JP2017537645A5

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Publication number: JP2017537645A5
Application number: JP2017532096A
Authority: JP
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2019-01-17

Claims

細胞の部分集団中の１つまたはそれを超える標的分子を検出するための方法であって、該方法は、
ａ）細胞の複合混合物を含むサンプルを２つのユニーク結合物質と接触させる工程であって、ここで、該２つのユニーク結合物質は、互いに密に接近した標的ｍＲＮＡの相補的なセグメントにハイブリダイズするようにデザインされた近接オリゴヌクレオチドプローブであり、そしてここで、該２つのオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つは該標的分子の同一性を代表するオリゴヌクレオチドエピトープ特異的バーコードに付着されている、工程；
ｂ）架橋オリゴヌクレオチドを利用して前記近接オリゴヌクレオチドを連結させる工程；
ｃ）スプリットプールコンビナトリアル合成法を用いて２つまたはそれを超えるオリゴヌクレオチドアッセイ可能ポリマーサブユニットを該エピトープ特異的バーコードに連続的に付着させ、前記近接オリゴヌクレオチオプローブが結合した個々の細胞の同一性を代表するユニーク細胞起源バーコードを作製する工程；
ｄ）前記近接オリゴヌクレオチオプローブが会合した該エピトープ特異的バーコードおよび細胞起源バーコードを選択的に増幅し、標的ｍＲＮＡを発現する細胞の部分集団を識別する工程；
を含む、方法。
前記ユニーク結合物質が、ウイルスゲノム核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記ウイルスゲノムがＨＩＶウイルスゲノムである、請求項２に記載の方法。
少なくとも１つのユニーク結合物質が、細胞表面マーカーに対して向けられた抗体または抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
前記工程（ｄ）の選択的増幅が、連続的な２回またはそれを超えるラウンドの多重化ネステッド増幅反応を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
連続した各回の増幅が、工程（ｃ）において識別された細胞起源バーコードを構成する２つまたはそれを超えるアッセイ可能ポリマーサブユニット位置の配列内の異なる位置に配置された前記アッセイ可能ポリマーサブユニットにハイブリダイズするようにデザインされたプライマーセットを使用する、請求項５に記載の方法。
細胞の混合集団内の部分集団を識別するための方法であって、該方法は、
ａ）該細胞の混合集団を少なくとも１つのユニーク結合物質と接触させる工程であって、ここで、該少なくとも１つのユニーク結合物質は、該部分集団に存在する標的分子に結合するようにデザインされており、該少なくとも１つのユニーク結合物質は、該標的分子の同一性を代表するエピトープ特異的バーコードに付着されている、工程；
ｂ）２つまたはそれを超えるアッセイ可能ポリマーサブユニットを該エピトープ特異的バーコードに連続的に付着させる工程であって、該少なくとも１つのユニーク結合物質が結合した個々の細胞の同一性を代表するユニーク細胞起源バーコードを作製する工程；ならびに
ｃ）該エピトープ特異的バーコードおよび細胞起源バーコードを解読する工程であって、該細胞の混合集団内の部分集団を識別する工程
を含む、方法。
前記エピトープ特異的バーコードおよび前記アッセイ可能ポリマーサブユニットが、オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の方法。
前記２つまたはそれを超えるアッセイ可能ポリマーサブユニットが、スプリットプールコンビナトリアル合成法を用いて前記エピトープ特異的バーコードに付着される、請求項７に記載の方法。
前記エピトープ特異的バーコードおよび会合した細胞起源バーコードの前記２つまたはそれを超えるアッセイ可能ポリマーサブユニットの各存在が連結して、増幅および配列決定され得る結合体が形成される、請求項８に記載の方法。
エピトープ特異的バーコード−細胞起源バーコード結合体を増幅する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
前記解読する工程が、前記増幅されたエピトープ特異的バーコード−細胞起源バーコード結合体の全部または一部を配列決定することを含み、
混合集団中の、前記部分集団と会合した細胞起源バーコードの数と細胞総数との比が、前記標的分子を含む該混合集団内の細胞の割合の尺度を提供し、ここで
２つまたはそれを超えるユニーク結合物質が、前記部分集団を識別するために用いられる、請求項１１に記載の方法。
２つまたはそれを超えるユニーク結合物質が、２つまたはそれを超える部分集団を識別するために用いられる、請求項１２に記載の方法。
前記ユニーク結合物質の少なくとも１つが、ＤＮＡ、ヒストンおよびハウスキーピングタンパク質からなる群より選択される標的分子に結合するようにデザインされている、請求項１２に記載の方法。
前記少なくとも１つのユニーク結合物質が、ＤＮＡ、ヒストンおよびハウスキーピングタンパク質からなる群より選択される標的分子に対して向けられた抗体または抗体フラグメントであるか、又は前記少なくとも１つのユニーク結合物質が、ベルベリン、エチジウムブロマイド、プロフラビン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンおよびサリドマイドからなる群より選択されるＤＮＡ挿入分子であるか、又は前記少なくとも１つのユニーク結合物質が、スクシンイミジルエステル、スルホスクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、スルホジクロロフェノールエステル、イソチオシアネートおよび塩化スルホニルからなる群より選択されるアミン反応性プローブを含む、請求項１４に記載の方法。