、約＋５℃などの低い保存温度でワクシニアウイルスを保護すると考えられる。加えて、このような化合物は液体処方物の粘度を高め、これによりワクシニアウイルスと潜在的に有害な化合物の間の相互作用を制限し得る。
○ＥＤＴＡ、強い安定化効果を有する。
○エタノール、ＥＤＴＡよりは小さいが有意な安定化効果を有する。
○ＥＤＴＡとエタノールの組合せ、この組合せは、各化合物単独に比べてさらなる安定化効果を提供する。
従って、これらの化合物のうち１以上が安定な液体ワクシニアウイルス処方物中に存在してよい。
特に、上記の結果は、スクロース、一価の塩およびＥＤＴＡを含有し、かつ好ましくはエタノールも含有する緩衝液体処方物が特に良好な安定性を示すことを示す。
・以下の化合物は、液体処方物中でのワクシニアウイルスの安定性に有意な有益効果を持たないが、有害な効果も持たない：
○グルタミン酸Ｎａ。この化合物は安定性に不可欠ではなく、低濃度はＭＶＡに対して小さな安定化効果を持ち得る。
○アミノ酸混合物。この化合物は安定性に不可欠ではなく、低濃度はＭＶＡに対して小さな安定化効果を持ち得る。
このような化合物は、本発明による処方物中に存在してもしなくてもよい。
・以下の化合物は、液体処方物中でのワクシニアウイルスの安定性に対して、低濃度で有益な効果を持たず、より高濃度で有害な影響を持ち、従って、好ましくは、安定な液体ワクシニアウイルス中に存在しないか、または極めて低濃度の存在とするべきである：
○界面活性剤、例えば、ポリソルベート。低濃度では効果は見られない。しかしながら、少なくとも０．０２％ｖ／ｖの濃度では、ポリソルベート濃度とともに増大する脱安定化効果が見られる。
○ヒスチジン：１０ｍＭで、弱い脱安定化効果が見られる場合がある。
○ＭｇＣｌ２：０．５または１Ｍ、またはさらには７５ｍＭで（以下の実施例５を参照）、脱安定化効果が見られる。
○アルギニン：少なくとも３０ｍＭの濃度で弱い脱安定化効果が見られ、脱安定効果はアルギニン濃度とともに増大する。
実施例２：ＭＶＡウイルスの安定性に対するｐＨの影響
安定な液体処方物のための好適なｐＨを決定するために、ワクシニアウイルスの安定性に対する液体処方物のｐＨの影響を試験した。
材料および方法
ＭＶＡウイルス
使用したＭＶＡウイルスは、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ株ｊａ由来の非構造ＨＣＶタンパク質（ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５Ｂ）を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＨＣＶ（ＴＧ４０４０）（ＷＯ２００４／１１１０８２参照）であり、初期目標濃度４〜８ １０７ ＩＧ／ｍＬに希釈した。
ＭＶＡ−ＨＣＶは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で生産し、感染したＣＥＦ培養物の回収、機械的手段による細胞の破壊、およびプロテアーゼによる処理の工程を含まない種々の精製工程を含んでなる方法により回収および精製した。
供試処方物
供試処方物を以下の表１２に示す。
安定性の分析
安定性の分析は実施例１に記載のとおりに行った。
感染力価の測定
感染力価の測定は実施例１に記載のとおりに行った。
結果
トリス−ＨＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡおよびエタノールを含有する処方物中、＋３７℃および＋５℃でのＭＶＡ−ＨＣＶの安定性に対するｐＨの影響を種々のｐＨ値で試験した。結果を図１２Ａおよび１２Ｂに示す。
＋３７℃では（図１２Ａ）、７日後にすでに、ｐＨが６を越え９未満の間に含まれることが重要であることが明らかである。特に、ｐＨが７〜８の間に含まれる場合に良好な結果が得られる。
＋５℃でも（図１２Ｂ）、１２か月目の結果から、ｐＨが６を越え９未満の間に含まれることがより良いと示唆される。特に、ｐＨが７〜８の間に含まれる場合に良好な結果が得られる。
結論
上記の結果は、ワクシニアウイルス液体処方物のｐＨは好ましくは６を越え９未満の間に含まれるべきであることを示す。特に、ｐＨが７〜８の間に含まれる場合に良好な結果が得られる。従って、６．５〜８．５の間に含まれるｐＨが許容可能である。
実施例３：安定性に対するＭＶＡウイルス初期力価の影響
次に、液体処方物中でのその後の安定性に対するワクシニアウイルス初期力価の影響も試験した。
材料および方法
ＭＶＡウイルス
使用したＭＶＡウイルスは、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ株ｊａ由来の非構造ＨＣＶタンパク質（ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５Ｂ）を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＨＣＶ（ＴＧ４０４０）（ＷＯ２００４／１１１０８２参照）であり、種々の初期目標濃度：１．０− １０８ＰＦＵ／ｍＬ、５．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬ、１．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬ、および５．０ １０６ＰＦＵ／ｍＬに希釈した。
ＭＶＡ−ＨＣＶは、ニワトリ胚線維芽細胞で生産し、感染したＣＥＦ培養物の回収、機械的手段による細胞の破壊、およびプロテアーゼによる処理の工程を含まない種々の精製工程を含んでなる方法により回収および精製した。
供試処方物
供試処方物を以下の表１３に示す：
安定性の分析
安定性の分析は実施例１に記載のとおりに行った。
感染力価の測定
感染力価の測定は実施例１に記載のとおりに行った。
結果
＋３７℃、＋２５℃および＋５℃、種々の初期力価でのＭＶＡ−ＨＣＶの感染低下の評価をそれぞれ図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃに示す。
＋３７℃では、本発明による総ての処方物の感染力価は７日後に１ｌｏｇ未満であった。しかしながら、初期ＭＶＡ−ＨＣＶ力価が高いほど処方物の安定性が高い傾向が見られ得る。１４日目では、５．０ １０６ＰＦＵ／ｍＬの初期ＭＶＡ−ＨＣＶ力価を含有する処方物を除き、本発明による総ての処方物の感染力価はなお１ｌｏｇ未満であったが、初期ＭＶＡ−ＨＣＶ力価が高いほど処方物の安定性が高い傾向が見られる。この所見は２８日目に確認され、５．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬまたは１．０ １０８ＰＦＵ／ｍＬの初期ＭＶＡ−ＨＣＶ力価を含有する本発明による処方物だけが１ｌｏｇ未満の感染低下を示した（図１３Ａ）。
同様の所見が＋２５℃でも得られる（図１３Ｂ）。しかしながら、ＭＶＡ−ＨＣＶ初期力価に応じた本発明による処方物の安定性の差異はむしろ、少なくとも１．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬの３つの処方物（７か月目に１ｌｏｇ未満の感染力価低下を示す）とよび１．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬ未満の唯一の処方物（５．０ １０６ＰＦＵ／ｍＬ、１ｌｏｇを越える感染力価低下を示し、７か月目に、３か月目にすでにほとんど１ｌｏｇの感染力価低下を示す）の、２つのサブファミリーを区別する。
＋５℃では、ＭＶＡ−ＨＣＶ初期力価に応じた本発明による処方物の安定性の差異は、２５℃の場合と同じ、少なくとも１．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬの３つの処方物（１８か月目に０．２ｌｏｇ未満の感染力価低下を示す）と１．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬ未満の唯一の処方物（５．０ １０６ＰＦＵ／ｍＬ、１２か月目にすでに０．５ｌｏｇを越え、２か月目にすでにｏｆ ０．３ｌｏｇの画定限界を越える感染力価低下を示す）の、２つのサブファミリーを区別する（図１３Ｃ）。
結論
上記の結果から、ＭＶＡの液体処方物の保証安定性には少なくとも１．０ １０７ＰＦＵ／ｍＬの初期力価が極めて好ましいと思われる。
実施例４：種々のワクシニアウイルス株の安定性
これまでの実施例で定義された最適化処方物の安定性を確認するために、このような最適化処方物を、２つの異なる実験で種々のワクシニアウイルス株に対して試験した。
材料および方法
ウイルス
以下のワクシニアウイルスを使用した：
・実験１：
○ＭＵＣ１腫瘍関連抗原およびインターロイキン２を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＭＵＣ１（ＴＧ４０１０）（ＷＯ９２／０７０００およびＷＯ９５／０９２４１参照）、５〜８ １０８ ＩＧ／ｍＬの初期目標濃度に希釈した。
○ＨＣＶ 遺伝子型１ｂ株ｊａ由来の非構造ＨＣＶタンパク質（ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５Ｂ）を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＨＣＶ（ＴＧ４０４０）（ＷＯ２００４／１１１０８２参照）、４〜６ １０７ ＩＧ／ｍＬの初期目標濃度に希釈した。
○ヒト乳頭腫ウイルスＥ６およびＥ７抗原ならびにインターロイキン２を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＨＰＶ（ＴＧ４００１）（ＷＯ９０／１０４５９、ＷＯ９５／０９２４１、ＷＯ９８／０４７０５、ＷＯ９９／０３８８５、ＷＯ２００７／１２１８９４参照）、２〜３ １０８ ＩＧ／ｍＬの初期目標濃度に希釈した。
これら３種類のＭＶＡウイルスは、ニワトリ胚線維芽細胞で生産し、感染したＣＥＦ培養物の回収、機械的手段による細胞の破壊、およびプロテアーゼによる処理の工程を含まない種々の精製工程を含んでなる方法により回収および精製した。
・実験２：
○以下：
・ニワトリ胚細胞（ＭＶＡ−ＨＣＶ／ＣＥＣ）（初期目標力価２．５〜３ １０７ ＩＧ／ｍＬ）、または
・不死化カモ胚細胞株（ＭＶＡ−ＨＣＶ／カモ細胞株）（初期目標力価３〜４ １０７ ＩＧ／ｍＬ）
で生産した、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ株ｊａ由来の非構造ＨＣＶタンパク質（ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５Ｂ）を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＨＣＶ（ＴＧ４０４０）（ＷＯ２００４／１１１０８２参照）、
○ニワトリ胚細胞（ＭＶＡ−ＦＣＵ１／ＣＥＣ）で生産された、シトシンデアミナーゼ活性１を有する融合タンパク質を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＦＣＵ１（ＴＧ４０２３）（ＷＯ９９／５４４８１参照）（初期目標力価１〜１．５ １０８ ＩＧ／ｍＬ）、
○ニワトリ胚細胞で生産された、シトシンデアミナーゼ活性を有するＦＣＵ１融合タンパク質を発現し、かつ、欠陥型Ｉ４Ｌ遺伝子および欠陥型Ｊ２Ｒ遺伝子を含んでなる組換えワクシニアウイルスコペンハーゲン株であるコペンハーゲン−ＦＣＵ１（ＴＧ６００２）（ＷＯ２００９／０６５５４６およびＷＯ２００９／０６５５４７参照）（コペンハーゲン−ＦＣＵ１／ＣＥＣ）（初期目標力価２〜３．０ １０８ ＩＧ／ｍＬ）。
ＭＶＡ−ＨＣＶ／ＣＥＣ、ＭＶＡ−ＨＣＶ／カモ細胞株、ＭＶＡ−ＦＣＵ１／ＣＥＣ、およびコペンハーゲン−ＦＣＵ１／ＣＥＣウイルスの生産／精製に使用した方法は、プロテアーゼ酵素の添加を含む工程を含まなかった。
・実験３：
○ヒト連続細胞株で生産され、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製されたワイス株の組換えワクシニアウイルス（ＶＶワイス）も初期目標力価５〜８ １０８ＰＦＵ／ｍＬで使用した。
供試処方物
実験１：
ＭＶＡウイルスに対する供試処方物を以下の表１４に示す：
実験２：
ＭＶＡ−ＨＣＶ／ＣＥＣ、ＭＶＡ−ＨＣＶ／カモ細胞株、ＭＶＡ−ＦＣＵ１／ＣＥＣ、およびコペンハーゲン−ＦＣＵ１／ＣＥＣウイルスに対する供試処方物を以下の表１５Ａに示す：
実験３：
ＶＶワイスウイルスに対する供試処方物を以下の表１５Ｂに示す：
安定性の分析
安定性の分析は実施例１に記載のとおりに行った。
感染力価の測定
感染力価の測定は実施例１に記載のとおりに行った。
結果
実験１：
＋３７℃、＋２５℃および＋５℃、本発明の最適化処方物中での３種類のＭＶＡウイルスの安定性をそれぞれ図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃに示す。
＋３７℃では、３種類のＭＶＡベクターは総て、２８日目に１ｌｏｇ未満の感染力価低下を示し、従って、この高い温度で極めて良好な安定性を示す。
＋２５℃でも、３種類のＭＶＡベクターは総て、６か月目に１ｌｏｇ未満の感染力価低下を示し、従って、この温度で極めて良好な安定性を示す。
最後に、また、３種類のＭＶＡベクターは総て、＋５℃で３０か月後に０．３ｌｏｇ未満の感染力価低下を示し、従って、この目標保存温度で極めて高い安定性を示す。
使用したＭＶＡベクターによっていくらかの軽微な変動が見られる場合があるが、上記の結果は、以上の実施例で設計された最適化処方物は、いずれの異種配列がそれに挿入されるかによらず、いずれのＭＶＡベクターにも適用可能であることを明らかに示す。
実験２：
この第２の実験では、ＭＶＡに対してこれまでに指摘かされた同じ処方物を、種々の方法により得た数種のＭＶＡウイルス、および別のワクシニアウイルス株：コペンハーゲン（ベクターＴＧ６００２）に対して試験した。
結果を図１５Ａに示し、ＭＶＡウイルスに対して最適化された本発明による供試処方物はまた、コペンハーゲンなどの他のワクシニアウイルス株の安定化も可能とすることを示す。特に、総ての供試ウイルスで１４日目に１ｌｏｇ未満の低下が見られる。
安定化が低いウイルスはＭＶＡ−ＨＣＶ／ＣＥＣである。これはこのウイルスが最低の初期力価で使用されたウイルスであるという事実により説明できる。
実験３：
この第３の実験では、ＭＶＡに対して従前に最適化された同じ処方物を、ヒト連続細胞株で生産され、少なくとも１種類のプロテアーゼで処理する少なくとも１つの工程を含む方法により精製された別のワクシニアウイルス株（ワイス株）に対して試験した。
結果を図１５Ｂに示し、ＭＶＡウイルスに対して最適化された本発明による供試処方物はまた、ウイルス環境中にいくらかのプロテアーゼが潜在的に残留しているにも関わらず、ワイスワクシニアウイルス株の安定化を可能とすることを示す。特に、２８日目に１ｌｏｇ未満の低下が見られる。
また、いくらかの残留プロテアーゼを含有し得るウイルス環境に関して、一価の塩（ＮａＣｌ）を２００ｍＭから５００ｍＭに増やすとウイルスの安定性がさらに増すことも注記しておくべきであろう。
結論
上記の結果は、本発明者らにより設計された最適化処方物が種々のワクシニアウイルス株に適用可能であること、およびこのようなウイルスに挿入され得る異種構築物は本発明による最適化処方物より提供される安定化に有意な影響を及ぼさないことを明らかに実証する。
上記の結果はまた、本発明者らにより設計された最適化処方物は、精製プロセスが少なくとも１種類のプロテアーゼによる処理を含む場合、従って、ウイルス環境が残留プロテアーゼを含有し得る場合であっても適用可能であることを示す。この特定の場合では、処方物の一価の塩濃度を２００ｍＭを越えて増やすと安定性がさらに改善される。
実施例５：好ましい化合物の、同じ系列または他の系列の化合物による置き換え
これまでに試験した個々の化合物が同じ系列または他の系列の他の化合物に置き換え可能であるかどうかを確認するために、従前に供試した最適化処方物の個々の化合物のそれぞれを同じ系列または他の系列の化合物に置き換える実験を行った：
・バッファー：従前に供試したトリス−ＨＣｌバッファーを、同じ２０ｍＭ濃度のトリシンまたはＨＥＰＥＳバッファーに置き換えた。両置換バッファーもｐＨ７〜ｐＨ８の間で緩衝能を有する。
・塩：従前に供試した一価の塩ＮａＣｌ、を同じ７５ｍＭ濃度の別の一価の塩（ＫＣｌ）または二価の塩（ＭｇＣｌ２）のいずれかに置き換えた。
・二糖または糖アルコール：従前に供試した二糖スクロースを、同じ１０％ｗ／ｖ濃度の別の二糖（トレハロース）または糖アルコール（マンニトール）のいずれかに置き換えた。
・キレート剤：従前に供試したキレート剤ＥＤＴＡを、同じ１５０μＭ濃度の２種類の他のキレート剤ＥＧＴＡまたはＤＴＰＡに置き換えた。
・Ｃ２−Ｃ３アルコール：従前に供試したＣ２−Ｃ３アルコールエタノールを、同じ０．５％濃度のイソプロパノールに置き換えた。
材料および方法
ウイルス
使用したＭＶＡウイルスは、ＭＵＣ１腫瘍関連抗原およびインターロイキン２を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＭＵＣ１（ＴＧ４０１０）（ＷＯ９２／０７０００およびＷＯ９５／０９２４１参照）であり、８．０ １０７〜２ １０８ＩＧ／ｍＬの間の初期目標力価に希釈した。
ＭＶＡ−ＭＵＣ１は、ニワトリ胚線維芽細胞で生産し、感染したＣＥＦ培養物の回収、機械的手段による細胞の破壊、およびプロテアーゼによる処理の工程を含まない種々の精製工程を含んでなる方法により回収および精製した。
供試処方物
供試処方物を以下の表１６に示す：
安定性の分析
安定性の分析は実施例１に記載のとおりに行った。
感染力価の測定
感染力価の測定は実施例１に記載のとおりに行った。
結果
＋３７℃での種々の供試処方物の感染低下を図１６Ａに示す。
最初に試験した化合物を上述の他の化合物の１つに置き換えることの統計的有意性を、＋３７℃で２１日後（図１６Ｂ）または２８日後（図１６Ｃ）にＮｅｍｒｏｄＷ（登録商標）ソフトウエアを用いて分析した。結果は次のことを示す：
・バッファー：２１日目では、トリス−ＨＣｌをトリシンまたはＨＥＰＥＳバッファーに置き換えても、ＭＶＡウイルスの安定性に有意に影響を及ぼさないが、トリス−ＨＣｌはＭＶＡ−ＭＵＣ１の安定化にやや良好であると思われる。２８日目では、トリス−ＨＣｌをトリシンに置き換えてもＭＶＡウイルスの安定性に有意に影響を及ぼさないが、トリス−ＨＣｌの方がやや良好であると思われ、ＨＥＰＥＳバッファーはトリス−ＨＣｌおよびトリシンより効果が低い。
・塩：ＮａＣｌをＫＣｌに置き換えても、２１日後または２８日後にＭＶＡウイルスの安定性に有意に影響を及ぼさない。これに対し、ＮａＣｌまたはＫＣｌをＭｇＣｌ２に置き換えることは、２１日目と２８日目の両方でＭＶＡの安定性に有意に有害な効果を持ち、ＭｇＣｌ２は７５ｍＭといった低濃度で有害であり得ることがさらに確認される。
・二糖または糖アルコール：スクロースをマンニトールに置き換えても、ＭＶＡウイルスの安定性に有意に影響を及ぼさない。スクロースをトレハロースに置き換えると、ＭＶＡの安定性の改善に向かう小さな効果が２１日目および２８日目に認められる。
・キレート剤：ＥＤＴＡをＤＴＰＡまたはＥＧＴＡに置き換えても、２１日目および２８日目にＭＶＡウイルスの安定性に有意に影響を及ぼさない。
・Ｃ２−Ｃ３アルコール：エタノール（ＥｔＯＨ）をイソプロパノールに置き換えても、２１日目および２８日目にＭＶＡウイルスの安定性に有意に影響を及ぼさない。
＋５℃での種々の供試処方物の感染低下を図１６Ｄに示す。結果は、１８０日目に、総ての供試処方物が極めて低い感染低下を示し、総て０．３ｌｏｇ１０を下回ることを示す。
結論
上記の結果は、本発明による最適化処方物では、最初に試験した化合物は、ワクシニアウイルスの安定性を有意に変更することなく同じ系列の他の化合物に置換され得る（トリス−ＨＣｌをｐＨ７〜８の間で緩衝能を有する別のバッファーに、ＮａＣｌを別の一価の塩に、スクロースを別の二糖または糖アルコールに、ＥＤＴＡを別のキレート剤に、ＥｔＯＨを別のＣ２−Ｃ３アルコールに）ことを明らかに証明する。
これに対し、ＮａＣｌまたは別の一価の塩は二価の塩に置き換えるべきではなく、従って、かなりの濃度（ここでは７５ｍＭ）で存在する場合に二価の塩の有害な影響を示す従前の結果が確認される。
実施例６：本発明による安定な液体ＭＶＡ処方物のｉｎ ｖｉｖｏにおける免疫特性
本発明による安定化液体ＭＶＡ処方物が、１２か月保存後に得られたばかりのＭＶＡ処方物と同等のｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性を持っていたかどうかをさらに確認した。
材料および方法
ＭＶＡウイルス
使用したＭＶＡウイルスは、ＭＵＣ１腫瘍関連抗原およびインターロイキン２を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＭＵＣ１（ＴＧ４０１０）（ＷＯ９２／０７０００およびＷＯ９５／０９２４１参照）であり、１〜３ １０８ＰＦＵ／ｍＬの初期目標力価に希釈した。
ＭＶＡ−ＭＵＣ１は、ニワトリ胚線維芽細胞で生産し、感染したＣＥＦ培養物の回収、機械的手段による細胞の破壊、およびプロテアーゼによる処理の工程を含まない種々の精製工程を含んでなる方法により回収および精製した。
供試処方物および保存
ＭＶＡ−ＭＵＣ１を、トリス−ＨＣｌ ２０ｍＭ、スクロース１０％ｗ／ｖ、ＮａＣｌ ７５ｍＭ、ＥＤＴＡ １５０μＭ、ＥｔＯＨ ０；５％ｖ／ｖ、およびグルタミン酸Ｎａ ５ｍＭを含有する液体処方物中に処方した。
免疫原性試験については、−８０℃で保存した処方したばかりのＭＶＡ（Ｔ＝０）、または＋５℃±３℃で１２か月間保存した処方ＭＶＡ（Ｔ＝１２か月）のいずれかを使用した。
免疫原性試験
使用したモデルは、ＭＵＣ１抗原を発現する腫瘍細胞をさらに投与する前にＭＶＡ−ＭＵＣ１ベクターがマウスに注入されるという、予防モデルである。さらなる詳細を以下に示す：
第１の実験：
・マウス：Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した。各群は２０個体の動物から構成された：
○群１：処方物単独、
○群２〜４：ＭＶＡ−ＭＵＣ１ Ｔ＝０（１０４、１０５、または１０６ＰＦＵ）、
○群５〜７：ＭＶＡ−ＭＵＣ１ Ｔ＝１２か月（１０４、１０５、または１０６ＰＦＵ）。
・試験する生成物の投与：各条件につき（Ｔ＝０／Ｔ＝１２か月）、各生成物を１週間間隔で３回（Ｄ０／Ｄ７／Ｄ１４）皮下注射した。各生成物につき、３種類の用量（１０４、１０５、または１０６ＰＦＵ）を試験した。加えて、陰性対照として、処方物単独（ＭＶＡ−ＭＵＣ１ウイルス不含）を同じプロトコールで投与した。
・腫瘍細胞の投与：ウイルス／処方物の最後の注射から１週間後、すなわち、２１日目（Ｄ２１）に、ＲＭＡ−ＭＵＣ１細胞を皮下注射した。
・マウスの生存、腫瘍の存在および大きさを１０７日目（Ｄ１０７）までまたは腫瘍体積が２０００ｍｍ３となるまでモニタリングし、この時点でマウスを犠牲にした）。
第２の実験：
Ｔ＝０およびＴ＝２４か月、１０４ＰＦＵの用量に関して、処方物単独または処方物中のＭＶＡ−ＭＵＣ１の免疫原性を比較するために同じモデルを使用した。
結果
第１の実験：
以下の表１７Ａは生成物（０または１２か月保存後の処方物単独またはＭＶＡ−ＭＵＣ１）および注射用量に応じた、８６日目に腫瘍不含であったマウスのパーセンテージを表す。
上記の結果は次のことを示す：
・供試した液体処方物は、そのままでは、ＲＭＡ−ＭＵＣ１腫瘍細胞からマウスを保護する免疫応答を誘導しない、および
・供試処方物中、ＭＶＡ−ＭＵＣ１の＋５℃±３℃で１２か月の保存は、ＲＭＡ−ＭＵＣ１腫瘍細胞からマウスを保護する免疫応答を誘導するＭＶＡ−ＭＵＣ１の能力に有意に影響を及ぼさない。
第２の実験：
以下の表１７Ｂは、生成物（０または２４か月保存後の処方物単独またはＭＶＡ−ＭＵＣ１）に応じた、６５日目に腫瘍不含であったマウスのパーセンテージを表す。
上記の結果は次のことを示す：
・供試した液体処方物は、そのままでは、ＲＭＡ−ＭＵＣ１腫瘍細胞投与からマウスを保護する免疫応答を誘導しない、および
・供試処方物中、ＭＶＡ−ＭＵＣ１の＋５℃±３℃で２４か月の保存は、ＲＭＡ−ＭＵＣ１腫瘍細胞投与からマウスを保護する免疫応答を誘導するＭＶＡ−ＭＵＣ１の能力に有意に影響を及ぼさない。
結論
上記のデータから、本発明による最適化処方物は２年の保存中に感染性ウイルス力価を維持するだけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏで防御免疫応答を誘導する能力も維持することが確認される。
実施例７：ＵＶ損傷からのＥＤＴＡの保護効果
ワクシニアウイルスは、ＵＶ損傷を受けやすいことが知られている（LYTLE et al. J. Virol. 2005, 79(22):14244参照）。ＵＶ損傷からワクシニアウイルスを保護する種々の処方物の能力を２種類の独立した実験で調べた。
材料および方法
ＭＶＡウイルス
使用したＭＶＡウイルスは、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ株ｊａ由来の非構造ＨＣＶタンパク質（ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５Ｂ）を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＨＣＶ（ＴＧ４０４０）（ＷＯ２００４／１１１０８２参照）であり、実験１では５ １０７〜７ １０７ＩＧ／ｍＬの間、実験２では３ １０８〜５ １０８ＩＧ／ｍＬの間の初期目標力価に希釈した。
ＭＶＡ−ＨＣＶは、ニワトリ胚線維芽細胞で生産し、感染したＣＥＦ培養物の回収、機械的手段による細胞の破壊、およびプロテアーゼによる処理の工程を含まない種々の精製工程を含んでなる方法により回収および精製した。
供試処方物
実験１のＭＶＡ−ＨＣＶに対する供試処方物を以下の表１８に示す：
実験２のＭＶＡ−ＨＣＶに対する供試処方物を以下の表１９に示す：
光条件
サンプルを以下の光条件で保存した：
・光無し、
・室温、ＰＳＭ下（可視出力と紫外（ＵＶ）出力を組み合わせた人工日光蛍光灯、キセノン灯、またはメタルハリド灯などの、Ｄ６５／ＩＤ６５放射基準と同様の出力を作り出すように設計された任意の光源。Ｄ６５は、ＩＳＯ １０９７７（１９９３）に定義される屋外日光として国際的に認知されている基準である。ＩＤ６５は、等価な屋内間接的日光基準である。３２０ｎｍより下方域の有意な放射線を発する光源としては、そのような放射線を発するように適当なフィルターを取り付ければよい）、または
・ＩＣＨ光下（３２０ｎｍ〜４００ｎｍのスペクトル分布を有し、最大エネルギー放射が３５０ｎｍ〜３７０ｎｍの間である近ＵＶ蛍光灯；有意な割合のＵＶが３２０〜３６０ｎｍおよび３６０〜４００ｎｍの両バンド内になければならない。ＩＣＨ Ｑ１Ｂ Ｐｈｏｔｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ参照）。
安定性の分析
安定性は２８日間、＋２５℃（±２℃）で分析した。
感染低下は、測定時のｍＬ当たりの感染ゲノムの数（ＩＧ／ｍＬ）を、０日目のＩＧ初期数／ｍＬに対して差し引くことにより計算し、常用対数（ｌｏｇ１０（ＩＧ／ｍＬ））として表し、本明細書ではｌｏｇ（ＩＧ／ｍＬ）と略した。
感染力価の測定
感染力価の測定は実施例１に記載のとおりに行った。
結果
実験１および２に関する結果をそれぞれ図１７Ａおよび１７Ｂに示す。
図１７Ａでは、対照および本発明による最適化処方物の安定性に対する種々の光条件（光無し、ＰＳＭ、またはＩＣＨ）の効果を試験した。総ての処方物について、ＩＣＨ光条件は有意な脱安定化をもたらし、これはワクシニアウイルスの光感受性およびＩＣＨ条件の極めて強い照明を知れば驚くことではない。しかしながら、総ての処方物の脱安定化にもかかわらず、図１７Ａから、本発明による液体処方物を用いれば、ＭＶＡ−ＨＣＶの脱安定化の低下が生じることが明らかである（特に２、３および７日目の感染低下を参照）。これらの劇的な光条件下で、対照処方物で見られた感染力価低下は増幅され、２日目に１ｌｏｇに達したことを注記しておかなければならない。
加えて、より妥当な光条件（ＰＳＭ条件）の場合には、本発明による液体処方物を用いれば、ここでもＭＶＡ−ＨＣＶの脱安定化の有意な低下がもたらされ、対照処方物では２５℃で２１日後に１ｌｏｇを越えるところ、＋２５℃で２８日後の感染低下はおおむね０．５ｌｏｇ未満である。
図１７Ｂでは、種々の処方物のＩＣＨ光条件下での安定化効果を試験した。図１７Ａと同様に、トリス−ＨＣｌ、ＮａＣｌ、グルタミン酸Ｎａ、スクロース、ＥＤＴＡおよびＥｔＯＨを含有する最適化処方物は、ＥＤＴＡおよびＥｔＯＨ不含の対照処方物よりも良好にＩＣＨ光条件下で安定性を改善する。加えて、図１７Ｂは、ＥＤＴＡを含有するがＥｔＯＨは含有しない処方物は同等の安定化効果を有するが、ＥｔＯＨを含有するがＥＤＴＡは含有しない処方物は対照処方物よりも良いとは言えないことから、安定化効果がＥＤＴＡによるものであることを示す。
結論
上記の結果は、本発明による処方物は光の不在下でワクシニアウイルスを安定化させるだけでなく、さらにＵＶ損傷による分解からワクシニアウイルスを保護することを明らかに示す。これは液体処方物中でのワクシニアウイルスの保存時の制約の限定に非常に役立ち得る。
実施例８：種々の成分濃度での特許請求処方物のロバストな安定化効果
本発明による処方物の安定化効果のロバストネスを調べるために、種々の濃度の異なる成分を含有する数種の処方物を、ＭＶＡベクターを安定化させるそれらの能力に関して試験した。
材料および方法
ウイルス
使用したＭＶＡウイルスは、ＭＵＣ１腫瘍関連抗原およびインターロイキン２を発現する組換えＭＶＡウイルスであるＭＶＡ−ＭＵＣ１（ＴＧ４０１０）（ＷＯ９２／０７０００およびＷＯ９５／０９２４１参照）であり、１〜４ １０８ＰＦＵ／ｍＬの初期目標力価に希釈した。
ＭＶＡ−ＭＵＣ１は、ニワトリ胚線維芽細胞で生産し、感染したＣＥＦ培養物の回収、機械的手段による細胞の破壊、およびプロテアーゼによる処理の工程を含まない種々の精製工程を含んでなる方法により回収および精製した。
供試処方物
供試処方物を以下の表２０に示す：
安定性の分析
安定性の分析は実施例１に記載のとおりに行った。
感染力価の測定
感染力価の測定は実施例１に記載のとおりに行った。
結果
＋３７℃での種々の供試処方物の感染低下を図１８に示す。
処方後２１日目に、総ての供試処方物１ｌｏｇ１０を下回る感染低下を有した。２８日目でも、ほとんどの供試処方物が１ｌｏｇ１０を下回る感染低下を有した。
結論
上記のデータから、最適化本発明による処方物は、処方物中に含まれる成分の一定範囲の濃度にわたってロバストな安定化効果を有することが確認される。
実施例９： 別の種類のポックスウイルスに対する特許請求処方物の安定化効果
材料および方法
ウイルス
非組換え偽牛痘ウイルス（パラポックスウイルス科）を１〜３ １０８ＰＦＵ／ｍＬの初期目標力価で使用した。
供試処方物
供試処方物を以下の表２１に示す：
安定性の分析
安定性の分析は３７℃で実施例１に記載のとおりに行った。
感染力価の測定
感染力価の測定は実施例１に記載のとおりに行った。
結果
結果を図１９に示し、本発明による供試処方物は偽牛痘ウイルスを大幅に安定化させることを示す。特に、トリスおよびスクロース単独中の対照偽牛痘ウイルスでは、３７℃で２８日後の感染低下が２．５ｌｏｇ１０を越え、処方の偽牛痘ウイルスでは、３７℃で２８日後の感染低下がわずか約０．５ｌｏｇ１０である。
結論
上記の結果は、本発明による処方物がパラポックスウイルス科のポックスウイルスである偽牛痘ウイルスを安定化させるためにも好適であることを明らかに示す。
参照文献

Claims (27)

  1. ａ）ポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルス、
    ｂ）薬学上許容可能なバッファー、
    ｃ）一価の塩、
    ｄ）薬学上許容可能な二糖または糖アルコール、および
    ｅ）薬学上許容可能なキレート剤
    を含んでなり、そのｐＨが６．５〜８．５である、液体処方物。
  2. 界面活性剤を含まないか、または０．００５％（ｗ／ｖ）未満の濃度の界面活性剤を含む、請求項１に記載の液体処方物。
  3. 二価の塩を含まないか、または１ｍＭ未満の濃度の二価の塩を含む、請求項１に記載の液体処方物。
  4. ヒスチジンを含まないか、または５ｍＭ未満の濃度のヒスチジンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体処方物。
  5. アルギニンおよびメチオニンを含まないか、または３００ｍＭ未満の濃度のアルギニンおよび／または６０ｍＭ未満の濃度のメチオニンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体処方物。
  6. 前記ポックスウイルスが少なくとも１０７ＰＦＵ／ｍＬの力価で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体処方物。
  7. 前記ポックスウイルスが少なくとも半精製され、含まれる宿主細胞タンパク質が５００μｇ未満／用量であり、含まれる宿主細胞ＤＮＡが１０ｎｇ未満／用量である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の液体処方物。
  8. 前記薬学上許容可能なバッファーがｐＨ７〜ｐＨ８の間で緩衝能を有し、１０〜５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の液体処方物。
  9. 前記薬学上許容可能なバッファーがｐＨ７〜ｐＨ８の間で緩衝能を有し、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｎａ２ＨＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４の混合物またはＮａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４の混合物を含んでなるリン酸バッファー、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＩＳ−トリス−プロパン、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、およびトリシンバッファーから選択され、好ましくは、ｐＨ７〜ｐＨ８の間で緩衝能を有する前記薬学上許容可能なバッファーがＴＲＩＳ−ＨＣｌバッファーである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の液体処方物。
  10. 前記一価の塩が１０〜１０００ｍＭの濃度で存在する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の液体処方物。
  11. 前記一価の塩がＮａＣｌおよびＫＣｌから選択され、好ましくは、前記一価の塩がＮａＣｌである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の液体処方物。
  12. 前記薬学上許容可能な二糖または糖アルコールが５〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは５〜１５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約１０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の液体処方物。
  13. 前記薬学上許容可能な二糖または糖アルコールがスクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、およびソルビトールから選択され、好ましくは、前記薬学上許容可能な二糖または糖アルコールがスクロースである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の液体処方物。
  14. 前記薬学上許容可能なキレート剤が少なくとも５０μＭ、好ましくは５０〜２５０μＭの濃度で存在する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の液体処方物。
  15. 前記薬学上許容可能なキレート剤がエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、および２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）から選択され、好ましくは、前記薬学上許容可能なキレート剤がＥＤＴＡである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の液体処方物。
  16. ０．０５〜５％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．１〜２％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約０．５％（ｖ／ｖ）の濃度のＣ２−Ｃ３アルコールをさらに含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の液体処方物。
  17. 前記Ｃ２−Ｃ３アルコールがエタノールおよびイソプロパノールから選択され、好ましくは、前記Ｃ２−Ｃ３アルコールがエタノールである、請求項１６に記載の液体処方物。
  18. １０ｍＭ未満の濃度、好ましくは２．５〜７．５ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭの濃度のグルタミン酸ナトリウムをさらに含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の液体処方物。
  19. 前記液体処方物中の感染性ポックスウイルス力価の低下が、＋３７℃で少なくとも１週間の保存中に感染性ウイルス１ｌｏｇ１０未満である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の液体処方物。
  20. 前記液体処方物中の感染性ポックスウイルス力価の低下が、＋５℃で少なくとも１２か月の保存中に感染性ウイルス０．３ｌｏｇ１０未満である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の液体処方物。
  21. 前記ポックスウイルスがオルソポックスウイルスまたはパラポックスウイルスである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の液体処方物。
  22. 前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであり、好ましくは、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）株、ワイス株、およびコペンハーゲン株から選択される、請求項２１に記載の液体処方物。
  23. 前記ワクシニアウイルスが、
    ・直接的または間接的細胞傷害機能を有する分子をコードする外因性配列、特に、シトシンデアミナーゼ（ＣＤａｓｅ）遺伝子などの自殺遺伝子、
    ・腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、特に、ＭＵＣ１、および場合により、サイトカイン、特に、インターロイキン２（ＩＬ−２）をコードする外因性配列、
    ・ウイルス抗原、特に、ヒト乳頭腫ウイルス抗原、Ｂ型肝炎抗原、Ｃ型肝炎抗原をコードする外因性配列、ならびに
    ・細菌抗原、特に、マイコバクテリア抗原をコードする外因性配列
    から選択される少なくとも１つの外因性配列を含んでなる組換えワクシニアウイルスである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の液体処方物。
  24. ＵＶ損傷に対してポックスウイルスを安定化させるための、薬学上許容可能なキレート剤の使用。
  25. 前記薬学上許容可能なキレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、および２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）から選択され、好ましくは、前記薬学上許容可能なキレート剤がＥＤＴＡである、請求項２４に記載の使用。
  26. 前記ポックスウイルスが液体組成物中にあり、前記薬学上許容可能なキレート剤が少なくとも５０μＭ、好ましくは５０〜２５０μＭの濃度で存在する、請求項２４または２５に記載の使用。
  27. 前記ポックスウイルスが請求項１〜２３のいずれか一項に記載の液体組成物中にある、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の使用。
JP2017529010A 2014-12-01 2015-12-01 安定な液体ワクシニアウイルス処方物 Active JP6655618B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14306930 2014-12-01
EP14306930.0 2014-12-01
PCT/EP2015/078239 WO2016087457A1 (en) 2014-12-01 2015-12-01 Stable liquid vaccinia virus formulations

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2017537910A true JP2017537910A (ja) 2017-12-21
JP2017537910A5 JP2017537910A5 (ja) 2019-01-17
JP6655618B2 JP6655618B2 (ja) 2020-02-26

Family

ID=52002884

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017529010A Active JP6655618B2 (ja) 2014-12-01 2015-12-01 安定な液体ワクシニアウイルス処方物

Country Status (13)

Country Link
US (1) US10517943B2 (ja)
EP (1) EP3226894B1 (ja)
JP (1) JP6655618B2 (ja)
KR (1) KR102507483B1 (ja)
CN (1) CN107206063B (ja)
AU (1) AU2015357225B2 (ja)
DK (1) DK3226894T3 (ja)
ES (1) ES2753364T3 (ja)
IL (1) IL252512B (ja)
MX (1) MX378901B (ja)
RU (1) RU2704485C2 (ja)
WO (1) WO2016087457A1 (ja)
ZA (1) ZA201703534B (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020519677A (ja) * 2017-05-15 2020-07-02 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 安定なウイルス含有組成物
JP2021535165A (ja) * 2018-09-06 2021-12-16 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 保管が改善されたポックスウイルス組成物
JP2022547234A (ja) * 2019-08-29 2022-11-10 アステラス製薬株式会社 遺伝子操作された腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびその使用方法

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3512496B1 (en) 2016-09-16 2025-07-30 Leukocare Ag A novel method for producing low viscous and highly concentrated biopharmaceutical drug products in liquid formulation
JP7051132B2 (ja) * 2016-09-16 2022-04-11 ロイコケア・アクチェンゲゼルシャフト ワクチン接種または遺伝子治療のための効率的なウイルスベクターベースの組成物を得るための新規方法
WO2018210804A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
CN112512560A (zh) 2018-03-07 2021-03-16 特兰斯吉恩股份有限公司 副痘病毒属载体
CN113453712A (zh) 2018-12-28 2021-09-28 特兰斯吉恩股份有限公司 M2缺陷型痘病毒
PH12021551928A1 (en) * 2019-02-15 2022-05-23 Serum Inst Of India Pvt Ltd Live attenuated influenza vaccine composition and process for preparation thereof
CN110669739A (zh) * 2019-09-30 2020-01-10 长春生物制品研究所有限责任公司 一种新型甲型肝炎病毒抗原制备方法
EP3842065A1 (en) 2019-12-23 2021-06-30 Transgene Process for designing a recombinant poxvirus for a therapeutic vaccine
JP7712284B2 (ja) 2020-03-12 2025-07-23 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ ポックスウイルスの安定性を改善する組成物
WO2022148736A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Transgene Vectorization of muc1 t cell engager
CN115704011A (zh) * 2021-08-11 2023-02-17 北京永泰生物制品有限公司 一种高稳定性的慢病毒制剂及其制备方法和其应用
CN119654339A (zh) 2022-07-01 2025-03-18 特兰斯吉恩股份有限公司 包含表面活性蛋白-d和tnfsf成员的融合蛋白
EP4585699A1 (en) * 2022-09-09 2025-07-16 BGI Shenzhen Use of heteroaromatic ring compounds in nucleic acid tests
CN117003897B (zh) * 2023-08-10 2024-10-29 深圳泰华赛尔生物科技有限公司 靶向Claudin18.2的CAR-T细胞及其用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS49109518U (ja) * 1973-01-12 1974-09-19
JPS6314729U (ja) * 1986-07-14 1988-01-30
WO2005066333A1 (en) * 2003-12-30 2005-07-21 Aventis Pasteur, Inc. Stabilizing compositions for recombinant viruses
WO2014053571A1 (en) * 2012-10-02 2014-04-10 Transgene Sa Virus-containing formulation and use thereof

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3915794A (en) 1973-02-09 1975-10-28 Rit Rech Ind Therapeut Stabilizing compositions for cell-free viruses and cell-free virus preparations containing them
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
DK331087A (da) 1986-06-30 1987-12-31 Smith Kline Rit Stabilisator for levende vaccine
FR2643817B1 (fr) 1989-03-06 1993-12-17 Transgene Sa Composition pharmaceutique, utile a titre preventif ou curatif contre les tumeurs induites par les papillomavirus
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
GB9001641D0 (en) 1990-01-24 1990-03-21 Imp Cancer Res Tech Compounds
FR2668064B1 (fr) 1990-10-23 1994-12-16 Transgene Sa Composition pharmaceutique pour le traitement ou la prevention d'une tumeur maligne.
US6241989B1 (en) * 1991-07-09 2001-06-05 Cornell Research Foundation, Inc. Recombinant multivalent viral vaccine
KR100350169B1 (ko) * 1992-06-04 2004-05-20 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드 약독화된바리셀라조스터바이러스백신의제조방법,및이를위한세포의단층배양방법및조성물
FR2710536B1 (fr) 1993-09-29 1995-12-22 Transgene Sa Usage anti-cancéreux d'un vecteur viral comportant un gène modulateur de la réponse immunitaire et/ou inflammatoire.
FR2751879B1 (fr) 1996-07-30 1998-10-30 Transgene Sa Composition pharmaceutique contre les tumeurs et infections a papillomavirus
US5672485A (en) 1996-08-13 1997-09-30 Regents Of The University Of Minnesota Immortalized cell lines for virus growth
FR2766091A1 (fr) 1997-07-18 1999-01-22 Transgene Sa Composition antitumorale a base de polypeptide immunogene de localisation cellulaire modifiee
FR2777570A1 (fr) 1998-04-17 1999-10-22 Transgene Sa Mutant ayant une activite phosphoribosyl transferase
US7456009B2 (en) 2000-03-07 2008-11-25 Merck & Co., Inc. Adenovirus formulations
PL213326B1 (pl) 2001-12-10 2013-02-28 Bavarian Nordic As Formulacja zawierajaca wirus ospy, sposób jej otrzymywania i zastosowanie
KR101357443B1 (ko) 2003-02-25 2014-02-06 메디뮨 엘엘씨 인플루엔자 백신 조성물의 제조 방법
FR2855758B1 (fr) 2003-06-05 2005-07-22 Biomerieux Sa Composition comprenant la polyproteine ns3/ns4 et le polypeptide ns5b du vhc, vecteurs d'expression incluant les sequences nucleiques correspondantes et leur utilisation en therapeutique
EP1897938B9 (en) 2003-07-21 2011-08-31 Transgene SA Polypeptide having an improved cytosine deaminase activity
EP2143788A1 (en) 2003-07-22 2010-01-13 Vivalis Production of poxviruses with duck cell lines
KR101400379B1 (ko) 2004-11-05 2014-05-28 웰스테트 바이올로직스 코포레이션 안정하고 여과 가능한 외피보유 바이러스 조성물
EP1933857A2 (en) 2005-09-07 2008-06-25 Jennerex Biotherapeutics ULC Systemic treatment of metastatic and/or systemically-disseminated cancers using gm-csf-expressing poxviruses
CN102268413A (zh) 2006-01-05 2011-12-07 特兰斯吉恩股份有限公司 鸟类端粒酶反转录酶
JP2009534331A (ja) 2006-04-21 2009-09-24 トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム Ｈｐｖ‐１８を主体とするパピローマウイルスワクチン
ES2671230T3 (es) 2006-06-20 2018-06-05 Transgene Sa Procedimiento para producir poxvirus y composiciones de poxvirus
KR20080084528A (ko) 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
US8361788B2 (en) 2007-07-03 2013-01-29 Transgene S.A. Immortalized avian cell lines comprising E1A nucleic acid sequences
WO2009065547A2 (en) 2007-11-19 2009-05-28 Transgene Sa Poxviral oncolytic vectors
CN102703389B (zh) 2007-11-19 2015-12-02 特朗斯吉有限公司 痘病毒溶瘤载体
US7998488B2 (en) * 2008-11-14 2011-08-16 Baxter International Inc. Vaccine formulations and uses thereof
NZ596595A (en) 2009-05-12 2013-05-31 Transgene Sa Method for orthopoxvirus production and purification
TWI638829B (zh) 2012-07-10 2018-10-21 法商傳斯堅公司 分枝桿菌抗原疫苗
WO2014009433A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant
US9314519B2 (en) 2012-08-21 2016-04-19 Intervet Inc. Liquid stable virus vaccines

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS49109518U (ja) * 1973-01-12 1974-09-19
JPS6314729U (ja) * 1986-07-14 1988-01-30
WO2005066333A1 (en) * 2003-12-30 2005-07-21 Aventis Pasteur, Inc. Stabilizing compositions for recombinant viruses
WO2014053571A1 (en) * 2012-10-02 2014-04-10 Transgene Sa Virus-containing formulation and use thereof

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020519677A (ja) * 2017-05-15 2020-07-02 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 安定なウイルス含有組成物
JP7406377B2 (ja) 2017-05-15 2023-12-27 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー 安定なウイルス含有組成物
JP2021535165A (ja) * 2018-09-06 2021-12-16 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 保管が改善されたポックスウイルス組成物
JP7437385B2 (ja) 2018-09-06 2024-02-22 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 保管が改善されたポックスウイルス組成物
JP2022547234A (ja) * 2019-08-29 2022-11-10 アステラス製薬株式会社 遺伝子操作された腫瘍溶解性ワクシニアウイルスおよびその使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
DK3226894T3 (da) 2019-10-21
KR102507483B1 (ko) 2023-03-07
AU2015357225A1 (en) 2017-06-15
EP3226894A1 (en) 2017-10-11
CN107206063A (zh) 2017-09-26
JP6655618B2 (ja) 2020-02-26
EP3226894B1 (en) 2019-08-07
ZA201703534B (en) 2019-10-30
ES2753364T3 (es) 2020-04-08
RU2704485C2 (ru) 2019-10-29
WO2016087457A1 (en) 2016-06-09
US10517943B2 (en) 2019-12-31
CA2969034A1 (en) 2016-06-09
AU2015357225B2 (en) 2020-04-09
KR20170091653A (ko) 2017-08-09
RU2017121019A (ru) 2019-01-09
MX378901B (es) 2025-03-10
MX2017007178A (es) 2017-08-28
RU2017121019A3 (ja) 2019-05-23
US20170326230A1 (en) 2017-11-16
IL252512B (en) 2020-05-31
IL252512A0 (en) 2017-07-31
CN107206063B (zh) 2021-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6655618B2 (ja) 安定な液体ワクシニアウイルス処方物
TWI690322B (zh) 含病毒的調配物及其使用
JP5154632B2 (ja) ウイルス増殖法
JP2005513109A6 (ja) ポックスウイルス含有調合物およびその調製方法
BRPI0712158B1 (pt) processo para produzir uma composição de poxvírus de tipo selvagem, atenuado e/ou recombinante sem especificidade de infecção visada
JP2005513109A (ja) ポックスウイルス含有調合物およびその調製方法
JP2004535203A5 (ja)
AU2002314201A1 (en) Method for virus propagation
Wang et al. Attenuate Newcastle disease virus by codon modification of the glycoproteins and phosphoprotein genes
CA2969034C (en) Stable liquid vaccinia virus formulations
HK1242182B (en) Stable liquid vaccinia virus formulations
HK1242182A1 (en) Stable liquid vaccinia virus formulations
HK1066245B (en) Method for virus propagation

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181129

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20181129

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190906

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191205

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20200107

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20200203

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6655618

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250