JP2017537103A - エフェクター欠損抗cd32a抗体 - Google Patents
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Abstract
血小板減少症、アレルギー、止血障害、免疫性、炎症性及び自己免疫性障害を含むCD32a媒介性疾患及び障害を治療するための方法及び使用と同様に、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体が包含される。【選択図】図34
Description
本出願は、2014年11月26日出願の米国特許出願第14/555,556号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が全ての目的のために参照により組み込まれる。
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全内容は出典明示により本明細書に組み込まれる。前記ASCIIコピーは、2014年11月20日に作成され、01119−0008−00US_SL.txtと命名され、大きさは111,281バイトである。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全内容は出典明示により本明細書に組み込まれる。前記ASCIIコピーは、2014年11月20日に作成され、01119−0008−00US_SL.txtと命名され、大きさは111,281バイトである。
分野
CD32aによって媒介される疾患及び障害を治療及び予防するための方法及び組成物が提供される。
CD32aによって媒介される疾患及び障害を治療及び予防するための方法及び組成物が提供される。
抗体のエフェクター領域又はFc領域は、多くの異なる細胞型の様々な受容体に結合する。そのような受容体の1つは、CD32a IgG受容体(FcガンマRIIaとしても知られている)である。好塩基球、好酸球、単球、好中球、樹状細胞、マクロファージ、及び肥満細胞などのヒト血小板及び他のヒト細胞は、細胞表面のCD32a受容体を提示することが報告されている(Hogarth PM et al. Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond (Mar 2012) Nat Rev Drug Discov 11:311; PubMed ID: 22460124; Bruhns P. Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models (Jun 2012) Blood 119:5640; PubMed ID: 22535666)。(抗原特異性に関わらず)IgG抗体のFc領域によるCD32aの活性化は、多くのインビボ反応をもたらし、その多くはヒト宿主に負の影響を及ぼす。例えば、CD32aのIgG活性化は、ヘパリン起因性血小板減少症の死亡に寄与し得る(HIT;Boon DM et al. Heparin-induced thrombocytopenia and thrombosis: a potential fatal complication in a routine treatment (Mar 1995) Neth J Med 46:146; PubMed ID: 7731489;及びWarkentin TE et al. Sera from patients with heparin-induced thrombocytopenia generate platelet-derived microparticles with procoagulant activity: an explanation for the thrombotic complications of heparin-induced thrombocytopenia (Dec 1994) Blood 84:3691; PubMed ID: 7949124を参照)。好中球、単球、及びマクロファージ上のCD32aのIgG媒介性活性化が気道炎症、アレルギー反応及びアナフィラキシーを促進することも報告されている。例えば、Joensson F. et al. Human Fc-gamma-RIIA induces anaphylactic and allergic reactions (2012 Mar 15) Blood 119:2533-44, PubMed ID: 22138510を参照。IgG−FcによるCD32aの活性化はまた、HITにおける血栓症の一因となり得る(例えば、Arepally G et al. Fc gamma RIIA H/R 131 polymorphism, subclass-specific IgG anti-heparin/platelet factor 4 antibodies and clinical course in patients with heparin-induced thrombocytopenia and thrombosis (Jan 1997) Blood 89:370; PubMed ID: 9002937; Newman PM et al. Heparin-induced thrombocytopenia: new evidence for the dynamic binding of purified anti-PF4-heparin antibodies to platelets and the resultant platelet activation (Jul 2000) Blood 96:182; PubMed ID: 10891449; Jaffray B et al. Fatal venous thrombosis after heparin therapy (Mar 1991) Lancet 337:561; PubMed ID: 1671929を参照)。
Joenssonらの2012年の報告では、著者らはCD32a受容体の遮断がマウスを局所及び全身性アナフィラキシーから保護すると報告し、同文献の2542で、ヒトにおける炎症及び自己免疫/アレルギー反応における特異的遮断分子によりFcガンマRIIAを標的とすることは、リウマチ性関節炎のマウスモデルにおけるマウスFcガンマRIIIAについて最近報告したのと同様の阻害をもたらす可能性があると結論づけた。Joenssonは同文献の2542で、mAb IV.3の高用量がアナフィラキシーを予防するのではなく誘導することを報告したので、ヒトにおけるアレルギー性疾患及び自己免疫性疾患を予防するために二価リガンド(例えば、mAb IV.3)を用いてFcガンマRIIAを遮断することは想定されるべきではないと続けた(強調が加えられた)。従って、CD32aの遮断は、炎症性、自己免疫性及びアレルギー性障害を治療するための望ましい目標であったが、当業者は、インビボ投与の既知の負の副作用のためにCD32a抗体による遮断を想定していなかった。発明者らは、アナフィラキシーのような負の副作用を誘発しない新規なCD32a抗体を提供することによってこの問題を解決した。
CD32aの活性化によって媒介される疾患及び障害に加えて、多くの疾患及び障害が、CD32aを直接活性化しない固定化IgGのFc領域とのCD32a相互作用によって媒介される。「固定化IgG」は、表面に結合するか、又は表面上に沈殿し、従って制限された移動性を有する(すなわち、「固定されている」)抗体分子を指す。あるいは、固定化IgGを有する細胞は、「IgGで被覆された」細胞として記載され得る。CD32aは、可溶性であろうと(Hogarth PM et al. Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond (Mar 2012) Nat Rev Drug Discov 11:311; PubMed ID: 22460124)固定化されていようと(Wines BD et al. The IgG Fc contains distinct Fc receptor (FcR) binding sites: the leukocyte receptors Fc gamma RI and Fc gamma RIIa bind to a region in the Fc distinct from that recognized by neonatal FcR and protein A (May 2000) J Immunol 164:5313; PubMed ID: 10799893)、単一IgG分子のFc領域とごくわずかに相互作用することが知られている。従って、CD32aを直接的に活性化することができない抗体は、血小板表面に固定された場合には血小板減少症などのCD32a媒介性疾患及び障害を引き起こした(McKenzie et al. The role of the human Fc receptor FcgammaRIIA in the immune clearance of platelets: a transgenic mouse model (Apr 1999) J Immunol 162:4311; PubMed ID: 10201963)。
IgGで被覆された血小板(又は他の細胞)は、循環血液から能動的に除去される。例えば、免疫血小板減少性紫斑病(ITP)において、循環する抗血小板抗体(典型的にはIgG)を有するヒト患者は、大部分が脾臓及び肝臓によって媒介される血小板クリアランスを経験することがよく知られており、ここでは食細胞上のFc受容体(CD32aを含む)がIgGで被覆された血小板に結合して保持する。脾臓の除去(脾臓切除)はこの状態を緩和することができる。しかしながら、HITとは異なり、血栓症は、典型的には、ITP中のIgGで被覆された血小板のクリアランスと関連していない。むしろ、出血の臨床的問題がより顕著な懸念であり、この問題に対する改善された治療戦略が必要とされている(Altomare I et al. Bleeding and mortality outcomes in ITP clinical trials: a review of thrombopoietin mimetics data (Oct 2012) Am J Hematol 87:984; PubMed ID: 22729832)。
CD32aはまた、自己免疫性溶血性貧血(AIHA)などのCD32a媒介性疾患及び障害においてIgGで被覆された赤血球(赤血球(erythrocyte))のクリアランスを媒介することも知られている。従って、遮断mAbを用いてCD32aを標的とすることは、AIHAの治療において大きな有用性があると思われ;実際、これは、ヒトCD32a導入遺伝子を有するが他の点では古典的なマウスIgG受容体機能を欠いているマウスにおいてIgG抗体誘発性貧血を改善することが示されている抗CD32mAb、MDE−8で報告されており、すなわち、MDE−8を試験するために使用した動物は、I型(CD64)及びIII型(CD16)の機能的マウスIgG受容体を欠いており、これらがインビボでMDE−8活性にどのように影響を及ぼすかについての問題が残されている(van Royen-Kerkhof A et al. A novel human CD32 mAb blocks experimental immune haemolytic anaemia in FcgammaRIIA transgenic mice (Jul 2005) Br J Haematol 130:130; PubMed ID: 15982355)。MDE−8は治療用抗体として開発されていない。MDE−8の前臨床開発の欠如の理由は公に開示されていない。しかしながら、本発明者らは、MDE−8及び他の抗CD32a抗体に関する以前には記載されていない問題を同定し解決した。すなわち、それらを改変してIgG Fc受容体への結合を減少させることにより、それらは細胞に固定化されたときにCD32aを介するクリアランスをもはや媒介せず、それにより臨床開発を可能にしている。
従って、負の副作用を引き起こさずにIgGで被覆された細胞のCD32a媒介性クリアランスを防止し得る組成物が望まれる。本発明者らは、このような組成物を記載し、CD32a媒介性疾患及び障害を治療及び予防するために、それらの成功した使用を詳述する。
本明細書の記載に従って、発明者らは、インビボでの天然抗CD32a抗体の投与が、血小板減少、体温の低下及びショックの症状を含む有害反応を引き起こすことを発見した。発明者らは、エフェクター欠損抗CD32a抗体を投与することがこれらの有害反応を緩和することを見出した。
従って、一実施態様では、本発明は、エフェクター欠損抗CD32a抗体を投与することによって抗CD32a抗体の投与によって引き起こされる有害反応を予防する方法を提供する。同様に、エフェクター欠損CD32a抗体を投与することを含むCD32a媒介性疾患又は障害を治療するための方法が提供される。
ある症例では、CD32a媒介性疾患又は障害は血小板減少症である。
他の実施態様において、CD32a媒介性疾患又は障害は、アナフィラキシーショックを含むショックの症状である。
なお更なる実施態様では、CD32a媒介性疾患又は障害は、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、変形性関節症及び全身性エリテマトーデス(SLE)を含む炎症性、免疫性又は自己免疫性疾患又は障害である。
なお更なる実施態様では、CD32a媒介性疾患又は障害は、自己免疫又は特定の薬物(例えば、ヘパリン)及び抗体療法(例えば、抗VEGF、抗TNFα、抗IgE、又は抗CD40L免疫療法)に関連するヘパリン誘発性血小板減少症(HIT)、免疫性血小板減少性紫斑病(ITP)、抗リン脂質症候群(APS)、血栓症又は血小板減少症、アレルギー性鼻炎、抗体仲介性貧血、アナフィラキシー、慢性特発性蕁麻疹(CIU)、又は気道炎症である。
本発明者らは、エフェクター能力のある非抗CD32a IgG抗体を投与すると、血小板減少、体温の低下、又はショックの症状を含む有害反応を引き起こすことができることを更に発見した。エフェクター欠損抗CD32a抗体を投与することにより、これらの有害反応を妨げる。従って、一実施態様では、本発明は、非CD32a抗体を含む、IgG抗体によって引き起こされる有害反応を治療するためのエフェクター欠損抗CD32a抗体を投与する方法を提供する。
エフェクター欠損キメラ及びヒト化AT−10及びIV.3ならびにエフェクター欠損ヒトMDE−8モノクローナルIgG抗体を含むこれらの方法で使用するための化合物が提供される。エフェクター欠損抗体は、Fc領域の少なくとも一部を含み、全長であってもよく、又は切断されていてもよい。
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるCD32a媒介性疾患又は障害を治療するための方法であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体をヒト被験体に投与することを含み、それによりCD32a媒介性疾患又は障害を治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、その量は治療的に有効である。一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるCD32aを遮断するための方法及び/又はCD32a活性化を妨げるための方法であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体をヒト被験体に投与することを含み、それによりCD32aを遮断し、かつ/又はCD32a活性化を妨げる方法を提供する。幾つかの実施態様では、その量は治療的に有効である。
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるCD32a媒介性疾患又は障害を治療することにおけるエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用を提供し、ここで抗体はFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である。一実施態様では、本発明は、ヒト被験体においてCD32aを遮断し、かつ/又はCD32a活性化を妨げることにおけるエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用を提供し、ここで抗体はFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である。
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるCD32a媒介性疾患又は障害を治療するための医薬の調製におけるエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用を提供し、ここで抗体はFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である。一実施態様では、本発明は、ヒト被験体においてCD32aを遮断し、かつ/又はCD32a活性化を妨げるための医薬の調製におけるエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用を提供し、ここで抗体はFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である。
幾つかの実施態様において、エフェクター欠損抗体は、IgG免疫複合体試験及び固定化IgG試験の両方に適合し、ここで、CD16、CD32及び/又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除するように、エフェクター欠損抗体のFC領域が改変されている。
幾つかの実施態様において、CD32a媒介性疾患又は障害は、IgG媒介性止血障害である。幾つかの実施態様において、止血障害は、血小板減少症を伴うか又は伴わない血栓症である。幾つかの実施態様において、止血障害は、IgG媒介性血小板減少症、免疫媒介性血小板減少症(ITP)、抗リン脂質症候群(APS)、抗血小板抗体障害、ヘパリン誘発性血小板減少症(HIT)、血栓症を伴うヘパリン誘発性血小板減少症(HITT)、がん誘発性血小板活性化、がん誘発性凝固性亢進、血小板媒介性腫瘍細胞転移、及び血小板媒介性がん転移からなる群から選択される。
幾つかの実施態様において、CD32a媒介性疾患又は障害は、IgG媒介性免疫性、自己免疫性又は炎症性疾患又は障害である。幾つかの実施態様において、IgG媒介性免疫、自己免疫又は炎症性障害は、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、抗リン脂質症候群(APS)、変形性関節症、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、IgG抗体誘発性貧血、及びIgG媒介性血球減少からなる群から選択される。
幾つかの実施態様において、CD32a媒介性疾患又は障害は、血小板、単球、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ、樹状細胞、滑膜細胞、肥満細胞、又は皮膚微小血管内皮細胞上におけるCD32aのIgG−Fc媒介性活性化によって特徴付けられる。
幾つかの実施態様において、CD32a媒介性疾患又は障害は、IgG媒介性免疫性、自己免疫性又は炎症性疾患又は障害である。幾つかの実施態様において、IgG媒介性免疫、自己免疫又は炎症性障害は、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、抗リン脂質症候群(APS)、変形性関節症、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、IgG抗体誘発性貧血、及びIgG媒介性血球減少からなる群から選択される。
幾つかの実施態様において、CD32a媒介性疾患又は障害は、IgG免疫複合体媒介性疾患又は障害である。幾つかの実施態様において、IgG免疫複合体媒介性疾患又は障害は、非抗CD32aモノクローナル抗体又はその断片の投与によって引き起こされる抗治療抗体(ATA)応答である。幾つかの実施態様において、非抗CD32a抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ペゴール(抗体様)、ゴリムマブ、エタネルセプト(抗体様)、ウステキヌマブ、オマリズマブ又はベバシズマブである。幾つかの実施態様において、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、非抗CD32aモノクローナル抗体の前、同時、又は後に投与される。
幾つかの実施態様において、IgG免疫複合体媒介性疾患又は障害は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、又は潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患(IBD)の治療のために、非抗CD32aモノクローナル抗体により治療されている患者において生じる。
幾つかの実施態様において、CD32a媒介性疾患又は障害は、ヒト被験体の血液中を循環する細胞の表面に局在するIgGにより特徴付けられる。幾つかの実施態様において、循環細胞型は、以下の1つ以上からなる:血小板、赤血球、単球、好中球、好塩基球、好酸球、Bリンパ球、マクロファージ、肥満細胞、白血病細胞、又はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物などの微生物。幾つかの実施態様において、疾患又は障害は、以下の1つ以上から選択される:血小板減少症、白血球減少症、好中球減少症、リンパ球減少症、単球減少症、貧血、溶血性貧血、又は敗血症。
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するための方法であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の治療的有効量をヒト被験体に投与することを含み、それによりI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する方法を提供する。
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するためのエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用であって、ここで該抗体はFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する、該抗体の使用を提供する。
一実施態様では、本発明は、ヒト被験体におけるI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏反応を治療するための医薬の調製のためのエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用であって、ここで該抗体はFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する、該抗体の使用を提供する。
幾つかの実施態様において、アレルギー性疾患は、アトピー、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、全身性アナフィラキシー、花粉症、喘息、蕁麻疹、食物アレルギー、及び湿疹に示されるような局所化されたアナフィラキシー、ワクチンに対するアレルギー反応、食品に対するアレルギー反応、アレルギー反応、昆虫生産物へのアレルギー反応、薬物に対するアレルギー反応、カビ胞子に対するアレルギー反応、動物の毛及びふけに対するアレルギー反応、ラテックスに対するアレルギー反応、輸血反応、血小板輸血反応、赤血球輸血反応、胎児赤芽球症、溶血性貧血、血清病、インフュージョンリアクション、壊死性血管炎、糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、及び微生物に対するアレルギー反応からなる群から選択される。
一実施態様では、本発明は、エフェクター欠損であるFc領域の少なくとも一部を含む、ヒトCD32aに特異的に結合するエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体であって、該エフェクター欠損抗体が、改変されていない対照と比較して、CD16、CD32、及び/又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除する改変されたFc領域を含む、抗体を提供する。
幾つかの実施態様において、モノクローナル抗体はヒト化されている。
幾つかの実施態様において、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、エフェクター欠損MDE−8、IV.3又はAT−10モノクローナル抗体である。
幾つかの実施態様において、AT−10抗体は
a.配列YYWMN(配列番号1)若しくはGFTFSYYW(配列番号73及び配列番号88)と同一であるか又は配列YYWMN(配列番号1)若しくはGFTFSYYW(配列番号73及び配列番号88)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列EIRLKSNNYATHYAESVKG(配列番号2)若しくはIRLKSNNYAT(配列番号74及び配列番号89)と同一であるか又は配列EIRLKSNNYATHYAESVKG(配列番号2)若しくはIRLKSNNYAT(配列番号74及び配列番号89)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列RDEYYAMDY(配列番号3)若しくはNRRDEYYAMDY(配列番号75及び配列番号90)と同一であるか又は配列RDEYYAMDY(配列番号3)若しくはNRRDEYYAMDY(配列番号75及び配列番号90)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RASESVDNFGISFMN(配列番号4)若しくはESVDNFGISF(配列番号76及び配列番号91)と同一であるか又は配列RASESVDNFGISFMN(配列番号4)若しくはESVDNFGISF(配列番号76及び配列番号91)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列GASNQGS(配列番号5)若しくはGAS(配列番号77及び配列番号92)と同一であるか又は配列GASNQGS(配列番号5)若しくはGAS(配列番号77及び配列番号92)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列QQSKEVPWT(配列番号6)若しくはQQSKEVPWT(配列番号78及び配列番号93)と同一であるか又は配列QQSKEVPWT(配列番号6)若しくはQQSKEVPWT(配列番号78及び配列番号93)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
a.配列YYWMN(配列番号1)若しくはGFTFSYYW(配列番号73及び配列番号88)と同一であるか又は配列YYWMN(配列番号1)若しくはGFTFSYYW(配列番号73及び配列番号88)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列EIRLKSNNYATHYAESVKG(配列番号2)若しくはIRLKSNNYAT(配列番号74及び配列番号89)と同一であるか又は配列EIRLKSNNYATHYAESVKG(配列番号2)若しくはIRLKSNNYAT(配列番号74及び配列番号89)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列RDEYYAMDY(配列番号3)若しくはNRRDEYYAMDY(配列番号75及び配列番号90)と同一であるか又は配列RDEYYAMDY(配列番号3)若しくはNRRDEYYAMDY(配列番号75及び配列番号90)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RASESVDNFGISFMN(配列番号4)若しくはESVDNFGISF(配列番号76及び配列番号91)と同一であるか又は配列RASESVDNFGISFMN(配列番号4)若しくはESVDNFGISF(配列番号76及び配列番号91)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列GASNQGS(配列番号5)若しくはGAS(配列番号77及び配列番号92)と同一であるか又は配列GASNQGS(配列番号5)若しくはGAS(配列番号77及び配列番号92)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列QQSKEVPWT(配列番号6)若しくはQQSKEVPWT(配列番号78及び配列番号93)と同一であるか又は配列QQSKEVPWT(配列番号6)若しくはQQSKEVPWT(配列番号78及び配列番号93)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
幾つかの実施態様において、AT−10抗体は、配列番号8又は配列番号12に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列、及び配列番号10又は配列番号14に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む。
幾つかの実施態様において、AT−10抗体は
a.配列番号16、配列番号18又は配列番号20に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号22又は配列番号24に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
a.配列番号16、配列番号18又は配列番号20に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号22又は配列番号24に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
幾つかの実施態様において、IV.3抗体は
a.配列NYGMN(配列番号25)若しくはGYTFTNYG(配列番号79)と同一であるか又はその配列と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列WLNTYTGESIYPDDFKG(配列番号26)若しくはLNTYTGES(配列番号80)と同一であるか又は配列WLNTYTGESIYPDDFKG(配列番号26)若しくはLNTYTGES(配列番号80)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列GDYGYDDPLDY(配列番号27)若しくはARGDYGYDDPLDY(配列番号81)と同一であるか又は配列GDYGYDDPLDY(配列番号27)若しくはARGDYGYDDPLDY(配列番号81)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RSSKSLLHTNGNTYLH(配列番号28)若しくはKSLLHTNGNTY(配列番号82及び配列番号100)と同一であるか又は配列RSSKSLLHTNGNTYLH(配列番号28)若しくはKSLLHTNGNTY(配列番号82及び配列番号100)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列RMSVLAS(配列番号29)若しくはRMS(配列番号83、配列番号101)と同一であるか又は配列RMSVLAS(配列番号29)若しくはRMS(配列番号83、配列番号101)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
配列MQHLEYPLT(配列番号30及び配列番号84及び配列番号102)と同一であるか又は配列MQHLEYPLT(配列番号30及び配列番号84及び配列番号102)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
a.配列NYGMN(配列番号25)若しくはGYTFTNYG(配列番号79)と同一であるか又はその配列と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列WLNTYTGESIYPDDFKG(配列番号26)若しくはLNTYTGES(配列番号80)と同一であるか又は配列WLNTYTGESIYPDDFKG(配列番号26)若しくはLNTYTGES(配列番号80)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列GDYGYDDPLDY(配列番号27)若しくはARGDYGYDDPLDY(配列番号81)と同一であるか又は配列GDYGYDDPLDY(配列番号27)若しくはARGDYGYDDPLDY(配列番号81)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RSSKSLLHTNGNTYLH(配列番号28)若しくはKSLLHTNGNTY(配列番号82及び配列番号100)と同一であるか又は配列RSSKSLLHTNGNTYLH(配列番号28)若しくはKSLLHTNGNTY(配列番号82及び配列番号100)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列RMSVLAS(配列番号29)若しくはRMS(配列番号83、配列番号101)と同一であるか又は配列RMSVLAS(配列番号29)若しくはRMS(配列番号83、配列番号101)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
配列MQHLEYPLT(配列番号30及び配列番号84及び配列番号102)と同一であるか又は配列MQHLEYPLT(配列番号30及び配列番号84及び配列番号102)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
幾つかの実施態様において、IV.3抗体は
a.配列番号32、配列番号36又は配列番号38に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列;及び
b.配列番号34、配列番号41又は配列番号85に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列
を含む。
a.配列番号32、配列番号36又は配列番号38に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列;及び
b.配列番号34、配列番号41又は配列番号85に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列
を含む。
幾つかの実施態様において、IV.3抗体は
a.配列番号43、配列番号45、配列番号47又は配列番号49に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号51、配列番号53又は配列番号87に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
a.配列番号43、配列番号45、配列番号47又は配列番号49に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号51、配列番号53又は配列番号87に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
幾つかの実施態様において、MDE−8抗体は
a.配列SYGMH(配列番号54)若しくはGFTFSSYG(配列番号94)と同一であるか又は配列SYGMH(配列番号54)若しくはGFTFSSYG(配列番号94)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列VIWYDGSNYYYTDSVKG(配列番号55)若しくはIWYDGSNY(配列番号95)と同一であるか又は配列VIWYDGSNYYYTDSVKG(配列番号55)若しくはIWYDGSNY(配列番号95)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列DLGAAASDY(配列番号56)若しくはARDLGAAASDY(配列番号96)と同一であるか又は配列DLGAAASDY(配列番号56)若しくはARDLGAAASDY(配列番号96)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RASQGINSALA(配列番号57)若しくはQGINSA(配列番号97)と同一であるか又は配列RASQGINSALA(配列番号57)若しくはQGINSA(配列番号97)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列DASSLES(配列番号58)若しくはDAS(配列番号98)と同一であるか又は配列DASSLES(配列番号58)若しくはDAS(配列番号98)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列QQFNSYPHT(配列番号59)若しくはQQFNSYPHT(配列番号99)と同一であるか又は配列QQFNSYPHT(配列番号59)若しくはQQFNSYPHT(配列番号99)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
a.配列SYGMH(配列番号54)若しくはGFTFSSYG(配列番号94)と同一であるか又は配列SYGMH(配列番号54)若しくはGFTFSSYG(配列番号94)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列VIWYDGSNYYYTDSVKG(配列番号55)若しくはIWYDGSNY(配列番号95)と同一であるか又は配列VIWYDGSNYYYTDSVKG(配列番号55)若しくはIWYDGSNY(配列番号95)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列DLGAAASDY(配列番号56)若しくはARDLGAAASDY(配列番号96)と同一であるか又は配列DLGAAASDY(配列番号56)若しくはARDLGAAASDY(配列番号96)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RASQGINSALA(配列番号57)若しくはQGINSA(配列番号97)と同一であるか又は配列RASQGINSALA(配列番号57)若しくはQGINSA(配列番号97)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列DASSLES(配列番号58)若しくはDAS(配列番号98)と同一であるか又は配列DASSLES(配列番号58)若しくはDAS(配列番号98)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列QQFNSYPHT(配列番号59)若しくはQQFNSYPHT(配列番号99)と同一であるか又は配列QQFNSYPHT(配列番号59)若しくはQQFNSYPHT(配列番号99)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
幾つかの実施態様において、MDE−8抗体は
a.配列番号61に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列;及び
b.配列番号63に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列
を含む。
a.配列番号61に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列;及び
b.配列番号63に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列
を含む。
幾つかの実施態様において、MDE−8抗体は
a.配列番号65又は配列番号67に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号69に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
a.配列番号65又は配列番号67に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号69に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
配列の記述
表1−5は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。
表1−5は、本明細書で参照される特定の配列のリストを提供する。
実施態様の記述
一実施態様では、ヒト被験体におけるCD32a媒介性疾患又は障害を治療する方法が包含され、本明細書に記載の1つ以上のエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の治療的有効量をヒト被験体に投与し、それによりCD32a媒介性疾患又は障害を治療する。
一実施態様では、ヒト被験体におけるCD32a媒介性疾患又は障害を治療する方法が包含され、本明細書に記載の1つ以上のエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の治療的有効量をヒト被験体に投与し、それによりCD32a媒介性疾患又は障害を治療する。
一実施態様では、抗CD32aモノクローナル抗体は、1)IgG免疫複合体によるCD32aの活性化を妨げることができ;2)CD16、CD32、又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除するように改変されたFc領域を有する。
一実施態様では、抗CD32aモノクローナル抗体は、1)IgG免疫複合体によるCD32aの活性化を妨げることができ;2)CD16、CD32、又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除するように改変されたFc領域を有する。
一実施態様では、CD16、CD32及び/又はCD64に対するFc結合の減少は、エフェクター能力のある抗体対照と比較して完全な減少である。他の態様では、減少は、エフェクター能力のある抗体対照と比較して、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、又は約95%である。
抗体
抗体
任意のエフェクター欠損抗CD32a抗体を本方法の実施態様において使用することができる。組成物及び方法の実施態様の抗体は、Fc領域の少なくとも一部を含む。
一実施態様では、エフェクター欠損抗体は、表1−5のように、それぞれ、各抗体について記載された1つ以上のCDRを含むAT−10、IV.3又はMDE−8抗体であり、エフェクター欠損である。他の実施態様では、エフェクター欠損抗体は、表1−5のように、それぞれ、各抗体について記載された可変重鎖及び軽鎖を含むAT−10、IV.3又はMDE−8抗体であり、エフェクター欠損である。他の実施態様では、エフェクター欠損抗体は、表1−5のように、それぞれ、各抗体について記載された全長重鎖及び全長軽鎖を含むAT−10、IV.3又はMDE−8抗体であり、エフェクター欠損である。
一実施態様では、エフェクター欠損抗体は、その抗体の1つ以上のCDRを含むAT−10、IV.3又はMDE−8抗体であり、ここで、CDRは、表1−5にそれぞれ各抗体について記載されたCDR配列と同一であり、表1のように各抗体について記載された配列と比較して、CDRの1つ、2つ、又は3つが1つ又は2つの変異を有し、エフェクター欠損である。
他の実施態様では、エフェクター欠損抗体は、それぞれ各抗体について表1−5に記載された可変重鎖及び軽鎖を含むAT−10、IV.3又はMDE−8抗体であり、可変重鎖及び軽鎖は、それぞれ各抗体について表1−5に記載された可変重鎖及び可変軽鎖と75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であり、抗体はエフェクター欠損である。
他の実施態様では、エフェクター欠損抗体は、それぞれ各抗体について表1−5に記載された全長重鎖及び軽鎖を含むAT−10、IV.3又はMDE−8抗体であり、又は可変重鎖及び軽鎖は、それぞれ各抗体について表1−5に記載された重鎖及び軽鎖と75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であり、エフェクター欠損である。
本発明の抗体組成物、並びに本明細書に記載の方法及び使用において使用される抗体は、IgG免疫複合体によるCD32aの活性化を妨げることができる。抗体がIgG免疫複合体によるCD32aの活性化を妨げることができるかどうかは、当技術分野で周知の方法によって、すなわち、以下に記載される「IgG免疫複合体試験」に従って、IgG免疫複合体に対する凝集又は脱顆粒反応のために洗浄した血小板を試験することによって試験することができる。例えば、Meyer T et al.Bevacizumab immune complexes activate platelets and induce thrombosis in FCGR2A transgenic mice (Jan 2009) J Thromb Haemost 7:171; PubMed ID: 18983497を参照。
「IgG免疫複合体試験」:以下の工程は、抗体がIgG免疫複合体によるCD32aの活性化を妨げることができるかどうかを決定することができる。第1に、例えば、ヒト血小板は、「洗浄」方法によって他の血液細胞から単離することができる(例えば、Meyer T et al.(Jan 2009) J Thromb Haemost 7:171; PubMed ID: 18983497)。あるいは、FCGR2Aトランスジェニックマウス由来の血小板を、同様の方法を用いて単離することができる(例えば、Robles-Carrillo L et al.Anti-CD40L immune complexes potently activate platelets in vitro and cause thrombosis in FCGR2A transgenic mice (Aug 2010) J Immunol 185:1577; PubMed ID: 20585032を参照)。次に、このように洗浄した血小板を用いて、ヒトCD32aを活性化することが知られているIgG抗体、例えば抗CD9 mAb(例えば、PubMed ID:18983497、op citに記載のように)又は抗CD40L mAb、M90(例えば、PubMed ID:20585032、op citに記載のように)によってCD32a媒介性活性化を試験することができる。洗浄した血小板上のCD32aを活性化するために、洗浄した血小板に曝露する前にCD40Lと組み合わせたM90の場合のように、免疫複合体(IC)を形成するように抗原によってクラスター化する必要がある抗体もある。CD32a活性化抗体は、Chrono−Logモデル490シリーズ凝集計のような血小板凝集計を用いて同定することができる。抗体が凝集計キュベットに導入された後に血小板凝集を引き起こし、そのような凝集が抗CD32aブロッキング抗体(例えば、IV.3、AT−10、又はMDE−8など;他に多くのものが市販されており、当業者に知られている)によって妨げられる場合、次いで抗体は血小板CD32aを特異的に活性化し、従って「IgG免疫複合体試験」において必要な試薬として使用するのに十分である。洗浄された血小板凝集試験の代替法は、血小板脱顆粒を測定するセロトニン放出アッセイ(又は「SRA」)である(例えば、PubMed ID 18983497及び20585032 citを参照)。CD32aはヒト血小板上の唯一のIgG受容体である;従って、これらの試験はCD32a活性化抗体を特異的に同定することができる。「IgG免疫複合体試験」の第3工程では、CD32a活性化IgG抗体の導入の前に、洗浄した血小板を候補抗CD32a抗体に曝露する必要がある。例えば、アッセイ緩衝液(典型的には250/ナノリットル)中に懸濁した洗浄ヒト血小板を凝集計キュベットに入れる。機器の設定は、アッセイシグナル範囲及びベースラインを確立するように調整される。次に、候補の抗CD32a遮断抗体(例えば、IV.3、AT−10又はMDE−8)をキュベットに導入する(典型的には、ミリリットルあたり10マイクログラムかその近くで)。次に、キュベット中の血小板懸濁液に、血小板活性化IgG抗体又はIgG免疫複合体(例えば、M90+CD40L、典型的には50−500nMの最終アッセイ濃度で)を添加する。最後に、抗CD32a mAbがIgG抗体/免疫複合体誘発性血小板凝集を妨げるかどうかを評価するために、少なくとも1分間(又は、典型的には5分以上)血小板凝集をモニターする。これらの工程を使用して、抗CD32a抗体が、凝集(又はSRAが使用される場合は脱顆粒)の阻害によって証明されるように、IgG抗体又はIgG免疫複合体によるCD32aの活性化を防ぐことができる場合、次いで抗CD32a抗体は「IgG免疫複合体試験」に適合する。同様に、抗CD32a抗体が血小板凝集及び脱顆粒を妨げる能力を欠いている場合、前記抗CD32a抗体は「IgG免疫複合体試験」に適合しない。
本明細書に含まれる実施例において、図19−33は、洗浄された血小板凝集(すなわち、「IgG免疫複合体試験」を使用)によって、マウスIV.3、キメラIV.3、及びヒト化IV.3、キメラAT−10及びヒト化AT−10、及びヒトMDE−8 IgG抗CD32a mAbは全て、そのような抗CD32a抗体がIgG1又はIgG2アイソタイプのサブクラスであるかどうかにかかわらず、かつそのような抗CD32a mAbが天然又はエフェクター欠損Fc領域を有するかどうかにかかわらず、「IgG免疫複合体試験」に適合することを実証する。「IgG免疫複合体試験」としての血小板凝集の使用の代替として、図34及び35は、血小板凝集の代わりにSRAを用いたIV.3、AT−10、及びMDE−8抗体変異体について同様の結果を示しており;ここでもまた、全ての試験された抗体は、IC誘発性血小板活性化を妨げ、従って、「IgG免疫複合試験」に適合する。
a.エフェクター欠損
本発明の抗体組成物、並びに本明細書に記載の方法及び使用において使用される抗体は、「エフェクター欠損」である。本明細書中で使用される場合、「エフェクター欠損」抗体は、CD16、CD32及び/又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除するように改変されたFc領域を有する抗体として定義される。
本発明の抗体組成物、並びに本明細書に記載の方法及び使用において使用される抗体は、「エフェクター欠損」である。本明細書中で使用される場合、「エフェクター欠損」抗体は、CD16、CD32及び/又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除するように改変されたFc領域を有する抗体として定義される。
一実施態様では、CD16、CD32及び/又はCD64に対するFc結合の減少は、エフェクター能力のある対照と比較して完全な減少である。他の態様では、減少は、エフェクター能力のある抗体対照と比較して、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、又は約95%である。抗体がCD16、CD32及び/又はCD64に対するFc結合の減少を有するかどうかを決定する方法は、当技術分野で周知である。例えば、米国特許出願公開第20110212087(A1)号、国際公開第2013165690号、及びVafa O.et al.An engineered Fc variant of an IgG eliminates all immune effector functions via structural perturbations (Jan 2014) Methods 65:114; PubMed ID: 23872058を参照。
更なる実施態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、1)IgG免疫複合体によるCD32aの活性化を妨げることができる抗体であり;2)CD16、CD32、及び/又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除するように改変されたFc領域を有し;3)投与後にFc媒介性有害宿主反応を誘導しない。
本発明の抗CD32aエフェクター欠損抗体が投与後に有害宿主反応を誘導することができるか否かは、以下に記載する「固定化IgG試験」によって試験することができる。
「固定化IgG試験」:以下の工程は、抗CD32a抗体が、宿主動物への静脈内投与後にIgG媒介性有害反応を誘導することができるかどうかを決定することができる。宿主動物は哺乳類でなければならず、試験されるべき抗CD32a抗体が抗原として結合することが知られている少なくとも1つのエピトープを有するCD32 IgG受容体を提示しなければならない。例えば、IV.3はCD32a抗原に結合することが知られているIgG mAbである(例えば、配列番号70に記載、及び配列番号71に記載;例えばRosenfeld SI et al.Human platelet Fc receptor for immunoglobulin G.Identification as a 40,000-molecular-weight membrane protein shared by monocytes (Dec 1985) J Clin Invest 76:2317; PubMed ID: 2934409);AT−10は、CD32抗原に結合することが知られているIgG mAbである(例えば、配列番号70−72に記載される;例えば、Greenman J et al.Characterization of a new monoclonal anti-Fc gamma RII antibody, AT10, and its incorporation into a bispecific F(ab')2 derivative for recruitment of cytotoxic effectors (Nov 1991) Mol Immunol 28:1243; PubMed ID: 1835758を参照のこと);MDE−8は、CD32抗原に結合することが知られているIgG mAbである(例えば、配列番号70−72に記載される;例えば、van Royen-Kerkhof A et al.A novel human CD32 mAb blocks experimental immune haemolytic anaemia in FcgammaRIIA transgenic mice (Jul 2005) Br J Haematol 130:130; PubMed ID: 15982355を参照)。抗CD32a mAbについての「固定化IgG試験」で使用するための1つの適切な宿主動物は、FCGR2Aマウスである(「B6;SJL−Tg(FCGR2A)11Mkz/J」マウス、#003542、The Jackson Laboratory、Bar Harbor、Maine、USA)。他の適切なCD32陽性宿主動物は、当業者に周知である。次いで、「固定化IgG試験」を、例えば、精製した抗CD32a試験抗体(好ましくは生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、又は他の適切な不活性ビヒクル中で)を(この場合は)FCGR2A(すなわちCD32A)マウスの尾静脈に注射することにより実施する。典型的には、50−100マイクログラムが注射される;しかしながら、反応の欠如は、より多くの量の抗体が注射されるべきであることを示唆し得る:例えば、120マイクログラム又は140マイクログラムが反応を誘発するために必要とされ得る。150マイクログラムを超える量は、通常、FCGR2Aマウスには必要とされない。試験抗体(この例では、抗CD32a mAb)の注射直後に、注射後少なくとも20分間、10分間ごとに動物を中核体温について(典型的には、直腸温度計を使用して)モニターする(ベースライン温度は、試験mAb注射の前に確立される)。摂氏2度を超える温度低下(すなわち、低体温)が5分を超えて持続することは、抗CD32a試験mAbが「固定化IgG試験」に適合しなかったことを示す有害反応を示す。更に、抗CD32a試験mAbの注射の少なくとも20分後、好ましくは抗CD32a試験mAbの注射の30分後に、全血を宿主動物から採取し(後眼窩、又は静脈穿刺により)、分析して循環する標的細胞の数の変化を評価する。細胞数は、フローサイトメトリー、自動セルカウンター、又は血球計の使用によって得ることができる。FCGR2Aマウスにおいて抗CD32a mAbを試験する場合、試験前日、又は抗CD32a試験mAbの注射の少なくとも1−3時間前にベースライン血小板数が得られる。ここで留意すべきは、血液採取のプロセス、特に連続的な血液採取のプロセスは、見かけの細胞数を減少させることができることである。典型的には、FCGR2Aマウスのベースライン血小板数は、1ナノリットルあたり700を超えるであろうし、より典型的には1ナノリットル当たり800より大きく、1ナノリットル当たり1200,1500,1800又は2000にも達する可能性がある。FCGR2A(CD32A)マウスにおいて抗CD32a mAbを試験する場合、50%を超える循環血小板数の減少は、抗CD32a試験mAbが「固定化IgG試験」に適合しなかったことを示す有害反応を示す。対照的に、50μg以上の抗CD32a mAbをCD32Aマウスに静脈注射すると、中核体温は5分以上で2℃以上低下せず、循環血小板数が30分以内に50%以上減少しない場合、抗CD32a抗体は「固定化IgG試験」に適合する。
本明細書に含まれる実施例において、図1−17及び図36は(すなわち、「固定化IgG試験」を使用して)、エフェクター欠損であるが天然フォーマットではないキメラIV.3、キメラAT−10、ヒト化AT−10、及びヒトMDE−8 IgG抗CD32a mAbは、そのような抗CD32a抗体がIgG1又はIgG2アイソタイプのサブクラスのものであるかどうかにかかわらず、「固定化IgG試験」に適合することを実証する。とりわけ、「固定化IgG試験」によって試験した全ての天然抗CD32a IgG mAbは、これらの実施例では「固定化IgG試験」に適合しなかったが、「固定化IgG試験」によって試験した全てのエフェクター欠損抗CD32a IgG mAbは「固定化IgG試験」に適合した。
CD16、CD32、及び/又はCD64に対するFc依存性結合の能力が低下したエフェクター欠損抗体を操作する方法は、当技術分野で周知である。例えば、この結果を達成するために、エフェクター欠損抗体は、以下の変異のうちの一又は複数を有し得る:E233P、G237M、D265A、D265N、E269R、D270A、D270N、N297A、N297Q、N297D、N297R、S298N、T299A(番号はKabatのEUインデックスである)。
特定の実施形態において、Fc領域の変異は、治療用抗体の循環半減期を延長させることが知られている変異であるM252Y+S254T+T256E、G385D+Q386P+N389S、及びH433K+N434F+Y436Hから選択される(例えば、米国特許第8323962号)。
特定の実施態様では、免疫原性を促進することが当該分野で周知であるT細胞エピトープを除去するために、本発明の抗CD32a mAbが修飾される。
1.エフェクター欠損AT−10モノクローナル抗体
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、エフェクター欠損AT−10抗体である。一態様において、AT−10抗体は、
a.配列YYWMN(配列番号1)若しくはGFTFSYYW(配列番号73及び配列番号88)と同一であるか又はYYWMN(配列番号1)若しくはGFTFSYYW(配列番号73及び配列番号88)と比較して1個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列EIRLKSNNYATHYAESVKG(配列番号2)若しくはIRLKSNNYAT(配列番号74及び配列番号89)と同一であるか又はEIRLKSNNYATHYAESVKG(配列番号2)若しくはIRLKSNNYAT(配列番号74及び配列番号89)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列RDEYYAMDY(配列番号3)若しくはNRRDEYYAMDY(配列番号75及び配列番号90)と同一であるか又はRDEYYAMDY(配列番号3)若しくはNRRDEYYAMDY(配列番号75及び配列番号90)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RASESVDNFGISFMN(配列番号4)若しくはESVDNFGISF(配列番号76及び配列番号91)と同一であるか又はRASESVDNFGISFMN(配列番号4)若しくはESVDNFGISF(配列番号76及び配列番号91)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列GASNQGS(配列番号5)若しくはGAS(配列番号77及び配列番号92)と同一であるか又はGASNQGS(配列番号5)若しくはGAS(配列番号77及び配列番号92)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列QQSKEVPWT(配列番号6)若しくはQQSKEVPWT(配列番号78及び配列番号93)と同一であるか若しくはQQSKEVPWT(配列番号6)又はQQSKEVPWT(配列番号78及び配列番号93)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、エフェクター欠損AT−10抗体である。一態様において、AT−10抗体は、
a.配列YYWMN(配列番号1)若しくはGFTFSYYW(配列番号73及び配列番号88)と同一であるか又はYYWMN(配列番号1)若しくはGFTFSYYW(配列番号73及び配列番号88)と比較して1個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列EIRLKSNNYATHYAESVKG(配列番号2)若しくはIRLKSNNYAT(配列番号74及び配列番号89)と同一であるか又はEIRLKSNNYATHYAESVKG(配列番号2)若しくはIRLKSNNYAT(配列番号74及び配列番号89)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列RDEYYAMDY(配列番号3)若しくはNRRDEYYAMDY(配列番号75及び配列番号90)と同一であるか又はRDEYYAMDY(配列番号3)若しくはNRRDEYYAMDY(配列番号75及び配列番号90)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RASESVDNFGISFMN(配列番号4)若しくはESVDNFGISF(配列番号76及び配列番号91)と同一であるか又はRASESVDNFGISFMN(配列番号4)若しくはESVDNFGISF(配列番号76及び配列番号91)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列GASNQGS(配列番号5)若しくはGAS(配列番号77及び配列番号92)と同一であるか又はGASNQGS(配列番号5)若しくはGAS(配列番号77及び配列番号92)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列QQSKEVPWT(配列番号6)若しくはQQSKEVPWT(配列番号78及び配列番号93)と同一であるか若しくはQQSKEVPWT(配列番号6)又はQQSKEVPWT(配列番号78及び配列番号93)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
他の態様において、エフェクター欠損AT−10抗体は、配列番号8に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列、及び配列番号10に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む。
一態様において、エフェクター欠損AT−10抗体は、
a.配列番号16又は配列番号18に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号22に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
a.配列番号16又は配列番号18に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号22に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
別の実施態様において、エフェクター欠損ヒト化AT−10抗体は、配列番号12に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列;及び配列番号14に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む。
別の態様において、エフェクター欠損ヒト化AT−10抗体は、
配列番号20に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
配列番号24に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
配列番号20に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
配列番号24に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
2.エフェクター欠損IV.3モノクローナル抗体
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、エフェクター欠損IV.3抗体である。一態様において、IV.3抗体は、
a.配列NYGMN(配列番号25)若しくはGYTFTNYG(配列番号79)と同一であるか又は配列NYGMN(配列番号25)若しくはGYTFTNYG(配列番号79)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列WLNTYTGESIYPDDFKG(配列番号26)若しくはLNTYTGES(配列番号80)と同一であるか又は配列WLNTYTGESIYPDDFKG(配列番号26)若しくはLNTYTGES(配列番号80)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列GDYGYDDPLDY(配列番号27)若しくはARGDYGYDDPLDY(配列番号81)と同一であるか又は配列GDYGYDDPLDY(配列番号27)若しくはARGDYGYDDPLDY(配列番号81)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RSSKSLLHTNGNTYLH(配列番号28)若しくはKSLLHTNGNTY(配列番号82及び配列番号100)と同一であるか又は配列RSSKSLLHTNGNTYLH(配列番号28)若しくはKSLLHTNGNTY(配列番号82及び配列番号100)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列RMSVLAS(配列番号29)若しくはRMS(配列番号83及び配列番号101)と同一であるか又は配列RMSVLAS(配列番号29)若しくはRMS(配列番号83及び配列番号101)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列MQHLEYPLT(配列番号30)若しくはMQHLEYPLT(配列番号84及び配列番号102)と同一であるか又は配列MQHLEYPLT(配列番号30)若しくはMQHLEYPLT(配列番号84及び配列番号102)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、エフェクター欠損IV.3抗体である。一態様において、IV.3抗体は、
a.配列NYGMN(配列番号25)若しくはGYTFTNYG(配列番号79)と同一であるか又は配列NYGMN(配列番号25)若しくはGYTFTNYG(配列番号79)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列WLNTYTGESIYPDDFKG(配列番号26)若しくはLNTYTGES(配列番号80)と同一であるか又は配列WLNTYTGESIYPDDFKG(配列番号26)若しくはLNTYTGES(配列番号80)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列GDYGYDDPLDY(配列番号27)若しくはARGDYGYDDPLDY(配列番号81)と同一であるか又は配列GDYGYDDPLDY(配列番号27)若しくはARGDYGYDDPLDY(配列番号81)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RSSKSLLHTNGNTYLH(配列番号28)若しくはKSLLHTNGNTY(配列番号82及び配列番号100)と同一であるか又は配列RSSKSLLHTNGNTYLH(配列番号28)若しくはKSLLHTNGNTY(配列番号82及び配列番号100)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列RMSVLAS(配列番号29)若しくはRMS(配列番号83及び配列番号101)と同一であるか又は配列RMSVLAS(配列番号29)若しくはRMS(配列番号83及び配列番号101)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列MQHLEYPLT(配列番号30)若しくはMQHLEYPLT(配列番号84及び配列番号102)と同一であるか又は配列MQHLEYPLT(配列番号30)若しくはMQHLEYPLT(配列番号84及び配列番号102)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
他の態様において、エフェクター欠損IV.3抗体は、配列番号32に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列;及び配列番号34に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む。
一態様において、エフェクター欠損IV.3抗体は、
a.配列番号43又は配列番号45に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む重鎖配列;及び
b.配列番号51に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む軽鎖配列
を含む。
a.配列番号43又は配列番号45に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む重鎖配列;及び
b.配列番号51に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む軽鎖配列
を含む。
一実施態様では、エフェクター欠損IV.3抗体は、配列番号36又は配列番号38に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列;及び配列番号41又は配列番号85に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列を含むヒト化抗体である。
特定の実施態様において、エフェクター欠損ヒト化IV.3抗体は、
a.配列番号47又は配列番号49に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号53又は配列番号87に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
a.配列番号47又は配列番号49に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号53又は配列番号87に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
3.エフェクター欠損MDE−8モノクローナル抗体
幾つかの態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、エフェクター欠損MDE−8抗体である。幾つかの態様において、エフェクター欠損MDE−8抗体は、
a.配列SYGMH(配列番号54)若しくはGFTFSSY(配列番号94の残基1−7)と同一であるか又は配列SYGMH(配列番号54)若しくはGFTFSSY(配列番号94の残基1−7)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列VIWYDGSNYYYTDSVKG(配列番号55)若しくはIWYDGSNY(配列番号95)と同一であるか又は配列VIWYDGSNYYYTDSVKG(配列番号55)若しくはIWYDGSNY(配列番号95)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列DLGAAASDY(配列番号56)若しくはARDLGAAASDY(配列番号96)と同一であるか又は配列DLGAAASDY(配列番号56)若しくはARDLGAAASDY(配列番号96)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RASQGINSALA(配列番号57)若しくはQGINSA(配列番号97)と同一であるか又は配列RASQGINSALA(配列番号57)若しくはQGINSA(配列番号97)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列DASSLES(配列番号58)若しくはDAS(配列番号98)と同一であるか又は配列DASSLES(配列番号58)若しくはDAS(配列番号98)と比較して1個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列QQFNSYPHT(配列番号59)若しくはQQFNSYPHT(配列番号99)と同一であるか又は配列QQFNSYPHT(配列番号59)若しくはQQFNSYPHT(配列番号99)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
幾つかの態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、エフェクター欠損MDE−8抗体である。幾つかの態様において、エフェクター欠損MDE−8抗体は、
a.配列SYGMH(配列番号54)若しくはGFTFSSY(配列番号94の残基1−7)と同一であるか又は配列SYGMH(配列番号54)若しくはGFTFSSY(配列番号94の残基1−7)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列VIWYDGSNYYYTDSVKG(配列番号55)若しくはIWYDGSNY(配列番号95)と同一であるか又は配列VIWYDGSNYYYTDSVKG(配列番号55)若しくはIWYDGSNY(配列番号95)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列DLGAAASDY(配列番号56)若しくはARDLGAAASDY(配列番号96)と同一であるか又は配列DLGAAASDY(配列番号56)若しくはARDLGAAASDY(配列番号96)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RASQGINSALA(配列番号57)若しくはQGINSA(配列番号97)と同一であるか又は配列RASQGINSALA(配列番号57)若しくはQGINSA(配列番号97)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列DASSLES(配列番号58)若しくはDAS(配列番号98)と同一であるか又は配列DASSLES(配列番号58)若しくはDAS(配列番号98)と比較して1個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列QQFNSYPHT(配列番号59)若しくはQQFNSYPHT(配列番号99)と同一であるか又は配列QQFNSYPHT(配列番号59)若しくはQQFNSYPHT(配列番号99)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む。
他の態様において、エフェクター欠損MDE−8抗体は、配列番号61に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列;及び配列番号63に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、
a.配列番号65又は配列番号67に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号69に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
a.配列番号65又は配列番号67に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号69に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む。
組成物及び方法の実施態様の抗体は、完全ヒト、ヒト化、キメラ、組換え、又は合成であってもよい。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書に開示されるエフェクター欠損抗体とCD32aとの結合について競合する単離された抗体を含む。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書に記載のエフェクター欠損抗CD32a抗体を含む薬学的組成物を含む。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、エフェクター欠損MDE−8、IV.3又はAT−10モノクローナル抗体である。一実施態様では、エフェクター欠損MDE−8、IV.3、又はAT−10モノクローナル抗体がヒト化される。
1つ以上のアミノ酸で変異したFcドメインの少なくとも一部を含むCD32aに特異的に結合するエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体であって、CD16、CD32、又はCD64 IgG受容体へのFc媒介性結合を妨げる変異が包含される。
b.更なる抗体の実施態様
組成物及び方法の実施態様における抗体は、以下の機能的特徴の何れか又は全てを示し得る:
a.抗体の抗原結合部分は、水溶液中で10−8Mよりも強い(未満の)平衡親和定数値(「KD」)でヒトCD32aに結合する;
b.抗体の抗原結合部分は、ヒトCD32に結合し、ここでこのような結合は、そのような結合したCD32と任意のヒト又は治療用IgG分子のFc領域との間の安定な相互作用を阻害し、ここでこのようなヒト又は治療用IgG分子は、(1)少なくとも1つの抗原分子にFab依存的に結合しているか、又は(2)少なくとも2つのそのようなヒト又は治療用IgG分子の集合体にクラスター化されているか、又は(3)ヒト又は治療用IgG分子の水性拡散を制限する;
c.抗体は、Fc領域の少なくとも一部を含み、古典的なI型(CD64)、II型(CD32)、又はIII型(CD16)のヒトIgG受容体(FcガンマR)へのFc領域結合の能力を欠くか又は能力を減少させており、そのような結合の減少又は欠如は、対応する天然に存在する古典的なIgG−Fc領域(すなわち、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4の何れか)の結合よりも、20%、30%、40%、45%、又は50%以上比較的弱く、任意のそのような古典的なIgG−Fc領域は、CD16、CD32、又はCD64への結合を示す。
組成物及び方法の実施態様における抗体は、以下の機能的特徴の何れか又は全てを示し得る:
a.抗体の抗原結合部分は、水溶液中で10−8Mよりも強い(未満の)平衡親和定数値(「KD」)でヒトCD32aに結合する;
b.抗体の抗原結合部分は、ヒトCD32に結合し、ここでこのような結合は、そのような結合したCD32と任意のヒト又は治療用IgG分子のFc領域との間の安定な相互作用を阻害し、ここでこのようなヒト又は治療用IgG分子は、(1)少なくとも1つの抗原分子にFab依存的に結合しているか、又は(2)少なくとも2つのそのようなヒト又は治療用IgG分子の集合体にクラスター化されているか、又は(3)ヒト又は治療用IgG分子の水性拡散を制限する;
c.抗体は、Fc領域の少なくとも一部を含み、古典的なI型(CD64)、II型(CD32)、又はIII型(CD16)のヒトIgG受容体(FcガンマR)へのFc領域結合の能力を欠くか又は能力を減少させており、そのような結合の減少又は欠如は、対応する天然に存在する古典的なIgG−Fc領域(すなわち、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4の何れか)の結合よりも、20%、30%、40%、45%、又は50%以上比較的弱く、任意のそのような古典的なIgG−Fc領域は、CD16、CD32、又はCD64への結合を示す。
組成物及び方法の実施態様における抗体は、以下の構造的特徴の何れか又は全てを示し得る:
a.抗体は、単一IgG分子当たり合計4つのポリペプチドの以下の配置(アミノ酸組成に関して)を含む、該配置からなる又は本質的に該配置からなる:
i.少なくとも2つのシステイン−システインジスルフィド結合によって共有結合された2つの重鎖ポリペプチド、ここでこのような鎖間ジスルフィド結合は、ヒンジ領域内又はヒンジ領域付近に位置し、そのような重鎖ポリペプチドは、重鎖免疫グロブリン分子のIgGアイソタイプ(クラス1、2、3又は4、又はそれらのセグメントを含む任意のハイブリッドバージョン)のものであり、そのような重鎖ポリペプチドの各々は、1つの可変ドメイン(VH)の少なくとも一部及び1つ、2つ又は3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)又はその一部を含む。ハイブリッド定常領域IgG重鎖分子の例は、IgG1に由来するヒンジ領域を有するIgG1 CH1ドメインと、IgG2重鎖のCH2及びCH3ドメインのものに由来するポリペプチドの残りのカルボキシ末端部分とを有するものであろう;
ii.(上記の項目[i]の)単一の重鎖ポリペプチドに各々(個々に)共有結合した2つの軽鎖ポリペプチドであって、そのような共有結合は、単一の前記軽鎖と単一の前記重鎖ポリペプチドとの間の少なくとも1つのシステイン−システイン鎖間ジスルフィド結合からなり、そのような軽鎖ポリペプチドは、κ型又はλ型の軽鎖免疫グロブリン分子であり、それらの各々が少なくとも1つの可変ドメイン(VL)及び少なくとも1つの軽鎖定常ドメインを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる;
b.抗体は、見かけの分子量で、約100,000ダルトンより大きく約250,000ダルトン未満、約120,000ダルトンより大きく約180,000ダルトン未満、又は約140,000から約165,000ダルトンの見かけの分子量(非還元条件下で8%−12%ポリアクリルアミドゲルを使用するSDS−PAGE分析によって測定される)を有し得る;
c.抗体は、クラス1(IgG1)、2(IgG2)、3(IgG3)又は4(IgG4)の天然に存在するヒトIgGアイソタイプ分子の重鎖定常領域に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸組成を有する重鎖定常領域を有し得、ここでそのような同一性は、遺伝子配列決定によって見出されるか、又は関連する文献に報告されるように、又はヒト患者を治療するために使用される任意の治療用IgG抗体に見出されるように、任意のアイソタイプのヒトIgG重鎖に天然に存在する各対応する位置と比較して、抗体の各アミノ酸について決定され、ここでそのような同一性の比較は、比較されたポリペプチド間の同一性を最大にするのに十分な配列ギャップ長及び十分な量のギャップを可能にする。前記天然に存在するヒト抗体分子の組成物は、任意かつ全てのアロタイプ変異体を含む;(例えば、Jefferis R, Lefranc MP.Human immunoglobulin allotypes: possible implications for immunogenicity (2009 Jul-Aug) MAbs 1:332; PubMed ID: 20073133を参照);
d.抗体は、天然に存在するヒトカッパ又はラムダ型分子の軽鎖定常領域に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸組成を有する軽鎖定常領域を有し得、ここでそのような同一性は、遺伝子配列決定によって見出されるか、又は関連する文献に報告されるように、又はヒト患者を治療するために使用される任意の治療用抗体に見出されるように、ヒト軽鎖に天然に存在する各対応する位置と比較して、抗体の各アミノ酸について決定され、ここでそのような同一性の比較は、比較されたポリペプチド間の同一性を最大にするのに十分な配列ギャップ長及び十分な量のギャップを可能にする。前記天然に存在するヒト抗体分子の組成物は、任意かつ全ての可能なアロタイプ変異体を含む(例えば、Jefferis R, Lefranc MP.Human immunoglobulin allotypes: possible implications for immunogenicity (2009 Jul-Aug) MAbs 1:332; PubMed ID: 20073133を参照);
e.抗体は、哺乳類供給源(例えば、ヒト、霊長類、ウサギ、反芻動物、マウス又は他のげっ歯類)に由来する重鎖可変(VH)及び軽鎖可変(VL)ドメインを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる。VH又はVLをコードする供給源がヒトではない場合、抗体はキメラ(ヒト定常領域の存在による)又はヒト化(ヒトフレームワーク可変領域への非ヒトアミノ酸配列の移植による)の何れかであり得る;
f.一実施態様では、抗体は以下の何れに対してもコンジュゲートしていない:(1)細胞毒素(例えば、ビンクリスチン)、(2)放射性物質(例えば、111インジウム)、(3)造影剤(例えば、フルオレセイン)、(4)小分子治療薬(例えば、ブレオマイシン)、(5)治療用非抗体ポリペプチド(例えば、インターフェロン−γ)、(6)酵素(例えば、ペルオキシダーゼ)、(7)ワクチン物質(例えば、ウイルスポリペプチド)、又は(8)ポリエチレングリコール分子(例えば、PEG)。
g.一実施態様では、抗体は以下の何れかに対してコンジュゲートしている:(1)細胞毒素(例えば、ビンクリスチン)、(2)放射性物質(例えば、111インジウム)、(3)造影剤(例えば、フルオレセイン)、(4)小分子治療薬(例えば、ブレオマイシン)、(5)治療用非抗体ポリペプチド(例えば、インターフェロン−γ)、酵素(例えば、ペルオキシダーゼ)、(7)ワクチン物質(例えば、ウイルスポリペプチド)、又は(8)ポリエチレングリコール分子(例えば、PEG)。
a.抗体は、単一IgG分子当たり合計4つのポリペプチドの以下の配置(アミノ酸組成に関して)を含む、該配置からなる又は本質的に該配置からなる:
i.少なくとも2つのシステイン−システインジスルフィド結合によって共有結合された2つの重鎖ポリペプチド、ここでこのような鎖間ジスルフィド結合は、ヒンジ領域内又はヒンジ領域付近に位置し、そのような重鎖ポリペプチドは、重鎖免疫グロブリン分子のIgGアイソタイプ(クラス1、2、3又は4、又はそれらのセグメントを含む任意のハイブリッドバージョン)のものであり、そのような重鎖ポリペプチドの各々は、1つの可変ドメイン(VH)の少なくとも一部及び1つ、2つ又は3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)又はその一部を含む。ハイブリッド定常領域IgG重鎖分子の例は、IgG1に由来するヒンジ領域を有するIgG1 CH1ドメインと、IgG2重鎖のCH2及びCH3ドメインのものに由来するポリペプチドの残りのカルボキシ末端部分とを有するものであろう;
ii.(上記の項目[i]の)単一の重鎖ポリペプチドに各々(個々に)共有結合した2つの軽鎖ポリペプチドであって、そのような共有結合は、単一の前記軽鎖と単一の前記重鎖ポリペプチドとの間の少なくとも1つのシステイン−システイン鎖間ジスルフィド結合からなり、そのような軽鎖ポリペプチドは、κ型又はλ型の軽鎖免疫グロブリン分子であり、それらの各々が少なくとも1つの可変ドメイン(VL)及び少なくとも1つの軽鎖定常ドメインを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる;
b.抗体は、見かけの分子量で、約100,000ダルトンより大きく約250,000ダルトン未満、約120,000ダルトンより大きく約180,000ダルトン未満、又は約140,000から約165,000ダルトンの見かけの分子量(非還元条件下で8%−12%ポリアクリルアミドゲルを使用するSDS−PAGE分析によって測定される)を有し得る;
c.抗体は、クラス1(IgG1)、2(IgG2)、3(IgG3)又は4(IgG4)の天然に存在するヒトIgGアイソタイプ分子の重鎖定常領域に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸組成を有する重鎖定常領域を有し得、ここでそのような同一性は、遺伝子配列決定によって見出されるか、又は関連する文献に報告されるように、又はヒト患者を治療するために使用される任意の治療用IgG抗体に見出されるように、任意のアイソタイプのヒトIgG重鎖に天然に存在する各対応する位置と比較して、抗体の各アミノ酸について決定され、ここでそのような同一性の比較は、比較されたポリペプチド間の同一性を最大にするのに十分な配列ギャップ長及び十分な量のギャップを可能にする。前記天然に存在するヒト抗体分子の組成物は、任意かつ全てのアロタイプ変異体を含む;(例えば、Jefferis R, Lefranc MP.Human immunoglobulin allotypes: possible implications for immunogenicity (2009 Jul-Aug) MAbs 1:332; PubMed ID: 20073133を参照);
d.抗体は、天然に存在するヒトカッパ又はラムダ型分子の軽鎖定常領域に対して少なくとも85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸組成を有する軽鎖定常領域を有し得、ここでそのような同一性は、遺伝子配列決定によって見出されるか、又は関連する文献に報告されるように、又はヒト患者を治療するために使用される任意の治療用抗体に見出されるように、ヒト軽鎖に天然に存在する各対応する位置と比較して、抗体の各アミノ酸について決定され、ここでそのような同一性の比較は、比較されたポリペプチド間の同一性を最大にするのに十分な配列ギャップ長及び十分な量のギャップを可能にする。前記天然に存在するヒト抗体分子の組成物は、任意かつ全ての可能なアロタイプ変異体を含む(例えば、Jefferis R, Lefranc MP.Human immunoglobulin allotypes: possible implications for immunogenicity (2009 Jul-Aug) MAbs 1:332; PubMed ID: 20073133を参照);
e.抗体は、哺乳類供給源(例えば、ヒト、霊長類、ウサギ、反芻動物、マウス又は他のげっ歯類)に由来する重鎖可変(VH)及び軽鎖可変(VL)ドメインを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になる。VH又はVLをコードする供給源がヒトではない場合、抗体はキメラ(ヒト定常領域の存在による)又はヒト化(ヒトフレームワーク可変領域への非ヒトアミノ酸配列の移植による)の何れかであり得る;
f.一実施態様では、抗体は以下の何れに対してもコンジュゲートしていない:(1)細胞毒素(例えば、ビンクリスチン)、(2)放射性物質(例えば、111インジウム)、(3)造影剤(例えば、フルオレセイン)、(4)小分子治療薬(例えば、ブレオマイシン)、(5)治療用非抗体ポリペプチド(例えば、インターフェロン−γ)、(6)酵素(例えば、ペルオキシダーゼ)、(7)ワクチン物質(例えば、ウイルスポリペプチド)、又は(8)ポリエチレングリコール分子(例えば、PEG)。
g.一実施態様では、抗体は以下の何れかに対してコンジュゲートしている:(1)細胞毒素(例えば、ビンクリスチン)、(2)放射性物質(例えば、111インジウム)、(3)造影剤(例えば、フルオレセイン)、(4)小分子治療薬(例えば、ブレオマイシン)、(5)治療用非抗体ポリペプチド(例えば、インターフェロン−γ)、酵素(例えば、ペルオキシダーゼ)、(7)ワクチン物質(例えば、ウイルスポリペプチド)、又は(8)ポリエチレングリコール分子(例えば、PEG)。
組成物及び方法の実施態様における抗体は、以下の機能機能相関の何れか又は全てを示し得る:
a.抗体は、2つの重鎖−軽鎖対のそれぞれによって形成される可変(Fab)領域に由来する2つのCD32結合ドメインを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になり得、この二価構造のために、1つ又は2つの抗原エピトープの何れかに結合する能力を有する。
b.抗体のFc領域は、ヒトCD16、CD32、又はCD64 IgG受容体に結合する能力が減少させるか、又は完全に能力を欠くかの何れかであり、ここでこのようなIgG受容体結合活性の減少は、(1)2つ以上のIgG−Fc領域ポリペプチド配列の融合(例えば、ハイブリダイゼーション)、(2)Fc領域の糖分子の酵素的修飾(例えば、KabatのEUインデックスにおける位置297に位置するアスパラギン残基からの糖分子の修飾又は除去)、又は(3)IgG重鎖の定常領域中の1つ以上の位置で操作されたアミノ酸変異の何れかの結果であり、ここでそのような操作された変異は、以下の型の古典的なヒトIgG受容体:CD16、CD32、及びCD64へのFc依存性の結合を減少させるか又は排除する:
c.抗体は、ヒトCD32に結合すると、他のIgG抗体のFc領域の能力を阻害して前記CD32分子が炎症性細胞反応を直接誘導するようにする安定な免疫複合体を形成し、このような他のIgG抗体は、(1)少なくとも1つの抗原分子にFab依存的に結合するか、又は(2)少なくとも2つのそのようなIgG分子の集合体にクラスター化されるか、又は(3)前記IgG分子の水性拡散を制限するような様式で表面へ局在化される。
a.抗体は、2つの重鎖−軽鎖対のそれぞれによって形成される可変(Fab)領域に由来する2つのCD32結合ドメインを含むか、それらからなるか、又はそれらから本質的になり得、この二価構造のために、1つ又は2つの抗原エピトープの何れかに結合する能力を有する。
b.抗体のFc領域は、ヒトCD16、CD32、又はCD64 IgG受容体に結合する能力が減少させるか、又は完全に能力を欠くかの何れかであり、ここでこのようなIgG受容体結合活性の減少は、(1)2つ以上のIgG−Fc領域ポリペプチド配列の融合(例えば、ハイブリダイゼーション)、(2)Fc領域の糖分子の酵素的修飾(例えば、KabatのEUインデックスにおける位置297に位置するアスパラギン残基からの糖分子の修飾又は除去)、又は(3)IgG重鎖の定常領域中の1つ以上の位置で操作されたアミノ酸変異の何れかの結果であり、ここでそのような操作された変異は、以下の型の古典的なヒトIgG受容体:CD16、CD32、及びCD64へのFc依存性の結合を減少させるか又は排除する:
c.抗体は、ヒトCD32に結合すると、他のIgG抗体のFc領域の能力を阻害して前記CD32分子が炎症性細胞反応を直接誘導するようにする安定な免疫複合体を形成し、このような他のIgG抗体は、(1)少なくとも1つの抗原分子にFab依存的に結合するか、又は(2)少なくとも2つのそのようなIgG分子の集合体にクラスター化されるか、又は(3)前記IgG分子の水性拡散を制限するような様式で表面へ局在化される。
核酸、ベクター、及び宿主細胞
本発明はまた、本明細書に記載の抗体の何れかをコードする合成又は組換え核酸配列を提供する。そのような核酸は、例えば、本明細書に記載の抗体を産生することができるB細胞から単離される。そのような核酸は、本明細書に記載の重鎖及び軽鎖の配列をコードする。あるいは、そのような核酸は、それぞれ、本明細書に記載の重鎖及び軽鎖CDRを含む重鎖及び軽鎖の配列をコードする。幾つかの実施態様において、核酸は、本明細書に記載の抗体の機能的部分をコードするであろう。核酸コードの縮重により、複数の核酸が同じアミノ酸をコードし、全てが本明細書に包含される。包含される特定の核酸は、表1−5に記載されている。
本発明はまた、本明細書に記載の抗体の何れかをコードする合成又は組換え核酸配列を提供する。そのような核酸は、例えば、本明細書に記載の抗体を産生することができるB細胞から単離される。そのような核酸は、本明細書に記載の重鎖及び軽鎖の配列をコードする。あるいは、そのような核酸は、それぞれ、本明細書に記載の重鎖及び軽鎖CDRを含む重鎖及び軽鎖の配列をコードする。幾つかの実施態様において、核酸は、本明細書に記載の抗体の機能的部分をコードするであろう。核酸コードの縮重により、複数の核酸が同じアミノ酸をコードし、全てが本明細書に包含される。包含される特定の核酸は、表1−5に記載されている。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを含む。幾つかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸分子を含む宿主細胞を含む。
幾つかの態様において、本発明は、本明細書に開示される少なくとも1つの抗体をコードする核酸分子を含む。
抗体を作製する方法
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体を作製する方法が提供される。一態様では、本方法は、エフェクター欠損抗CD32a抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、分泌された抗体を単離することを含む。エフェクター欠損抗CD32a抗体をコードする核酸は、表1−5に記載の任意の核酸又はその断片又は変異体であり得る。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体を作製する方法が提供される。一態様では、本方法は、エフェクター欠損抗CD32a抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、分泌された抗体を単離することを含む。エフェクター欠損抗CD32a抗体をコードする核酸は、表1−5に記載の任意の核酸又はその断片又は変異体であり得る。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体を発現する宿主細胞が包含される。宿主細胞は哺乳動物細胞であってもよい。非限定的な例には、ヒト個体、げっ歯類、ウサギ、ラマ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、アペ、又はゴリラに由来する宿主細胞が含まれる。一実施態様では、前記宿主細胞は、ヒト細胞、マウス細胞、ウサギ細胞及び/又はラマ細胞を含む。
一実施態様では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、293(T)細胞、COS細胞、NS0細胞及び当技術分野で周知の他の細胞株を含み、本明細書に記載の抗体をコードする核酸配列を含む。宿主細胞は、商業的抗体産生(「産生細胞」)に適応させることができる。前記産生細胞の増殖は、エフェクター欠損抗CD32a抗体を産生することができる産生細胞株をもたらす。産生細胞株は、ヒトで使用するための化合物を産生するのに適している可能性がある。従って、前記産生細胞株は、病原性微生物などの病原体を含まなくてもよい。
更に提供されるのは、CD32aに特異的に結合することができる抗体を産生するための方法であり、該抗体は、固定化IgGによるCD32aの活性化を妨げるか、又はIgG免疫複合体によるCD32の活性化を妨げ、該方法は前記エフェクター欠損抗体を産生することができる抗体産生細胞を産生し、前記抗体産生細胞により産生された抗体を得ることを含む。
本明細書で提供される方法の1つによって得ることができる、単離された又は組換え抗体、並びに単離された又は組換え宿主細胞、又はその機能的等価物もまた提供される。
一実施態様では、抗体は、抗CD32a抗体(IV.3、AT−10、及びMDE−8)の軽鎖及び重鎖の可変領域をコードする核酸分子を得ることによって産生された。例えば、抗体は、これらの細胞株から単離されたリボ核酸(RNA)及び5’リーダーコード配列及び5’定常鎖コード配列に向けられたオリゴプライマーを用いた逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)によって、ハイブリドーマ細胞株から、又は2)抗CD32a抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域の既知の核酸配列を含む合成分子を産生することによって得ることができる。
一実施態様では、抗CD32a抗体の軽鎖及び重鎖のヒト化可変領域をコードする核酸分子は、本明細書に記載の修飾を有する既知の核酸配列を含む合成分子を(商業的に利用可能な手段により)産生することによって得られた。
一実施態様では、抗CD32a抗体(IV.3、AT−10、及びMDE−8)の軽鎖及び重鎖の可変領域をコードする核酸分子を、軽鎖定常領域(免疫グロブリンカッパ)及び重鎖定常領域(ヒトIgG1又はヒトIgG2)をコードするそれぞれの核酸配列を含有する市販のプラスミドベクターpFUSEにクローニングした。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、pFUSEプラスミドの重鎖定常領域コード配列上の部位特異的突然変異誘発によって核酸変異を作製することによって産生された。
一実施態様では、抗CD32a抗体は、抗体軽鎖及び重鎖の可変領域並びに定常領域をコードする核酸分子を含むpFUSEプラスミドベクターでヒト胚性腎臓細胞(例えばExpi293細胞)をトランスフェクトすることによって産生された。幾つかの態様において、核酸分子は、天然型(エフェクター能力のある)又は変異型(エフェクター欠損)フォーマットでのIgG1又はIgG2アイソタイプの、キメラ、ヒト化又はヒト抗CD32a mAbをコードした。
一実施態様では、トランスフェクトされた細胞によって分泌された抗CD32a抗体を、プロテインGカラム精製によって培養培地から精製し、使用前に緩衝食塩水で透析した。
薬学的組成物
本発明は、本明細書に記載の少なくとも1つのエフェクター欠損抗CD32a抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を含む。幾つかの実施態様において、薬学的組成物は、付加的活性薬剤を更に含む。
本発明は、本明細書に記載の少なくとも1つのエフェクター欠損抗CD32a抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を含む。幾つかの実施態様において、薬学的組成物は、付加的活性薬剤を更に含む。
特定の実施態様において、薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形態及び所望される投与量に依存して、当業者によって決定されるであろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R.Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995)を参照。特定の実施態様において、そのような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度及びインビボクリアランスの速度に影響し得る。
特定の実施態様において、薬学的組成物中の賦形剤は、本質的に水性又は非水性とすることができる。例えば、特定の実施態様では、適切な賦形剤は、注射用水、生理食塩水又は人工脳脊髄液とすることができ、場合によっては非経口投与のための組成物に一般的な他の材料を補充してもよい。幾つかの実施態様において、生理食塩水は等張リン酸緩衝食塩水を含む。特定の実施態様において、血清アルブミンと混合した中性緩衝食塩水又は生理食塩水は、更なる例示的な賦形剤である。特定の実施態様において、薬学的組成物は、約pH7.0−8.5のTris緩衝液、又は約pH4.0−5.5の酢酸緩衝液を含み、ソルビトール又はそれに適した代用物質を更に含むことができる。特定の実施態様において、少なくとも1つの付加的治療剤を含むか又は含まない、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体を含む組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態の任意の製剤(RemingtonのPharmaceutical Sciences、前出)と混合することによって貯蔵のために調製することができる。更に、特定の実施態様では、少なくとも1つの付加的治療剤を含むか又は含まない、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として処方することができる。
本発明の抗体/組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸性に、経鼻的に、口腔的に、経膣的に又は移植されたリザーバーを介して投与され得る。本明細書で使用される用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術を含む。
CD32a媒介性疾患及び障害
CD32a媒介性疾患及び障害には、ヘパリン誘発性血小板減少症(HIT)、免疫血小板減少性紫斑病(ITP)、抗リン脂質症候群(APS)、自己免疫又は特定の薬物(例えば、ヘパリン)に関連する血栓症、及び抗体療法(例えば、抗VEGF又は抗CD40L免疫療法)、輸血又は臓器移植の反応、特定のウイルス感染、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、変形性関節症、全身性エリテマトーデス(SLE)、喘息、アレルギー性鼻炎、ループス腎炎、抗体媒介性貧血、アナフィラキシー及び気道炎症が含まれる。例えば、Gillis C et al.Contribution of Human FcgammaRs to Disease with Evidence from Human Polymorphisms and Transgenic Animal Studies (2014 May 30) Front Immunol 5:254; PubMed ID: 24910634; Bruhns P.Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models (2012 Jun 14) Blood, 119(24):5640-9, PubMed ID: 22535666; and Hogarth PM and Pietersz GA, Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond (2012 Mar 30) Nat Rev Drug Discov 11(4):311-31, PubMed ID: 22460124を参照。
CD32a媒介性疾患及び障害には、ヘパリン誘発性血小板減少症(HIT)、免疫血小板減少性紫斑病(ITP)、抗リン脂質症候群(APS)、自己免疫又は特定の薬物(例えば、ヘパリン)に関連する血栓症、及び抗体療法(例えば、抗VEGF又は抗CD40L免疫療法)、輸血又は臓器移植の反応、特定のウイルス感染、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患、変形性関節症、全身性エリテマトーデス(SLE)、喘息、アレルギー性鼻炎、ループス腎炎、抗体媒介性貧血、アナフィラキシー及び気道炎症が含まれる。例えば、Gillis C et al.Contribution of Human FcgammaRs to Disease with Evidence from Human Polymorphisms and Transgenic Animal Studies (2014 May 30) Front Immunol 5:254; PubMed ID: 24910634; Bruhns P.Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models (2012 Jun 14) Blood, 119(24):5640-9, PubMed ID: 22535666; and Hogarth PM and Pietersz GA, Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond (2012 Mar 30) Nat Rev Drug Discov 11(4):311-31, PubMed ID: 22460124を参照。
特定の実施態様では、CD32a媒介性疾患又は障害は血小板減少症である。血小板減少症は循環血小板の減少によって特徴付けられる。一実施態様では、血小板減少症は、正常値の下限値(通常は150x109/Lとする)より小さい血小板数として定義される。他の実施態様では、血小板減少症は、循環血小板の数の減少として定義される。例えば、血小板数が150x109/Lを下回っていなくても、ヘパリン投与後の血小板数の30−50%以上の減少は、ヘパリン誘発性血小板減少症の症状である可能性がある。(Warkentin TE.Clinical presentation of heparin-induced thrombocytopenia (Oct 1998) Semin Hematol 35(4 Suppl 5):9-16; discussion 35-6; PubMed ID: 9855179)。血小板数は、典型的には電子計数法によって、通常は完全血球数(CBC)の一部として測定される。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより血小板減少症を治療するための方法が包含される。
別の実施態様において、CD32a媒介性疾患又は障害は、IgG媒介性血栓症である。一実施態様において、IgG媒介性血栓症は、IgG免疫複合体によって又は固定化IgGによって引き起こされる血栓症である(例えば、Reilly MP et al.Heparin-induced thrombocytopenia/thrombosis in a transgenic mouse model requires human platelet factor 4 and platelet activation through FcgammaRIIA.Blood.2001 Oct 15;98(8):2442-7.PubMed ID: 11588041;また、Taylor SM et al.Thrombosis and shock induced by activating antiplatelet antibodies in human FcgammaRIIA transgenic mice: the interplay among antibody, spleen, and Fc receptor.Blood.2000 Dec 15;96(13):4254-60.PubMed ID: 11110699をそれぞれ参照).本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は組み合わせによりIgG媒介性血栓症を治療するための方法が包含される。IgG媒介性血栓症の治療のための方法であって、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の単独又は組み合わせを、単独又は他の療法と組み合わせて投与することを含む方法であって、ここでIgG血栓症はIgG免疫複合体によって引き起こされる任意の血栓症である。
幾つかの態様において、CD32a媒介性疾患又は障害は、少なくとも部分的に、血小板、単球、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ、樹状細胞(Boruchov AM et al.Activating and inhibitory IgG Fc receptors on human DCs mediate opposing functions (Oct 2005) J Clin Invest 115:2914; PubMed ID: 16167082)、肥満細胞、真皮微小血管内皮細胞(Groeger M et al.Dermal microvascular endothelial cells express CD32 receptors in vivo and in vitro (15 Feb 1996) J Immunol 156:1549; PubMed ID: 8568259)を含む細胞上又は細胞内でのCD32aの活性化によって引き起こされる(Hogarth PM et al.Fc receptor-targeted therapies for the treatment of inflammation, cancer and beyond (30 Mar 2012) Nat Rev Drug Discov 11:311; PubMed ID: 22460124)。幾つかの他の態様では、CD32a媒介性疾患又は障害、例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、結節性小裂開細胞リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、T細胞白血病/リンパ腫、成人T細胞白血病、濾胞性リンパ腫、B系統のびまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症(AILD)様T細胞リンパ腫、HIV関連の体腔に基づくリンパ腫、胎児性癌腫、鼻咽頭の未分化癌腫、キャッスルマン病、カポジ肉腫及び他のB細胞リンパ腫は悪性細胞上のCD32aの活性化によって少なくとも部分的に引き起こされる。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることによりCD32aの活性化によって特徴付けられる疾患又は障害を治療するための方法が包含される。
一実施態様において、CD32a媒介性疾患又は障害は、免疫性、自己免疫性、アレルギー性又は炎症性の疾患又は障害である。免疫性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性障害は、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、抗リン脂質症候群(APS)、アトピー性皮膚炎、慢性炎症性肺疾患、変形性関節症、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、全身性紅斑、グレーブス病、橋本甲状腺炎、ウェグナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病、急性感染性単核球症、HIV、ヘルペスウイルス関連疾患、多発性硬化症、溶血性貧血、甲状腺炎、スティフマン症候群、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、抗体介在性関節炎、又は抗体誘発性貧血若しくは血球減少症を挙げることができる。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は組み合わせにより免疫性、自己免疫性、アレルギー性、又は炎症性の疾患又は障害を治療するための方法が包含される。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせて、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、抗リン脂質症候群(APS)、アトピー性皮膚炎、慢性炎症性肺疾患、変形性関節症、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、抗体介在性関節炎、又は抗体誘発性貧血若しくは血球減少症を治療するための方法が包含される。
CD32a媒介性疾患又は障害は、免疫複合体媒介性疾患又は障害であって良い。免疫複合体介在性疾患又は障害は、この場合、例えば、RAにおける単球からの腫瘍壊死因子α(TNF−α、炎症性サイトカイン)のIgG誘発性放出によって引き起こされる炎症(Mathsson L et al.Immune complexes from rheumatoid arthritis synovial fluid induce FcgammaRIIa dependent and rheumatoid factor correlated production of tumour necrosis factor-alpha by peripheral blood mononuclear cells (2006) Arthritis Res Ther 8:R64; PubMed ID: 16569263)、又はSLE及び糸球体腎炎における多形核細胞(好中球、好塩基球、好酸球)によって引き起こされる腎臓損傷(Suzuki Y et al.Pre-existing glomerular immune complexes induce polymorphonuclear cell recruitment through an Fc receptor-dependent respiratory burst: potential role in the perpetuation of immune nephritis (2003 Mar 15) J Immunol 170:3243; PubMed ID: 12626583; Rovin BH.The chemokine network in systemic lupus erythematous nephritis (2008 Jan 1) Front Biosci 13:904; PubMed ID: 17981599)の細胞及び組織に損傷を与える局在性又は全身性の炎症過程により特徴付けられる。免疫複合体媒介性疾患又は障害には、多数の他の急性及び慢性状態が含まれる(Gillis C et al.Contribution of Human FcgammaRs to Disease with Evidence from Human Polymorphisms and Transgenic Animal Studies (2014 May 30) Front Immunol 5:254; PubMed ID: 24910634)。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより免疫複合体媒介性疾患又は障害を治療するための方法が包含される。免疫複合体形成に関連することが知られている疾患又は障害には、関節リウマチ(RA)、全身性エリテマトーデス(SLE)、ヘパリン誘発性血小板減少症(HIT)、ループス腎炎、及びAPSが挙げられる。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより関節リウマチ(RA)、全身性エリテマトーデス(SLE)、ヘパリン誘発性血小板減少症(HIT)、ループス腎炎、及びAPSを治療するための方法が包含される。
そのような疾患又は障害と関連する免疫複合体の型には、循環IgG免疫複合体、沈着IgG免疫複合体、及び固定化IgG免疫複合体が含まれる。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより循環IgG免疫複合体、沈着IgG免疫複合体、及び固定化IgG免疫複合体によって特徴付けられる疾患又は障害を治療するための方法が包含される。
一実施態様では、循環IgG免疫複合体、沈着IgG免疫複合体、又は固定化IgG免疫複合体によって特徴付けられる疾患又は障害には、循環IgG免疫複合体によって特徴付けられるRA及びSLEが含まれる。例えば、Zhao X et al.Circulating immune complexes contain citrullinated fibrinogen in rheumatoid arthritis (2008) Arthritis Res Ther 10:R94; PubMed ID: 18710572; Ohyama K et al.Immune complexome analysis of serum and its application in screening for immune complex antigens in rheumatoid arthritis (2011 Jun) Clin Chem 57:905; PubMed ID: 21482748; Soares NM et al.An improved anti-C3/IgG ELISA for quantification of soluble immune complexes (1 Mar 2001) J Immunol Methods 249:199; PubMed ID: 11226477;及びHuber C et al.C3-containing serum immune complexes in patients with systemic lupus erythematosus: correlation to disease activity and comparison with other rheumatic diseases (1989) Rheumatol Int 9:59; PubMed ID: 2814209)を参照。RA又はSLEが循環IgG免疫複合体によって特徴付けられるRA及びSELを、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより治療するための方法が包含される。
一実施態様では、循環IgG免疫複合体、沈着IgG免疫複合体、又は固定化IgG免疫複合体によって特徴付けられる疾患又は障害には、循環細胞又は粒子に、又は組織中に沈着したIgG免疫複合体によって特徴付けられるRA、SLE、及びAPSが含まれる。例えば、Zhao X et al.Circulating immune complexes contain citrullinated fibrinogen in rheumatoid arthritis (2008) Arthritis Res Ther 10:R94; PubMed ID: 18710572; Nielsen CT et al.Increased IgG on cell-derived plasma microparticles in systemic lupus erythematosus is associated with autoantibodies and complement activation (Apr 2012) Arthritis Rheum 64:1227; PubMed ID: 22238051;及びde Groot PG et al.The significance of autoantibodies against beta-2 glycoprotein I (Jul 12, 2012) Blood 120:266; PubMed ID: 22553312)を参照。RA、SLE又はAPSが循環細胞又は粒子に沈着したIgG免疫複合体によって特徴付けられるRA、SLE、及びAPSを、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより治療するための方法が包含される。
一実施態様では、循環IgG免疫複合体、沈着IgG免疫複合体、又は固定化IgG免疫複合体によって特徴付けられる疾患又は障害にはRA、SLE、HIT、及びAPSが含まれ、ここではRA、SLE、HIT、又はAPSは可溶性又は固定化免疫複合体によって特徴付けられる。例えば、Ohyama K et al.Immune complexome analysis of serum and its application in screening for immune complex antigens in rheumatoid arthritis (2011 Jun) Clin Chem 57:905; PubMed ID: 21482748; Roennelid J et al.Immune complexes from SLE sera induce IL10 production from normal peripheral blood mononuclear cells by an FcgammaRII dependent mechanism: implications for a possible vicious cycle maintaining B cell hyperactivity in SLE (Jan 2003) Ann Rheum Dis 62:37; PubMed ID: 12480667; Cines DB et al.Heparin-induced thrombocytopenia: an autoimmune disorder regulated through dynamic autoantigen assembly/disassembly (Feb 2007) J Clin Apher 22:31; PubMed ID: 17285619;及びde Groot PG et al.The significance of autoantibodies against beta-2 glycoprotein I (Jul 12, 2012) Blood 120:266; PubMed ID: 22553312を参照。RA、SLE、HIT、又はAPSが可溶性又は固定化免疫複合体によって特徴付けられるRA、SLE、HIT、又はAPSを、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより治療するための方法が包含される。
重要なことに、上記免疫複合体の2つ以上の型が、これら及び他の免疫複合体の疾患及び障害において同時に又は異なる時点で存在し得る。このシナリオにおいてさえ、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体は、疾患及び障害の1つ又は全てを治療するために投与され得る。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の何れか1つ又は任意の組み合わせを投与することを含む、PF4に結合する抗体によって特徴付けられる疾患又は障害を治療する方法が包含される。ヒト血小板因子4(PF4)に対する抗体は、RA、APS、SLE及びHITにおいて同定されている。例えば、Ohyama K et al.Immune complexome analysis of serum and its application in screening for immune complex antigens in rheumatoid arthritis (2011 Jun) Clin Chem 57:905; PubMed ID: 21482748; Sikara MP et al.Beta 2 Glycoprotein I binds platelet factor 4 (PF4): implications for the pathogenesis of antiphospholipid syndrome (Jan 21 2010) Blood 115:713; PubMed ID: 19805618; Satoh T et al.Heparin-dependent and -independent anti-platelet factor 4 autoantibodies in patients with systemic lupus erythematosus (2012 Sep) Rheumatology (Oxford) 51:1721 PubMed ID: 22718864;及びWarkentin TE et al.HITlights: a career perspective on heparin-induced thrombocytopenia (2012 May) Am J Hematol 87:S92; PubMed ID: 22367928を参照。従って、一実施態様において、RA、APS、SLE、又はHITが、PF4に結合する抗体によって特徴付けられるRA、APS、SLE及びHITを治療する方法であって、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の何れか1つ又は任意の組み合わせを、単独又は既存の療法と組み合わせて投与することを含む方法が包含される。
HITでは、抗PF4 IgG抗体は血小板CD32aを介して血小板減少症及び血栓症を媒介することが知られており、ここではヘパリンの治療量(ヘパリンはPF4抗原に結合する)がHIT免疫複合体を血小板表面に局在させる重要な役割を果たす。例えば、Newman PM et al.Heparin-induced thrombocytopenia: new evidence for the dynamic binding of purified anti-PF4-heparin antibodies to platelets and the resultant platelet activation (1 Jul 2000) Blood 96:182; PubMed ID: 10891449を参照。
一実施態様において、免疫複合体媒介性疾患は、非抗CD32a抗体又はその抗原結合断片の投与によって引き起こされる抗治療抗体(ATA)応答である。非抗CD32a抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブ、IgG−Fc融合治療剤、エタネルセプト、セソリズマブペゴール、ゴリムマブ、エタネルセプト、ウステキヌマブ、ベバシズマブ、オマリズマブ、ベリムマブ、又はタブルマブであり得る。これらの方法の実施態様において、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、非抗CD32aモノクローナル抗体の前、同時、又は後に投与され得る。
一実施態様では、免疫複合体媒介性疾患又は障害は、RA、SLE、HIT、ループス腎炎又は抗リン脂質症候群(APS)の治療のための非抗CD32aモノクローナル抗体で治療される患者において生じる。患者が非抗CD32aモノクローナル抗体を投与されているか又は投与された、RA、SLE、HIT、ループス腎炎、又は抗リン脂質症候群(APS)を、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせることにより治療するための方法が包含される。
他の実施態様において、疾患又は障害は止血障害である。止血障害は、抗体媒介性血小板減少症、免疫媒介性血小板減少症(ITP)、ヘパリン誘発性血小板減少症(HIT)、及び血栓症を伴うヘパリン誘発性血小板減少症(HITT)からなる群から選択され得る。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は組み合わせを投与することを含む、止血障害を治療するための方法が包含される。また、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の単独又は組み合わせを、単独又は他の療法(例えば、抗凝固剤)と組み合わせて投与することを含む、抗体媒介性血小板減少症、免疫媒介性血小板減少症(ITP)、ヘパリン誘発性血小板減少症(HIT)、及び血栓症を伴うヘパリン誘発性血小板減少症(HITT)を治療するための方法も包含される。
また、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は任意の組み合わせを投与することを含む、IV−Igを有する患者の治療によって引き起こされる止血障害を治療する方法であって、このようなエフェクター欠損抗体が、IV−Igの前、IV−Igの同時、又はIV−Ig処理の後に投与される方法も包含される。IV−Igは、自己免疫及び移植患者の治療に有用であるが、血小板減少症及び急性動脈血栓症及び静脈血栓症、アナフィラキシーショック、一過性腎不全、感染リスクの増大、及び白血球減少症などの副作用を伴う。血栓症はIV−Igによる治療においてますます認められている(Paran D et al.Venous and arterial thrombosis following administration of intravenous immunoglobulins (Jul (2005) Blood Coagul Fibrinolysis 16:313; PubMed ID: 15970713; Woodruff RK et al.Fatal thrombotic events during treatment of autoimmune thrombocytopenia with intravenous immunoglobulin in elderly patients (Jul 1986) Lancet 2:217; PubMed ID: 2873457)。IV−Igの使用において観察される重篤な血栓塞栓事象には、深部静脈血栓症(DVT)、心筋梗塞(MI)、肺塞栓症(PE)、網膜中心静脈閉塞、脳血管障害(CVA)が含まれる。Pollreiszと同僚は、IVIgは、CD32依存的に血小板の活性化、凝集、脱顆粒、及び血小板からの炎症性サイトカイン放出を誘導することができ、そしてこのIVIg誘導性CD32依存性血小板活性化はAT−10によって完全に遮断されることを示し、血小板CD32がIVIg誘発性血栓形成促進性活性に必要かつ十分であることが実証された(Pollreisz A et al.Intravenous immunoglobulins induce CD32-mediated platelet aggregation in vitro (Sep 2008) Br J Dermatol 159:578; PubMed PMID: 18565176)。
更に他の実施態様では、CD32a媒介性疾患又は障害はアレルギー性疾患である。アレルギー性障害は、喘息、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー、及びアレルギー反応からなる群から選択され得る。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は組み合わせを投与することを含む、アレルギー性障害を治療するための方法が包含される。同様に、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は任意の組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせて投与することを含む、喘息、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、アナフィラキシー及びアレルギー反応を治療するための方法が包含される。
ヒト血小板の表面上のCD32 IgG受容体及びCD23 IgE受容体の両方の存在は(Hasegawa S et al.Functional expression of the high affinity receptor for IgE (FcepsilonRI) in human platelets and its' [sic] intracellular expression in human megakaryocytes (Apr 1999) Blood 93:2543; PubMed ID: 10194433)、喘息及び慢性肺疾患において起こるように、特に肺炎症において明らかである、血小板とアレルギーとの間の不可欠な関連を示す(Page C et al.Platelets and allergic inflammation (Jul 2014) Clin Exp Allergy 44:901; PubMed ID: 24708345)。ヒト扁桃腺B細胞上のCD32のIV.3又はAT−10遮断が、誘導性IgG及び誘導性IgE合成の両方を抑制することが示されている未成熟Bリンパ球についても、CD32とCD23の間の関連が認められている(Horejs-Hoeck J et al.Inhibition of immunoglobulin E synthesis through Fc gammaRII (CD32) by a mechanism independent of B-cell receptor co-cross-linking (Jul 2005) Immunology 115:407; PubMed ID: 15946258)。CD32/CD23相乗作用の機構的説明は、CD32aを有する細胞において抗炎症状態を誘導するためのIV.3及びAT−10の能力において最近同定された(Ben Mkaddem S et al.Shifting Fc[gamma]RIIA- ITAM from activation to inhibitory configuration ameliorates arthritis (Sep 2014) J Clin Invest 124:3945; PubMed PMID: 25061875)。アレルギーにおけるCD32aの役割は、止血の障害にも関連する可能性がある(Potaczek DP.Links between allergy and cardiovascular or hemostatic system (Jan 2014) Int J Cardiol 170:278; PubMed ID: 24315352)。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体は、CD32aを提示する細胞における反応によって駆動される炎症を抑制するために使用され、そのようなCD32aは、血小板又は赤血球の表面などの表面に固定化されたIgG分子に結合する。例えば、固定化IgGは、血小板CD32aに結合して活性化し、接着及び顆粒分泌をもたらし、このプロセスはIV.3によって遮断されることが示されている(Haimovich B et al.The FcgammaRII receptor triggers pp125FAK phosphorylation in platelets (July 1996) J Biol Chem 271:16332; PubMed ID: 8663117)。更に、IgGIgGで被覆された赤血球はCD32aを介して貪食され、この活性はIV.3によって阻害される(Wiener E et al.Role of Fc gamma RIIa (CD32) in IgG anti-RhD-mediated red cell phagocytosis in vitro (Sep 1996) Transfus Med 6:235; PubMed ID: 8885153)。更に、IgGで被覆された細胞は、SLE患者ではCD32a依存的に排除され、このクリアランスはIV.3によって阻害されることが知られている(Seres T et al.Correlation of Fc gamma receptor expression of monocytes with clearance function by macrophages in systemic lupus erythematosus (Sep 1998) Scand J Immunol 48:307; PubMed ID: 9743218)。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体は、CD32aを提示する細胞における反応によって駆動される炎症を抑制するために使用され、ここではそのようなCD32aは、フォンビルブラント因子(vWF)などの自己抗原に結合したIgG分子と相互作用し、CD32a陽性細胞に局在化し、IV.3によって阻害されることが知られている炎症性活性化を導く(例えば、Hoylaerts MF et al.Recurrent arterial thrombosis linked to autoimmune antibodies enhancing von Willebrand factor binding to platelets and inducing Fc gamma RII receptor-mediated platelet activation (Apr 1998) Blood 91:2810; PubMed ID: 9531591を参照)。従って、1つ又は複数のエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体を投与し、それによって炎症を抑制する、炎症を抑制するための方法が包含される。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体は、感染性ウイルスによって引き起こされる炎症を抑制するために使用される。例えば、IV.3は、ヒト肥満細胞のデングウイルス感染を阻害することが知られている(Brown MG et al.A dominant role for FcgammaRII in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells and associated CCL5 release (Dec 2006) J Leukoc Biol 80:1242; PubMed ID: 16940332)。従って、炎症が感染性ウイルスによって媒介される場合、1つ又は複数のエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体を投与し、それによって炎症を抑制する、炎症を抑制するための方法が包含される。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体は、感染性微生物によって引き起こされる炎症を抑制するために使用される。例えば、黄色ブドウ球菌は感染性心内膜炎を引き起こし、IV.3によって阻害される血小板駆動型CD32a炎症反応性を誘導する(Fitzgerald JR et al.Fibronectin-binding proteins of Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus gordonii, Streptococcus oralis, and Streptococcus pneumoniae mediate activation of human platelets via fibrinogen and fibronectin bridges to integrin GPIIb/IIIa and IgG binding to the FcgammaRIIa receptor (Jan 2006) Mol Microbiol 59:212; PubMed ID: 16359330; Arman M et al.Amplification of bacteria-induced platelet activation is triggered by Fc[gamma]RIIA, integrin [alpha]IIb[beta]3, and platelet factor 4 (May 2014) Blood 123:3166; PubMed ID: 24642751)。同様に、グラム陽性敗血症における全身性炎症、敗血症関連血管漏出、血小板活性化及び凝固機能不全はCD32a媒介性であり、これらの炎症過程はIV.3によって遮断される(Sun D et al.Bacillus anthracis peptidoglycan activates human platelets through Fc[gamma]RII and complement (Jul 2013) Blood 122:571; PubMed ID: 23733338)。従って、炎症が感染性微生物によって媒介される場合、1つ又は複数のエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体を投与し、それによって炎症を抑制する、炎症を抑制するための方法が包含される。
一実施態様では、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体は、IV−Igとともに、又はIV−Igの代わりに患者に対して治療として投与される。静脈内免疫グロブリン(IgG)又は「IV−Ig」は、原発性液性免疫不全、多巣性運動ニューロパシー、B細胞慢性リンパ球性白血病、免疫性血小板減少性紫斑病、川崎病候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーを含む様々な自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療のためにFDAによって承認されている。また、IVIgは、新生児の同種免疫性血小板減少症、HIV関連血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、骨髄移植患者における間質性肺炎又はサイトメガロウイルス感染、水疱性類天疱瘡、後天性表皮水疱症、粘膜類天疱瘡、壊死性筋膜炎、落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、中毒性表皮壊死症又はスティーブンス・ジョンソン症候群、バードショット網膜症、ギラン・バレー症候群、ランバート・イートン筋萎縮症候群、重症筋無力症、オプソクローヌス・ミオクローヌス、多発神経根障害、難治性皮膚筋炎、難治性多発性筋炎、再発寛解型多発性硬化症を治療するために使用される。エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体は、これらの状態を治療するために使用され得る。
方法の実施態様のそれぞれにおいて、CD32a媒介性疾患又は障害は、ショックの症状によって特徴付けられ得る。本明細書中で使用される場合、用語「ショック」とは、限定するものではないが、I型の過敏性反応(すなわち、IgEによって媒介される)、II型の過敏性反応(すなわち、固定化IgGによって媒介される)、又はIII型の過敏性反応(すなわち、IgG複合体によって媒介される)、IgG媒介性血栓性反応、及びIgG媒介性神経学的反応を含む。本明細書に記載のエフェクター欠損抗体の何れか1つ又は組み合わせを単独又は他の療法と組み合わせて投与することを含むショックの症状を緩和するための方法が包含される。
例示的な実施態様
一実施態様では、ヒト被験体におけるCD32a媒介性疾患又は障害を治療するための方法であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の治療的有効量をヒト被験体に投与することを含み、それによりCD32a媒介性疾患又は障害を治療する方法が提供される。
一実施態様では、ヒト被験体におけるCD32a媒介性疾患又は障害を治療するための方法であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の治療的有効量をヒト被験体に投与することを含み、それによりCD32a媒介性疾患又は障害を治療する方法が提供される。
一実施態様では、エフェクター欠損抗体は、IgG免疫複合体試験及び固定化IgG試験の両方に適合し、かつCD16、CD32及び/又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除するように改変されたFC領域を有する。
本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、CD32a媒介性疾患又は障害は、IgG媒介性止血障害であり得る。止血障害は、血小板減少症の有無にかかわらず、血栓症であり得る。止血障害は、IgG媒介性血小板減少症、免疫媒介性血小板減少症(ITP)、抗リン脂質症候群(APS)、抗血小板抗体障害、ヘパリン誘発性血小板減少症(HIT)、血栓症を伴うヘパリン誘発性血小板減少症(HITT)、がん誘発性血小板活性化、がん誘発性凝固性亢進、血小板媒介性腫瘍細胞転移、及び血小板媒介性がん転移からなる群から選択され得る。
本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、CD32a媒介性疾患又は障害は、血小板、単球、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ、樹状細胞、滑膜細胞、肥満細胞、又は皮膚微小血管内皮細胞上におけるCD32aのIgG−Fc媒介性活性化によって特徴付けられ得る。
本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、CD32a媒介性疾患又は障害は、IgG媒介性免疫性、自己免疫性又は炎症性疾患又は障害であり得る。IgG媒介性免疫、自己免疫又は炎症性障害は、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、抗リン脂質症候群(APS)、変形性関節症、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、IgG抗体誘発性貧血、及びIgG媒介性血球減少からなる群から選択され得る。
本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、CD32a媒介性疾患又は障害は、IgG免疫複合体媒介性疾患又は障害であり得る。IgG免疫複合体媒介性疾患は、非抗CD32aモノクローナル抗体又はその断片の投与によって引き起こされる抗治療抗体(ATA)応答であり得る。本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、非抗CD32a抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ペゴール(抗体様)、ゴリムマブ、エタネルセプト(抗体様)、ウステキヌマブ、オマリズマブ又はベバシズマブであり得る。本明細書に記載の方法の実施態様の何れかにおいて、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、非抗CD32aモノクローナル抗体の前、同時、又は後に投与され得る。単独で又は他の方法と組み合わせた方法の実施態様の何れかにおいて、IgG免疫複合体媒介性疾患又は障害は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、又は潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患(IBD)の治療のために、非抗CD32aモノクローナル抗体により治療されている患者において生じ得る。
方法の実施態様の何れかにおいて、CD32a媒介性疾患又は障害は、ヒト被験体の血液中を循環する細胞の表面に局在するIgGにより特徴付けられ得る。循環細胞型は、以下の1つ以上であり得る:血小板、赤血球、単球、好中球、好塩基球、好酸球、Bリンパ球、マクロファージ、肥満細胞、白血病細胞、又はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物などの微生物。方法の実施態様の何れかにおいて、細胞表面に局在化するIgGによって特徴付けられる疾患又は障害は、以下の1つ以上であり得る:血小板減少症、白血球減少症、好中球減少症、リンパ球減少症、単球減少症、貧血、溶血性貧血、又は敗血症。
幾つかの実施態様では、ヒト被験体におけるI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するための方法であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の治療的有効量をヒト被験体に投与することを含み、それによりI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する方法が提供される。この実施態様及び方法の実施態様の何れかにおいて、又は方法の実施態様の任意の組み合わせにおいて、エフェクター欠損抗体は、IgG免疫複合体試験及び固定化IgG試験の両方に適合し、かつCD16、CD32及び/又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除するように改変されたFC領域を有する。方法の実施態様の何れかにおいて、アレルギー性疾患は、アトピー、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、全身性アナフィラキシー、花粉症、喘息、蕁麻疹、食物アレルギー、及び湿疹に示されるような局所化されたアナフィラキシー、ワクチンに対するアレルギー反応、食品に対するアレルギー反応、アレルギー反応、昆虫生産物に対するアレルギー反応、薬物に対するアレルギー反応、カビ胞子に対するアレルギー反応、動物の毛及びふけに対するアレルギー反応、ラテックスに対するアレルギー反応、輸血反応、血小板輸血反応、赤血球輸血反応、胎児赤芽球症、溶血性貧血、血清病、インフュージョンリアクション、壊死性血管炎、糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、及び微生物に対するアレルギー反応からなる群から選択され得る。
様々な実施態様の任意の組み合わせを含む、本明細書に記載の方法の実施態様のそれぞれにおいて、エフェクター欠損抗CD32a抗体は、エフェクター欠損MDE−8、IV.3又はAT−10モノクローナル抗体であり得、かつモノクローナル抗体はヒト又はヒト化されていてもよい。
様々な方法の実施態様の任意の組み合わせを含む、本明細書に記載の方法の実施態様のそれぞれにおいて、MDE−8、IV.3及びAT−10モノクローナル抗体は、本明細書及び配列表に記載されるように、各抗体について6つのCDRを含み得、又は本明細書及び配列表に記載されるCDRの間に1又は2個のアミノ酸の相違を有する配列を含み得る。
エフェクター欠損であるFc領域の少なくとも一部を含む、ヒトCD32aに特異的に結合するエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体であって、該エフェクター欠損抗体が、改変されていない対照と比較して、CD16、CD32、及び/又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除する改変されたFc領域を含む、抗体が提供される。
定義
本明細書で使用される場合、用語「ヒトCD32Aマウス」、「CD32Aマウス」、「トランスジェニックCD32Aマウス」及び「トランスジェニックヒトCD32Aマウス」は互換的に使用される。CD32Aマウスは以前に記載されている(McKenzie et al., The role of the human Fc receptor FcgammaRIIA in the immune clearance of platelets: a transgenic mouse model.J Immunol.1999 Apr 1;162(7):4311-8.PubMed ID: 10201963)。
本明細書で使用される場合、用語「ヒトCD32Aマウス」、「CD32Aマウス」、「トランスジェニックCD32Aマウス」及び「トランスジェニックヒトCD32Aマウス」は互換的に使用される。CD32Aマウスは以前に記載されている(McKenzie et al., The role of the human Fc receptor FcgammaRIIA in the immune clearance of platelets: a transgenic mouse model.J Immunol.1999 Apr 1;162(7):4311-8.PubMed ID: 10201963)。
Fc受容体(FcR)は、抗体のFc部分に特異的に結合する白血球表面糖タンパク質である。IgGの受容体、すなわちFcガンマRIIIは、最も広範でかつ多種多様であり、その主な型は、FcガンマRI(CD64)、FcガンマRII(CD32)及びFcガンマRIII(CD16)である。本明細書で使用される場合、用語「CD32a」は、FcgammaRIIの活性化型及び「ガンマ」の代わりにギリシャのガンマ記号を使用する反復などその反復と同義である。
用語「抗体」は、標的抗原への特異的結合のためにインタクトな抗体と競合することができる任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン又はその断片を指し、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト及び二重特異性抗体を含む。インタクトな抗体は、少なくとも2つの全長重鎖及び2つの全長軽鎖を含むことができるが、幾つかの例では、重鎖のみを含むことができるラクダ科動物において天然に存在する抗体など、より少ない鎖を含むことができる。抗体は、単一の供給源から単独で得ることができるか、又は「キメラ」であることができ、すなわち、抗体の異なる部分は、2つの異なる抗体に由来し得る。抗原結合タンパク質、抗体、又は結合断片は、ハイブリドーマにおいて、組換えDNA技術によって、又はインタクトな抗体の酵素的又は化学的切断によって産生され得る。他に示されない限り、用語「抗体」には、2つの全長重鎖及び2つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片及び変異体を含む。更に、明示的に除外されない限り、抗体には、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニ抗体、ドメイン抗体、合成抗体(本明細書では「抗体模倣物」と呼ばれることもある)、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物(本明細書では「抗体コンジュゲート」と呼ばれることもある)及びその断片を含む。
本明細書中で使用される場合、「特異的結合」は、所定の抗原に結合する抗体を指す。典型的には、抗体は10E7M以下の解離定数(KD)で結合し、所定の抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原(例えば、アルブミン、カゼイン)への結合について、そのKDよりも少なくとも2倍低いKDで所定の抗原に結合する。
本明細書で使用される用語「Kass」又は「Ka」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すことを意図しているが、一方、本明細書で使用される用語「Kdis」又は「Kd」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことを意図している。本明細書で使用される用語「KD」は、Kd対Kaの比(すなわち、Kd/Ka)から得られ、モル濃度(M)として表される解離定数を指すことを意図している。
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス(例えば、IgM又はIgG1)を指す。
本明細書で使用される場合、用語「結合を阻害する」及び「結合を遮断する」(例えば、CD32リガンド、例えばIgGのCD32への結合の阻害/遮断を指す)は互換的に使用され、部分的及び完全な阻害/遮断の両方を包含する。CD32に対するIgGの阻害/遮断は、好ましくは、IgGが阻害又は遮断なしにCD32に結合するときに生じるエフェクター細胞機能の正常なレベル又は型を減少させるか又は変化させる。阻害及び遮断はまた、抗CD32抗体と接触していないリガンドと比較して、抗CD32抗体と接触した場合のIgGのCD32への結合親和性の任意の測定可能な減少、例えば、CD32へのCD32リガンドの少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%又は100%の遮断を含むことが意図される。
「Fc」領域は、抗体の定常「CH」ドメインの一部又は全てを含む2つの重鎖断片を含む。2つの重鎖断片は、2つ以上のジスルフィド結合によって一緒に保持される。Fc領域は、重鎖定常領域からの付加的アミノ酸を有するか又は有しないかのどちらかであって、ヒンジ領域の全て又は一部を含み得る。換言すれば、Fc領域は、任意でCH2及びCH3の一方又は両方を含み得る。
「Fab’断片」は、鎖間ジスルフィド結合が2つのFab’断片の2つの重鎖の間に形成されてF(ab’)2分子を形成することができるように、1つの軽鎖並びにVHドメイン及びC−H1ドメイン及びCH1ドメインとCH2ドメインと間の領域をも含む1つの重鎖の一部を含む。
用語「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子又は実体(例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス)を意味する。
本明細書で使用する用語「血小板減少症」とは、循環血液中の血小板の異常な数を指す(Wintrobe MM et al.Disorders of Platelets and Hemostasis.In: Clinical Hematology, Seventh Edition, Lea & Febiger, Philadelphia, 1974)。これは典型的には、血小板減少症は、正常値の下限値(通常は150x109/Lとする)より小さい血小板数として定義される。また、循環血小板の数の減少として特徴付けることもできる。例えば、血小板数が150x109/Lを下回っていなくても、ヘパリン投与後の血小板数の30−50%以上の減少は、ヘパリン誘発性血小板減少症の症状である可能性がある。(Warkentin TE.Clinical presentation of heparin-induced thrombocytopenia (Oct 1998) Semin Hematol 35(4 Suppl 5):9-16; discussion 35-6; PubMed ID: 9855179)。血小板数は電子計数法によって通常は完全血球数(CBC)の一部として測定される。
本明細書で使用される用語「血栓症」は、血管(静脈又は動脈)の内部の血餅の形成を指す。典型的には、血餅又は血栓は、様々な割合で活性化血小板を含むフィブリン及び血液細胞からなるであろう。
本明細書で使用される場合、「IgG媒介性血栓症」という語句は、IgG抗体分子が血栓の形成に寄与する血栓症を指す。
用語「患者」及び「被験体」は、本明細書において互換的に使用され、治療の実施を必要とする哺乳動物を指す。
本明細書で使用する用語「疾患」及び「障害」は、医学的疾患又は障害の存在を示唆する兆候、症状、又は検査室ベースの診断によって正常な健康とは区別される機能障害の異常又は徴候とみなされる病状及び症候群を含むことも意図される。
「治療する」には、治療及び予防の両方が含まれる。
用語「同一性」は、配列を整列させて比較することによって決定される、2つ以上のポリペプチド分子又は2つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、比較される分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較される分子の最小のサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、アライメント(もしあれば)におけるギャップは、好ましくは、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)によって対処される。整列された核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用され得る方法には、Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M.and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M.Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J.Applied Math.48:1073に記載されているものが挙げられる。
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が1つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体を指すことを意図する。例えば、重鎖及び軽鎖の可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体は、マウス−ヒトキメラ抗体として記載され得る。
用語「ヒト化抗体」は、マウスなどの様々な哺乳動物種由来の抗体に由来するCDR配列がヒト生殖系列可変フレームワーク配列上に移植された抗体を指すことを意図している。更なるフレームワーク領域のアミノ酸修飾を導入することができる。
用語「エフェクター機能」は、免疫系のタンパク質及び/又は細胞及び血小板に結合する抗体のFc領域又は定常領域の機能的能力を指す。IgG抗体の典型的なエフェクター機能には、補体タンパク質(例えば、C1q)、新生児受容体(FcRn)、又はIgG Fc受容体(FcガンマR)(例えば、FcガンマRI、FcガンマRII、FcガンマRIII)に結合する能力を含む。前述の分子の1つ以上に結合することができるという効果には、限定されないが、抗原依存性細胞傷害(ADCC)、補体依存性細胞毒性(CDC)、食作用、オプソニン作用、及びエフェクター細胞調節が含まれる。エフェクター機能の抑止又は減少は、抗体の可変領域の抗原結合活性を維持しつつ、Fcのその受容体又は補体タンパク質又はエフェクター細胞への結合によって少なくとも部分的に誘導される生化学的又は細胞性活性の1つ又は複数における抑止又は減少を指し得る。
本明細書中で使用される場合、「エフェクター欠損」抗体は、CD16、CD32及び/又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除するように改変されたFc領域を有する抗体として定義される。
用語「抗原」は、抗体に特異的に結合することができる任意の天然又は合成物質を指す。
用語「特異的結合」とは、所定の抗原に結合する抗体を指す。典型的には、抗体は、10−7Mより強い親和性平衡定数で結合し、非特異的抗原に対する少なくとも2倍強い結合で所定の抗原に結合する。
本明細書で使用される場合、用語「免疫複合体」は、1つ以上の抗原分子に特異的に結合した1つ以上の抗体分子からなる分子構造を指す。
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合するか、又は抗体による特異的結合が可能なタンパク質決定基を指す。
実施例1
エフェクター欠損モノクローナル抗体MDE−8
本発明者らは、天然ヒトMDE−8 mAbが、そのヒト抗原(すなわち、CD32A)のトランスジェニックマウスにおいてインフュージョンリアクションを引き起こすことを実証した。これらのマウスは、本明細書では「CD32Aマウス」と呼ばれる。CD32AマウスにおけるIgG媒介性インフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、低体温、急速又は浅い呼吸、猫背の姿勢、及び運動機能障害が含まれる;重度のインフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、運動抑制、痙攣、意識の明らかな喪失、(まれに)死亡も含まれる。
エフェクター欠損モノクローナル抗体MDE−8
本発明者らは、天然ヒトMDE−8 mAbが、そのヒト抗原(すなわち、CD32A)のトランスジェニックマウスにおいてインフュージョンリアクションを引き起こすことを実証した。これらのマウスは、本明細書では「CD32Aマウス」と呼ばれる。CD32AマウスにおけるIgG媒介性インフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、低体温、急速又は浅い呼吸、猫背の姿勢、及び運動機能障害が含まれる;重度のインフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、運動抑制、痙攣、意識の明らかな喪失、(まれに)死亡も含まれる。
MDE−8 mAbのエフェクタードメイン(すなわち、Fcドメイン)をエフェクター欠損IgGフォーマットに変えることにより、CD32Aマウスに投与したときのインフュージョンリアクションが排除された。
更に、エフェクター欠損MDE−8 mAbが免疫複合体による曝露前に提供された場合、エフェクター欠損MDE−8 mAbは、免疫複合体誘発性インフュージョンリアクション、ならびに血小板減少症、血栓症及びショックを予防した。
従って、エフェクター欠損モノクローナルMDE−8抗体は、任意のCD32a媒介性疾患又は障害を処置するための天然MDE−8抗体の代わりに使用され得る。理由は、エフェクター欠損MDE−8抗体が天然MDE−8で観察されるようにインフュージョンリアクションを誘発しないであろうことを含む。更に、予防的又は治療的に投与される場合、エフェクター欠損MDE−8抗体は、IgG免疫複合体によって引き起こされる任意の疾患又は障害を治療及び/又は予防するために使用され得る。
材料及び方法
MDE−8 mAbのエフェクター能力のある変異体及びエフェクター欠損変異体(IgG1及びIgG2フォーマットの両方で)をCD32Aマウスに静脈内(尾静脈)注射した。この研究では、MDE−8の2つのエフェクター欠損変異体を評価した。E269R及びN297A。CD32Aマウスは以前にMcKenzie et al., 1999 Apr 1, J Immunol, 162(7):4311-8, PubMed ID: 10201963に記載されている。.MDE−8 mAb注射(100マイクログラム)の後、動物をインフュージョンリアクションの評価のために30分間モニターした。MDE−8 mAb注射の前及び30分後に、血液を後眼窩から採血した。この採取した血液から血小板をフローサイトメトリーにより計数した。3時間後、幾つかの動物に、抗原であるCD40L三量体(50マイクログラム)(Peprotech#310−02)と平衡化学量論の150マイクログラムのマウスモノクローナル抗ヒトCD40L抗体(クローンM90、ATCC HB−12055ハイブリドーマ馴化培地からプロテインGクロマトグラフィーにより精製したマウスIgG1 mAb)からなる免疫複合体(IC)の200マイクロリットルボーラスを静脈内注射した。IC注射の30分後、血小板を再び計数した。次いで、動物を直ちに屠殺し(すなわち、M90+CD40L IC注射の30分後)、肺を採取し、H&E染色のために処理し、血栓の存在について顕微鏡検査した。
MDE−8 mAbのエフェクター能力のある変異体及びエフェクター欠損変異体(IgG1及びIgG2フォーマットの両方で)をCD32Aマウスに静脈内(尾静脈)注射した。この研究では、MDE−8の2つのエフェクター欠損変異体を評価した。E269R及びN297A。CD32Aマウスは以前にMcKenzie et al., 1999 Apr 1, J Immunol, 162(7):4311-8, PubMed ID: 10201963に記載されている。.MDE−8 mAb注射(100マイクログラム)の後、動物をインフュージョンリアクションの評価のために30分間モニターした。MDE−8 mAb注射の前及び30分後に、血液を後眼窩から採血した。この採取した血液から血小板をフローサイトメトリーにより計数した。3時間後、幾つかの動物に、抗原であるCD40L三量体(50マイクログラム)(Peprotech#310−02)と平衡化学量論の150マイクログラムのマウスモノクローナル抗ヒトCD40L抗体(クローンM90、ATCC HB−12055ハイブリドーマ馴化培地からプロテインGクロマトグラフィーにより精製したマウスIgG1 mAb)からなる免疫複合体(IC)の200マイクロリットルボーラスを静脈内注射した。IC注射の30分後、血小板を再び計数した。次いで、動物を直ちに屠殺し(すなわち、M90+CD40L IC注射の30分後)、肺を採取し、H&E染色のために処理し、血栓の存在について顕微鏡検査した。
結果
エフェクター欠損MDE−8 mAbは、エフェクター能力のあるMDE−8抗体で見られるインフュージョンリアクションを引き起こさない。
CD32Aマウスに静脈内注射されると、天然ヒトMDE−8 IgG1抗体は、中核体温によって測定される場合、低体温を特徴とするインフュージョンリアクションを引き起こす(図1;菱形)。天然ヒトMDE−8 IgG1抗体を注射したマウスも、明らかな意識消失を含む重度のインフュージョンリアクションの徴候を示した(データ非表示)。マウスIgG受容体は、ヒトIgG2への結合が減少しており(例えば、Overdijk et al., Crosstalk between human IgG isotypes and murine effector cells, 2012 Oct 1, J Immunol, 189(7): 3430-8, PubMed ID: 22956577を参照)、これは低体温を引き起こすIgG2フォーマットの天然抗ヒトMDE−8抗体の不全と一致する(図1;四角)。重要なことに、2つの代表的なエフェクター欠損ヒトMDE−8 mAb(IgG1及びIgG2フォーマットの両方で)(配列番号69のアミノ酸を配列番号65又は配列番号67のアミノ酸とともに含む抗体)は天然ヒトMDE−8 IgG1抗体で観察されるようなインフュージョンリアクションを引き起こさなかった(図1;三角形及びX)。血小板減少症を引き起こしたとしても、低体温(予想されるように)を引き起こすIgG2ののエフェクター能力のあるmAbの不全は当業者には驚くことかもしれない。この驚くべき発見はまた、体温上昇の欠如が、mAbが安全であることを示さないことも明らかにする。この実験で提供されるエフェクター欠損の結果は、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体が以前に認識されていなかった血小板減少症の安全問題を解決することを実証する。
エフェクター欠損MDE−8 mAbは、エフェクター能力のあるMDE−8抗体で見られるインフュージョンリアクションを引き起こさない。
CD32Aマウスに静脈内注射されると、天然ヒトMDE−8 IgG1抗体は、中核体温によって測定される場合、低体温を特徴とするインフュージョンリアクションを引き起こす(図1;菱形)。天然ヒトMDE−8 IgG1抗体を注射したマウスも、明らかな意識消失を含む重度のインフュージョンリアクションの徴候を示した(データ非表示)。マウスIgG受容体は、ヒトIgG2への結合が減少しており(例えば、Overdijk et al., Crosstalk between human IgG isotypes and murine effector cells, 2012 Oct 1, J Immunol, 189(7): 3430-8, PubMed ID: 22956577を参照)、これは低体温を引き起こすIgG2フォーマットの天然抗ヒトMDE−8抗体の不全と一致する(図1;四角)。重要なことに、2つの代表的なエフェクター欠損ヒトMDE−8 mAb(IgG1及びIgG2フォーマットの両方で)(配列番号69のアミノ酸を配列番号65又は配列番号67のアミノ酸とともに含む抗体)は天然ヒトMDE−8 IgG1抗体で観察されるようなインフュージョンリアクションを引き起こさなかった(図1;三角形及びX)。血小板減少症を引き起こしたとしても、低体温(予想されるように)を引き起こすIgG2ののエフェクター能力のあるmAbの不全は当業者には驚くことかもしれない。この驚くべき発見はまた、体温上昇の欠如が、mAbが安全であることを示さないことも明らかにする。この実験で提供されるエフェクター欠損の結果は、本明細書に記載のエフェクター欠損抗体が以前に認識されていなかった血小板減少症の安全問題を解決することを実証する。
次に、重篤な血小板減少症が、IgG1及びIgG2の両方のフォーマットにおいて、CD32Aトランスジェニックマウスへの天然ヒトMDE−8 mAbの静脈内注射に続いたことが観察された(図2、カラム1及びカラム2)。対照的に、2つの代表的なエフェクター欠損ヒトMDE−8 mAb(配列番号69のアミノ酸を配列番号65又は配列番号67のアミノ酸とともに含む抗体)は、CD32Aマウスに注射したときに血小板減少症を誘導しなかった(図2、カラム3及び4)。図2のカラム3及び4に見られる循環血小板数のわずかな減少は典型的なものであり、繰り返される採血から生じる。
これらの実験は、IgG2フォーマットのMDE−8は低体温を引き起こすことができなかったが(図1参照)、しかし循環血小板を大きく枯渇させた(図2)ので、血小板減少症は低体温とは無関係であり、血小板数の減少は温度の低下よりも敏感な指標であることを実証している。
ヒトIgG1フォーマットにおける天然ヒトMDE−8 mAbの静脈内注射の前(図3A)及び後(図3B)のCD32Aトランスジェニックマウスからの全血のフローサイトメトリー分析は、重篤な血小板枯渇を示した(図3B)。(蛍光ビーズ[1マイクロメートルは、血液量を制御するために含められ[ゲートP5];右上の象限は赤血球及び白血球を含む[ゲートP4])。
重要なことに、天然ヒトMDE−8 IgG1 mAbがエフェクター欠損にされたとき(配列番号69のアミノ酸を配列番号65のアミノ酸とともに含む抗体)、それらは循環血小板を除去することができなかった(図3C[注射前]及び図3D[エフェクター欠損ヒトMDE−8 mAbの注射後]を図3A及び図3Bと比較)。従って、エフェクター欠損ヒトMDE−8 mAbは血小板を枯渇させなかった(図3D)。更に、エフェクター欠損ヒトMDE−8 mAb(IgG1 E269R及びIgG2 N297A)を注射したマウスは、インフュージョンリアクションの観察可能な徴候を示さなかった(データ非表示)。
エフェクター欠損ヒトMDE−8 mAbの異なるIgGサブクラスであるMDE−8(配列番号69のアミノ酸を配列番号67のアミノ酸とともに含む抗体)を用いた場合も同様の結果が得られた。天然MDE−8 mAb IgG2の静脈内注射の前(図3E)及び後(図3F)のCD32Aトランスジェニックマウスからの全血のフローサイトメトリー分析は、重篤な血小板枯渇を示した(図3F)。重要なことに、天然MDE−8 mAb IgG2がエフェクター欠損にされたとき、それはもはや循環血小板を除去しなかった(図3G[注射前]及び図3H[エフェクター欠損ヒトMDE−8 mAbの注射後]を図3E及び図3Fと比較)。
これらの結果は、2つの代表的なIgGサブクラス型のエフェクター欠損ヒトMDE−8 mAbは、循環血小板を枯渇させなかったことを示す(図3D及び3H)。
図3に示す結果は、天然MDE−8 IgG mAbのエフェクタードメインがCD32Aマウスにおいてインフュージョンリアクションを引き起こし、そのようなインフュージョンリアクションがIgG−Fcドメインを改変することによって排除されることを実証する。従って、IgG Fc受容体に効率的に結合する抗CD32a抗体の能力を取り除くことは、インフュージョンリアクションを排除するのに有益である。MDE−8 mAbをエフェクター欠損にすることはまた、循環血液から血小板を除去する抗体の能力を抑止し、そのようなクリアランスが、MDE−8の場合、CD32Aトランスジェニックマウス血小板の表面上に固定化されているIgG−Fcドメインによっても媒介されていることを示している。
エフェクター欠損MDE−8 mAbは、CD32Aトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護する。
次に、エフェクター欠損MDE−8 mAbは、CD32Aトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症(循環血小板数の減少)から保護することが決定された。免疫複合体曝露の3時間前に、ビヒクルリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)又は2つの代表的なエフェクター欠損ヒトMDE−8 mAb(100μg):1)エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269R(配列番号65とともに配列番号65);又は2)エフェクター欠損MDE−8 IgG2 N297A(配列番号69とともに配列番号67)のうちの1つでCD32Aマウスを処置した。マウスに免疫複合体(M90+CD40L、合計200μg)を曝露し、曝露の30分後に全血を採取した。図4は結果を示す。ビヒクル対照で前処置したマウスでは、IC注射により、重篤なショックの徴候(データ非表示)及び重篤な血小板枯渇を有するマウスが得られた。エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269Rで前処置された動物は、IC依存性のインフュージョンリアクション又はショックの徴候を示さなかった(データ非表示)。また、図4Bに示すように、エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269Rで前処置されたマウスは、IC誘発性血小板減少症を経験しなかった(すなわち、血小板はICにより除去されなかった;図4B)。インフュージョンリアクションのために、天然IgG1フォーマットのエフェクター能力のあるMDE−8 mAbを同様に試験することはできなかった。
次に、エフェクター欠損MDE−8 mAbは、CD32Aトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症(循環血小板数の減少)から保護することが決定された。免疫複合体曝露の3時間前に、ビヒクルリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)又は2つの代表的なエフェクター欠損ヒトMDE−8 mAb(100μg):1)エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269R(配列番号65とともに配列番号65);又は2)エフェクター欠損MDE−8 IgG2 N297A(配列番号69とともに配列番号67)のうちの1つでCD32Aマウスを処置した。マウスに免疫複合体(M90+CD40L、合計200μg)を曝露し、曝露の30分後に全血を採取した。図4は結果を示す。ビヒクル対照で前処置したマウスでは、IC注射により、重篤なショックの徴候(データ非表示)及び重篤な血小板枯渇を有するマウスが得られた。エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269Rで前処置された動物は、IC依存性のインフュージョンリアクション又はショックの徴候を示さなかった(データ非表示)。また、図4Bに示すように、エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269Rで前処置されたマウスは、IC誘発性血小板減少症を経験しなかった(すなわち、血小板はICにより除去されなかった;図4B)。インフュージョンリアクションのために、天然IgG1フォーマットのエフェクター能力のあるMDE−8 mAbを同様に試験することはできなかった。
同様の結果はエフェクター欠損MDE−8 IgG2 N297Aについても得られた。図4Cは、ビヒクル対照で前処置され、IC注射後のCD32Aマウスからの血小板数を示す。図4Dは、エフェクター欠損MDE−8 IgG2 N297で前処置されたCD32AマウスのIC後の血小板数を示す。図4のデータは、試験した全ての動物の代表例である。
図5は、ビヒクル又はエフェクター欠損MDE−8抗体の何れかで前処置した(IC曝露の3時間前に前処置)CD32AマウスへのIC注射後の循環血小板の減少(%)を示す棒グラフを示す。ビヒクル(PBS)で前処置したCD32Aマウスは、著しく血小板減少性になったが(図5A及び5B、棒#1)、一方エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269R(図5A)又はエフェクター欠損MDE−8 IgG2 N297A(図5B)で前処置されたマウスは、循環血小板の喪失から大部分が保護されていた。図5A及び図5Bの動物#1をビヒクル(PBS)で前処置した。M90+CD40L免疫複合体を全ての動物に静脈内注射した。30分後、血液を採取し、血小板を計数した。図5Aは、エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269Rがマウスを免疫複合体媒介性血小板減少症から保護することを示す(図5A、カラム2,3及び4を参照)。図5Bは、エフェクター欠損MDE−8 IgG2 N297Aがマウスを免疫複合体媒介性血小板減少症から保護することを示す(図5B、カラム2及び3を参照)。従って、エフェクター欠損MDE−8 mAbの2つの代表的なIgGサブクラス(IgG1、IgG2)は、CD32Aトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護した。
エフェクター欠損MDE−8抗体は、免疫複合体(IC)によって引き起こされる肺血栓症からCD32Aトランスジェニックマウスを保護する。
CD32Aトランスジェニックマウスをビヒクル(PBS)又は100マイクログラムの代表的なエフェクター欠損MDE−8mAb(配列番号65又は配列番号67とともに配列番号69)で前処置した。3時間後、マウスにM90+CD40L IC(200マイクログラム)を曝露した。30分後、マウスを屠殺し、それらの肺を分析用に採取した。図6Aは、IC曝露の3時間前にビヒクルで前処置されたマウスからのH&E染色された肺切片を示す。ビヒクルで前処置したマウスでは、広汎性閉塞性肺血栓(*)が観察された。驚くべきことに、エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269Rで前処置されたマウスは、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した(図6B)。血管が異常であり、血管内で観察された赤血球の数がより少なく、炎症を起こした肺胞組織の証拠があるビヒクル処置マウス(図6A)と比較して、エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269R前処置マウスもまた正常(健康な)肺胞組織に豊富な赤血球を有する正常な血管を示した(図6B)。
CD32Aトランスジェニックマウスをビヒクル(PBS)又は100マイクログラムの代表的なエフェクター欠損MDE−8mAb(配列番号65又は配列番号67とともに配列番号69)で前処置した。3時間後、マウスにM90+CD40L IC(200マイクログラム)を曝露した。30分後、マウスを屠殺し、それらの肺を分析用に採取した。図6Aは、IC曝露の3時間前にビヒクルで前処置されたマウスからのH&E染色された肺切片を示す。ビヒクルで前処置したマウスでは、広汎性閉塞性肺血栓(*)が観察された。驚くべきことに、エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269Rで前処置されたマウスは、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した(図6B)。血管が異常であり、血管内で観察された赤血球の数がより少なく、炎症を起こした肺胞組織の証拠があるビヒクル処置マウス(図6A)と比較して、エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269R前処置マウスもまた正常(健康な)肺胞組織に豊富な赤血球を有する正常な血管を示した(図6B)。
IC曝露後のマウス肺のH&E顕微鏡検査によって、視野あたりの肺血栓を計数した。4匹のマウスにM90+CD40L ICを注射した。動物#1(図6C、棒1;ビヒクル対照)は、広汎性肺血栓症(視野あたり平均20)を示したが、IC曝露の前にエフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269Rで前処置された動物#2−4(図6C、棒2−4)は、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した。図1に示す結果は、また、図6Cは、エフェクター欠損MDE−8 IgG1 E269Rが肺血栓症を引き起こさなかったことも実証している。
同様の結果はエフェクター欠損MDE−8 IgG2 N297Aについても得られた。図7Aは、IC曝露の3時間前にビヒクルで前処置されていたマウスからのH&E染色された肺切片を示す。図7Aには、広汎性閉塞性肺血栓(*)が観察された。対照的に、エフェクター欠損MDE−8 IgG2 N297Aで前処置されたマウスは、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した(図7B)。ビヒクル(PBS)前処置マウス(図7A)の異常な(血管内で観察された赤血球の数が少なくいだけでなく炎症の証拠もある)肺胞組織とは対照的に、エフェクター欠損MDE−8 IgG2 N297A前処置マウスは健康な肺胞組織の中に豊富な赤血球を有する正常な血管も示した(図7B)。図6及び7データは、試験した全ての動物の代表例である。
図7Cは、ビヒクル又はエフェクター欠損MDE−8抗体で前処置したマウスにおけるIC曝露後のマウス肺のH&E顕微鏡写真を示す。視野あたりの肺血栓を計数した。4匹のマウスにM90+CD40L ICを注射した。動物#1(図7C、棒1;対照)は、広汎性肺血栓症(視野あたり平均18.6)を示したが、エフェクター欠損MDE−8 IgG2 N297Aで前処置された動物#2及び#3(図7C、棒2及び3)は、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した。これらの知見は、MADE−8 IgG2 N297A mAb自体が肺血栓症を引き起こさなかったことも実証している。
まとめると、実施例1に示すデータは、(1)天然の(エフェクター能力のある)抗CD32a IgG mAbが、インフュージョンリアクションを引き起こし、血小板減少症を誘導する;(2)MDE−8 mAbをエフェクター欠損フォーマットに改変することにより、最適なIgGの注入を安全にしかつ止血的に安全にする(それは血小板減少症を誘導しない);(3)天然MDE−8 mAb媒介性インフュージョンリアクション及び血小板減少症は、IgG−Fc(エフェクター)ドメインの機能に依存する;(4)エフェクター欠損MDE−8 IgG1及びIgG2 mAbが、CD32Aトランスジェニックマウスを、免疫複合体媒介性インフュージョンリアクション、ショック、血小板減少症及び血栓症から保護する;(5)CD32A IgG受容体が、これらの免疫学的にインタクトな(例えば、マウスIgG受容体の完全配列を有する)CD32AトランスジェニックマウスにおけるICによって媒介されるようなインフュージョンリアクション、血小板減少症、血栓症、及びショックを主に制御することを実証する。血栓性ICに応答した、他の全てのマウスIgG−Fc受容体(マウスFcガンマRI、FcガンマRIIb、及びFcガンマRIII)よりもヒトCD32A導入遺伝子産物の支配的な効果は予期せぬ発見である。
実施例2
エフェクター欠損キメラモノクローナル抗体AT−10
本発明者らは、天然キメラ(マウス−ヒト)AT−10 IgG mAbが、CD32aについてトランスジェニックマウスにおいて(例えば、CD32Aマウスにおいて)、インフュージョンリアクションを引き起こすことを更に実証した。CD32AマウスにおけるIgG媒介性インフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、低体温、急速又は浅い呼吸、猫背の姿勢、及び運動機能障害が含まれる。重篤なインフュージョンリアクションの観察可能な兆候は、運動抑制、痙攣、そして(まれに)死亡が含まれる。
エフェクター欠損キメラモノクローナル抗体AT−10
本発明者らは、天然キメラ(マウス−ヒト)AT−10 IgG mAbが、CD32aについてトランスジェニックマウスにおいて(例えば、CD32Aマウスにおいて)、インフュージョンリアクションを引き起こすことを更に実証した。CD32AマウスにおけるIgG媒介性インフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、低体温、急速又は浅い呼吸、猫背の姿勢、及び運動機能障害が含まれる。重篤なインフュージョンリアクションの観察可能な兆候は、運動抑制、痙攣、そして(まれに)死亡が含まれる。
我々は本明細書において、天然AT−10 mAbのエフェクタードメイン(すなわち、Fcドメイン)をエフェクター欠損IgGフォーマットに変えることにより、CD32Aマウスに投与したときのインフュージョンリアクションが排除されたことを示す。
更に、エフェクター欠損AT−10 mAbが免疫複合体による曝露前に投与された場合、エフェクター欠損AT−10 mAbは、免疫複合体誘発性インフュージョンリアクション、ならびに血小板減少症及び血栓ショックを予防した。
従って、エフェクター欠損モノクローナルAT−10抗体は、任意のCD32a媒介性疾患又は障害を処置するための天然AT−10抗体の代わりに使用され得る。理由は、エフェクター欠損AT−10抗体が天然AT−10 mAbで観察されるようにインフュージョンリアクションを誘発しないであろうことを含む。更に、エフェクター欠損AT−10 mAbは、予防的又は治療的に与えられた場合に、免疫複合体によって引き起こされる任意の疾患又は障害を治療及び/又は予防するために使用され得る。
材料及び方法
AT−10 mAbのエフェクター能力のある変異体及びエフェクター欠損変異体(それぞれIgG1及びIgG1 E269R)を(実施例1のように)CD32Aマウスに静脈内(尾静脈)注射した。注射(100マイクログラム)後、マウスをインフュージョンリアクションの評価のために30分間モニターした。AT−10 mAb注射の前及び30分後に、血液を(後眼窩から)採血した。この採取した血液から血小板をフローサイトメトリーにより計数した。3時間後、幾つかの動物に免疫複合体(IC1、実施例1のように、200マイクログラム)を注射し、注射の30分後に血液を採取した。この採取した血液から血小板を再び計数した。ICの注射から30分後に肺を採取し、H&E染色のために処理し、血栓の存在について顕微鏡検査した。
AT−10 mAbのエフェクター能力のある変異体及びエフェクター欠損変異体(それぞれIgG1及びIgG1 E269R)を(実施例1のように)CD32Aマウスに静脈内(尾静脈)注射した。注射(100マイクログラム)後、マウスをインフュージョンリアクションの評価のために30分間モニターした。AT−10 mAb注射の前及び30分後に、血液を(後眼窩から)採血した。この採取した血液から血小板をフローサイトメトリーにより計数した。3時間後、幾つかの動物に免疫複合体(IC1、実施例1のように、200マイクログラム)を注射し、注射の30分後に血液を採取した。この採取した血液から血小板を再び計数した。ICの注射から30分後に肺を採取し、H&E染色のために処理し、血栓の存在について顕微鏡検査した。
結果
エフェクター欠損AT−10 mAbは、エフェクター能力のあるAT−10抗体で見られるインフュージョンリアクションを引き起こさない。
CD32Aトランスジェニックマウスに静脈内注射された場合、天然キメラAT−10mAbは、血小板減少症によって特徴付けられるインフュージョンリアクションを引き起こす(図8、棒1)。特に、これらのマウスは低体温を有していなかった(データ非表示)。エフェクター欠損キメラAT−10ヒトIgG1 E269R mAb(図8、カラム2)(配列番号22のアミノ酸を配列番号16のアミノ酸とともに含む抗体)を天然キメラAT−10ヒトIgG1の代わりに投与したときに血小板減少症が取り除かれた。
エフェクター欠損AT−10 mAbは、エフェクター能力のあるAT−10抗体で見られるインフュージョンリアクションを引き起こさない。
CD32Aトランスジェニックマウスに静脈内注射された場合、天然キメラAT−10mAbは、血小板減少症によって特徴付けられるインフュージョンリアクションを引き起こす(図8、棒1)。特に、これらのマウスは低体温を有していなかった(データ非表示)。エフェクター欠損キメラAT−10ヒトIgG1 E269R mAb(図8、カラム2)(配列番号22のアミノ酸を配列番号16のアミノ酸とともに含む抗体)を天然キメラAT−10ヒトIgG1の代わりに投与したときに血小板減少症が取り除かれた。
天然キメラAT−10ヒトIgG1の静脈内注射の前(図9A)及び後(図9B)のCD32Aマウスからの全血のフローサイトメトリー分析は、低体温を有しないにもかかわらず。重篤な血小板枯渇を示した(図9B)。重要なことに、天然キメラAT−10ヒトIgG1 mAbがエフェクター欠損にされたとき、それらはもはや循環血小板を減少させなかった(図9C[注射前]及び図9D[エフェクター欠損キメラAT−10ヒトIgG1 mAbの注射後]を比較)。従って、エフェクター欠損AT−10 mAbは血小板を枯渇させなかった。このデータは、IgGエフェクタードメインがAT−10 IgG誘発性血小板減少症の原因であることを実証している。
これらの実験は、IgG1フォーマットの天然AT−10 mAbは低体温症を引き起こすことができなかったが(データ非表示)、重篤な血小板枯渇を引き起こしたため、血小板減少症では血小板数の減少は温度低下とは無関係であり、この場合温度低下よりもインフュージョンリアクションのより敏感な指標であることを実証している。重要なことに、エフェクター欠損AT−10mAbは、エフェクター能力のあるカウンターパートと同様に、血小板を枯渇させなかった(すなわち、血小板減少症を引き起こす)。
図8及び9に示す結果は、天然AT−10 IgG mAbのエフェクター領域がCD32Aマウスにおいてインフュージョンリアクションを媒介し、そのようなインフュージョンリアクションがIgG−Fc領域を改変することによって排除されることを実証する。従って、IgG Fc受容体に効率的に結合する抗CD32a抗体の能力を取り除くことは、インフュージョンリアクションを排除するのに有益である。
エフェクター欠損AT−10 mAbは、CD32Aトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護する。
次に、エフェクター欠損AT−10 mAbがCD32Aトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護することができることが実証された(図10)。免疫複合体曝露の3時間前に、マウスをPBSビヒクル又はエフェクター欠損AT−10mAb(IgG1 E269R)(配列番号22のアミノ酸を配列番号16のアミノ酸とともに含む抗体)で処置した。免疫複合体(M90+CD40L(実施例1のように);200マイクログラム)を静脈内注射し、IC曝露の30分後に全血を採取した。この採取した血液から血小板を計数した。
次に、エフェクター欠損AT−10 mAbがCD32Aトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護することができることが実証された(図10)。免疫複合体曝露の3時間前に、マウスをPBSビヒクル又はエフェクター欠損AT−10mAb(IgG1 E269R)(配列番号22のアミノ酸を配列番号16のアミノ酸とともに含む抗体)で処置した。免疫複合体(M90+CD40L(実施例1のように);200マイクログラム)を静脈内注射し、IC曝露の30分後に全血を採取した。この採取した血液から血小板を計数した。
図10は、ビヒクル又はエフェクター欠損キメラAT−10ヒトIgG1 E269R抗体の何れかで前処置したCD32AマウスへのIC注射後の循環血小板の減少(%)を示す棒グラフを示す。ビヒクル(PBS)で前処理したCD32Aマウスは、著しく血小板減少性になったが(図10のカラム1)、一方エフェクター欠損キメラAT−10ヒトIgG1 E269R(図10のカラム2及び3)で前処置されたマウスは、循環血小板の喪失から大部分が保護されていた。エフェクター欠損キメラAT−10ヒトIgG1 E269Rは、免疫複合体誘発性血小板減少症からマウスを保護した(図10、対照のカラム1と比較してカラム2及び3)。
図11は、上記のようにビヒクル又はエフェクター欠損AT−10抗体の何れかで前処置したCD32AマウスへのIC注射後の循環血小板のフローサイトメトリー分析を示す。図11Aは、ビヒクルを投与されたマウスからの血小板枯渇を示す。図11Bは、エフェクター欠損キメラAT−10ヒトIgG1 E269Rで前処置された動物は、IC注射に応答して血小板減少症を経験しなかったことを示す。更に、エフェクター欠損キメラAT−10ヒトIgG1 E269Rの前処置は、媒介性インフュージョンリアクションの観察可能な兆候からCD32Aマウスを完全に保護した(キメラAT−10ヒトIgG1 E269R処置動物は、IC注射による影響を受けなかったようにみえたが、一方ビヒクル処置対照は、ショックと一致して、運動障害、猫背の姿勢、浅い急速な呼吸の徴候を示した。
エフェクター欠損AT−10抗体は、免疫複合体(IC)によって引き起こされる肺血栓症からCD32Aトランスジェニックマウスを保護する。
マウスは、ビヒクル(PBS)又はエフェクター欠損AT−10mAb(配列番号16のアミノ酸とともに配列番号22のアミノ酸を含む抗体)で前処理した。3時間後、マウスにM90+CD40L IC(実施例1と同様;200マイクログラム)を曝露した。30分後、マウスを屠殺し、それらの肺を分析用に除去した。図12Aは、IC曝露の3時間前にビヒクルで前処置されたマウスからの代表的なH&E染色された肺切片を示す。広汎性閉塞性肺血栓(*)がビヒクル処理マウスで検出された。驚くべきことに、エフェクター欠損AT−10 IgG1 E269Rで前処置されたマウスは、これらのマウスが免疫学的にインタクトである(すなわち、ヒトCD32Aに加えて正常なマウスIgG受容体の完全なレパートリーを有する)にもかかわらず、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した(図12B)。エフェクター欠損AT−10 IgG1 E269R前処置マウスはまた、対照(ビヒクル処置)マウス(図12A)と比較して、健康な肺胞組織の中に豊富な赤血球を有する正常な血管を示した(図12B)。これらの結果は、エフェクター欠損キメラAT−10ヒトIgG1 E269R mAbがIC誘発性血栓症から保護することができることを示している。
マウスは、ビヒクル(PBS)又はエフェクター欠損AT−10mAb(配列番号16のアミノ酸とともに配列番号22のアミノ酸を含む抗体)で前処理した。3時間後、マウスにM90+CD40L IC(実施例1と同様;200マイクログラム)を曝露した。30分後、マウスを屠殺し、それらの肺を分析用に除去した。図12Aは、IC曝露の3時間前にビヒクルで前処置されたマウスからの代表的なH&E染色された肺切片を示す。広汎性閉塞性肺血栓(*)がビヒクル処理マウスで検出された。驚くべきことに、エフェクター欠損AT−10 IgG1 E269Rで前処置されたマウスは、これらのマウスが免疫学的にインタクトである(すなわち、ヒトCD32Aに加えて正常なマウスIgG受容体の完全なレパートリーを有する)にもかかわらず、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した(図12B)。エフェクター欠損AT−10 IgG1 E269R前処置マウスはまた、対照(ビヒクル処置)マウス(図12A)と比較して、健康な肺胞組織の中に豊富な赤血球を有する正常な血管を示した(図12B)。これらの結果は、エフェクター欠損キメラAT−10ヒトIgG1 E269R mAbがIC誘発性血栓症から保護することができることを示している。
図12Cは、上記のようにビヒクル(対照)又はエフェクター欠損キメラAT−10抗体で前処置したCD32AマウスへのIC注射後のマウス肺のH&E顕微鏡写真を示す(図12A及び12B参照)。動物#1(図12C、棒1;対照)は、広汎性肺血栓症(視野あたり平均17.6の血餅)を示したが、エフェクター欠損キメラAT−10ヒトIgG1 E269Rで前処置された動物#2及び#3(図12C、棒2及び3)は、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した。
ヒト化エフェクター欠損AT−10 mAb。
エフェクター欠損ヒト化AT−10 IgG1 E269R mAb(「hAT−10」)を作製し、試験した(配列番号24のアミノ酸を配列番号20のアミノ酸とともに含む抗体)。図13Aに示すように、hAT−10 E269R mAb(116μg)をCD32Aマウスに投与し、マウスの中核体温を経時的に評価した。hAT−10 E269R mAbは、低体温(インフュージョンリアクションの指標)を引き起こさなかった。低体温を示さないことに加えて、これらの動物は、インフュージョンリアクションを有する他の徴候を示さなかった。図13Bは、CD32Aマウス由来の血小板をhAT−10 E269R注射(116マイクログラム)の前後で評価した研究の結果を示す。hAT−10は循環血小板数に影響を及ぼさなかった(図13Bの右側のパネルを参照)。
エフェクター欠損ヒト化AT−10 IgG1 E269R mAb(「hAT−10」)を作製し、試験した(配列番号24のアミノ酸を配列番号20のアミノ酸とともに含む抗体)。図13Aに示すように、hAT−10 E269R mAb(116μg)をCD32Aマウスに投与し、マウスの中核体温を経時的に評価した。hAT−10 E269R mAbは、低体温(インフュージョンリアクションの指標)を引き起こさなかった。低体温を示さないことに加えて、これらの動物は、インフュージョンリアクションを有する他の徴候を示さなかった。図13Bは、CD32Aマウス由来の血小板をhAT−10 E269R注射(116マイクログラム)の前後で評価した研究の結果を示す。hAT−10は循環血小板数に影響を及ぼさなかった(図13Bの右側のパネルを参照)。
更に、hAT−10 E269Rは、M90+CD40L IC誘発性血小板減少症からマウスを完全に保護する。ビヒクル(PBS対照)で前処置を受けた対照動物は、IC曝露を受けてから10分以内に無意識になり、続いて重篤なショックと一致する徴候を示した。対照的に、hAT−10 E269Rで前処置されたマウスは、IC曝露によって影響を受けなかったようであった(データ非表示)。hAT−10 E269R前処置はまた、CD32Aマウスを血小板減少症から保護した(図13C左パネル(ビヒクル処置群における血小板喪失を示す)及び図13C右パネル(hAT−10 E269R処置動物における血小板喪失を示さない)を比較されたい)。
最後に、ヒト化エフェクター欠損AT−10 IgG1 E269R(hAT−10 E269R)抗体は、マウスを免疫複合体誘導性肺血栓症から保護した。AT−10キメラ抗体で観察されるように(図12)、hAT−10 E269Rでの前処置は、IC曝露後のCD32Aマウスにおける肺血栓症を完全に予防した(M90+CD40L;実施例1と同様、200マイクログラム)。図13Dは、対照処置マウスの肺における有意な血栓及びhAT−10 E269R処置マウスにおける血栓のほぼ完全な欠如を示す。hAT−10 E269Rで前処置したマウスにおける血栓の欠如と比較して、対照処置マウスにおける広汎性肺血栓症(視野あたり平均24.4の血餅を示す)(図13F)図13Eも参照。
まとめると、実施例2に示すデータは、(1)天然の(エフェクター能力のある)抗CD32a IgG mAbが、血小板減少症によって特徴付けられるインフュージョンリアクションを引き起こす;(2)AT−10 mAbをエフェクター欠損に改変することにより、AT−10の注入を安全にしかつ止血的に安全にする(それは血小板減少症を誘導しない);(3)天然(エフェクター能力のある)AT−10抗体媒介性インフュージョンリアクション及び血小板減少症は、IgG−Fc(エフェクター)ドメインの機能に依存する;(4)エフェクター欠損AT−10 IgG mAbがCD32Aトランスジェニックマウスを、免疫複合体媒介性インフュージョンリアクション、血小板減少症及び血栓症から保護する;(5)CD32A IgG受容体が、これらの免疫学的にインタクトなCD32AマウスにおけるICによって媒介されるようなインフュージョンリアクション、血小板減少症、血栓症、及びショックを主に制御することを実証する。
実施例3
エフェクター欠損キメラモノクローナル抗体IV.3
本発明者らは、天然キメラIV.3 mAbが、その抗原のトランスジェニックマウス(すなわち、CD32Aマウス)においてインフュージョンリアクションを引き起こすことを更に実証した。CD32AマウスにおけるIgG媒介性インフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、低体温、急速又は浅い呼吸、猫背の姿勢、及び運動機能障害が含まれる;重度のインフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、運動障害、痙攣、意識の明らかな喪失、(まれに)死亡も含まれる。
エフェクター欠損キメラモノクローナル抗体IV.3
本発明者らは、天然キメラIV.3 mAbが、その抗原のトランスジェニックマウス(すなわち、CD32Aマウス)においてインフュージョンリアクションを引き起こすことを更に実証した。CD32AマウスにおけるIgG媒介性インフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、低体温、急速又は浅い呼吸、猫背の姿勢、及び運動機能障害が含まれる;重度のインフュージョンリアクションの観察可能な兆候には、運動障害、痙攣、意識の明らかな喪失、(まれに)死亡も含まれる。
我々は本明細書において、キメラIV.3のエフェクタードメイン(すなわち、Fcドメイン)をエフェクター欠損IgGフォーマットに変えることにより、CD32Aマウスに投与後のインフュージョンリアクションが排除されたことを示す。
更に、エフェクター欠損IV.3 mAbが免疫複合体による曝露前に被験体に提供された場合、エフェクター欠損IV.3 mAbは、免疫複合体誘発性インフュージョンリアクション、ならびに血小板減少症及び血栓ショックを予防した。
従って、エフェクター欠損モノクローナルIV.3抗体は、任意のCD32a媒介性疾患又は障害を処置するための天然IV.3抗体の代わりに使用されるべきである。理由は、エフェクター欠損IV.3抗体が天然IV.3 mAbで観察されるようにインフュージョンリアクションを誘発しないであろうことを含む。更に、エフェクター欠損IV.3は、予防的又は治療的に与えられた場合に、免疫複合体によって引き起こされる任意の疾患又は障害を治療及び/又は予防するために使用され得る。
材料及び方法
この一連の実験において、キメラIV.3 mAbのエフェクター能力のある変異体及びエフェクター欠損変異体(それぞれヒトIgG2及びヒトIgG2 N297A)を(実施例1のように)ヒトCD32Aトランスジェニックマウスに静脈内(尾静脈)注射した。注射(100マイクログラム)後、動物をインフュージョンリアクションの評価のために30分間モニターした。IV.3 mAb注射の前及び30分後に、血液を(後眼窩から)採血した。次いでこの採取した血液から血小板をフローサイトメトリーにより計数した。3時間後、幾つかの動物に免疫複合体(IC1、実施例1のように、200マイクログラム)を注射し、その後(30分)血小板を再び計数した。次いで肺を採取し、H&E染色のために処理し、血栓の存在について顕微鏡検査した。
この一連の実験において、キメラIV.3 mAbのエフェクター能力のある変異体及びエフェクター欠損変異体(それぞれヒトIgG2及びヒトIgG2 N297A)を(実施例1のように)ヒトCD32Aトランスジェニックマウスに静脈内(尾静脈)注射した。注射(100マイクログラム)後、動物をインフュージョンリアクションの評価のために30分間モニターした。IV.3 mAb注射の前及び30分後に、血液を(後眼窩から)採血した。次いでこの採取した血液から血小板をフローサイトメトリーにより計数した。3時間後、幾つかの動物に免疫複合体(IC1、実施例1のように、200マイクログラム)を注射し、その後(30分)血小板を再び計数した。次いで肺を採取し、H&E染色のために処理し、血栓の存在について顕微鏡検査した。
結果
エフェクター欠損IV.3 mAbは、エフェクター能力のあるIV.3抗体で見られるインフュージョンリアクションを引き起こさない。
我々は、CD32Aトランスジェニックマウスに静脈内注射された場合、エフェクター能力のあるキメラIV.3ヒトIgG2 mAbが、低体温を伴わない血小板減少症を特徴とする用量依存的なインフュージョンリアクションを引き起こすことを発見した。図14は、天然ヒトIgG2フォーマットにおけるキメラIV.3の静脈内注射後、CD32Aトランスジェニックマウスが著しく血小板減少性になったことを示す(図14A、黒の棒)。この血小板減少症は、エフェクター欠損キメラIV.3ヒトIgG2 N297A mAb(配列番号51のアミノ酸を配列番号45のアミノ酸とともに含む抗体)を天然キメラIV.3の代わりに投与した場合に、大部分が取り除かれた(図14A、白の棒)。図14Bは、天然キメラIV.3ヒトIgG2もそのエフェクター欠損(IV.3 IgG2 N297A)フォーマットもCD32Aトランスジェニックマウスにおいて低体温を引き起こさなかったことを示す。
エフェクター欠損IV.3 mAbは、エフェクター能力のあるIV.3抗体で見られるインフュージョンリアクションを引き起こさない。
我々は、CD32Aトランスジェニックマウスに静脈内注射された場合、エフェクター能力のあるキメラIV.3ヒトIgG2 mAbが、低体温を伴わない血小板減少症を特徴とする用量依存的なインフュージョンリアクションを引き起こすことを発見した。図14は、天然ヒトIgG2フォーマットにおけるキメラIV.3の静脈内注射後、CD32Aトランスジェニックマウスが著しく血小板減少性になったことを示す(図14A、黒の棒)。この血小板減少症は、エフェクター欠損キメラIV.3ヒトIgG2 N297A mAb(配列番号51のアミノ酸を配列番号45のアミノ酸とともに含む抗体)を天然キメラIV.3の代わりに投与した場合に、大部分が取り除かれた(図14A、白の棒)。図14Bは、天然キメラIV.3ヒトIgG2もそのエフェクター欠損(IV.3 IgG2 N297A)フォーマットもCD32Aトランスジェニックマウスにおいて低体温を引き起こさなかったことを示す。
これらの結果は、血小板数の減少は、インビボで血小板と相互作用する抗体へのインフュージョンリアクションの指標として、中核体温低下とは無関係であり、この場合、中核体温低下よりも敏感であることを再び示唆している。
ヒトIgG2における天然キメラIV.3の静脈内注射の前(図15A)及び後(図15B)のCD32Aトランスジェニックマウスからの全血のフローサイトメトリー分析は、重篤な血小板枯渇を示した(図15B)。重要なことに、天然キメラIV.3 IgG2 mAbがエフェクター欠損にされたとき、それはもはや循環血小板を減少させなかった(図15C[注射前]及び図15D[エフェクター欠損キメラIV.3 mAbの注射後]を比較)。従って、エフェクター欠損IV.3 mAbは血小板を枯渇させなかった(図15D)。このデータは、IgGエフェクタードメインがIV.3 IgG誘発性血小板減少症の原因であることを実証している。
図14及び15に示す結果は、天然IV.3 IgG mAbのエフェクタードメインがCD32Aマウスにおいてインフュージョンリアクションを引き起こし、そのようなインフュージョンリアクションがIgG−Fcドメインを改変することによって排除されることを実証する。従って、IgG Fc受容体に効率的に結合する抗CD32a抗体の能力を取り除くことは、インフュージョンリアクションを排除するのに有益である。IV.3 mAbをエフェクター欠損にすることはまた、循環血液から血小板を除去する抗体の能力を抑止し、そのようなクリアランスが、IV.3の場合、CD32Aトランスジェニックマウス血小板の表面上に固定化されているIgG−Fcドメインによっても媒介されていることを示している。
エフェクター欠損IV.3 mAbは、CD32Aトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護する。
次に、エフェクター欠損キメラIV.3 mAbは、CD32Aトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護することが決定された。免疫複合体曝露の3時間前に、CD32AトランスジェニックマウスをPBSビヒクル又は100マイクログラムの代表的なエフェクター欠損キメラIV.3 IgG2 N297A(配列番号51のアミノ酸を配列番号45のアミノ酸とともに含む抗体)で前処置した。免疫複合体(M90+CD40L、実施例1のように、200マイクログラム)をマウスに曝露した30分後に全血を採取した。図16Aは、ビヒクルを投与されたマウスからの全血試料中の血小板枯渇を示す。図16Bは、キメラIV.3 IgG2 N297Aで前処置された動物は、ICに応答して血小板減少症を経験しなかったことを示す。
次に、エフェクター欠損キメラIV.3 mAbは、CD32Aトランスジェニックマウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護することが決定された。免疫複合体曝露の3時間前に、CD32AトランスジェニックマウスをPBSビヒクル又は100マイクログラムの代表的なエフェクター欠損キメラIV.3 IgG2 N297A(配列番号51のアミノ酸を配列番号45のアミノ酸とともに含む抗体)で前処置した。免疫複合体(M90+CD40L、実施例1のように、200マイクログラム)をマウスに曝露した30分後に全血を採取した。図16Aは、ビヒクルを投与されたマウスからの全血試料中の血小板枯渇を示す。図16Bは、キメラIV.3 IgG2 N297Aで前処置された動物は、ICに応答して血小板減少症を経験しなかったことを示す。
図17は、上記のようにビヒクル又はエフェクター欠損キメラIV.3抗体の何れかで前処置したCD32AマウスへのIC注射後(M90+CD40L、実施例1のように、200マイクログラム)の循環血小板の減少(%)を示す棒グラフを示す。ビヒクル(PBS)で前処理したCD32Aマウスは、著しく血小板減少性になったが(図17、棒1)、一方エフェクター欠損キメラIV.3ヒトIgG2 N297A(図17、棒2、3及び4)で前処置されたマウスは、循環血小板の喪失から大部分が保護されていた。従って、エフェクター欠損キメラIV.3ヒトIgG2 N297Aは、マウスを免疫複合体誘発性血小板減少症から保護した(図17)。
エフェクターキメラ欠損IV.3抗体は、免疫複合体(IC)によって引き起こされる肺血栓症からCD32Aトランスジェニックマウスを保護する。
この実験では、CD32Aマウスをビヒクル又は100マイクログラムのエフェクター欠損キメラIV.3ヒトIgG2 N297A mAb(配列番号45とともに配列番号51)で前処置した。3時間後、前処置したマウスにM90+CD40L IC(実施例1と同様;200マイクログラム)を曝露した。30分後、マウスを屠殺し、それらの肺を分析用に除去した。図18Aは、IC曝露の3時間前にビヒクルで前処置されたマウスからのH&E染色された肺切片を示す。広汎性閉塞性肺血栓(*)がビヒクル処理マウスで検出された。驚くべきことに、エフェクター欠損キメラIV.3ヒトIgG2 N297Aで前処置されたマウスは、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した(図18B)。キメラIV.3 IgG2ヒトN297A前処置マウスはまた、異常でかつ閉塞した血管を呈したビヒクル処置マウス(図18A)と比較して、健康な肺胞組織の中に豊富な赤血球を有する正常な血管を示した(図18B)。特に、これらのマウスは免疫学的にインタクトであり(天然に存在するマウスIgG−Fc受容体の完全な配列を有する)、IC誘発性血小板減少症、血栓症及びショックにおけるCD32aの優位性を実証した。
この実験では、CD32Aマウスをビヒクル又は100マイクログラムのエフェクター欠損キメラIV.3ヒトIgG2 N297A mAb(配列番号45とともに配列番号51)で前処置した。3時間後、前処置したマウスにM90+CD40L IC(実施例1と同様;200マイクログラム)を曝露した。30分後、マウスを屠殺し、それらの肺を分析用に除去した。図18Aは、IC曝露の3時間前にビヒクルで前処置されたマウスからのH&E染色された肺切片を示す。広汎性閉塞性肺血栓(*)がビヒクル処理マウスで検出された。驚くべきことに、エフェクター欠損キメラIV.3ヒトIgG2 N297Aで前処置されたマウスは、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した(図18B)。キメラIV.3 IgG2ヒトN297A前処置マウスはまた、異常でかつ閉塞した血管を呈したビヒクル処置マウス(図18A)と比較して、健康な肺胞組織の中に豊富な赤血球を有する正常な血管を示した(図18B)。特に、これらのマウスは免疫学的にインタクトであり(天然に存在するマウスIgG−Fc受容体の完全な配列を有する)、IC誘発性血小板減少症、血栓症及びショックにおけるCD32aの優位性を実証した。
図18Cにおいて、IC曝露後のマウス肺のH&E顕微鏡検査によって、10の視野当たりの平均肺血栓数を決定した。上記のように4匹のマウスにM90+CD40L ICを注射した。動物#1(PBS前処理対照)は、広汎性肺血栓症(視野あたり平均17.6の血餅)を示したが、エフェクター欠損キメラIV.3ヒトIgG2 N297Aで前処置された動物#2、#3、及び#4は、血栓症の証拠のない正常な肺の解剖所見を示した。
まとめると、実施例3に示すデータは、(1)天然キメラIV.3抗CD32a IgG2 mAbが、インフュージョンリアクションを引き起こし、血小板減少症を誘導する;(2)キメラAT−10 mAbをエフェクター欠損フォーマットに改変することにより、キメラIV.3の注入を安全にしかつ止血的に安全にする(それは血小板減少症を誘導しない);(3)IV.3媒介性インフュージョンリアクション及び血小板減少症は、IgG−Fc(エフェクター)ドメインの機能に依存する;(4)エフェクター欠損キメラIV.3 IgG mAbがCD32Aトランスジェニックマウスを、免疫複合体媒介性インフュージョンリアクション、血小板減少症、血栓症及びショックから保護することを実証する。
実施例4
抗CD32a mAbは、CD32a媒介性免疫複合体誘発ヒト血小板凝集及び脱顆粒を強力に阻害する。
抗CD32a mAbは、CD32a媒介性免疫複合体誘発ヒト血小板凝集及び脱顆粒を強力に阻害する。
この実施例では、インビトロでの免疫複合体誘発性ヒト血小板凝集及び脱顆粒を分析して、抗CD32a mAbの効力及び有効性を評価した。
方法
方法
血小板活性化免疫複合体(IC)を、CD40リガンド(CD40L、CD154とも呼ばれる)、ヒト血小板因子4(hPF4)、ヒトβ2−糖タンパク質I(β2−GPI)、又はTNFα抗体とそれらのそれぞれのリガンドと典型的には平衡化学量論(100−1000nM)で組み合わせることにより調製した。以下の型の免疫複合体を試験した:(1)M90抗CD40L mAb+CD40L;(2)M91抗CD40L mAb+CD40L;(3)M90抗CD40L mAb+M91抗CD40L mAb+CD40L(ポリクローナル免疫複合体);(4)抗hPF4 mAb+hPF4+0.1U/mlヘパリン(HIT様IC);(5)ポリクローナル抗ベータ2−GPI+ベータ2−GPI(APS様IC);(6)インフリキシマブ+TNFアルファ(治療用mAb様IC);(7)アダリムマブ+TNFアルファ(治療用mAb様IC);(8)ヤギF(ab’)2−抗ヒトIgG−F(ab’)2+インフリキシマブ(抗治療用抗体IC活性を模倣するため)。
単離された血小板は、以下のように光透過凝集測定法を介して評価された。インフォームド・コンセントに従って健康なヒトドナー(n=10)から血小板を得て、洗浄し、アッセイ緩衝液に懸濁させた。血小板を凝集計のキュベットに入れ、安定したベースラインが達成されるまで37℃でインキュベートした。
抗CD32a抗体又は生理食塩水を、血小板活性化免疫複合体の添加の5−10分前にキュベットに添加した。免疫複合体の添加後、凝集痕跡を少なくとも5分間モニターした。CD32a mAbが免疫複合体誘発性凝集を防止した場合、血小板の凝集能力は、標準アゴニストコラーゲンの添加(7マイクログラム/ミリリットル最終濃度)によって確認された。
結果
結果
図19において、500nMのM90+CD40L ICは、洗浄されたヒト血小板上のCD32aを活性化し、凝集をもたらし、対照mAb(組換えウサギIgG)によって遮断されなかった。図19(ライン1)。血小板凝集は、マウスIV.3mIgG2b(図19、ライン2)及び天然キメラIV.3hIgG1(図19、ライン3)によって完全にブロックされ、それらは同様の効力(<5nMが必要)を呈する。このデータは、クローン化天然キメラIV.3 hIgG1が、親マウスモノクローナル抗体のものに匹敵するCD32a遮断活性を有することを実証する。
図20において、250nMのM90+CD40L ICは、7nMアグリコシル化マウスIV.3mIgG2bによって遮断された(図20、ライン2)CD32a依存性凝集を強力に誘導した(図20、ライン1)。これらの結果は、抗体エフェクター欠損をもたらすマウスIV.3mIgG2b mAbの「Fc」エフェクタードメインの脱グリコシル化は、血小板CD32aの遮断における効力(すなわち、そのFab依存活性)を有意に変化させないことを示唆する。
図21において、500nMのM90+CD40L Icは、天然キメラIV.3 hIgG2によって遮断された(図21、ライン2、3、4)凝集を誘導した(図21、ライン1)。500nMのM91+CD40L ICで試験した第2のドナー由来の血小板の凝集もまた、天然キメラIV.3 hIgG2によって完全に阻害された(データ非表示)。
図22において、500nMのM90+CD40L IC誘発性凝集(図22、ライン1)は3.3nM(図22、ライン2)及び1.7nM(図22、ライン3)のエフェクター欠損キメラIV.3 hIgG2 N297A mAb(配列番号45とともに配列番号51)によって遮断される。19分で添加したコラーゲン(ここと以下で*で示す)は、抗CD32a mAbで処置した血小板が凝集能力を保持していることを実証した。
図23において、500nMのM90+CD40L IC誘発性凝集(図23、ライン1)は13nMのエフェクター欠損キメラAT−10hIgG1 E269R(図23、ライン2)mAb(配列番号16とともに配列番号22)によって遮断される。また、天然キメラAT−10 hIgG1、hIgG2、及びエフェクター欠損キメラhIgG2 N297Aフォーマット(配列番号18とともに配列番号22)は、他のドナーからの血小板で同様の結果を示した(データ非表示)。
図24において、M90+M91及びCD40Lの700nM混合物からなるICは、血小板凝集を引き起こした(図24、ライン1)。このICの活性は、3nM未満のエフェクター欠損ヒトMDE−8 IgG1 E269R(配列番号65とともに配列番号69)によって完全に遮断された(図24、ライン2)。15分で添加されたコラーゲンは、凝集能力を示した(図24、ライン2*)。天然ヒトMDE−8 IgG1、IgG2、及びエフェクター欠損IgG2 N297A(配列番号67とともに配列番号69)は同様にIC誘発性凝集を遮断した(データ非表示)。
図25において、500nMのM90+CD40L IC誘発性凝集(図25、ライン1)は、3nMのエフェクター欠損ヒト化IV.3.1 IgG1 E269R(配列番号47とともに配列番号53、図25、ライン2)によって及び3nMのマウスIV.3 mIgG2b(図25、ライン3)mAbによって同様に阻害された。エフェクター欠損ヒト化IV.3.2 IgG1 E269R mAb(配列番号49とともに配列番号53)の同一濃度(3nM)もこのICの活性を阻害した(データ非表示)。このデータは、ヒト化IV.3 mAbとマウスIV.3 mAbとの間の同様の効力を示す。
図26において、500nMのM90+CD40L IC誘発性凝集(図26、ライン1)は、2nMのエフェクター欠損ヒト化IV.3.1 IgG1 E269R(配列番号47とともに配列番号53、図26、ライン2)によって阻害されなかったが、2nMのマウスIV.3 mIgG2b mAb(図26、ライン3)によって阻害された。10.5分で添加されたコラーゲンは、血小板凝集能力を実証した。
図27において、M90+CD40L(500nM)IC誘発性凝集(図27、ライン1)は、6nMのエフェクター欠損ヒト化IV.3.1 IgG1 E269R(配列番号47とともに配列番号53、図27、ライン2)によって遮断された。コラーゲン(*)が11分で添加され(図27、ライン2)、血小板凝集能力を実証した。
図28において、M90+M91及びCD40Lの1000nM混合物からなるICは、血小板凝集を引き起こした(図28、ライン1)。このICの活性は、25nMのエフェクター欠損ヒト化IV.3.1 IgG1 E269R(配列番号47とともに配列番号53、図28、ライン2)によって及び25nMのマウスIV.3 mIgG2b(図28、ライン3)mAbによって同様に阻害された。陰性対照(ICを添加しなかった;図28、ライン4)は凝集しなかった。
図29において、250nMのhPF4+抗hPF4+ヘパリン(0.1単位/ミリリットル)、HIT様IC(図29、ライン1)は、40nMのエフェクター欠損ヒト化IV.3.1 IgG1 E269R(配列番号47とともに配列番号53、図29、ライン2)によって完全に遮断された。コラーゲンを10.5分で添加した(図29、ライン2)。エフェクター欠損ヒト化IV.3.2 IgG1 E269R mAb(配列番号49とともに配列番号53)の同一濃度(3nM)もこのICの活性を阻害した(データ非表示)。
図30において、500nMの抗ヒトベータ2GPIポリクローナル抗体+125nMのヒトベータ2GPIIC(APS様IC)は、強い血小板凝集を誘導し(図30、ライン1)、それは33nMのエフェクター欠損ヒト化IV.3.1 IgG1 E269R mAb(配列番号47とともに配列番号53、図30、ライン2)及び50nMのエフェクター欠損ヒトMDE−8 IgG1 E269R(配列番号65とともに配列番号69、図30、ライン3)の両方によって遮断された。
図31において、M90+CD40L(500nM)IC誘発性凝集(図31、ライン1)は、15nMのエフェクター欠損ヒト化AT−10 IgG1 E269R(配列番号20とともに配列番号24、図31、ライン2)によって阻害された。Fcドメインを欠いているヤギ抗ヒトF(ab’)2のF(ab’)2断片375nMの添加(#で示される;16分で添加された)は、血小板凝集を引き起こし、従って、エフェクター欠損ヒト化AT−10 IgG1 E269Rの血小板表面局在ならびに凝集能力を実証する。
まとめると、図19−31に示す結果は、幾つかの異なる型の免疫複合体(IC)がCD32a依存的に血小板凝集を誘導することができることを示している。これらのICは、IgG1及びIgG2アイソタイプサブクラスを含む、エフェクター能力のあるフォーマット及びエフェクター欠損フォーマットの両方において、キメラ又はヒト化IV.3によって、キメラ又はヒト化AT−10によって、及びMDE−8によって強力に遮断される。ヒト化AT−10及びヒト化IV.3 mAbは、それらの親マウスmAbに匹敵するCD32a遮断活性を示したので、これらの以前に記載されていない新規なmAbは、免疫複合体がCD32aを介して病理学的役割を果たすヒト疾患の治療に有用であり得る。
まとめて考えた場合、インビボ(マウス)及びインビトロ(凝集、脱顆粒)データはまた、IgG1又はIgG2フォーマットのいずれであろうと、キメラ、ヒト化、又は完全ヒトであるかどうかに関わらず、IV.3、AT−10、及びMDE−8のエフェクター欠損フォーマットは、CD32aの強力な遮断を提供しながら安全なインビボ投与プロファイルを有し、従ってIC又は固定化IgGによって誘導されるCD32aの活性化を妨げることが期待できる。
組み合わせたAT−10、IV.3及びMDE−8 mAbはCD32aを活性化しない。
我々は次に、本明細書に記載のエフェクター欠損キメラ、ヒト化及びヒト抗CD32a mAbが、組み合わせた場合に、CD32aを活性化することができるかどうかを検討した(すなわち、受容体を直接多量体化又はクラスター化することにより)。この目的のために、我々は、全てがエフェクター欠損IgG1 E269Rフォーマットである、2nMのヒト化AT−10(配列番号20とともに配列番号24)、150nMのヒト化IV.3.1(配列番号47ととも配列番号53)、及び150nMのヒトMDE−8(配列番号65とともに配列番号69)を組み合わせ、これらの抗CD32a mAbの組み合わせを洗浄したヒト血小板に暴露した。図32は、500nMのM90+CD40L ICは強力な血小板凝集を誘導したが(図32、ライン1)、組み合わせた抗CD32a mAbは凝集を生じなかった(図32、ライン2)ことを示す。18分で添加されたコラーゲンは凝集能力を実証した。図33は、300nMのエフェクター欠損キメラAT−10hIgG1 E269R(配列番号16とともに配列番号22)、300nMエフェクター欠損キメラIV.3hIgG2 N297A(配列番号45とともに配列番号51)及び300nMのエフェクター欠損ヒトMDE−8 IgG1 E269R(配列番号65とともに配列番号65)の組み合わせもまた、血小板凝集を誘導することができなかったが、コラーゲン(*)は成功したことを示す。
我々は次に、本明細書に記載のエフェクター欠損キメラ、ヒト化及びヒト抗CD32a mAbが、組み合わせた場合に、CD32aを活性化することができるかどうかを検討した(すなわち、受容体を直接多量体化又はクラスター化することにより)。この目的のために、我々は、全てがエフェクター欠損IgG1 E269Rフォーマットである、2nMのヒト化AT−10(配列番号20とともに配列番号24)、150nMのヒト化IV.3.1(配列番号47ととも配列番号53)、及び150nMのヒトMDE−8(配列番号65とともに配列番号69)を組み合わせ、これらの抗CD32a mAbの組み合わせを洗浄したヒト血小板に暴露した。図32は、500nMのM90+CD40L ICは強力な血小板凝集を誘導したが(図32、ライン1)、組み合わせた抗CD32a mAbは凝集を生じなかった(図32、ライン2)ことを示す。18分で添加されたコラーゲンは凝集能力を実証した。図33は、300nMのエフェクター欠損キメラAT−10hIgG1 E269R(配列番号16とともに配列番号22)、300nMエフェクター欠損キメラIV.3hIgG2 N297A(配列番号45とともに配列番号51)及び300nMのエフェクター欠損ヒトMDE−8 IgG1 E269R(配列番号65とともに配列番号65)の組み合わせもまた、血小板凝集を誘導することができなかったが、コラーゲン(*)は成功したことを示す。
次に、IC32aがICによってクラスター化される場合に起こる、血小板脱顆粒を誘導するための組み合わせたCD32a mAbの能力を調べた。我々はまた、TNFアルファと複合体を形成した治療用TNFアルファ抗体(100nM)によって引き起こされる血小板脱顆粒を防止するためのこれらの抗CD32a mAbの能力を評価した。この目的のために、我々は、マウスIV.3mIgG2b、エフェクター欠損ヒト化IV.3.1 hIgG1 E269R(配列番号47とともに配列番号53)、エフェクター欠損キメラAT−10 hIgG1 E269R(配列番号16とともに配列番号22)、及びエフェクター欠損ヒトMDE−8 IgG1 E269R(配列番号65とともに配列番号69)、並びにこれらの4つのmAbの組み合わせ(全て100nMで)を、セロトニン放出アッセイ(図34)における脱顆粒によって測定される、洗浄されたヒト血小板を活性化するそれらの能力について試験した。結果は、試験した全ての抗CD32a mAbがTNFアルファ−免疫複合体誘発性血小板脱顆粒を防止し、全てのmAbの組み合わせが血小板の脱顆粒に失敗したことを示した。図34。
更に、全てがエフェクター欠損IgG1 E269Rフォーマットである、25nMのヒト化IV.3.1(配列番号47とともに配列番号53)、90nMのヒト化AT−10(配列番号20ととも配列番号24)、及び75nMのヒトMDE−8(配列番号65とともに配列番号69)の組み合わせをもまた同様に試験し、同じ結果であった(すなわち、CD32aの活性化なし、データ非表示)。
試験したmAbの各々は、インフリキシマブ及びアダリムマブ抗TNFアルファIC誘発性血小板活性化を遮断した。4つの抗CD32a mAb(マウスIV.3、ヒト化IV.3、キメラAT−10及びヒトMDE−8)は、血小板活性化を引き起こすことができなかった(図34)。
まとめると、図32−34に示す結果は、試験されたmAbが相乗的にCD32aを活性化点にクラスター化しない点で適合性(compatible)であり、これらのmAbが相乗的活性化なしに患者に潜在的に送達され得ることを示唆している。更に、これらのmAbの適合性は、抗CD32a療法のための進行性の治療経過を提供し、ここでは第1の治療用抗CD32a mAbに対する免疫反応性を発症する患者には、慢性免疫複合体媒介性疾患の長期治療に適合する追跡治療薬が提供される。
免疫複合体媒介性障害を有する患者における治療に使用されるヒト化抗体及びヒト抗体は、免疫原性が低いと予想されるが、その証拠は、それにもかかわらず、多くのそのような患者は、治療用抗体(例えば、抗治療用抗体抗体又はATA)に対する免疫反応を発症することを示唆する。これらの宿主応答抗体は、CD32aを活性化する免疫複合体を形成し得る;しかしながら、本明細書に記載のエフェクター欠損CD32a mAbは、これらのATA免疫複合体から患者を保護する際に使用する候補である。
この根拠に従って、我々は、抗CD32a mAbが、インフルキシマブ及びヤギ抗ヒトIgG−F(ab’)2抗体のF(ab’)2断片から形成されたICによって誘導される血小板脱顆粒を防止する能力を試験し、ここでこのようなICの唯一の機能的Fcドメインは、治療用mAbであるインフリキシマブのものである。図35は、インフリキシマブ+ヤギ抗ヒトIgG F(ab’)2 ICが血小板脱顆粒を誘導することを示す(図35、第1カラム)。このICの活性は、マウスIV.3mIgG2b mAb(図35、第2カラム)によって、エフェクター欠損ヒトMDE−8 IgG1 E269R(配列番号65とともに配列番号69、図35、第3カラム)によって、エフェクター欠損キメラAT−10 hIgG1 E269R(配列番号16とともに配列番号22、図35、第4カラム)によって、及びエフェクター欠損ヒト化IV.3.1 hIgG1 E269R(配列番号47とともに配列番号53、図35、第5カラム)によって遮断された。これらの結果は、CD32aの遮断は、治療用mAb、インフリキシマブをクラスター化する抗体から形成されるICによって血小板の活性化を防止することができ、本発明のエフェクター欠損CD32a抗体は、ICによる、特に治療用非CD32aモノクローナル抗体のクラスターから形成されたICによる血小板の活性化を防止する方法において有用であることを実証する。
更に、そのような治療用非CD32a mAbに免疫学的に反応性である患者は、典型的には、抗TNFα療法の場合のように、同じ抗原標的を有する別の治療用mAbへと移行されるか、又は「切り替えられ」、ここで反応性患者は、例えばインフリキシマブからアダリムマブに切り替えることができる。この懸念は、残留する以前の治療用抗体がもはや存在しないことを保証するために、長い治療間隙を必要とする可能性がある。しかし、我々のデータは、免疫反応性レシピエント(すなわち、投与された非抗CD32a抗体に対する免疫反応を有する患者)は、治療間隙のない本明細書に記載のエフェクター欠損CD32a抗体に安全に切り替えることができ、相乗的な血小板活性化の心配なしに、本明細書に記載されているように、複数のエフェクター欠損CD32a抗体で患者を治療することもできることを示している。
この根拠に従って、3種の抗CD32a mAbの組み合わせをCD32Aトランスジェニックマウスに注射し、可能な相乗的インフュージョンリアクションの尺度として中核体温及び血小板数を調べた。エフェクター欠損キメラAT−10 hIgG1 E269R(配列番号16とともに配列番号22)、エフェクター欠損キメラIV.3 hIgG2 N297A(配列番号51とともに配列番号45)、及びエフェクター欠損ヒトMDE−8 IgG1 E269R(配列番号65とともに配列番号69)を予め混合し、2回のCD32Aトランスジェニックマウスに単回ボーラスとして静脈内注射した。第1の動物には50マイクログラムの各mAbを投与した(合計150マイクログラムの抗CD32a IgGを注射した)。第2の動物には100マイクログラムの各mAbを投与した(300マイクログラムの全IgGを注射した)。各動物の血小板数(全血中)をmAb注射の前(図36A及び36C)及び30分後に測定した(図36B=50マイクログラム×3、図36D=100マイクログラム×3)。ゲートP1は血小板を同定する(ゲートP4は他の血液細胞である)。図36Eは、エフェクター欠損mAbの注射後30分間モニターしたCD32Aトランスジェニックマウスの中核体温を示す。これらの結果は、これらのエフェクター欠損抗CD32aクローン(すなわち、IV.3、AT−10、MDE−8)を組み合わせると、CD32AマウスにおいてCD32aをクラスター化するか又は血小板減少症を誘発する能力を付与しないことを示す。
まとめると、図32−36に示される結果は、IV.3、AT−10、及びMDE−8の驚くべき機能的適合性を示し、組み合わされた場合、これらの抗体はインビトロ及びインビボの両方でそれらの非活性化プロファイルを保持し、例えば抗薬物抗体(ATA)の存在下での継続的な抗CD32a免疫療法のための治療戦略を提供する。
実施例5
抗CD32a mAbの更なる特徴付け。
この実施例において、我々は、明らかな内在性CD32a活性化活性の欠如及び予想されるCD32a遮断能について、エクスビボで機能的に抗CD32a mAbを確認した。我々はまた、IV.3溶液が動的光散乱にれば凝集体を含まないことを確認した。
抗CD32a mAbの更なる特徴付け。
この実施例において、我々は、明らかな内在性CD32a活性化活性の欠如及び予想されるCD32a遮断能について、エクスビボで機能的に抗CD32a mAbを確認した。我々はまた、IV.3溶液が動的光散乱にれば凝集体を含まないことを確認した。
方法
インビトロヒト血小板研究のための血小板活性化免疫複合体。追加の(M90+CD40L以外の)血小板活性化ICを、M91(別のCD40L mAb、ATCC)、TNF−α抗体(インフリキシマブ、Centocor、及びアダリムマブ、Invivogen)を、それぞれのリガンドと平衡化学量論(100−1000nM)で組み合わせることによって調製した。全てにおいて、以下の型の免疫複合体を試験した:(1)M90抗CD40L mAb+CD40L;(2)M91抗CD40L mAb+CD40L;(3)インフリキシマブ+TNF−α(治療用mAb様IC);(4)アダリムマブ+TNF−α(治療用mAb様IC)。TNF−αは、R&D Systemsから入手した。
インビトロヒト血小板研究のための血小板活性化免疫複合体。追加の(M90+CD40L以外の)血小板活性化ICを、M91(別のCD40L mAb、ATCC)、TNF−α抗体(インフリキシマブ、Centocor、及びアダリムマブ、Invivogen)を、それぞれのリガンドと平衡化学量論(100−1000nM)で組み合わせることによって調製した。全てにおいて、以下の型の免疫複合体を試験した:(1)M90抗CD40L mAb+CD40L;(2)M91抗CD40L mAb+CD40L;(3)インフリキシマブ+TNF−α(治療用mAb様IC);(4)アダリムマブ+TNF−α(治療用mAb様IC)。TNF−αは、R&D Systemsから入手した。
抗体の動的光散乱分析。IV.3調製物及び参照抗体溶液を動的光散乱分析に供した。熱凝集したIV.3は、1mg/mlのIV.3溶液を63℃で20分間インキュベートすることによって調製した。抗体分子の流体力学的直径は、緑色レーザー(532nm)を備えたZetasizer Nano ZS90 DLSシステム、及びアバランシェフォトダイオード検出器(532nmで50%を超える量子効率;Malvern Instruments、Worcestershire、UK)で測定した。3mmのHellma QSキュベットを試料容器として使用した。DTS Applications 5.10ソフトウェアを使用してデータを分析した。報告された平均分子サイズは、非負最小二乗分析法で得られた強度平均に基づくものであった。体積分布は1.45の屈折率を有する強度分布から計算した。各試料について、3回の測定を20秒の実行時間で行った。サイズ測定には90°の検出角を用いた。
マウス血小板表面上のCD32a mAb局在のフローサイトメトリー分析。選択CD32a mAb(35μg)又はPBSをFCGR2Aマウスに静脈内注射した。
血液を注射の10分後に後眼窩から採取し、5μlをAlexaFluor−488ヤギ抗ヒトIgG(Invitrogen;Eugene、OR)と100μlの反応容量でインキュベート(20分)した。次に、試料をPBSで1:5に希釈し、FACSCanto IIフローサイトメーター(BD、San Jose、CA)を用いて分析した。血小板をFSC対SSCプロットに基づいて同定し、50,000事象の蛍光を分析した。ビヒクル(PBS)を注射した動物からの血液を対照として使用した。
血液を注射の10分後に後眼窩から採取し、5μlをAlexaFluor−488ヤギ抗ヒトIgG(Invitrogen;Eugene、OR)と100μlの反応容量でインキュベート(20分)した。次に、試料をPBSで1:5に希釈し、FACSCanto IIフローサイトメーター(BD、San Jose、CA)を用いて分析した。血小板をFSC対SSCプロットに基づいて同定し、50,000事象の蛍光を分析した。ビヒクル(PBS)を注射した動物からの血液を対照として使用した。
フローサイトメトリー及び凝集測定のためのマウス多血小板血漿及び洗浄血小板の調製。複数のFCGR2Aマウスから血液(1ml/マウス)を酸クエン酸デキストロース(ACD、1:6比)に収集し、プールした。0.5X容量のTyrodes−HEPES緩衝液を加えて血液を希釈した[137mMのNaCl、2.7mMのKCl、1mMのMgCl2、5.6mMのデキストロース、3.3mMのNaH2PO4、20mMのHEPES、pH7.4]。フローサイトメトリーには、プールされた血液の遠心分離(室温で血液を2300×gで10秒/ml)で得られた多血小板血漿(PRP)を用いた。洗浄した血小板の調製のために、PRPをBSA被覆チューブに入れた。プロスタグランジン−I2(Sigma;St.Louis、MO)を最終濃度300ng/mlで添加し、室温で5分間インキュベートした。次いで、PRPを遠心分離した(740×g)。血漿除去後、ペレット化血小板を0.1%BSA−Tyrodes−HEPES緩衝液中に300×106/mlの濃度で懸濁させ、光透過性血小板凝集測定法(Chrono−Log;Havertown、PA)を用いた血小板凝集研究に使用した。
マウス血小板活性化のフローサイトメトリー分析。マウスPRPをPBSで希釈し、2.5×106個の血小板(100μl中)をIV.3及び組換えCD32a mAb(全て35μg/mlで)とともにインキュベートした。対照IgG(セツキシマブ、35μg/ml)及びアラキドン酸(0.5mM)をそれぞれ陰性対照及び陽性対照として使用した。CD32a mAb及び/又は対照の添加直後に、FITC標識抗マウスCD62P又はアイソタイプ対照抗体(BD Pharmingen;San Jose、CA)を血小板に添加し、室温で15分間インキュベートした。次いで、試料をPBSで1:5に希釈し、フローサイトメトリー(FACSCanto II、BD)で分析した。血小板をFSC対SSCプロットに基づいて同定し、50,000事象の蛍光を分析した。
マウス血小板凝集測定。270μlの洗浄したマウス血小板(300×106/ml)を含む反応物(最終体積320μl)をCD32a mAb(5−60μg/ml)とともに10−15分間インキュベートした。PBS及び無関係のIgG(セツキシマブ、60μg/ml)を陰性対照として使用した。次いで、500nMのM90+hCD40Lからなる予め形成された(室温で5分間)免疫複合体の30マイクロリットルを反応物に添加し、10−15分間インキュベートした。次いでヤギ抗ヒトIgG(20μg/ml)(Jackson Immunoresearch:West Grove、PA)を、CD32a mAbを含有する反応物に添加し、ヤギF(ab’)2抗マウスIgG(20μg/ml)(Jackson Immunoresearch)をマウスIV.3を含む反応液に添加した。光伝達血小板凝集測定は、4チャンネル血小板凝集計(Chrono−Log)において37℃で攪拌することによって行った。
ヒト血小板凝集測定。健康なヒト被験者からのインフォームドコンセントに従って、ACDチューブ(1:9比)に収集した全血から血小板を得た。血液を120×gで15分間遠心分離して、多血小板血漿(PRP)を得た。PRPをBSAコ被覆yチューブに収集し、2U/mlアピラーゼ(Sigma;St.Louis、MO)とともに室温で5分間インキュベートし、10分間遠心分離した(740×g)。血漿除去後、ペレット化した血小板を0.1%のBSA−Tyrodes−HEPES緩衝液に懸濁し、血小板凝集に使用した。270μlの洗浄したヒト血小板(250×106/ml)を含む反応物(最終容量300μl)をCD32a mAb(0.2−2μg/ml)とともに10−15分間インキュベートした。次いで、500nMのM90+CD40Lからなる予め形成された(室温で5分間)免疫複合体の30マイクロリットルを反応物に添加し、10−15分間インキュベートした。幾つかの場合、6μg/mlコラーゲン(Chrono−Log)を実行の最後に加えて血小板凝集性を確認した。光伝達血小板凝集測定は、4チャンネル血小板凝集計(Chrono−Log)において37℃で攪拌することによって行った。
セロトニン放出アッセイ。血小板脱顆粒を測定するためにセロトニン放出アッセイ(SRA)を使用した。健康なヒト被験者からのインフォームドコンセントに従って、ACDチューブ(1:9比)に収集した全血から血小板を得た。血液を120×gで15分間遠心分離して、多血小板血漿(PRP)を得た。PRPを37℃で45分間、[14C]セロトニン(0.1mCi/ml、[14C]−5HT、GE Healthcare)とともにインキュベートした。血小板をカルシウム及びアルブミンを含まないTyrodeの緩衝液(137mMのNaCl、2.7mMのKCl、12mMのNaHCO3、0.42mMのNaH2PO4、2mMのMgCl2、5mMのHEPES、5.6mMのデキストロース、1.5U/mlのアピラーゼ、pH6.2)で洗浄した。洗浄した血小板を、2mMのCaCl2(pH7.3)を含むアルブミン−及びアピラーゼフリー(AFT)Tyrode緩衝液に再懸濁した。CD32a mAb(30μg/ml)及び予め形成された抗TNF ICをPBS中で調製し、血小板に添加した。混合物を使用前に室温で5分間インキュベートした。マイクロタイタープレート中の3つの反応(100μlの最終容量)は、70μlの洗浄した血小板(300−500×106/ml)及び30μlのアゴニスト(すなわち、予め形成されたIC)からなっていた。「バックグラウンド」反応は、AFT緩衝液で処理した血小板からなっていたのに対して、「全取り込み」反応では、血小板が3%Triton X−100に可溶化された。反応は、400rpmで振動振盪しながら室温で60分間行った。等容積の4%EDTAを加えることによって反応を停止させ、血小板を2100×gで5分間の遠心分離によってペレット化した。放出されたセロトニンを含む上清をUltima Gold LSC Cocktailシンチレーション液(PerkinElmer)で1:50に希釈し、β−放射能の放出をTri−Carb液体シンチレーションカウンター(Perkin Elmer)で1分間測定した。3回の反応の平均を計算した。パーセントセロトニン放出は、(試験の平均cpm−バックグラウンドの平均cpm)/(全取り込みの平均cpm−バックグラウンドの平均cpm/100)として計算した。
結果
IV.3 mAb調製物は多量体を含まない。マウス注射のために使用されるIV.3調製物を、多量体の潜在的な存在を評価するために動的光散乱分析に供した。多量体を欠く参照試薬として、注射用医薬品グレードのモノクローナルIgG1抗体、セツキシマブ、及びラットIgG2b(BioXCell)を用いた。3つ全てのピークは、モノマーIgGの正常範囲内に入る(Ahrer et al.Journal of Chromatography A; 2003, 89-96)。熱凝集したIV3を、多量体IV3構造の陽性対照として用いた。結果を図17に示す。
IV.3 mAb調製物は多量体を含まない。マウス注射のために使用されるIV.3調製物を、多量体の潜在的な存在を評価するために動的光散乱分析に供した。多量体を欠く参照試薬として、注射用医薬品グレードのモノクローナルIgG1抗体、セツキシマブ、及びラットIgG2b(BioXCell)を用いた。3つ全てのピークは、モノマーIgGの正常範囲内に入る(Ahrer et al.Journal of Chromatography A; 2003, 89-96)。熱凝集したIV3を、多量体IV3構造の陽性対照として用いた。結果を図17に示す。
エフェクター欠損組換えCD32a mAbは、インビボでFCGR2Aマウス血小板の表面に局在する。FCGR2Aマウスに、様々なエフェクター欠損CD32a mAbを注射した(35μg/マウス)。血小板表面結合抗CD32aを、AlexaFluor 488標識ヤギ抗ヒトIgGを用いてエクスビボで(全血で)検出した。PBS(未処置)を注射したFCGR2Aマウス由来の血小板は、陰性対照として機能を果たした。図2に示す結果は、CD32a mAb(cAT10−E269R、cAT10−N297A、MDE8−E269R、及びMDE8−N297A)が血小板に特異的に局在することを示していた。E269R標識はIgG1サブクラスを示す。N297A標識はIgG2サブクラスを示す。
IV.3ならびに組換えエフェクター欠損CD32a mAbは、エクスビボでFCGR2Aマウス血小板を直接活性化しない。FCGR2AマウスからのPRPを希釈してCD32a mAb(35μg/ml)で処理し、表面上にCD62Pの存在について試験した。対照IgG及びアラキドン酸で処置した血小板は、それぞれ活性化の陰性及び陽性対照として機能を果たした。更に、ヤギF(ab’)2抗ヒトIgGを用いて表面結合CD32a mAb、MDE8−E269Rをクラスター化し、それによって血小板を活性化した。図39A−Hに示す結果は、CD32a mAb(MDE8−E269R、MDE8−N297A、cAT10−E269R、及びcAT10−N297A)は、エクスビボで明らかな内因性CD32a活性化活性を欠いていたことを示していた。E269R標識はIgG1サブクラスを示す。N297A標識はIgG2サブクラスを示す。
IV.3ならびに組換えエフェクター欠損CD32a mAbがFCGR2Aマウス血小板を直接凝集しないが、それらはエクスビボでIC媒介性凝集を遮断し、血小板表面に特異的に結合する。FCGR2Aマウスの洗浄した血小板をCD32a mAbで処置した(5−60μg/ml)。CD32a mAbの潜在的な血小板凝集活性を検出するために、血小板凝集トレースを10−15分間モニターした。この間隔の後、予め形成されたM90+CD40L ICを血小板に導入し、CD32a mAbの阻害能力を評価するためにトレースを更に10分間モニターした。実験の終わりに、ヤギF(ab’)2抗ヒトIgG(組換えmAb及びセツキシマブについて)又はヤギF(ab’)2抗マウスIgG(IV.3について)の添加によって、平坦なトレースについて血小板の凝集能力を確認した。図40A−Bに示す結果は、CD32a mAbが免疫複合体による血小板CD32a活性化を妨げるという結論を支持する。
FCGR2AマウスへのIV.3の腹腔内注射は、血小板減少症を誘導する。FCGR2Aマウス(n=6、平均±sd)に、70μgのIV.3を腹腔内(i.p.)注射した。IV.3注射の前及び30分後、ならびに3時間、24時間、及び48時間後に、(本実施例の方法の項に記載のように、眼窩後出血により回収した全血のフローサイトメトリー分析により)血小板数を決定した。最初の30分間の期間中に、i.p注射されたマウスはショックの兆候を示さず、低体温にならなかった。図41に示す結果は、IV.3(70μg/マウス;n=6)の腹腔内注射は、血小板を著しく枯渇させたFCGR2Aマウスにおいてアナフィラキシーを誘導することができなかったことを示した。
FCGR2AマウスへのIV.3の静脈内注射は、肺血管において血栓塞栓症を引き起こさなかった。IV.3(70μg)をFCGR2Aマウスに静脈内注射した。30分後、肺を採取し、少なくとも48時間ホルマリン固定し、H&E切片を調製し、血栓塞栓症の証拠について分析した。閉塞性血栓の欠如は、IV.3を注射された代表的なマウスの肺血管(赤血球で満たされた)において観察された(図42A−C)。肺血栓症の基準として、血栓性IC(500nM M90+CD40L)を注射された代表的なマウスからの肺切片の画像が提供され、ここでは広汎性血栓(例えば、図42Fの矢印によって示される領域)が多数の血管で観察された(図42D−F)。従って、血栓塞栓症は、IV.3注射マウス由来のH&E染色FCGR2Aマウス肺切片では明らかではなかった。
血小板の表面上のagly−IV.3A488の共焦点顕微鏡画像。70μgのagly−IV.3A488の注射後30分(図43A)又は24時間(図43B)のFCGR2Aマウスから収集した血小板の表面上のagly−IV.3A488の共焦点顕微鏡画像(1000x)。びまん性灰色染色は、血小板アクチンを表し;焦点黒色染色は、agly−IV.3A488を示す(例えば、図43Aに矢印で示されるフォーカス)。agly−IV.3A488シグナルは、498nmでの励起と506nmから579nmへの発光により得られた。ファロイジンA555シグナル(拡散した灰色として表示)は、554nmでの励起と559nmから631nmへの発光により得られた。592nmレーザーを用いて誘導抑制が実施された。共焦点画像は、Leica TCS SP5 Xシステム(100x/1.40油性対物レンズ、PLAPO)上で単一の切片として取得され、デコンボリューションされなかった。スライドは、70μgのagly−IV.3A488の注射の30分後又は24時間後に収集した心臓穿刺血液から調製したPRPからの洗浄したFCGR2Aマウス血小板を用いて調製し、メタノールを含まない2%のホルムアルデヒド(Polysciences、Warrington、PA)に固定し、洗浄し、透過性にし、ファロイジン−AlexaFluor555(Invitrogen;Eugene、OR)で対比染色し、ProLong Gold(Invitrogen;Eugene、OR)に包埋し、Nexterion D 22mm2#1.5H−0.170mm(±5μm)カバーガラス(Applied Microarrays、Tempe、AZ)にマウントした。図43A−Bに示すように、agly−IV.3A488のIV注射の30分後及び24時間後に収集されたAlexaFluor488陽性血小板の共焦点画像化の結果は、血小板は循環中に残り、注射後30分と24時間の両方で蛍光agly−IV.3を獲得し、保持したことを示した。
以下の科学刊行物が全目的のためにその全体が参考として援用される:Meyer T, Robles-Carrillo L, Davila M, Brodie M, Desai H, Rivera-Amaya M, Francis JL, Amirkhosravi A., “CD32a antibodies induce thrombocytopenia and type II hypersensitivity reactions in FCGR2A mice," Blood, 2015 Nov 5;126(19):2230-8; doi:10.1182/blood-2015-04-638684; Epub 2015 Sep 22; PubMed PMID: 26396093; PubMed Central PMCID: PMC4644267。
等価物
前述の明細書は、当業者が本実施態様を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施態様を詳述し、本発明者らによって考えられる最良の形態を記述する。しかしながら、上記のことがどれほど詳細に記載されていても、実施態様は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
前述の明細書は、当業者が本実施態様を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。前述の説明及び実施例は、特定の実施態様を詳述し、本発明者らによって考えられる最良の形態を記述する。しかしながら、上記のことがどれほど詳細に記載されていても、実施態様は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲及びその均等物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
本明細書で使用される「約」という用語は、明示されているか否かにかかわらず、例えば、整数、分数、及びパーセンテージを含む数値を指す。「約」という用語は、一般に、当業者が列挙された値と同等であると考えるであろう(例えば、同じ機能又は結果を有する)ある数値の範囲(例えば、列挙された範囲の+/−5〜10%)を指す。幾つかの例では、「約」という用語は最も近い有効数字に四捨五入された数値を含むことができる。
Claims (37)
- ヒト被験体におけるCD32a媒介性疾患又は障害を治療するための方法であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体をヒト被験体に投与することを含み、それによりCD32a媒介性疾患又は障害を治療する、方法。
- ヒト被験体におけるCD32aを遮断するための方法及び/又はCD32a活性化を妨げるための方法であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体をヒト被験体に投与することを含み、それによりCD32aを遮断し、かつ/又はCD32a活性化を妨げる、方法。
- ヒト被験体におけるCD32a媒介性疾患又は障害を治療することにおけるエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、使用。
- ヒト被験体におけるCD32a媒介性疾患又は障害を治療するための医薬の調製におけるエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、使用。
- ヒト被験体においてCD32aを遮断し、かつ/又はCD32a活性化を妨げることにおけるエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりCD32aを遮断し、かつ/又はCD32a活性化を妨げる、使用。
- ヒト被験体においてCD32aを遮断し、かつ/又はCD32a活性化を妨げるための医薬の調製におけるエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりCD32aを遮断し、かつ/又はCD32a活性化を妨げる、使用。
- エフェクター欠損抗体が、IgG免疫複合体試験及び固定化IgG試験の両方に適合し、ここで、CD16、CD32及び/又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除するように、エフェクター欠損抗体のFC領域が改変されている、請求項1若しくは2に記載の方法又は請求項3から6の何れか一項に記載の使用。
- CD32a媒介性疾患又は障害が、IgG媒介性止血障害である、請求項1から7の何れか一項に記載の方法又は使用。
- 止血障害が、血小板減少症を伴うか又は伴わない血栓症である、請求項8に記載の方法又は使用。
- 止血障害が、IgG媒介性血小板減少症、免疫媒介性血小板減少症(ITP)、抗リン脂質症候群(APS)、抗血小板抗体障害、ヘパリン誘発性血小板減少症(HIT)、血栓症を伴うヘパリン誘発性血小板減少症(HITT)、がん誘発性血小板活性化、がん誘発性凝固性亢進、血小板媒介性腫瘍細胞転移、及び血小板媒介性がん転移からなる群から選択される、請求項8に記載の方法又は使用。
- CD32a媒介性疾患又は障害が、IgG媒介性免疫性、自己免疫性又は炎症性疾患又は障害である、請求項1から7の何れか一項に記載の方法又は使用。
- IgG媒介性免疫、自己免疫又は炎症性障害が、関節リウマチ(RA)、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、抗リン脂質症候群(APS)、変形性関節症、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、IgG抗体誘発性貧血、及びIgG媒介性血球減少からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- CD32a媒介性疾患又は障害が、血小板、単球、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ、樹状細胞、滑膜細胞、肥満細胞、又は皮膚微小血管内皮細胞上におけるCD32aのIgG−Fc媒介性活性化によって特徴付けられる、請求項1から12の何れか一項に記載の方法又は使用。
- CD32a媒介性疾患又は障害が、IgG免疫複合体媒介性疾患又は障害である、請求項1から12の何れか一項に記載の方法又は使用。
- IgG免疫複合体媒介性疾患又は障害が、非抗CD32aモノクローナル抗体又はその断片の投与によって引き起こされる抗治療抗体(ATA)応答である、請求項14に記載の方法又は使用。
- 非抗CD32a抗体が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ペゴール(抗体様)、ゴリムマブ、エタネルセプト(抗体様)、ウステキヌマブ、オマリズマブ又はベバシズマブである、請求項15に記載の方法又は使用。
- エフェクター欠損抗CD32a抗体が、非抗CD32aモノクローナル抗体の前、同時、又は後に投与される、請求項15又は16に記載の方法又は使用。
- IgG免疫複合体媒介性疾患又は障害が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)、ループス腎炎、又は潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患(IBD)の治療のために、非抗CD32aモノクローナル抗体により治療されている患者において生じる、請求項15に記載の方法又は使用。
- CD32a媒介性疾患又は障害が、ヒト被験体の血液中を循環する細胞の表面に局在するIgGにより特徴付けられる、請求項1から18の何れか一項に記載の方法又は使用。
- 循環細胞型が、血小板、赤血球、単球、好中球、好塩基球、好酸球、Bリンパ球、マクロファージ、肥満細胞、白血病細胞、又はウイルス、細菌、真菌若しくは寄生生物などの微生物の1つ以上からなる、請求項19に記載の方法又は使用。
- 疾患又は障害が、血小板減少症、白血球減少症、好中球減少症、リンパ球減少症、単球減少症、貧血、溶血性貧血、又は敗血症の1つ以上から選択される、請求項19又は20に記載の方法又は使用。
- ヒト被験体におけるI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するための方法であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損である、エフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体をヒト被験体に投与することを含み、それによりI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する、方法。
- ヒト被験体におけるI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するためのエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する、使用。
- ヒト被験体におけるI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療するための医薬の調製のためのエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体の使用であって、抗体がFc領域の少なくとも一部を含み、かつエフェクター欠損であり、それによりI型、II型又はIII型の抗体媒介性アレルギー反応又は過敏性反応を治療する、使用。
- アレルギー性疾患が、アトピー、接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、全身性アナフィラキシー、花粉症、喘息、蕁麻疹、食物アレルギー、及び湿疹に示されるような局所化されたアナフィラキシー、ワクチンに対するアレルギー反応、食品に対するアレルギー反応、アレルギー反応、昆虫生産物に対するアレルギー反応、薬物に対するアレルギー反応、カビ胞子に対するアレルギー反応、動物の毛及びふけに対するアレルギー反応、ラテックスに対するアレルギー反応、輸血反応、血小板輸血反応、赤血球輸血反応、胎児赤芽球症、溶血性貧血、血清病、インフュージョンリアクション、壊死性血管炎、糸球体腎炎、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、及び微生物に対するアレルギー反応からなる群から選択される、請求項22に記載の方法又は請求項23又は24に記載の使用。
- エフェクター欠損抗CD32a抗体が、エフェクター欠損MDE−8、IV.3又はAT−10モノクローナル抗体である、請求項1から25の何れか一項に記載の方法又は使用。
- モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項26に記載の方法又は使用。
- AT−10抗体が、
a.配列YYWMN(配列番号1)若しくはGFTFSYYW(配列番号73及び配列番号88)と同一であるか又は配列YYWMN(配列番号1)若しくはGFTFSYYW(配列番号73及び配列番号88)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列EIRLKSNNYATHYAESVKG(配列番号2)若しくはIRLKSNNYAT(配列番号74及び配列番号89)と同一であるか又は配列EIRLKSNNYATHYAESVKG(配列番号2)若しくはIRLKSNNYAT(配列番号74及び配列番号89)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列RDEYYAMDY(配列番号3)若しくはNRRDEYYAMDY(配列番号75及び配列番号90)と同一であるか又は配列RDEYYAMDY(配列番号3)若しくはNRRDEYYAMDY(配列番号75及び配列番号90)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RASESVDNFGISFMN(配列番号4)若しくはESVDNFGISF(配列番号76及び配列番号91)と同一であるか又は配列RASESVDNFGISFMN(配列番号4)若しくはESVDNFGISF(配列番号76及び配列番号91)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列GASNQGS(配列番号5)若しくはGAS(配列番号77及び配列番号92)と同一であるか又は配列GASNQGS(配列番号5)若しくはGAS(配列番号77及び配列番号92)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列QQSKEVPWT(配列番号6)若しくはQQSKEVPWT(配列番号78及び配列番号93)と同一であるか又は配列QQSKEVPWT(配列番号6)若しくはQQSKEVPWT(配列番号78及び配列番号93)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む、請求項26又は27に記載の方法又は使用。 - AT−10抗体が、配列番号8又は配列番号12に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列、及び配列番号10又は配列番号14に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列を含む、請求項26又は27に記載の方法又は使用。
- AT−10抗体が、
a.配列番号16、配列番号18又は配列番号20に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号22又は配列番号24に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む、請求項26又は27に記載の方法又は使用。 - IV.3抗体が、
a.配列NYGMN(配列番号25)若しくはGYTFTNYG(配列番号79)と同一であるか又はその配列と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列WLNTYTGESIYPDDFKG(配列番号26)若しくはLNTYTGES(配列番号80)と同一であるか又は配列WLNTYTGESIYPDDFKG(配列番号26)若しくはLNTYTGES(配列番号80)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列GDYGYDDPLDY(配列番号27)若しくはARGDYGYDDPLDY(配列番号81)と同一であるか又は配列GDYGYDDPLDY(配列番号27)若しくはARGDYGYDDPLDY(配列番号81)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RSSKSLLHTNGNTYLH(配列番号28)若しくはKSLLHTNGNTY(配列番号82及び配列番号100)と同一であるか又は配列RSSKSLLHTNGNTYLH(配列番号28)若しくはKSLLHTNGNTY(配列番号82及び配列番号100)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列RMSVLAS(配列番号29)若しくはRMS(配列番号83、配列番号101)と同一であるか又は配列RMSVLAS(配列番号29)若しくはRMS(配列番号83、配列番号101)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
配列MQHLEYPLT(配列番号30及び配列番号84及び配列番号102)と同一であるか又は配列MQHLEYPLT(配列番号30及び配列番号84及び配列番号102)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む、請求項26又は27に記載の方法又は使用。 - IV.3抗体が、
a.配列番号32、配列番号36又は配列番号38に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列;及び
b.配列番号34、配列番号41又は配列番号85に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列
を含む、請求項26又は27に記載の方法又は使用。 - IV.3抗体が、
a.配列番号43、配列番号45、配列番号47又は配列番号49に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号51、配列番号53又は配列番号87に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む、請求項26又は27に記載の方法又は使用。 - MDE−8抗体が、
a.配列SYGMH(配列番号54)若しくはGFTFSSYG(配列番号94)と同一であるか又は配列SYGMH(配列番号54)若しくはGFTFSSYG(配列番号94)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR1配列;
b.配列VIWYDGSNYYYTDSVKG(配列番号55)若しくはIWYDGSNY(配列番号95)と同一であるか又は配列VIWYDGSNYYYTDSVKG(配列番号55)若しくはIWYDGSNY(配列番号95)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR2配列;
c.配列DLGAAASDY(配列番号56)若しくはARDLGAAASDY(配列番号96)と同一であるか又は配列DLGAAASDY(配列番号56)若しくはARDLGAAASDY(配列番号96)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む重鎖可変領域CDR3配列;
d.配列RASQGINSALA(配列番号57)若しくはQGINSA(配列番号97)と同一であるか又は配列RASQGINSALA(配列番号57)若しくはQGINSA(配列番号97)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR1配列;
e.配列DASSLES(配列番号58)若しくはDAS(配列番号98)と同一であるか又は配列DASSLES(配列番号58)若しくはDAS(配列番号98)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR2配列;及び
f.配列QQFNSYPHT(配列番号59)若しくはQQFNSYPHT(配列番号99)と同一であるか又は配列QQFNSYPHT(配列番号59)若しくはQQFNSYPHT(配列番号99)と比較して1若しくは2個のアミノ酸の相違を有する配列である配列を含む軽鎖可変領域CDR3配列
を含む、請求項26又は27に記載の方法又は使用。 - MDE−8抗体が、
a.配列番号61に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変重鎖配列;及び
b.配列番号63に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である配列を含む可変軽鎖配列
を含む、請求項26又は27に記載の方法又は使用。 - MDE−8抗体が、
a.配列番号65又は配列番号67に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である重鎖配列;及び
b.配列番号69に示される配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である軽鎖配列
を含む、請求項26又は27に記載の方法又は使用。 - エフェクター欠損であるFc領域の少なくとも一部を含む、ヒトCD32aに特異的に結合するエフェクター欠損抗CD32aモノクローナル抗体であって、改変されていない対照と比較して、CD16、CD32、及び/又はCD64型IgG受容体へのFc結合を減少させるか又は排除する改変されたFc領域を含む、抗体。
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