JP2017535258A - 新規cho組込み部位およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2014年10月23日に出願された米国仮出願番号第62/067,774の優先権の利益を主張しており、その全体の内容は、本明細書中に参考といて援用される。
2015年10月20日に作成され、EFS−Webを介して米国特許商標庁に提出された、28KBの32353_T0045US01_SequenceListing.txtと命名したASCIIテキストファイルの配列表は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明は、真核生物細胞における組換えタンパク質の安定な組込みおよび/または発現を提供する。特に、本発明は、発現増強性ヌクレオチド配列を用いることによって、真核生物細胞、特にチャイニーズハムスター(Cricetulus griseus)細胞株におけるタンパク質の改善された発現のための方法および組成物を含む。本発明は、組換え媒介性カセット交換(RMCE)を促進するポリヌクレオチドおよび改変された細胞を含む。本発明の方法は、改変された細胞による組換えタンパク質の増強された安定な発現を促進するために、チャイニーズハムスター細胞ゲノム中の特異的染色体遺伝子座において外因性核酸を組み込む。
(関連技術の説明)
細胞発現系は、研究使用または治療的使用のいずれのためであれ、所与のタンパク質の製造のための信頼性のある効率的な供給源を提供することを目的とする。哺乳動物細胞における組換えタンパク質発現は、例えば、組換えタンパク質を適切に翻訳後修飾する哺乳動物発現系の能力に起因して、治療的タンパク質を製造するための好ましい方法である。
短いインキュベーション時間で高レベルの組換えタンパク質を達成するために、cis−調節エレメント、および一部の場合にはtrans−調節エレメントの種々の組合せを各々が含むいくつかの細胞系が、タンパク質の発現のために利用可能である。多数の系の利用可能性にもかかわらず、効率的な遺伝子移入および組換えタンパク質の発現のための組み込まれた遺伝子の安定性の課題が、なおも存在する。複数の局所的遺伝因子が、目的の標的遺伝子がいつ発現されるべきであるかだけでなく、細胞が生産的アウトプットに向かう遺伝子の転写を機能的に駆動できるかどうか、または発現が長期持続するかどうかさえも、決定し得る。特定の遺伝子内のまたは特定の遺伝子に隣接する染色体組込み部位、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)組込み部位および遺伝子座制御領域は、当該分野で特徴付けられている(WO2012/138887A1;Li, Q.ら、2002年 Blood. 100巻:3077〜3086頁)。このように、標的化された調節領域は、内因性タンパク質をコードする領域中で典型的には識別される。しかし、標的導入遺伝子の長期発現のために、重要な考慮事項は、細胞株の表現型の変化を回避するために、細胞遺伝子の破壊を最小限に留めることである。
一態様では、本発明は、遺伝子座内の特異的部位において組み込まれた外因性核酸配列を含む細胞を提供し、遺伝子座は、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子座は、配列番号1に対して少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子座は、配列番号4に対して少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列を含む。
本方法を記載する前に、本発明は、特定の方法および記載された実験条件に限定されないのであり、それは、かかる方法および条件が変動し得るからであることを理解すべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載することだけを目的としており、限定を意図しないこともまた理解すべきである。
定義
一般的記載
CHO組込み部位の物理的および機能的特徴
CHO発現増強性遺伝子座およびその断片
標的遺伝子座を遺伝子改変する
遺伝子標的化構築物
目的のタンパク質
宿主細胞およびトランスフェクション
(実施例1)
目的の遺伝子座の識別および組込み部位の特徴付け
(実施例2)
宿主細胞組込み部位中に効率的に組み込まれた外因性DNA
(実施例3)
RMCEによる、目的の遺伝子座における操作された細胞の標的化組換え
Claims (55)
- 遺伝子座内の特異的部位において組み込まれた外因性核酸配列を含む細胞であって、前記遺伝子座は、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列を含む、細胞。
- 第2の核酸配列内の特異的部位中に組み込まれた第1の核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記第2の核酸配列は、配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 前記特異的部位が、配列番号1内の位置に位置するか、または配列番号1内の位置に隣接して位置し、前記位置が、配列番号1の10〜4,000;100〜3,900;200〜3,800;300〜3,700;400〜3,600;500〜3,500;600〜3,400;700〜3,300;800〜3,200;900〜3,100;1,000〜3,000;1,100〜2,900;1,200〜2,800;1,300〜2,700;1,200〜2,600;1,300〜2,500;1,400〜2,400;1,500〜2,300;1,600〜2,200;1,700〜2100;1,800〜2050;1,900〜2040;2,000〜2,020、2002〜2021、2,010〜2,015、2001〜2002、2009〜2010および2021〜2022と番号付けされた位置に及ぶヌクレオチドから選択される、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1内の前記特異的部位または配列番号1内の位置に隣接する前記特異的部位が、配列番号1の10〜500;500〜1,000;500〜2,100;1,000〜1,500;1,000〜2,100;1,500〜2,000;1,500〜2,500;2,000〜2,500;2,500〜3,000;2,500〜3,500;3,000〜3,500;3,000〜4,000;および3,500〜4,000と番号付けされた位置に及ぶヌクレオチドからなる群から選択される、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 改変されたゲノムを含む改変された細胞であって、前記ゲノムは、前記ゲノムの遺伝子座内での外因性核酸配列の挿入によって改変され、前記遺伝子座は、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%同一である発現増強性ヌクレオチド配列を含む、細胞。
- 前記細胞がCHO細胞である、請求項5に記載の改変された細胞。
- 前記外因性核酸配列が、1または複数の組換え認識配列を含む、請求項5または6に記載の改変された細胞。
- 前記外因性核酸配列が、少なくとも2つの組換え認識配列と、前記2つの組換え認識配列間に配置された選択可能なマーカーとを含む、請求項7に記載の改変された細胞。
- 前記1または複数の組換え認識配列が、LoxP部位、Lox511部位、Lox2272部位、Lox2372部位、Lox5171部位、Loxm2部位、Lox71部位、Lox66部位、LoxFas部位およびfrt部位からなる群から選択される、請求項7に記載の改変された細胞。
- 前記外因性核酸配列が、前記発現増強性ヌクレオチド配列に作動可能に連結した少なくとも1つの外因性の目的の遺伝子(GOI)を含む、請求項5または6に記載の改変された細胞。
- 前記少なくとも1つの外因性GOIが、ヒト遺伝子であり、前記ヒト遺伝子が、外因性プロモーターに作動可能に連結している、請求項10に記載の改変された細胞。
- 第1のGOIの3’側に第2のGOIをさらに含み、前記第2のGOIが、外因性プロモーターに作動可能に連結している、請求項11に記載の改変された細胞。
- 前記第1のGOIが抗体の軽鎖をコードし、前記第2のGOIが抗体の重鎖をコードする、請求項12に記載の改変された細胞。
- 抗体の軽鎖をコードする前記遺伝子の5’側に第1のリコンビナーゼ部位と、抗体の重鎖をコードする前記遺伝子に直接隣接し、かつ3’側にある第2のリコンビナーゼ部位とをさらに含む、請求項13に記載の改変された細胞。
- 前記第1のリコンビナーゼ認識部位と前記第2のリコンビナーゼ認識部位とが異なり、前記第1および第2のリコンビナーゼ認識部位が、LoxP部位、Lox511部位、Lox2272部位、Lox2372部位、Lox5171部位、Loxm2部位、Lox71部位、Lox66部位、LoxFas部位およびfrt部位からなる群から選択される、請求項14に記載の改変された細胞。
- CHO細胞ゲノムを改変する方法であって、前記CHO細胞中に、外因性配列を含むビヒクルを導入するステップを含み、前記外因性配列は、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列を含む前記ゲノムの遺伝子座中に組み込まれる、方法。
- 目的のタンパク質を発現するようにCHO細胞ゲノムを改変する方法であって、CHO細胞中に、前記目的のタンパク質の発現のための配列を含む外因性核酸を前記CHO細胞のゲノム中に導入するためのビヒクルを導入するステップを含み、前記ビヒクルはベクターを含み、前記ベクターは、
a.配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な5’相同アーム、
b.前記目的のタンパク質をコードする核酸、および
c.配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な3’相同アーム
を含む、方法。 - 前記ビヒクルが、少なくともさらなるベクターまたはmRNA分子を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記さらなるベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾンおよび/またはトランスポザーゼ、インテグラーゼ基質ならびにプラスミドからなる群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記5’相同アームが、配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記目的のタンパク質をコードする前記核酸と連続している、請求項17に記載の方法。
- 前記3’相同アームが、配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記目的のタンパク質をコードする前記核酸と連続している、請求項17に記載の方法。
- 目的のタンパク質を発現するようにCHO細胞ゲノムを改変するためのビヒクルであって、
a.配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同である5’相同アーム、
b.前記目的のタンパク質をコードする核酸、および
c.配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な3’相同アーム
を含むベクターを含むビヒクル。 - 少なくともさらなるベクターまたはmRNA分子を含む、請求項22に記載のビヒクル。
- 前記さらなるベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾンおよび/またはトランスポザーゼ、インテグラーゼ基質、ならびにプラスミドからなる群から選択される、請求項23に記載のビヒクル。
- 前記5’相同アームが、配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記目的のタンパク質をコードする前記核酸と連続している、請求項22に記載のビヒクル。
- 前記3’相同アームが、配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記目的のタンパク質をコードする前記核酸と連続している、請求項22に記載のビヒクル。
- 目的のタンパク質を作製するための方法であって、
a.細胞中に目的の遺伝子(GOI)を導入するステップであって、前記GOIは、配列番号1または配列番号4の発現増強性配列に対して少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列を含む特異的遺伝子座中に組み込まれる、ステップ;
b.(a)の細胞を、前記GOIの発現を可能にする条件下で培養するステップ;および
c.前記目的のタンパク質を回収するステップ
を含む方法。 - 前記GOIが、前記発現増強性配列に作動可能に連結し、少なくとも1つのリコンビナーゼ認識部位が、前記GOIと直接隣接する、請求項27に記載の方法。
- 前記GOIが、免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片、および受容体またはそのリガンド結合性断片から選択されるタンパク質をコードする、請求項28に記載の方法。
- 前記免疫グロブリンが、抗体軽鎖もしくはその抗原結合性断片、抗体重鎖もしくはその抗原結合性断片、Fc融合タンパク質、またはFc−受容体融合タンパク質から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのリコンビナーゼ認識部位が、LoxP部位、Lox511部位、Lox2272部位、Lox2372部位、Lox5171部位、Loxm2部位、Lox71部位、Lox66部位、LoxFas部位およびfrt部位からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記GOIが前記リコンビナーゼ認識部位に直接隣接し、かつ5’側にあり、そして前記GOIに直接隣接し、かつ3’側にある第2のリコンビナーゼ認識部位をさらに含む、請求項31に記載の方法。
- 前記第2のリコンビナーゼ認識部位に直接隣接し、かつ3’側にある第2のGOIをさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 前記第2のGOIに直接隣接し、かつ3’側にある第3のリコンビナーゼ認識部位をさらに含む、請求項33に記載の方法。
- 前記第2のリコンビナーゼ認識部位と前記第2のGOIとの間に少なくとも1つのマーカー遺伝子をさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのマーカー遺伝子が、薬物耐性遺伝子および発現レポーター遺伝子からなる群から選択される、請求項35に記載の方法。
- 前記第1のGOIに作動可能に連結したプロモーターおよび前記第2のGOIに作動可能に連結したプロモーターをさらに含む、請求項36に記載の方法。
- 前記第2および前記第3のリコンビナーゼ認識部位が、前記第1のリコンビナーゼ認識部位と反対の配向である、請求項37に記載の方法。
- 前記第1、第2および第3のリコンビナーゼ認識部位が異なる、請求項38に記載の方法。
- 目的のタンパク質を作製するための方法であって、
(a)CHO細胞中に、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列を含む発現増強性配列と、目的のタンパク質をコードする外因性GOIとを含む核酸構築物を導入するステップであって、前記GOIは、前記発現増強性配列に作動可能に連結している、ステップ;
(b)(a)のCHO細胞を、前記GOIの発現を可能にする条件下で培養するステップ;および
(c)前記目的のタンパク質を回収するステップ
を含む方法。 - 前記GOIが、プロモーターに作動可能に連結している、請求項40に記載の方法。
- 前記GOIが、免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片をコードする、請求項41に記載の方法。
- 前記GOIが、抗体、受容体もしくはそのリガンド結合性断片、Fc−受容体融合タンパク質またはFc融合タンパク質をコードする、請求項42に記載の方法。
- 認識配列が組み込まれるようにCHO細胞ゲノムを改変する方法であって、CHO細胞中に、認識配列を含む外因性核酸を前記CHO細胞のゲノム中に導入するためのビヒクルを導入するステップを含み、前記ビヒクルはベクターを含み、前記ベクターは、
a.配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な5’相同アーム、
b.認識配列を含む外因性核酸、および
c.配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な3’相同アーム
を含み、前記認識配列が、配列番号1または配列番号4に対して少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列を有する前記ゲノムの遺伝子座内に組み込まれる、方法。 - 前記外因性核酸配列が、少なくとも2つの組換え認識配列と、前記2つの組換え認識配列間に配置された選択可能なマーカーとを含む、請求項44に記載の方法。
- 前記ビヒクルが、少なくともさらなるベクターまたはmRNA分子を含む、請求項44または45に記載の方法。
- 前記さらなるベクターが、前記認識配列を組み込むための部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、ZFNダイマー、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、TALエフェクタードメイン融合タンパク質またはRNAガイドDNAエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項47に記載の方法。
- 認識配列が組み込まれるようにCHO細胞ゲノムを改変するためのビヒクルであって、
a.配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な5’相同アーム、
b.前記認識配列を含む核酸、および
c.配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な3’相同アーム
を含むベクターを含む、ビヒクル。 - 前記核酸が、少なくとも2つの組換え認識配列と、前記2つの組換え認識配列間に配置された選択可能なマーカーとを含む、請求項49に記載のビヒクル。
- 少なくともさらなるベクターまたはmRNA分子を含む、請求項49または50に記載のビヒクル。
- 前記さらなるベクターが、前記認識配列を組み込むための部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含む、請求項51に記載のビヒクル。
- 前記部位特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、ZFNダイマー、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、TALエフェクタードメイン融合タンパク質またはRNAガイドDNAエンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項52に記載のビヒクル。
- 前記5’相同アームが、配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記認識配列を含む前記核酸と連続している、請求項49に記載のビヒクル。
- 前記3’相同アームが、配列番号1または配列番号4のヌクレオチド配列中に存在する配列に対して相同な配列を含み、前記認識配列を含む前記核酸と連続している、請求項49に記載のビヒクル。
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