JP2017529873A

JP2017529873A - ニューロン再生療法に適するナノボディー

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Publication number: JP2017529873A
Application number: JP2017532217A
Authority: JP
Inventors: クリストフ・プレハウ; モニク・ラフォン; ピエール・ラファイエ
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2014-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2017-10-12
Anticipated expiration: 2035-09-09
Also published as: US20170283490A1; EP3191510C0; US20210040187A1; CN107001483B; CA2958953A1; CN107001483A; WO2016038122A1; US11339211B2; ES2949039T3; JP6673608B2; EP3191510B9; CA2958953C; US10640552B2; EP3191510A1; AU2015314186A1; EP2995624A1; AU2015314186B2; EP3191510B1

Abstract

本発明は、血液脳関門を横断した脳細胞への分子送達に関する分野に属する。本発明は、血液脳関門を横断して、エフェクターペプチドをニューロン細胞に効率的に送達するのを可能にする、ポリペプチドに基づく新規担体、並びにかかる担体の製造方法及び試験方法に関し、同方法には、血液脳関門を横断するかかる分子の能力、及び/又は血液脳関門に対する分子の毒性、及び/又は横断した分子がヒト脳細胞(例えば、ニューロン、アストロサイト、及びミクログリア細胞)を標的とする能力を試験するためのモデルが含まれる。

Description

本発明は、血液脳関門を横断した脳細胞への分子送達に関する分野に属する。本発明は、血液脳関門を横断して、エフェクターペプチドをニューロン細胞に効率的に送達するのを可能にする、ポリペプチドに基づく新規担体、並びにかかる担体の製造方法及び試験方法に関し、同方法には、血液脳関門を横断するかかる分子の能力、及び/又は血液脳関門に対する分子の毒性、及び/又は横断した分子がヒト脳細胞(例えば、ニューロン、アストロサイト、及びミクログリア細胞)を標的する能力を試験するためのモデルが含まれる。

神経変性疾患等の疾患及び脳の外傷に対する治療法の開発という観点において、薬物アクセス及び脳での利用可能性に関するニーズは、未だ満たされていない。確かに、脳は、血液脳関門(BBB)と呼ばれる構造により全身性の血流から隔離されている。BBBは、隣接する細胞:アストロサイト、周細胞、血管周囲のミクログリア、及びニューロンと動的に相互作用する脳血管内皮細胞(cerebral endothelial cell)から主に構成される。BBBの3つの主要な機能として、ニューロン機能のためのイオンホメオスタシスの構築と維持、中枢神経系(CNS)への栄養分供給、及び毒性傷害又はいくつかの感染性病原体からの保護が挙げられる。脳に治療物質を送達するには、BBBを克服し、それを進入ゲートとして用いなければならない。結合関門若しくは流出関門(junctional or efflux barrier)を突破する、又はBBBを回避する努力にもかかわらず、新規に開発されたほとんどの神経医薬品は、CNS薬物動態(pharmokinetics)が不良のため、不奏功である。

血液脳関門(BBB)を横断して分子を送達するという文脈において、ラクダ重鎖単独抗体 (HcAbs)に由来する高度に可溶性担体の種類が記載されている。この抗体の可変性重鎖ドメイン(VHH)は、軽鎖及び重鎖ヘテロ二量体からなる従来型の抗体構築物と類似した抗原特異性及びアフィニティーを示すし、およそ15kDaのより小型のサイズを示す。またVHHは、「VHHフラグメント」とも呼ばれ、抗体の一部であることを反映する。VHHは、特殊な状況では、BBBを横断することが明らかにされた。目下のところ、BBBを横断する透過性を付与するVHHの特別な構造的特質は特定されていないが、重要なパラメーターは等電点(pI)のようであり、透過性のVHHは、通常塩基性と考えられている(特に、8.5よりも高いpIを有する)。更に、サイズが、VHH透過性及び輸送能力の重要な因子と考えられており、特にその低分子量単量体構造は、これらの能力に寄与するものと考えられる。特異的細胞表面抗原が標的となると、エンドサイトーシスが誘発され、BBBを横断するかかるVHHの透過性が改善するものと考えられた。また、カーゴ分子が、BBBを横断して、脳内の特定部位を標的とするように、脳抗原に対して特異的なVHHを媒体として使用することも検討された(Liら、2012年、国際公開第2010/004432 A1、米国特許第8,460,888 B2号)。しかし、かかる媒体-カーゴ構築物は、脳抗原に結合し、その結果大部分のカーゴ分子がその作用部位から遠ざかって隔離される可能性があり、このようなことに特に起因して、その有効性が低下する又は適用範囲が狭まってしまうおそれがある。

国際公開第2010/004432 A1 米国特許第8,460,888 B2号国際公開第2010/116258 A1号国際公開第2013/068430 A2号米国特許第8,084,254 B2号国際公開第2006/056879号欧州特許第1 964 915 A1号国際公開第2013/068430号国際公開第2013/068430 A1号欧州特許第09290257.6号 PCTIB2010000967号米国特許第13/263050号米国特許第2012100116号

本発明者らは、驚くべきことに、脳特異的抗原のいずれも認識せず、血液脳関門を横断してペプチドを輸送する媒体(いわゆるカーゴペプチド)として有用である塩基性VHHを同定した。カーゴ分子は、一般的には、脳成分に対して特異的な活性を有するペプチドであるが、BBBを横断しても、その生物活性を保持し、またその活性部位にアクセスすることができる。

従って、本発明は、ラクダ重鎖抗体のVHHを含む又はそれからなる新規ポリペプチドを提供し、前記VHHは配列番号3の配列を有する。本発明は、配列番号3の配列変異体を有するVHHを含む又はそれからなるポリペプチドを更に提供するが、かかる変異体は以下で記載される通りである。本発明は、以下で記載されるように、配列番号3の配列の一部分を有するVHHを含む又はそれからなるポリペプチド、又はその配列変異体を更に提供する。本発明のVHH及び/又はVHHを含むポリペプチドは、BBBを横断して透過可能であり、また脳抗原のいずれも、特にヒト脳抗原のいずれも認識しない、及び/又はヒト脳タンパク質のいずれとも特異的に結合しない。特定の実施形態では、本発明のVHH及び/又はVHHを含むポリペプチドは、塩基性のpIを有する。

本発明は、以下で記載されるように、キメラ(又は融合)ポリペプチドからなるVHH含有ポリペプチドも提供し、本明細書で定義するVHHを含む又はそれからなり、ニューロン細胞を標的とするペプチド、タグ及び/スペーサーとして用いられるペプチド、並びに/或いは脳細胞に対して意図するような及び有利な生物学的効果を有するエフェクターペプチドを含む、追加の融合型ペプチド/ポリペプチドを有する。

また、かかるVHH又はVHH含有ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、かかるベクター、ポリヌクレオチド、VHH又はVHH含有ポリペプチドを含む細胞、及びかかる細胞、ベクター、ポリヌクレオチド、VHH又はVHH含有ポリペプチドを含む医薬組成物も提供される。また、かかるVHH若しくはVHH含有ポリペプチド又はポリヌクレオチドの製造方法も提供されるが、これには、ポリペプチド又は任意のその他の分子がBBBを横断して透過可能か、その透過性を試験するための方法及びデバイスが含まれる。また、治療用途を含む、本発明のVHH又はポリペプチドの使用も提供される。

特に、本発明者らは、かかるVHH又はVHH含有ポリペプチドの標的性は、例えば好ましくはN-末端部においてVHH配列と融合したニューロン細胞標的ペプチドを通じて改善し得ることを発見した。かかるペプチドは、好ましくは狂犬病ウイルスGタンパク質(RVG)の配列、特に本明細書に開示する新規の狂犬病由来ペプチド(RDP)の配列に由来する。かかるペプチドは、それ自体BBBを横断して透過可能であり、BBBを横断してカーゴ分子を輸送するのにその利用が検討されてきた(Fuら、2012年)。しかし、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドとは異なり、かかるペプチドは、本明細書に記載するニューロヴィータペプチド(neurovita peptide)等のエフェクターペプチドの安定化(半減期の増加)を可能にするとは示されていない。特定の実施形態では、従って、VHHは、好ましくは(配列番号1又は配列番号32)の配列を備えたニューロン細胞標的ペプチド、特にRDPと融合している。

VHHは、分子内ジスルフィド結合を形成し得る2個のシステインアミノ酸残基(以後システイン)を通常有する。VHHは、分子間ジスルフィド結合を形成し得る奇数のシステインを含まず、また一般的に言うと、ホモ二量体を形成する能力を有さない。VHHの融合タンパク質を生成すること、さもなければ多量体VHHを生成することが検討されている。しかし、先行技術では、VHH(又はVHH由来の)タンパク質のC-末端領域を含めた二量体化戦略のみが報告されており、またジスルフィド結合の形成は、生産収率及びVHH溶解度の劇的低下を引き起こすことが報告されている(Simmonsら、2006年)。更に、サイズが小型のVHHは、BBBを透過する際に、重要な役割を演ずると考えられているのでの、VHHがBBB透過性担体として用いられる状況では、二量体化及び/又は多量体化は検討されていない。本発明者らは、VHH又はVHH含有ポリペプチドが二量体化能力を有するように、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドを設計するのが有利であり得ることを驚くべきことに発見し、このことを本明細書において報告する。特に、ジスルフィド結合形成性のシステインを、特にVHH又はVHH含有ポリペプチドのN-末端領域内、例えば上記ニューロン細胞標的ペプチドの配列内に含めることができる。こうしても、その製造で用いられる細菌内での発現量の減少は認められず、構築物の活性の増強を引き起こす。ジスルフィド結合を形成するVHH又はVHH含有ポリペプチドは、細菌の周辺細胞質内に二量体として容易に発現され、また構築物の回収も容易である。また、二量体が形成されれば、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドの半減期の増加も可能である。特定の実施形態では、従って、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドは、好ましくはジスルフィド結合の形成を通じて、及び/又は本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドのN-末端領域内のドメインを通じて二量体化、特にホモ二量体化能力を有する。好ましい実施形態では、ジスルフィド結合形成性システインは、VHH含有ポリペプチドのN-末端位置において融合したニューロン細胞標的ペプチドの配列内に含まれる。更に、特定の実施形態では、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドは、細菌内周辺細胞質内に発現され、そして回収され、また任意選択で前記細菌
の周辺細胞質から、好ましくはホモ二量体の形態で精製される。

本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドは、脳内への医薬品の直接投与を必要とせずに、脳細胞に対して生物学的効果を発揮させたい用途で通常用いられる。生物学的効果(例えば、生存性、増殖、神経突起伸長の増加)は、既知ペプチドを通じて時に取得可能であるが、しかしこのようなペプチドは、BBBを横断して透過する能力、及び/又はそれ自体がその作用部位を標的とする能力(例えば、特定の細胞、細胞のコンパートメント、タンパク質、又はタンパク質複合体等)を有さない可能性がある。本明細書に記載するVHH又はVHH含有ポリペプチドに結合すると、ペプチドは、その活性を保持し得る一方、BBBを横断して透過可能であり、及び/又は特定の作用部位を標的とすることができる。従って、本発明は、特に前記ペプチドと融合した、脳細胞に対する生物活性を有するエフェクターペプチドと結合した本明細書で定義するVHH又はVHH含有ポリペプチドを提供する。

MAST-2結合ドメインを含むポリペプチドの特定のファミリーである、ニューロヴィータファミリーが、神経生存性及び神経保護性の効果を有する、及び/又は神経突起伸長を促進するものとして記載されている(国際公開第2010/116258 A1号、国際公開第2013/068430 A2号)。かかるニューロヴィータペプチドの使用は、治療用途として検討されてきたが、それ自体、BBBを横断して効率的に透過することができず、CNSを標的としなければならない用途でそれを使用する妨げとなっている。脳内でペプチドを発現させるために、発現ベクター(例えば、個人の細胞においてex vivoで形質導入された)に基づく送達システムを使用することが開示されているが、しかしこの種の送達法を用いた場合、投与から実際の効率的な発現までの時間は、日数単位で表され、多くの用途(例えば、傷害又は脳卒中後のニューロン修復/回復等)では遅すぎる一方、ベクターの半減期は、数週のオーダーであり、あまりに長過ぎると考えられるので、このような使用は、発現ベクターの使用と関連した安全性の検討、並びに薬物動態の検討を含む、非常に多くの欠点を有する。レンチウイルスベクターに基づく送達が特に開示されており、mRNAは容易に検出されるものの、ペプチドの半減期は短く、検出可能なタンパク質濃度にはほとんど達しない。細胞貫通システムに基づく送達システム、例えばニューロヴィータペプチドに対応するHIV-1由来のTATペプチド等についても開示されている。しかし、融合ペプチドの効率が低い、及び/又は半減期が短いことから、高用量のペプチドを使用する必要があり、毒性効果の可能性がある(Prehaudら、2010年)。

本発明者らは、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドのC-末端部において融合させると、ニューロヴィータペプチドは、その生物活性を保持することができ、また例えば、経静脈的に注射した場合、BBBを横断して効果的に送達されること、並びにかかる融合は、神経突起伸長、及び/又は神経生存性、及び/又は神経保護を促進し、並びに病変後のニューロン細胞の修復/回復を可能にすることを驚くべきことに発見した。従って、本発明は、C-末端において本明細書に記載するVHH又はVHH含有ポリペプチドと融合したニューロヴィータペプチドを提供し、これによりニューロンに対して特異的な活性を有する本発明のVHH含有ポリペプチドを提供する。特定の実施形態では、ニューロヴィータペプチドは、配列番号7の配列を有する。

本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドに結合した(又は含まれた)カーゴペプチドを、BBBを横断して効率的に送達できれば、特に神経変性疾患等のCNSが関わる疾患、又は脳卒中若しくは傷害等の脳細胞損傷に関連した状態、又はかかる疾患若しくは状態の進行の治療を目的として、かかる構築物を使用することを想起することができる。かかる使用は、in vivo投与、特に静脈内注射に適する、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチド、及び任意選択でその他の薬学的に許容される構成成分を含む組成物と関係し得る。従って、本発明は、かかる組成物を提供する。また本発明は、本発明のVHH、VHH含有ポリペプチド、及び/又は組成物を用いた治療法も提供する。また本発明は、薬剤、特に神経変性疾患又は脳細胞損傷に関連する状態の治療で用いられる薬剤としての使用、又はその薬剤の製造での使用を目的として、本発明のかかるVHH、VHH含有ポリペプチド、及び/又は組成物を提供する。特定の実施形態では、治療は、本発明のVHH、VHH含有ポリペプチド、及び/又は組成物の静脈内注射を含む。

本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造する方法は、本明細書に記載されおり、本発明の一部である。VHHは、本発明の生成物の不可欠要素として位置づけられる。前記VHHの主要な特徴として、好ましくはVHH含有ポリペプチドの文脈において、そのBBBを横断する透過性又はBBBを横断する能力が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明のVHHは、脳抗原のいずれも、特にヒト脳抗原のいずれも認識しない、及び/又はVHH、VHH含有ポリペプチド、及び/又はVHH含有ポリペプチドのVHHは、脳タンパク質のいずれとも、特にヒト脳タンパク質のいずれとも特異的に結合しない。前記特徴を担持するVHHを調製する方法は、詳細に記載されている。特別な実施形態では、選択されたVHH又はVHH含有ポリペプチドは、塩基性のpIを有する。特別な実施形態では、選択されたVHH、及び/又は好ましくは、VHH含有ポリペプチドは、BBBを横断して効率的に透過し(又は横断可能であり)、特にBBBのin vitroモデルにおいて、BBBを模倣する内皮細胞層を横断して効率的に透過する。特別な実施形態では、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドは、ホモ二量体を形成し得る。本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドを製造する方法の特別な実施形態では、前記VHH又はVHH含有ポリペプチドは、細胞内、好ましくは細菌細胞内で発現される。前記方法の特別な実施形態では、前記VHH又はVHH含有ポリペプチドは、細菌の周辺細胞質内において回収される。

結合関門若しくは流出関門を突破する、又はBBBを回避する努力にもかかわらず、新規に開発されたほとんどの神経医薬品は、CNS薬物動態が不良のため、不奏功である。従って、これらの分子を、その関門貫通性及び関門との相互作用について、関連性及び信頼性を有するBBBモデル上で初期スクリーニングすることが重要である。法令の変更、及び動物実験と関連する倫理的問題に起因して、in vitroヒトBBBモデルの開発が、基礎研究及び企業にとって重要な関心事である。BBBを横断する透過性について試験するためのin vitroモデルでは、BBBを横断して透過するように意図された物質、特に治療及び/又は診断において、特にCNSに影響を及ぼす疾患に関して用いられる物質の開発について多大な関心が寄せられている。また、かかるモデルでは、BBBと関連する研究及び開発にも関心が寄せられている。現在のところ、そのような用途で用いられるin vitroモデルとして、BBBそれ自体が、例えばフィルター上で増殖し得る内皮細胞のコンフルエントな層(単層、又は複数の層)により模倣されるようなモデルが挙げられる。フィルターが、細胞培養容器を2つのコンパートメントに分離して、1つのコンパートメントから他方のコンパートメントに高分子が受動的拡散するのを阻止するように、細胞培養容器内に配置され得る。かかるモデルでは、物質は、一方のコンパートメントの中でインキュベートされ得るが、またその透過性は、所定の時間経過後に他方のコンパートメントに見出される物質の量を測定することにより測定可能であり、及び/又はそのBBBに対する効果は、すなわち、コンフルエントな層を構成する内皮細胞の生存率を測定することにより測定可能である(Wekslerら、2005年、米国特許第8,084,254 B2号、国際公開第2006/056879号)。

しかし、かかる単純なモデルは、BBBのin vivoでの挙動を正確に反映することはできないと認識される。特に、BBBそのものを構成する内皮細胞に付加して、周辺細胞、特に脳に見出される細胞の効果が重要と認識される。従って、内皮細胞の層に付加して、ニューロン細胞及び/又は例えばアストロサイト等のグリア細胞を含む、より洗練されたモデルが開発された(Bickerら、2014年、欧州特許第1 964 915 A1号)。しかし、かかるモデルでは、齧歯類/ウシ細胞が通常使用され、一方、信頼性のあるモデルは、ヒト起源の細胞から構成されるべきであると認識されている。ミクログリア細胞は、BBB環境の重要な構成要素をなす。しかし、ほとんどの先行技術のモデルは、特にモデルに対して傷害を与え得ると考えられる炎症性の効果を理由として、そうした細胞を欠いている。確かに、活性化したミクログリア細胞は、BBB(特に内皮細胞)の機能障害を誘発することが示されているが、一方、その活性化は、非常に多くの刺激に起因する可能性がり、in vitro培養では避けるのが困難である(Sumiら、2010年)。更に、不死化細胞からなるモデルは、不良な関門特性を示すことが記載されているが(Lippmannら、2013年)、かかるモデルは、本質的に実用的な長所を有する。本発明者らは、驚くべきことに、内皮細胞のコンフルエントな(単一)層に加えて、ニューロン、アストロサイト、及びミクログリア細胞を1つのコンパートメント内に含むヒト不死化細胞からなる、上記のようなin vitro脳モデルは、BBBと関連するin vitro試験、例えば物質のBBBを横断する透過性又は物質のBBBに対する効果、並びに既にBBBを横断することができた分子又は微生物の脳実質細胞(ニューロン、アストロサイト、ミクログリア)への標的化及び効果の評価等において容易に使用可能であることを見出した。

従って、本発明は、デバイス、特にBBBのin vitroモデルで用いるのに適するデバイスを含み、同デバイスは、高分子の受動的拡散に対して不透過性のヒト内皮細胞の1つ又は複数のコンフルエントな層により、2つのコンパートメントに分離しており、そして少なくとも1つのコンパートメント(本明細書では「脳コンパートメント」と定義する)内にヒトミクログリア細胞を含む細胞培養容器を含む又はそれからなる。特定の実施形態では、脳コンパートメントは、ミクログリア細胞に付加してその他の細胞、特に非ミクログリアヒト脳細胞を含み、ミクログリア細胞は、好ましくは該細胞を含有するコンパートメント(脳コンパートメント)内の細胞のうち1.5%〜24%を占める。特定の実施形態では、非ミクログリア脳細胞は、ヒトニューロン細胞及び/又はアストロサイトである。好ましい実施形態では、内皮細胞、ミクログリア細胞、及び/又はその他の細胞は、ヒト細胞、好ましくは不死化ヒト細胞である。本発明は、脳コンパートメント内にニューロン及び/又はアストロサイト等の細胞を含むBBB及び複数BBBの製造において、Ntera-2clD/1細胞の使用を特に提供する。本発明は、細胞株、SK-N-SHDも提供し、これは、従来型の細胞培養培地内で増殖可能であり、またNeuroGRO(商標)又は類似した培地内に播種した場合、ニューロン細胞に分化する。この細胞株は、BBBのモデルの脳コンパートメントの播種用として特に提供され、かかる細胞を含むいくつかのモデルも提供される。本発明は、存在するすべての細胞型に対して適合性を有する最適培地を含む、かかるデバイスを調製する方法を更に提供する。本発明は、特にBBBのin vitroモデルとしてのかかるデバイスの使用も提供する。特定の実施形態は、試験物質のBBBを横断する透過性を試験する方法、及び/又はBBBに対する試験物質の毒性を試験する方法を含み、前記方法は、本発明のデバイス内での前記試験物質のインキュベーションを含む。これらの方法は、前記デバイスのコンパートメント内で、前記試験物質をインキュベートする工程を通常含み、所定のインキュベーション時間が経過した後、i)他方のコンパートメント内の試験物質の量を測定する工程、及び/又はii)内皮細胞及び/又は「標的細胞」(ニューロン、アストロサイト、ミクログリア
)等の細胞の生存率を測定する工程を含む。

特異的VHH含有ポリペプチドの略図及び発現を示す図である。A. VHH1、VHH2、及びVHH3の構造。RDP =ニューロン細胞標的ペプチド(配列番号1);VHH(配列番号3);StrepTag =ストレプタグ (配列番号5); PDZ-BS =ニューロヴィータペプチド(配列番号7);δ-PDZ-BS(VHH3内) = PDZ-BSを欠損しているニューロヴィータペプチド、従って不活性(配列番号9)。「S」の記号を結ぶ黒い線は、RDPのシステイン残基間のジスルフィド架橋を表す。B. 本発明のVHH含有ポリペプチドを生成し、抗ストレプ抗体を用いたイムノアフィニティー法により精製したが、その発現はウェスタンブロット法で評価した。1=VHH1、2=VHH2、3=VHH3。C. 変性(レーン1)及び非変性(レーン2)条件における、本発明のニューロヴィータ-ニューロカーゴ構造物(VHH1)のPAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)分析であり、ポリペプチドの二量体状態を示す。レーン1の左側におよその分子量を示す。レーン2の右側には、単量体の形態を「M」で、また二量体の形態を「D」で示す。D. VHH A12は、脳タンパク質のいずれも認識しないことを、ウェスタンブロッティングにより明らかにされた。VHH A12又はH8/E9を用いて、ヒト脳抽出物(Sg τ 4697;レーン1)、マウス脳抽出物(Tg 4510;レーン2)、及びアストロサイトの特異的マーカーであるGFAPの精製後のタンパク質(レーン3)について、ウェスタンブロッティングを実施した。E. VHH A12は、脳タンパク質のいずれも認識しないことを、免疫組織化学検査により明らかにされた。免疫組織化学染色を、VHH A12又はAT8 mAbを用いて、tg 4510パラフィン包埋マウス脳切片について実施し、1.25×及び20×で示す。AT8は、脳組織中に存在するNFTを認識した。スケールを、黒い太線で示す。 VHH含有ポリペプチドのアセチルコリン受容体α7サブ-ユニット(AchR α7)への結合を示す図である。競合物質の存在下、4℃において、30分後に、FACSによりVHH含有ポリペプチドのAchR α7発現HEK293細胞への結合を評価した。A. 狂犬病ウイルス(RABV)との競合。横軸:Cy5強度(対数目盛)。縦軸:細胞数。「C」曲線はコントロール曲線である。RABVが存在しない場合(「-」、上段)、VHH1は細胞に容易に結合する一方、VHH2(ニューロン細胞標的ペプチドを欠いている)の結合は、コントロールと区別できない(グラフでは、VHH2とコントロールの曲線を区別するのは実際にはできない)。黒矢印は、ピークのシフトを示す。RABVが存在すると(「+」、下段)、VHH1の結合が54%減少することが認められる。B. α-ブンガロトキシンとの競合。軸と矢印は、パネルAと同じである。α-ブンガロトキシンが存在しても(「+」曲線)、VHH2の結合に変化は生じない一方、VHH1の結合は58%低下する。C. VHH1、VHH2、VHH3の結合の比較。VHH含有ポリペプチドの結合を狂犬病ウイルス(RABV)の不存在下(-)又は存在下(+)で試験し、相対的な単位(RU)で表した。「**」は、スチューデントのt検定でp値<0.004を示す。 VHH含有ポリペプチドによる神経突起伸長刺激を示す図である。A. コントロール細胞(Ct)、又は本発明のVHH含有ポリペプチドであるVHH1、VHH2、及びVHH3が存在する細胞(左側パネル)、又は細菌中で発現したVHH1の周辺細胞質分画(P)若しくは細胞質分画(C)(右側パネル)について、神経突起伸長アッセイ法を、実施例セクションの記載に従い実施した。VHH1は、モノマーとして細胞質内に産生される。縦軸:ニューロン1個当たりの平均神経突起長さをμmで表す。ANOVA検定では、いずれの場合もp値<0,0001を示した。B. パネルAの実験に対応する顕微鏡画像(72時間インキュベーション)。細胞質分画内のVHH1(モノマー性)は、神経突起の伸長を刺激するが、周辺細胞質分画内のVHH1(ホモダイマー性)ではそれほどでもなく、大規模な成長円錐伸長を引き起こす契機とはならない。 VHH含有ポリペプチド結合及びニューロンへの進入を示す図である。A. VHH含有ポリペプチドの、分化後のNS細胞との結合及びこれへの進入を、30分後、4℃においてFACSにより評価した。横軸:Alexa 488強度(対数目盛)。縦軸:細胞数。「C」曲線はコントロール曲線であり、「1」曲線はVHH1曲線である。VHH1は細胞に容易に結合する一方、VHH2及びVHH3の結合は、コントロールとほとんど区別できない(グラフでは、VHH2、VHH3、及びコントロールの曲線を区別することは、実際にはほとんどできない)。B. VHH1で72時間処理したNS細胞におけるVHH1の免疫蛍光検査法。四角枠内は、ニューロン成長円錐を示す。VHH1はニューロン成長円錐を伸長させる。C. コントロール(Ct)及びVHH1処理した(48時間、VHH1)分化後のNS細胞におけるアクチンの免疫蛍光検査法。矢印は、オリジナルのカラー画像において明確に目視可能なアクチンに対応する、高強度の染色を示す。VHH1は成長円錐の移動性を刺激する。 VHH含有ポリペプチドにより、受傷後の軸索再生が引き起こされることを示す図である。A. NT2-Nが、VHH含有ポリペプチド(VHH1、VHH2、又はVHH3)と共に、又は伴わずに(Ct)、細胞受傷前4時間プレインキュベートされた場合について、スクラッチアッセイ法を実施した。アッセイ値を、72時間インキュベート(すなわち、受傷後68時間)した後に読み取った。縦軸:再生したニューロンの平均割合(%)。(***)又は(****)は、スチューデントのt検定でp値<0.0001であることを示す。B. パネルAと類似した実験及び記号であるが、受傷は、VHH含有ポリペプチド添加の1時間前に実施し、受傷後72時間において読み取りを行った(すなわち、ポリペプチドと71時間インキュベートした後)。C. スクラッチング後3日目の再生(上段)、又は再生の欠如及び細胞破壊(下段)を示す代表的な画像である。ヒトミニブレイン-BBBのin vitroモデルを示す図である。A. In vitroモデルの略図であり、細胞培養ウェルの断面として示す。左側パネル、先行技術のモデルであり、脳コンパートメント内には細胞が存在しない;右側パネル:本発明のモデル。Br:脳コンパートメント; BI: BBBの「血液」側に対応する注入コンパートメント; E:内皮細胞; A:アストロサイト; N:ニューロン; M:ミクログリア細胞。B. 内皮細胞を含有するウェルに添加した後24時間におけるミニブレイン細胞の表現型。いくつかの遺伝子のmRNA発現を、本発明のモデルの一部をなす細胞内で測定し、NT2-N細胞では、1=ニューロン細胞のマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)、又はNT2-N、NT2-A、及びCHME細胞では、2=ニューロン細胞のマーカーである神経フィラメントタンパク質H(NEFH); 3=グリア原線維アストロサイトタンパク質(GFAP)、4=アクアポリン4(AQP4)、及び5=アストロサイトマーカーであるグリコーゲンホスホリラーゼB (PYGB)、; 6=ミクログリア細胞のマーカーであるCD 200受容体(CD200R)を測定した。縦軸:コントロールに対するmRNA発現率(%)。ミニブレイン-BBBモデルにおける内皮細胞のQ-PCR法による特徴づけを示す図である。内皮細胞を、脳細胞を含有する細胞培養容器に添加した24時間後の、いくつかの遺伝子のmRNA発現を、本発明のモデルの一部をなす内皮細胞内で測定し、前記モデルは、ミクログリア細胞を1.5%(左側パネル)又は24%(右側パネル)を用いて調製した。縦軸:コントロールに対するmRNA発現率(%)。A.流出トランスポータ: 1=ABCB1タンパク質、2=ABCG2タンパク質、3=多剤耐性関連タンパク質(ABCC1)、4=ABCC2タンパク質、5=ABCC4タンパク質、6=ABCC5タンパク質。B. 受容体: 1=低密度リポタンパク質受容体(LDLR)、2=低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1(LRP1)、3=インスリン受容体(INSR)、4=レプチン受容体(LEPR)、5=基底細胞接着分子(LU)、6=CD71抗原(TFRC)、7=グリコシル化進行型最終産物受容体(advanced glycosylation end-product receptor)(AGER)。C.トランスポータ:1=レチノイン酸刺激型遺伝子6タンパク質(stimulated by retinoic acid gene 6 protein)(STRA6)、2=グルコーストランスポータ1型(SLC2A1)、3=大型中性アミノ酸トランスポータ1(SLC7A5)、4=溶質担体ファミリー1タンパク質(SLC1A1)、5=溶質担体ファミリー38メンバー5タンパク質(SLC38A5)、6=モノカルボキシレート輸送タンパク質1(SLC16A1)。すべての条件において、STRA6は高度に発現し、またLUは過剰発現している。 VHH含有ポリペプチドによるミニブレイン-BBBモデルのニューロンに対する標的化を示す図である。VHH-E9又は本発明のVHH含有ポリペプチドがBBBを横断する能力を測定する蛍光顕微鏡アッセイ法では、1.5%のミクログリア細胞と共に本発明のデバイスを用いて実施し、その際前記VHH-E9、又はVHH含有ポリペプチドを3時間又は24時間インキュベートした。VHH-E9は、in vivoでBBBを横断することがこれまでに明らかにされている(Liら、2012年)。Ct=コントロール、すなわち二次抗体のみ。A. 3時間又は24時間後、脳コンパートメント内にVHH-E9(A488結合型)が存在することを示す蛍光画像。B. 3時間又は24時間インキュベーション後、脳コンパートメント内に、VHH-E9(A488結合型)、又は本発明のVHH含有ポリペプチドであるVHH1、VHH2、VHH3が存在することを(抗ストレプ-タグ抗体を用いて)示す蛍光。VHH-E9、及び本発明のVHH含有ポリペプチドであるVHH1、VHH2、及びVHH3は、本発明のBBB in vitroモデルを横断する。C. 本発明のVHH含有ポリペプチド(VHH1又はVHH2)がBBBを横断後、脳コンパートメントのニューロンを標的とすることを示す蛍光画像。画像は、Bの場合と同様に24時間インキュベーション後、及びニューロンのマーカーであるニューロフィラメント200kDa(Nf)の同時染色により得た。左側画像:VHH染色(緑色チャンネル);右側画像:Nf染色(赤色チャンネル)。白抜きの星型は、VHH含有ポリペプチドで染色されたニューロンを示す(すなわち、染色は両チャンネルにおいて検出された)一方、白抜きのドットは、VHH2染色されたがNf染色されない細胞を示す。かかる細胞は、VHH1画像中には存在しない。D. Cに記載されている実験では、VHH1及びVHH2についてニューロン標的化の有効性を測定した。縦軸:対応するVHH含有ポリペプチドについて染色された細胞のうち、Nf染色された細胞(ニューロン細胞)の割合(%)。(***)は、スチューデントのt検定でp値<0.0002であることを示す。VHH1は、BBBを横断した後、ニューロンを標的とする。先行技術のVHHとVHH A12との配列比較を示す図である。本明細書に開示するVHH含有ペプチドのVHH部分の配列(VHH A12)を、VHHに関する公開データベースから入手可能な配列(EMBL:uniprotkb、uniprotkb_{_}wissprot、uniprotkb_{_}wissprotsv、uniprotkb_{_}rembl、epop、jpop、kpop、uspop、nrpl1、nrpl2、uniparcall)と配列比較した。419よりも高いアライメントスコアを有するすべてのVHHを配列比較に含めた。CDR領域の残基を太字フォントで、且つ二重下線で表す。見てわかる通り、本発明のVHHの代表的な特徴として、CDR2の位置5〜6において、大半のVHHがGGを有し、その他はGRを有するのに対し、GF配列であること、CDR1の位置2〜3において、位置2がほとんどの場合Fであり(R、V、及びLが、すべて1回のみ現れる)、また位置3はほとんどの場合Sであり、時にG又はRであるのに対して、DV配列であることが挙げられ、また同様に特有の特徴が、CDR3及びフレームワーク領域内に見出される。ミクログリア細胞の比が様々である場合の本発明のデバイスの試験を示す図である。A.播種した日(0日目)及び2日後(2日目)における脳コンパートメントの細胞を示す顕微鏡画像であり、明細書に記載するBBBモデルには、1.5%のミクログリア細胞(左側)又は15%のミクログリア細胞(右側)を播種した。15%のミクログリア細胞を播種したBBBでは、かかる細胞は、播種後2日目には細胞の80%を占めるものと思われる。B. 1.5%又は15%のミクログリア細胞を播種したBBBモデルの限定的な傍細胞透過性。透過性は、経内皮電気抵抗(TEER、左側)及び内皮透過係数 (P_e、右側)により測定し、内皮細胞を播種した後様々な時点において15%のミクログリア細胞を播種したBBBモデル(左側)、及びミクログリア細胞を播種した後2日目に、ミクログリア細胞を播種しなかった、又は1.5%若しくは15%のミクログリア細胞を播種したモデル(右側)について示す。観察の通り、本明細書に開示のBBBでは、ミクログリア細胞が高い比で存在したとしても、関門の透過性に対する有害な効果を有しない。「ミニ-ミニブレイン」を示す図である。「ミニ-ミニブレイン)」デバイス、すなわち本明細書に開示のBBBモデルを、脳コンパートメントにおけるニューロン細胞供給源としてSK-N-SHD細胞株を用いて構築した。A. デバイスの略図及び脳コンパートメントの蛍光顕微鏡画像であり、強いB3チューブリンラベリングを示す。B. ニューロカーゴ-ニューロヴィータの不存在下(コントロール)、又は存在下で測定したミニ-ミニブレインの透過係数(P_e)であり、透過性は本明細書に開示のVHH含有ポリペプチドにより変化しないことを実証する。蛍光顕微鏡検査により、このような条件では、ニューロカーゴ-ニューロヴィータは、BBBを横断して輸送され、また脳コンパートメントの細胞が標的対象となることが確認された。

本発明の特徴及びその実施形態の開示に関係する一般定義
ペプチド又はポリペプチド
ペプチド又はポリペプチドは、ペプチド結合により結合したアミノ酸残基からなる高分子である。用語ペプチド及びポリペプチドは、ペプチドは通常より短い配列を指す(一般的に、アミノ酸残基50個未満、又は30個未満、又は20個未満)一方、ポリペプチドは通常より長い配列を指すが(一般的に、アミノ酸残基20個、30個、又は50個を超える)、本明細書では交換可能に用いられる。タンパク質という用語は、本明細書では、用語ポリペプチドと交換可能に用いられる。アミノ酸残基は、20種類の天然起源のアミノ酸、及び/又は当業者にとって公知の非天然起源のアミノ酸の中から選択され得る。アミノ酸残基は、天然起源の修飾又は非天然起源の修飾により修飾され得る。天然起源の修飾として、特にセリン、トレオニン、及び/又はチロシン残基のリン酸化、N-結合型及びO-結合型グリコシル化を含むグリコシル化、特にリジン残基のユビキチン化、SUMO化又はユビキチン様タンパク質によるその他の修飾等が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、非天然起源、すなわち天然には見出されない、及び/又は天然の産物ではなく、天然の産物とは顕著に異なる。かかる差異は、前記ポリペプチドのアミノ酸配列に起因し得る。例えば、異なる種、特に異なるファミリーに由来する種(例えば、ラクダ及びウイルス)に見出される少なくとも2つのポリペプチドの融合体からなる、又はそれを含むポリペプチドは、天然起源のポリペプチドに見出されない配列を通常有する。別の事例として、ポリペプチドは、その配列の保存的アミノ酸残基内に、少なくとも1つの突然変異を有し得る、すなわち、所定の位置にあるアミノ酸は、天然起源のポリペプチドのその位置には見出されないアミノ酸であり得る。また、差異は、非天然起源のアミノ酸の存在に起因する場合もある。また、差異は、非天然起源の修飾である、少なくとも1つのアミノ酸残基における修飾に起因する場合もある。また、差異は、天然起源のポリペプチドにおいては付加が認められない分子部分の付加に起因する場合もある。また、差異は、ポリペプチドの提示状態、すなわちポリペプチドが生成、提示、又は用いられる巨視的なフォーマットに起因する場合もある。特に、本発明のポリペプチドは、特に生物学的メンブレンにより、ポリペプチドがチューブ内のその他の成分から分離されない場合、すなわち、ポリペプチドとポリペプチドの前後において容器内に添加されたその他の分子及びマクロ分子との間で、直接的な分子接触が即時に生じ得る場合、例えば試験管又はその他の人工的な容器内での操作が好都合なように、それに適する形態であり得る。融合タンパク質/融合ポリペプチドは、ペプチド結合により連結した少なくとも2つのペプチドを含む又はそれからなるポリペプチドの通常の意味合いで、本明細書において用いられる用語である。実際、かかる融合体は、融合体に含まれるペプチドの連結した配列に対応する配列を有する単一のポリペプチドである。融合タンパク質/ポリペプチドが本明細書に記載される場合、及び明確に除外される、又は技術的に無関係である(現れる特定の文脈において当業者が認識するように)場合を除き、融合体は、具体的に記載されているペプチド間にインターカレートされた1つのスペーサーペプチド(本明細書に記載するような)、又は任意の数のスペーサーペプチド若しくはその他のペプチドを含み得る。通常文脈から明白なように、「ポリペプチドA及びポリペプチドBを含む融合ポリペプチド」は、本明細書では「ポリペプチドA及びポリペプチドB及び任意選択でその他のポリペプチド(スペーサーペプチドを含む)の融合ポリペプチド」を指し、並びに「ポリペプチドA及びポリペプチドBからなる融合ポリペプチド」は、本明細書では「ポリペプチドA及びポリペプチドB及び任意選択的なスペーサーペプチドの融合ポリペプチド」を指す。「ポリペプチドAは、ポリペプチドBと融合している」と本明細書で記載される場合、明確に記載されない限り、両方のポリペプチドは、互いに直接又はスペーサーペプチドを介して必然的に融合していることを示唆しない、すなわちペプチドは、任意の数のペプチドによって隔てられていてもよく、また任意の順序であり得る。「ポリペプチドAは、C-末端側でポリペプチドBと融合している」と本明細書で記載される場合、明確に記載されない限り、両方のポリペプチドが互いに直接又はスペーサーペプチドを介して融合していることを示唆しない。すなわち、Aが融合ポリペプチドのC-末端部に近接していれば、AとBは、任意の数のペプチド及び残基によって隔てられていてもよい。同様に、「N-末端側でポリペプチドBと融合したポリペプチド」は、融合ポリペプチドのN-末端部に近接しているが、任意の数のペプチド及び残基によってポリペプチドBから隔てられていてもよい。

第1の態様では、従って本発明は、配列番号3の配列を備えたラクダ重鎖抗体のVHH、又は以下で詳記するその変異体又は一部分を含む又はそれからなる配列を有するポリペプチドに関し、前記VHHは、血液脳関門を横断して透過可能であり、また、脳抗原のいずれも認識しない、及び/又は特に抗体/抗原相互作用を通じて、脳タンパク質のいずれとも特異的に結合しない。

以下でより詳細に明らかにされるように、本発明は、本明細書で定義するVHHを含むポリペプチドであって、VHHと融合した追加の任意選択的なペプチドを備え、所望の特性を付加するポリペプチドを含む。かかるポリペプチドは、本発明のVHH含有ポリペプチドとして本文書全体を通じて記載されている。但し、念のため、当業者が、VHH及びVHH含有ポリペプチドの両方が関係し得ると実際に認識する場合、本発明のVHH又は本発明のVHH含有ポリペプチドと記載することが時に省略される。従って、技術的に又は論理的に無関係の場合を除き、「本発明のVHH」と記載される場合、「本発明のVHH含有ポリペプチド」も関係し、また逆も成り立つ、すなわち1つのフレーズは、別のフレーズに置換され得る。本発明のポリペプチドという用語は、本発明のVHH及び本発明のVHH含有ポリペプチドの両方を指すのにも用いられる場合がある。

特に、本発明のVHHと関連する特徴の説明は、ほとんどの場合VHH含有ポリペプチドにも適用可能であり、これには本明細書で定義する配列番号3を備えたVHHの配列変異体又は一部分を含む又はそれからなるポリペプチドも含まれ、その変異体又は一部分も本発明の範囲に含まれる。より具体的には、本発明のVHH含有ポリペプチドは、塩基性のpIを有利に有する、及び/又はBBBを横断して透過可能である;及び/又は脳抗原のいずれも認識しない、及び/又はヒト脳タンパク質のいずれとも特異的に結合しない、及び/又は抗体/抗原相互作用を介して脳抗原のいずれとも結合しない、及び/又は脳抗原のいずれともVHH部分を介して結合しない。

VHH
VHHは、ラクダ由来の重鎖単独抗体の可変ドメイン(HcAb)、又はかかるVHHに由来する分子であり、特に抗原認識能力においてオリジナルのVHHと実質的に同じ特性を有する(抗原認識能力を有さない場合を含む)。ラクダ科のすべての種は、重鎖単独抗体を有する。好ましい実施形態では、本発明のVHHは、アルパカ(Lama pacos)から得られる。

本発明のVHHは、好ましくは配列番号3の配列を有する。またVHHは、前記配列と少なくとも70%、又は少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好ましくは少なくとも95%の同一性、及びなおいっそうより好ましくは少なくとも99%の同一性を有する変異体配列を有し得る。本発明のVHHが、配列番号3の配列の一部分のみを含む場合には、前記部分の配列について同一性レベルが計算される。前記部分の長さは、配列番号3の長さの少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、及びなおいっそうより好ましくは少なくとも95%である。好ましい実施形態では、前記部分の長さは、少なくとも60個のアミノ酸、少なくとも80個のアミノ酸、好ましくは少なくとも100個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも110個のアミノ酸、及びなおいっそうより好ましくは少なくとも115個のアミノ酸である。特定の実施形態では、本発明のVHHは、配列番号3の配列を備えたVHHについて、少なくとも3つのCDR領域を含む。特定の実施形態では、VHHは、配列IDVINNMA(配列番号47)を有するCDR1、配列TITSGFSTNY(配列番号48)を有するCDR2、及び配列KVHLIRLGAARAYDY(配列番号49)を有するCDR3を含む。しかし、当業者は、例えばVHHが投与される場合には、脱免疫化(de-immunization)を目的として、CDR内に突然変異を導入することが好ましい場合もあることを認識する。従って、VHHの特徴を維持する、限定的な突然変異も考えられる。特定の実施形態では、VHHのCDRは、そのアミノ酸配列内に、好ましくは各CDRにおいて2残基、及びなおいっそうより好ましくは1残基に限られた限定的置換を有する。特定の実施形態では、本発明のVHHは、配列番号3と少なくとも70%(又は、上記詳細の通りそれ以上)の同一性を有し、並びに配列番号47の配列、好ましくは配列番号47の配列を備えたCDR1と比較して2個以下のミスマッチ、好ましくは1個以下のミスマッチを有する配列を備えたCDR1;及び配列番号48の配列、好ましくは配列番号48の配列を備えたCDR2と比較して2個以下のミスマッチ、好ましくは1個以下のミスマッチを有する配列を備えたCDR2;及び配列番号49の配列、好ましくは配列番号49の配列を備えたCDR3と比較して、2個以下のミスマッチ、好ましくは1個以下のミスマッチを有する配列を備えたCDR3を含む。上記で意味するようなミスマッチは、好ましくはアミノ酸置換、特にCDR1及びCDR2におけるアミノ酸置換であるが、単一のアミノ酸の欠損又は挿入であり得る。上記で意味するようなミスマッチは、好ましくはアミノ酸の保存的置換、すなわち類似した特徴を有すると当業者が認識する別のアミノ酸へのアミノ酸置換である。かかるVHHの上記で定義したような部分も、特定の実施形態を構成する。特定の実施形態では、本発明のVHHは、図9の配列比較に示すようなフレームワーク配列(下線が引かれていないアミノ酸に対応するフレームワーク配列)を含む。特に、本発明のVHHは、配列番号3の配列を備える、又はこれらのフレームワーク領域の配列に対して少なくとも80%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性を有するVHHのフレームワーク領域を含み得る。

配列番号3の配列又はその一部分を備えたVHHの変異体であるVHHは、抗原認識(特に、脳抗原のいずれも認識しない)、脳タンパク質の結合(特に、ヒト脳タンパク質のいずれとも特異的に結合しない)、BBBを横断する透過性又はBBBを横断する能力(特に、本明細書で定義するように、BBBを横断して透過可能である、又はBBBを横断可能である)、及び/又はpI(特に、本明細書で定義するように、塩基性のpIを有する)について、後者のVHHの本質的な特徴を共有し、並びに本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドに関係する実施形態は、配列番号3の配列又はその一部分を備えたVHHの変異体であるVHHに適用される。このような特徴に関する試験は、当業者にとって容易にアクセス可能であり、特にかかる試験は、本明細書に、特に実施例セクションにおいて開示されている。疑義を回避するためではあるが、ラクダ科動物に由来する又はラクダ科動物から取得可能な抗体のHcAbの厳密にsensuなVHHフラグメントではないかもしれないが、配列変異体及びVHHの一部分(配列変異体の一部分を含む)は、技術的又は論理的に無関係の場合を除き、本明細書で用いる用語VHHに含まれる。いくつかの実施形態では、特に配列番号3に由来する変異体である配列を有する場合、本発明のVHHは、天然起源のVHHではなく、好ましくは天然起源のタンパク質ではない。

本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドはBBBを横断して透過可能である。物質(例えば、タンパク質)、及び特にBBBを横断して透過可能な本発明のVHHは、BBBにより保護された脳の部分の外部に投与される場合、しかるべき時間経過後に有意な量で脳内に見出され得る物質として定義可能である。「BBBを横断して透過可能である」と同じ意味で本明細書において用いられるその他の用語として、物質は「BBBを横断する能力を有する」、又は物質は「BBBを横断可能である」が挙げられ、透過性という用語は、本明細書においては、「BBBを横断する能力」の意味で用いられる。一般的に、in vivoで試験される場合、投与は、特に動物、特にヒト以外の哺乳動物、特にマウス又は齧歯類の頚動脈において、血管内注射により実施される。

BBBを横断する透過性をin vivo試験する場合、いくつかの困難が存在する。BBBを横断して透過可能である物質、及び特に本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドは、従ってin vitro BBBモデルと呼ばれるモデルにより別途定義可能である。特に、BBBを模倣する細胞のコンフルエントな層により分離した2つの細胞培養コンパートメントを備えるin vitro BBBモデルの場合、BBBを横断して透過可能な物質は、しかるべき時間、1つのコンパートメントにアプライされ、及び/又はその中でインキュベートされたときに、他方のコンパートメントにおいて有意な量で見出される物質として定義され得る。

上記定義において、最初にアプライされた、及び/又は投与された物質の0.01%又は0.1%よりも高い、好ましくは0.5%、1%、又は1.5%よりも高い、及びなおいっそうより好ましくは2.5%、5%、又は10%よりも高い量は、例えば有意な量とみなされ得る。特に、物質が透過可能か、その可否をin vivo判定する場合、BBBを通過した物質量の定量化は、困難又は不可能であると判明する可能性がある。特にin vivoでは、ほとんどの分子(十分なサイズを有する)が脳内に貫通するのを、BBBは非常に効果的に阻止するので、当業者は、従来型の最たる細胞検出法及び/又は分子検出法を用いて、脳(又は脳を模倣するコンパートメント)内でかかる物質がいくらかの量でも検出された場合、それは有意とみなすことができ、また透過性の兆候であると認識する。また、BBBを横断した物質の量が痕跡量(例えば、マススペクトロメトリー等の極めて高感度な技法によってのみ検出可能な量)の場合、特にin vitroモデルを用いて検出された場合には、通常それは有意とはみなされないと認識される。

透過性タンパク質のBBB貫通について通常認められた動力学を前提とすれば、当業者は、この文脈においてしかるべき時間とは、通常数十分から数時間のオーダーであると認識する。従って、投与から脳(又は脳を模倣するコンパートメント)内の物質の有無を調べる試験までの時間は、例えば、10分〜12時間の範囲であり得る。In vivo試験に要する代表的な時間は、好ましくは30分〜12時間、好ましくは30分、1時間、90分、2時間、4時間、8時間、又は12時間の範囲である。In vitro試験に要する代表的な時間は、好ましくは10分〜4時間、好ましくは10分、30分、45分、1時間、90分、2時間、3時間、又は4時間の範囲である。より長い時間も考えられるが、しかし、延長されたインキュベーション時間が採用された場合、物質は、試験される前に分解する可能性があり、従ってBBBを有効に横断したとしても検出されないままである可能性があるので、例えば物質の半減期等の要因が、結果に劇的な影響を及ぼす可能性がある。

特定の実施形態では、Wekslerら、2005年、米国特許第8,084,254 B2号又は国際公開第2006/056879号に記載されているin vitroモデル、及び/又はBickerら、2014年、又は欧州特許第1 964 915 A1号に記載されているin vitroモデル、及び/又は本明細書に記載する新規のin vitro BBBモデルを用いて試験する場合、最初にインキュベートされる本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドのうち、0.1%を超える量が、4時間のインキュベーション後に「脳」コンパートメント内で見出される。好ましい実施形態では、0.5%を超える、好ましくは1%を超える量が、4時間のインキュベーション後に見出される。更に好ましい実施形態では、0.5%を超える、好ましくは1%を超える量が、1時間のインキュベーション後に見出される。なおも更に好ましい実施形態では、1.5%を超える、好ましくは2.5%を超える量が、1時間のインキュベーション後に見出される。特定の実施形態では、「脳」コンパートメント内に、脳細胞、特にニューロン細胞を含有するこのようなモデルのいずれかを用いて試験した場合、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドは、前記脳細胞、特にニューロン細胞を対象とした免疫蛍光実験において、他方のコンパートメント内にアプライされたVHH又はVHH含有ポリペプチド10 pgを3時間インキュベートした後に、容易に検出される。

構築物全体のBBBを横断する透過性(すなわち、もしあれば「カーゴ」エフェクターペプチドを含む、本発明のVHH含有ポリペプチド全体)は、いくつかの用途において通常有利な特徴である。しかし、全構築物の一部分の透過性、例えばエフェクターペプチドを除いたVHH又はVHH含有ポリペプチドは、構築物全体の透過性に関連するので、構築物全体又はその一部分、特にエフェクターペプチドを除いたVHH及び/又はVHH含有ポリペプチドについて、透過性が代替的又は付加的に評価(測定及び/又は計算)され得る。

本発明の特定の実施形態では、ポリペプチド、特にVHH又はVHH含有ポリペプチドは、塩基性である。

特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、塩基性である。タンパク質、特にVHHは、その等電点(pI)が7よりも高い、より好ましくは8に等しい又はそれ以上、及びなおいっそうより好ましくは8.5に等しい又はそれ以上、或いは9に等しい又はそれ以上のとき、塩基性であるといわれる。タンパク質のpIは、タンパク質が正味荷電を有さない(すなわち、負電荷が正電荷と釣り合う)pHとして定義される。実験的な測定を通じて、又はタンパク質の配列に基づき理論的な計算を通じて、タンパク質のpIを測定する方法は、当業者にとって公知である。特に、pIは等電点電気泳動法を用いて実験的に測定可能である。代替的又は付加的に、pIは、コンピュータープログラム、例えばEuropean Bioinformatics Institute、Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、英国から入手可能なEMBOSS iepソフトウェア、及び/又はSwiss Institute of Bioinformatics、Quartier Sorge - Batiment Genopode、1015 Lausanne、スイスから入手可能なExpasyソフトウェアに由来するCompute pIツール等を用いて計算可能である。構築物全体(すなわち、もしあれば「カーゴ」エフェクターペプチドを含む、本発明のVHH含有ポリペプチド全体)のpI、並びにその一部分のpI、例えばエフェクターペプチドを除いたVHH又はVHH含有ポリペプチドは、構築物全体のBBBを横断する透過性と関連するので、pIは、構築物全体又はその一部分、特にエフェクターペプチドを除いたVHH及び/又はVHH含有ポリペプチドについて、代替的又は付加的に評価(測定及び/又は計算)され得る。

特定の実施形態では、本発明のVHHは、場合によっては、本発明のVHH含有ポリペプチドを形成するその他のペプチドを除き、8に等しい又はそれ以上、より好ましくは8.5に等しい又はそれ以上、及びなおいっそうより好ましくは9に等しい又はそれ以上のpIを有する。特定の実施形態では、本発明のVHH含有ポリペプチドは、好ましくはカーゴペプチドを含め、8に等しい又はそれ以上、より好ましくは8.5に等しい又はそれ以上、及びなおいっそうより好ましくは9に等しい又はそれ以上のpIを有する。

ペプチドのpIが高いと、細胞と非特異的に結合する可能性があり、従ってそのようなペプチドが特定の細胞を標的とする妨げとなる。特定の実施形態では、本発明のVHHは、場合によっては、本発明のVHH含有ポリペプチドを形成するその他のペプチドを除き、11に等しい又はそれ未満、より好ましくは10.5に等しい又はそれ未満、及びなおいっそうより好ましくは10に等しい又はそれ未満のpIを有する。特定の実施形態では、本発明のVHH含有ポリペプチドは、好ましくはカーゴペプチドを含め、12に等しい又はそれ未満、より好ましくは11に等しい又はそれ未満、及びなおいっそうより好ましくは10.5に等しい又はそれ以上のpIを有する。本発明のVHHのpIの好ましい範囲は、場合によっては、本発明のVHH含有ポリペプチドを形成するその他のペプチドを除き、8.5〜11、8.5〜10、9〜10、及び9〜10.5である。本発明のVHH含有ポリペプチドのpIの好ましい範囲は、8.5〜12、8.5〜11、9〜11、9〜10.5、9.5〜10.5、及び10〜10.5である。

本発明者らは、本明細書ではアルパカから得られるVHHについて提示する。このVHHは、配列番号3の配列を有し、また配列番号4配列を備えるポリヌクレオチドによりコードされる。実施例のセクションで詳記するように、このVHHは脳抗原のいずれも認識しないこと、塩基性のpI(pI>9)を有すること、少なくともVHH含有ポリペプチドの形態で、BBBを横断して透過可能であることが本発明者らにより明らかにされた(特にVHH1、VHH2、VHH3)。

特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ニューロン細胞を標的とする。特に、ポリペプチドは、VHHがニューロン細胞を標的とする分子と融合している融合ポリペプチドである。

本発明のVHHは、ニューロン細胞標的ペプチドと融合させてもよい。いくつかのペプチドは、本発明のポリペプチドが特定の細胞型を標的とするように仕向ける能力を有する、すなわち、そのようなペプチドを含むポリペプチドは、好ましくは特定の細胞と会合する、及び/又特定の細胞に輸送される、及び/又は特定の細胞と結合する。特に、ニューロンを標的とするかかるペプチドは、当技術分野において公知である。かかるペプチドは、狂犬病ウイルスGタンパク質に由来し得る。配列番号1の配列を備えるかかるペプチドは、それを説明する目的で本発明の範囲に含まれる。同一の標的特性を示し、また、アミノ酸残基の10%以下にしか影響を及ぼさない点突然変異、例えばアミノ酸残基の保存的置換による上記配列に由来するのであれば、これらの配列の変異体も、ニューロン細胞標的ペプチドとして本発明に含まれる。狂犬病ウイルスGタンパク質に由来するその他の適するニューロン細胞標的ペプチドとして、配列番号32、配列番号33、及び配列番号34の群の中から選択される配列を備えるペプチドが挙げられる。

特定の実施形態では、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドは、ニューロン細胞を標的とし、特に内皮細胞の層を横断した後、本発明のデバイス内のニューロン細胞を標的とする。標的化は、前記ポリペプチドが唯一存在すること、又は溶液中のその他の細胞型及び/又はポリペプチド(非細胞結合型)と比較してそれより多量に、ニューロン細胞の表面及び/又は内側に存在することの反映でもあり得る。

とりわけ、当技術分野において、以下で議論するように、VHHを含むキメラ構造物中にシステインを導入することは、その活性に必要と考えられるVHHの単量体状態を維持するために通常避けられる。しかし、狂犬病ウイルスGタンパク質に由来するニューロン細胞標的ペプチド中のシステインは、その生物活性を維持するために必要である(Lentzら、1987年)。従って、好ましい実施形態では、本発明のVHH含有融合ポリペプチドは、ペプチド、特に、システイン残基を含むようなニューロン細胞標的ペプチド、特に、N-末端側でVHH部分と融合したようなペプチドを含み、また特にかかるシステイン残基は、VHH部分の最初(N-末端)の残基からN-末端側5〜25、好ましくは10〜20、及び最も好ましくは16残基に見出される。

特定の実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、二量体化能力、特にホモ二量体化能力有し、また好ましくは、ホモ二量体化はジスルフィド架橋に起因する。

本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドは、二量体化能力を有し得る。従って、本発明は、VHH又はVHH含有ポリペプチドを二量体構築物として含む。ラクダ科動物から得られるVHHそのものは、二量体、特にホモ二量体を通常形成することはできないが、それはその特質の1つであり、また生物学的機能を発揮するのに必要とされる特徴と考えられる。従って、VHH又はVHH含有ポリペプチドを設計する当業者は、その単量体構造を維持するように通常設計する。しかし、本明細書において開示されるVHH含有ポリペプチドの場合、本発明者らは、驚くべきことに生物活性は、単量体形態と二量体形態(状態)の間で異なること、及び後者の方が好ましいことを見出した。

二量体形成を可能にする方法は、当業者にとって公知である。特に、かかる方法は、二量体化ドメイン、特に二量体であることが公知のタンパク質のホモ二量体化ドメインの付加を含む。代替的(又は付加的に)、VHHの配列内にシステイン残基が存在すると(例えば、配列内の別のアミノ酸の突然変異により)、又は本発明のポリペプチド内の前記VHHに結合した1つ又は複数のペプチド内にシステインが存在すると、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドの二量体形成、特にホモ二量体形成が可能となり得る。当業者は、ポリペプチドがその折り畳まれた立体構造の状態にあるときでも、システインが別のポリペプチドと結合しやすいように、前記システインは配列のある領域内に含まれなければならないと認識する。特定の実施形態では、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドは、二量体及び特にホモ二量体として提供される。特定の実施形態では、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドは、分子間ジスルフィド結合を形成することができる1つ又は複数のシステイン残基を含む。特定の実施形態では、二量体形成性(特にホモ二量体形成性)のシステインは、VHH又はVHH含有ポリペプチドのN-末端部内に存在し、特にVHHに対してN-末端側のペプチド、及び特にN-末端側でVHHと融合したニューロン標的ペプチド、例えば本明細書に開示のRDP等の中に存在する。

特定の実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、VHH含有ポリペプチドであり、従って本明細書で定義する任意のVHHを含む融合ポリペプチドであり、場合によっては、本明細書に開示の分子と融合しており、また融合したエフェクターポリペプチドを更に含んでいる。

本発明のVHH含有ポリペプチドは、ニューロヴィータペプチドを含み得る。本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチド(特に、本明細書に記載するニューロン細胞標的ペプチド及び/又はタグを含む)を、血液脳関門を横断してニューロヴィータペプチド(本明細書ではカーゴ又はエフェクター分子又はペプチドとも呼ばれる)を輸送する、(及び場合によっては、カーゴペプチドが所定の細胞、細胞コンパートメント等を標的とする)ための媒体として用いられるように設計した。

媒体として作用する本発明のVHH含有ポリペプチドに対する好ましい結合は、VHH又はVHH含有ポリペプチド媒体とエフェクターペプチドとを含む融合ポリペプチドの生成を介する。従って、VHH含有ポリペプチドという用語は、文脈より除外される又は技術的に無関係の場合を除き、本発明のVHH及びニューロヴィータペプチドを含む融合ポリペプチドを含み、また本発明に含まれる。好ましい実施形態では、カーゴペプチドは、40個未満、30個未満、好ましくは20個未満のアミノ酸を有する。また、当業者は、カーゴペプチドのpIは、媒体及びカーゴを含む融合ポリペプチドのpIに影響を及ぼす可能性があることも認識する。本明細書に別途記載するように、得られた本発明のVHH含有ポリペプチドは、好ましくは塩基性である。

ニューロンの生存性及び/又は保護及び/又は運動性に対して効果を有する、並びに/或いは神経突起伸長を促進する狂犬病ウイルスのGタンパク質に由来するペプチドは、本発明に基づくカーゴ分子である。その分子は、国際公開第2013/068430号で開示されている。これらのペプチドは、ペプチドの細胞質ドメインとして開示されており、前記細胞質ドメインは、MAST2結合ドメインの上流にある細胞質ドメインと前記公表文献中のMAST2結合ドメインからなる。用語「ニューロヴィータペプチド」は、本明細書で用いる場合、MAST2結合ドメイン及びその上流の配列(すなわち、N-末端側、MAST2結合ドメインは前記上流配列にC-末端側で融合している)を含む又はそれからなる細胞質ペプチドを指す。特定の実施形態では、ニューロヴィータペプチドは、狂犬病ウイルスのGタンパク質の細胞質ドメインに由来する30〜55個のアミノ酸ペプチドであり、前記Gタンパク質のMAST2結合ドメインを含み、ニューロンの生存性、保護、及び/又は移動性に対する効果を有し、並びに/或いは神経突起伸長を促進する。本発明を実施するためのかかるペプチドの事例として、配列番号7の配列を備えるペプチドが挙げられる。MAST2結合ドメインが本発明のVHH含有ポリペプチドのC-末端部にあるように、かかるペプチドは、好ましくは本発明のVHH、好ましくはVHH含有ポリペプチドの一部分を形成する任意のその他のペプチドにC-末端側で融合している。特定の実施形態では、本発明のVHH含有ポリペプチドは、好ましくはVHHとC-末端側で、より好ましくは本発明のポリペプチドのC-末端部で融合したVHH及びニューロヴィータペプチドを含む融合ポリペプチドを含む。

ニューロヴィータペプチド、及び特に配列番号7の配列を備える好ましいニューロヴィータペプチドは、塩基性のpIを有する。特に、ニューロヴィータのpIは、12以上であり得る。当業者は、かかる塩基性pIを有するペプチドは、細胞に非特異的に結合する可能性があり、従って特に特定の細胞を標的とするように意図されている場合には、かかるペプチドの使用は検討外であると認識する。しかし、本発明者らは、特に9.5〜10の範囲内のpI及び特にpI=9.86を有するそれほど塩基性ではないVHHとの融合で用いたときに、10〜10.5の範囲内のpI、及び特にpI=10.36を有するVHH含有ポリペプチドにおいて、非特異的結合は認められず、ポリペプチドは特異的標的対象となることを見出した。特定の実施形態では、ニューロヴィータペプチドは、12以上のpIを有する。特定の実施形態では、ニューロヴィータペプチドを含むVHH含有ポリペプチドは、12以下、好ましくは11以下、より好ましくは10.5以下のpI、及び特に8.5〜11範囲内、好ましくは9〜10.5範囲内、及び最も好ましくは10〜10.5範囲内に含まれるpIを有する。特に、ニューロヴィータペプチドを含むVHH含有ポリペプチドは、10.36のpIを有する。

ニューロヴィータペプチドは、国際公開第2013/068430 A1号の12〜22頁で開示される任意のMAST2結合ドメインを担持する可能性があり、そこで開示される各群は、特定の実施形態のニューロヴィータペプチドのMAST2結合ドメインがそこから選択される群を構成する。同様に、本発明の特定の実施形態におけるニューロヴィータペプチドのMAST2結合ドメインは、国際公開第2013/068430号の12〜22頁に記載される特定の実施形態で定義されたニューロヴィータペプチドのMAST2-結合ドメインの中から選択され得る。好ましい実施形態では、VHH含有ポリペプチドは、配列番号7の配列を有するニューロヴィータペプチドを含む。国際公開第2013/068430号の15、16、18、20、及び21頁に個別に開示されるニューロヴィータペプチドのMAST2結合ドメインそれぞれは、好ましい実施形態に含まれる。特に、本発明のニューロヴィータポリペプチドのMAST2結合ドメインは、サイズが11〜13残基の配列からなり、その最初の2残基はSとWであり、またその最後の4残基は、Q、T、R、及びLである(これら最後の4アミノ酸残基はいわゆるPDZ-BSに該当する)。

MAST-2結合ドメインは、いずれの群であろうとも、MAST2結合ドメインの最初の2つのアミノ酸残基がSとWであり、またMAST-2結合ドメインの最後の4アミノ酸残基が、Q、T、R、及びLであることを念頭に置いて下記の群の1つにより定義される:(A)第1の群では、MAST2結合ドメインは、サイズが11残基の配列からなり、その最初の2残基は、SとWであり、またその最後の4残基は、Q、T、R、及びLであり、SWX1X2X3X4X5QTRLからなり、X1、X2、X3、X4、及びX5のそれぞれは、任意のアミノ酸残基である(配列番号21);(B)第2の群では、MAST2結合ドメインは、サイズが11残基の配列からなり、その最初の2残基はSとWであり、またその最後の4残基は、Q、T、R、及びLであり、SWESHKSGGQTRL配列(配列番号19)から2つのアミノ酸残基が連続して又は連続しないで欠損することにより取得され得る;(C)第3の群では、MAST2結合ドメインは、サイズが12残基の配列からなり、その最初の2残基はSとWであり、またその最後の4残基は、Q、T、R、及びLであり、SWX1X2X3X4X5X6QTRLからなり、X1、X2、X3、X4、X5、及びX6のそれぞれは、任意のアミノ酸残基である(配列番号22);(D)第4の群では、MAST2結合ドメインは、サイズが12残基の配列からなり、その最初の2残基はSとWであり、またその最後の4残基は、Q、T、R、及びLであり、SWESHKSGGQTRL配列(配列番号19)から1つのアミノ酸残基が欠損することにより取得され得る;及び(E)第5の群では、MAST2結合ドメインは、サイズが13残基の配列からなり、その最初の2残基はSとWであり、またその最後の4残基は、Q、T、R、及びLであり、SWX1X2X3X4X5X6X7QTRLからなり、X1、X2、X3、X4、X5、X6、及びX7のそれぞれは、任意のアミノ酸残基である(配列番号23)。

本発明のニューロヴィータペプチド内のMAST2結合ドメインの上流にある結合ドメインの配列は、国際公開第2013/068430号の22〜24頁に開示され、前記用途と目的を同じくする任意の配列であり得る。特に、かかる配列は、20〜40個のアミノ酸残基、好ましくは25〜45個の残基、及び特に31個の残基を含み得る。特定の実施形態では、MAST2結合ドメインの上流にある細胞質ドメインの配列は、狂犬病ウイルスGタンパク質の細胞質ドメインのフラグメント、特に弱毒化狂犬病ウイルス系統に由来するGタンパク質の細胞質ドメインのフラグメント、又は強毒性狂犬病ウイルス系統に由来するGタンパク質の細胞質ドメインのフラグメント;より具体的には、MAST2結合ドメインの上流にある細胞質ドメインの配列は、上記で引用した公表文献に記載されるような下記の配列RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(配列番号17)、又はその変異体、特にRRVNRSEPTQLNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(配列番号18)からなる。

本発明のニューロヴィータポリペプチドの特別な例は下記からなる群の中から選択される:
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGQTRL(ニューロヴィータ1)(配列番号20);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGGQTRL(ニューロヴィータ2)(配列番号24);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQQTRL(ニューロヴィータ3)(配列番号7);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVATQQTRL(配列番号25);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVYTGQTRL(配列番号26);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHTGQTRL(配列番号27);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHTQQTRL(配列番号28);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVAGGQTRL(配列番号29);
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWAEAQHTQQTRL(配列番号30);及び
RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHASGGQTRL(配列番号31)。

特定の実施形態では、本発明のVHH含有ポリペプチドのニューロヴィータペプチドは、そのPDZ-BS配列(MAST2結合ドメインの最後の4アミノ酸残基)を欠損させることにより、不活性化させることができる。かかるニューロヴィータペプチドでは、生物活性が低下している、又は全く示さず、また本発明のVHH含有ポリペプチドにおいて、ニューロヴィータペプチドの特別な効果を試験するための対照として利用可能である。特定の不活性化ニューロヴィータペプチドとして、RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQ (配列番号9)の配列を備えたNV δ-PDZ-BSが挙げられる。

特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、タギングペプチドを更に含む、及び/又はVHHとエフェクターポリペプチドの間に特に挿入されたペプチドスペーサーを更に含む、及び/又はアフィニティーペプチドを更に含む。

本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドは、追加のペプチド、例えばタグ又はスペーサー等を含み得る。当業者は、特定の機能を有するペプチドを、本明細書に記載するターゲティングペプチド及び/又はエフェクターペプチドに付加して、VHH含有ポリペプチドに組み込むのが有利であり得ることを認識する。このようなものとして、例えば、スペーサーペプチド、タギングペプチド、及びアフィニティーペプチド(及びスペーサーペプチド及びタギングペプチド両方の特徴を有するペプチド)が該当する。本発明のVHH含有ポリペプチドは、1つ又は複数のかかるペプチドを含み得る。かかるペプチドは、当業者に周知されており、本明細書では短く触れるに過ぎない。当業者は、ペプチド、及び融合タンパク質におけるその位置の選択は、本発明における融合ポリペプチドの本質的な特性が有意に変化しないようになされるべきであると認識する。特に、pIは、好ましくは塩基性のままであるべきであり、可能な限り、追加のペプチドは、得られたポリペプチドのサイズ範囲に変化をもたらすべきでなく、またペプチドの付加は、得られたVHH含有ポリペプチドの凝集又は分離を引き起こす(例えば、特定の細胞組成に結合することにより)べきではない。

スペーサーペプチドは、通常、各ペプチド/ポリペプチドが他方とは独立して又は比較的独立して折り畳まれるのが可能となるように、すなわち、各ペプチド/ポリペプチドが、他方のペプチド/ポリペプチドと融合していないときのその立体構造と類似した立体構造を採ることが可能となるように、融合タンパク質の2つの定義されたペプチド又はポリペプチドの間にインターカレートされたいくつかのアミノ酸から構成される。スペーサーペプチドは、単一のアミノ酸、又は2、3、4、又は5個のアミノ酸、又は6〜10個のアミノ酸、又は11〜20個のアミノ酸のストレッチから構成される。

タギングペプチドは、融合ポリペプチドの精製及び/又は検出を促進するのに通常用いられる。場合によっては、タギングペプチドは、そのものにより検出可能である(例えば、GFP等の蛍光タグ)一方、その他の場合では、タギングペプチドは、検出可能な分子に特異的に結合する(次に、検出可能な分子は直接検出可能であり得る、例えば蛍光剤のように、又は検出可能な分子は、検出可能な分子がそれに特異的結合することにより検出可能である、すなわち分子のスキャフォールドが検出に必要とされ得る)ので、その検出が可能である。精製及び/又は間接的検出で用いられる場合には、かかるペプチドは、容易に利用可能な分子に対して高いアフィニティーを有するように通常設計される(又は見出される)。かかるペプチドは、多くの場合、ポリペプチドが、特に検出期間中に、何らかの交差反応を避けるのに用いられるように意図されている種とは無関係である種に由来する。タギングペプチドに結合する分子は、その検出可能性、及び/又は固定化の容易性、及び/又は精製プロセスにおける回収率から選択され得る。一般的なタギングペプチドとして、HA-タグ(ヒトインフルエンザ赤血球凝集素に由来する短いペプチド)、Flag-タグ、His-タグ(少なくとも6個のヒスチジン残基を含む)、及びストレプ-タグ(Strep-tag)(8個のアミノ酸を含み、市販のストレプ-タクチン及び抗体による結合が容易である)が挙げられる。特定の実施形態では、本発明のVHH含有ポリペプチドは、配列番号5の配列を備えたストレプ-タグを含み、特にVHHとC-末端側で融合し、特にVHHとエフェクターペプチドの間にインターカレートされる。

特定の実施形態では、従って、本発明は、配列番号1等のRDP配列、配列番号3等のVHH配列、配列番号5等のタグ配列、及び配列番号7等のニューロヴィータ配列の融合体を含むVHH含有ポリペプチドに関する。

特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号11又は配列番号45の配列を有する。

留意すべき点として、ペプチドの融合は、特に製造が容易という点において、いくつかの長所を呈するが、タギングペプチドの機能は、非ペプチド部分をポリペプチドに結合させることによっても取得可能であることが挙げられ、またかかる部分の利用は本明細書において検討されており、そして本発明は、かかる部分と結合したポリペプチドを含む。従って、用語「タグ」は、タギングペプチドの他に類似した機能を有する非ペプチド部分を含む。当業者は、用語「タグ」は、特にポリペプチドの文脈においては、「タギングペプチド」と解釈されるべきである一方、この用語が技術的に関連する文脈においては、「タギングペプチド」という場合、それは、非ペプチドタグを含むものと理解されなければならないことを認識する。

本発明のVHH及びVHH含有ポリペプチドの調製方法は、本明細書に開示されており、同方法は本発明の一部である。特定の実施形態では、本発明のVHHを製造する方法は、以下の工程を含む:
A - 特に本明細書で定義する配列番号3の配列を備えるVHH、若しくはその配列変異体、若しくはその一部分、又はかかるVHHをコードするポリヌクレオチドを取得する工程;
B - 塩基性のpIを有する前記VHHからなる又はそれを含むポリペプチド又はポリペプチドのサブセットを設計又は選択する工程、並びに任意選択で、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド[のサブセット]を設計又は取得する工程、及び/又は脳抗原のいずれも認識しない、又は脳タンパク質、特にヒト脳抗原及びタンパク質のいずれとも結合しないVHHを選択する工程;
C - BBBを横断して透過可能な前記VHHからなる又はそれを含むポリペプチド又はポリペプチドのサブセットを設計又は選択する工程、及び任意選択で、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド[のサブセット]を設計又は取得する工程。
工程B、及びCは、別途、異なる順序で実施可能である。

A - 本明細書で定義する配列番号3の配列を備えるVHH、若しくはその配列変異体、若しくはその一部分、又はかかるVHHをコードするポリヌクレオチドを取得する工程は、当業者にとって公知の方法により実現可能である。特定の実施形態では、かかるVHHを取得する工程は、下記の工程を含む:
- 前記cDNAをテンプレートとして用い、任意選択で例えばPCRプライマー内に所望の突然変異を導入することにより、前記フラグメント内に突然変異を導入して、配列番号4の配列を備えたcDNAを取得する工程、任意選択でフラグメント、特に前記cDNAの部分を含むPCRフラグメント、特に配列番号3の配列を備えたVHHのCDR領域を含む部分を取得する工程、
- 前記フラグメント、特にベクター内の、特に細菌内での発現に適するプラスミド内に、PCRフラグメントをクローニングする工程、任意選択でフレーム内の前記フラグメントを、ペプチド、例えば本明細書に記載するようなニューロン細胞標的ペプチド、エフェクターペプチド、及び/又はタギング/スペーサーペプチドをコードする核酸配列と共に融合させる工程;
- コードしたポリペプチド、特に融合ポリペプチドを、決定された細胞内で発現させる工程。

後続する選択工程が、いずれかの順序で実施され得る。コストを最低限に抑え、成功率を最大化する目的で、当業者は、より低スループットの工程の前により高スループットの選択工程を、通常実施すべきであり(各選択工程後、サブセットに含まれる可能性のあるクローンの数は減少する傾向を有するので)、また頻度がより低い特徴に関する選択工程は、より一般的な特徴に対する選択工程の前に実施されるべきである(稀な特徴について選択されたクローンを対象として一般的な特徴を見つける可能性の方が、その逆の可能性よりも高い)と認識する。あまり一般的でない特徴(又は選択があまり容易でない特徴)を見出す確率を上げるような、より一般的な特徴、又は選択がより容易な特徴について、最初に選択すべきである。従って、血液脳関門を横断する透過性について選択する前に、pIの選択を通常実施すべきであることは当業者にとって明白である。

また、本発明のVHH含有ポリペプチドは、関連性があり、明確に除外されなければ、記載されている方法において本発明のVHHを置き換えることが可能であることを繰り返しておかなければならない。特に、下記の選択工程は、VHHの代わりにVHH含有ポリペプチドに対しても実施可能である。選択工程は、かかるポリペプチドを調製する過程で、VHH及びVHH含有ポリペプチドの両方に対しても実施可能性である。特定の実施形態では、塩基性のpIを有するVHHのサブセットが選択され、次に本明細書に記載するVHH含有ポリペプチドのサブセットが調製されるが、サブセットのそれぞれは、好ましくは同一の追加ペプチド及び/又は修飾を有する選択されたVHHの1つを含み、そこで初めてBBBを横断して透過可能なVHH含有ポリペプチドを選択する工程が実施される。当業者は、脳抗原を認識しないVHHを選択する工程は、VHH単独(すなわち、別のペプチドと融合していない)で通常実施されること、及び修飾してもVHH含有ペプチド内のVHHが脳抗原を認識する能力が生み出される可能性は通常低いので、その他のペプチドの融合を含めた修飾後に反復する必要は通常はないことを認識する。対照的に、当業者は、BBBを横断して透過可能であるVHHを単独で選択する工程を含めることは有利であり得るが、但し、VHH含有ポリペプチドを生成するためにVHHを更に修飾すると、透過性に変化を及ぼす可能性があること、従ってこの工程は、VHH含有ポリペプチドについて有利に実施される(又は再実施される)が、VHHについて単独で選択を実施することも任意選択であると思われることを認識する。

B - 塩基性のpIを有する前記VHHからなる又はそれを含むポリペプチドを選択又は設計する工程は、前記VHH又はVHH含有ポリペプチドの配列からpIを計算することにより、又は等電点電気泳動法等のin vitro実験により実施可能である。当業者は、細菌中にin vitroで産生されたポリペプチドのpIを試験する方法を容易に導き出すことができる。しかし、好ましい方法は、ポリペプチドの配列に基づく。pIは、当業者にとって公知のアルゴリズム、例えばEuropean Bioinformatics Institute、Genome Campus、Hinxton、Cambridge CB10 1SD、英国から入手可能なEMBOSS iepソフトウェア、及び/又はSwiss Institute of Bioinformatics、Quartier Sorge - Batiment Genopode、1015 Lausanne、スイスから入手可能な、Expasyソフトウェアに由来するCompute pIツール等に基づき計算可能である。

脳抗原のいずれも、特にヒト脳抗原のいずれも認識しない、又は脳タンパク質のいずれとも、特にヒト脳タンパク質のいずれとも特異的に結合しないVHHを選択する工程は、当業者にとって公知の方法を用いて実施可能である。当業者が認識するように、ヒト脳抗原のいずれも認識しない、又はヒト脳タンパク質のいずれとも結合もしない抗原は、その他の起源のヒト細胞と対比したとき、脳内でもっぱら見出される、又は大半を占める抗原を認識する、又はタンパク質に結合するものとして理解され得る。特に、ヒト脳外部抗原を認識するVHHは、この定義に当てはまる可能性がある。そのような認識及び/又は結合が存在しないことは、有意な認識及び/又は結合が存在しない、すなわち当業者が生化学的に意味があると考える認識又は結合が存在しないこととして理解され得ることは、当業者にとってやはり明白である。特に、前記有意な認識及び/又は結合は、非脳起源の抗原又はタンパク質と比べた場合のものであってよく、これは、ヒト脳抗原/タンパク質の/それに対する特異的認識/結合として規定され得る。特定の実施形態では、特に本明細書に開示のウェスタンブロッティング手順を用い、また特にストレプタグと融合したVHHを用いて、特に脳-抗原特異的VHHが染色生成可能となるような条件においても、本発明のVHHは、全ヒト脳抽出物(Sg τ 4697)、マウス脳抽出物(Tg 4510)、及び/又はGFAPを用いたウェスタンブロッティングアッセイにおいて、特異的染色を生成しない。特定の実施形態では、特に本明細書に開示の条件において、脳抗原-特異的抗体が有意な染色を生成する条件においても、本発明のVHHは、Tg 4510マウス脳組織を用いた免疫組織化学アッセイにおいて、特異的染色を生成しない。特定の実施形態では、本発明のVHHは、上記したようなウェスタンブロッティング法によっても、又は免疫組織化学検査法によっても、特異的染色を生成しない。

C - BBBを横断して透過可能な前記VHHからなる又はそれを含むポリペプチドを選択又は設計する工程は、通常in vitro実験により最初に実施される。確かに、BBBを横断する透過性の予測を可能するような配列の特徴、又はその他の直接アクセス可能なポリペプチドに関するパラメーターは知られていないが、一方、in vivoでの直接試験は、倫理面及びコスト面に関して合理的でないと思われる。本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドの透過性について、試験を可能にする方法は、本発明のVHHの説明において上記した方法を含む。特に、このような方法は、本出願で開示する、BBBを横断した透過性を試験するための新規方法を含み、本発明者らにより開発され、また本明細書にも開示されている新規デバイスを利用する。この試験方法は、以下でより詳細に開示されるが、「本発明の試験方法」としてそれ自体、及び本発明のポリペプチドを調製する方法の特定の実施形態における工程として、いずれもそのまま本発明に含まれる。本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドを選択する際に、当業者は、本用途において方法を利用するためのガイダンスを見出す。特に、本発明のデバイスを用いる方法の特別な技術的特徴(実験条件を含む)は、下記の実施例セクションに開示されており、また本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドを調製する方法の好ましい実施形態を構成する。特に本発明のデバイスと類似した体裁を有する先行技術のデバイスに基づき、先行技術の方法を用いる際には、当業者は、類似した実験条件が、成功に導く可能性があることを認識し、またBBBを横断して透過可能なVHH又はVHH含有ポリペプチドを選択する工程を実施するために、本明細書の教示を使用する。

本発明は、本明細書に開示のポリペプチド及びその成分(VHH、ペプチド標的化分子、ニューロヴィータ、タグ、スペーサー)をコードするポリヌクレオチド、特に配列番号4の配列を備えるポリヌクレオチド又は前記配列の一部分とも関連する。

配列番号3の配列を備えたVHHをコードする核酸を取得する方法、並びに前記VHHの一部分をコードする核酸、前記VHHと少なくとも80%、90%、又は95%の同一性を有するVHH、前記VHH(本発明のVHH含有ポリペプチド)を含む融合タンパク質を取得する方法は、当業者にとって公知である。本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドをコードする前記核酸、及び前記核酸を取得する前記方法は、本発明に含まれる。特定の実施形態では、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドをコードする核酸は、
- 配列番号4の配列、又は本発明のVHHをコードする別の核酸の配列、
- 任意選択で、ニューロン細胞標的ペプチド、好ましくは配列番号2の配列をコードする核酸の配列、
- 任意選択で、タギングペプチドをコードする核酸の配列、好ましくは配列番号6の配列、
- 任意選択で、ニューロヴィータペプチドをコードする核酸の配列、好ましくは配列番号8の配列、又は国際公開第2013/068430号、特に32〜35頁に開示されるニューロヴィータペプチドをコードする核酸のいずれかの配列、又は好ましくは配列番号10の配列を備えた不活性化ニューロヴィータペプチドの配列、
を含む又はそれらからなる。

好ましい実施形態では、存在する場合には、ニューロン細胞標的ペプチドをコードする核酸は、VHHをコードする核酸の5'側にあり、及び/又は存在する場合には、ニューロヴィータペプチドをコードする核酸は、VHHをコードする核酸の3'側にある。好ましい実施形態では、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号4、配列番号12、配列番号14、配列番号16、又は配列番号46の配列なかから選択される配列を有する。特定の実施形態では、本発明のVHH含有ポリペプチドをコードする核酸は、天然に見出される核酸を除外する、特にラクダに見出される核酸、特にラクダから取得される、又は取得可能なVHHをコードする核酸からなる核酸を除外する。特定の実施形態では、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドをコードする核酸の配列は、VHHをコードする核酸の配列に付加して、少なくとも2個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも3個のヌクレオチド、及びより好ましくは少なくとも9、18、30、60、又は120個のヌクレオチドを含み、ラクダ及び/さもなければ天然には見出されない配列を形成する。特定の実施形態では、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドをコードする核酸の配列は、インフレーム、またVHHをコードする核酸の配列に隣接して、ラクダ及び/さもなければ天然には見出されない終止コドン形成配列を含み、特に天然起源のタンパク質と比較して、トランケーションされたタンパク質をコードするので、かかるラクダ又は天然の配列とは有意に及び/又は機能的に異なる。特定の実施形態では、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドをコードする核酸の配列は、そのコーディング配列内にラクダに見出されないコドンを含む。

また、本発明は、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターとも関連する。かかるベクターは、当業者にとって公知であり、細菌(大腸菌(E.coli)を含む)、又はその他の原核細胞若しくは細胞株、又は酵母菌、又はその他の真核細胞若しくは細胞株、特に哺乳動物の細胞若しくは細胞株において、VHH又はVHH含有ポリペプチドを発現させるのに要する発現ベクターを含み、また遺伝子工学を容易にするように設計された(例えば、クローニング及び/又は核酸、特にcDNA、ライブラリの維持を目的として、融合タンパク質をコードする核酸の生成を目的として最適化された…)、プラスミドやファージミドを含むクローニングベクターも含む。特に好ましい本発明のベクター(又は本発明のポリペプチドを生成する方法で用いられる)は、発現したタンパク質を細胞膜周辺腔内に誘導し、転位プロセス期間中に切り取られるompA等のペプチドシグナルを含むプラスミド、例えばIBA GmbH社、Rudolf-Wissell-Str. 28、D-37079 Goettingen、ドイツから入手可能なpASK-IBA2プラスミド等である。また、本発明のベクターは、レンチウイルスベクター等の、ウイルス由来のベクターを含む。特定の実施形態では、本発明のVHHをコードする核酸を含むベクターは、ラクダから取得される又は取得可能なVHHをコードするファージミドベクターを除外する。

本発明は、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドを含む細胞及び細胞株、かかるポリペプチドをコードする本発明の核酸、又はかかる核酸を含む本発明のベクターとも関連する。このような細胞は、細菌(大腸菌を含む)、又はその他の原核細胞若しくは細胞株、又は酵母菌、又はその他の真核細胞若しくは細胞株、特に哺乳動物細胞若しくは細胞株の群の中から選択され得る。

また本発明は、下記の化合物、すなわち本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする本発明の核酸、かかる核酸を含む本発明のベクター、及び/又はかかるポリペプチド、核酸及び/又はベクターを含む本発明の細胞若しくは細胞株のいずれかを含む組成物とも関連する。多数の異なるVHH又はVHHをコードする配列を含む組成物は、特に前記VHHの一部分が、本発明のVHHの特性を有さないときには、本発明の技術的効果を担持しない可能性がある。従って、特定の実施形態では、本発明の組成物は、限定された数の異なるVHH又はVHH含有ポリペプチド、及び/又は限定された数の異なるVHHをコードする核酸を含み、この場合、限定された数は、100個以下、好ましくは20個又は10個以下、及びなおいっそうより好ましくは5、4、3、2、又は1個以下である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチドを含み、及び1、2、3、4、又は5個以下の異なるVHH及び/又はVHH含有ポリペプチドを含む溶液である。引用される化合物は、組成物内のin vivo投与に適する生理学的に許容される媒体と会合している。

また本発明は、下記の化合物、すなわち本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする本発明の核酸、かかる核酸を含む本発明のベクター、及び/又はかかるポリペプチド、核酸、及び/又はベクターを含む本発明の細胞若しくは細胞株のいずれかを含む、in vivo投与、特に静脈内注射又は点眼に適する医薬組成物とも関連し、この場合、前記化合物は、薬学的に許容されるアジュバント、及び/又は溶媒、及び/又は担体と会合している。In vivo投与に適する組成物は、当業者にとって公知の方法により調製され得る。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、注射液又は点眼液である。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、VHH又はVHH含有ポリペプチドを有効成分として含み、この場合、VHHは、好ましくは配列番号3の配列、好ましくは配列番号7の配列を備え、前記VHHとC-末端側で融合したニューロヴィータペプチドを有する。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、VHH、ニューロヴィータペプチド、好ましくは配列番号1又は配列番号32の配列を備え、前記VHHとN-末端側で融合したニューロン細胞標的ペプチドを含むVHH含有ポリペプチドを有効成分として含む。

また本発明は、下記の化合物、すなわち本発明のVHH又はVHH含有ポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする核酸、かかる核酸を含むベクター、かかるポリペプチド、核酸、及び/又はベクターを含む細胞若しくは細胞株、又は前記ポリペプチド、核酸、ベクター、及び/又は細胞若しくは細胞株を含む医薬組成物等のいずれかからなる薬剤(「本発明の薬剤」と呼ぶ)とも関連し、この場合、本発明の前記薬剤は、薬剤として、及び/又は薬剤の調製において用いられる。また本発明は、本発明の薬剤を用いて治療する方法であって、それを必要としている宿主、特にヒト患者を治療する方法も含む。特定の実施形態では、本発明で用いられるVHH含有ポリペプチドは、好ましくは配列番号3の配列を備えたVHH、好ましくは配列番号7の配列を備え、前記VHHとC-末端側で融合しているニューロヴィータペプチドを含む。好ましい実施形態では、本発明で用いられるVHH含有ポリペプチドは、VHH、ニューロヴィータペプチド、好ましくは配列番号1又は配列番号32の配列を備え、前記VHHとN-末端側で融合したニューロン細胞標的ペプチドを含む。

特定の実施形態では、本発明の治療法は、本発明の薬剤を経静脈的に注射する工程を含み、及び/又は薬剤は静脈内注射用である。特定の実施形態では、本発明の治療は、眼内に薬剤を投与(点眼)する工程を含み、及び/又は薬剤は、点眼薬として提供される。特定の実施形態では、本発明の薬剤は、ヒト対象の治療で(又はそのための薬剤の調製用として)用いられる。特定の実施形態では、本発明の薬剤は、有利な及び/又は治療上の効果を脳細胞に対して有する。特定の実施形態では、本発明の薬剤は、CNS又は脳の疾患若しくは状態の治療において使用するため、及び/又はそれらの治療用の薬剤の調製のためのものである。検討される特定の疾患として、神経疾患、特に神経変性疾患が挙げられる。検討される特定の状態として、外因性又は内因性の(個人に対する)要因により誘発された脳卒中、傷害、緑内障、外傷又は病変が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の薬剤は、好ましくは配列番号3の配列を備えたVHH、好ましくは配列番号7の配列を備え、前記VHHとC-末端側で融合したニューロヴィータペプチド、及び任意選択で好ましくは配列番号1又は配列番号32の配列を備え、前記VHHとN-末端側で融合したニューロン細胞標的ペプチドを含む又はそれらからなるVHH含有ポリペプチドを含み、また前記薬剤は、神経疾患、特に神経変性疾患、又は脳卒中、緑内障、外傷、傷害若しくは病変の治療で(又はそのための薬剤の調製用として)用いられる。

更に、特に治療用途で用いられるラクダ抗体、及びその修飾体の製造に関する教示は、Harmsen及びDe Haard、2007年に開示されている。

デバイスは、内皮細胞の1つ又は複数のコンフルエントな層、好ましくは単層を含む細胞培養に適する容器からなる又はそれを含み、前記単層は、細胞培養容器を2つのコンパートメントに分離するという点において、本発明のデバイスは、先行技術、例えばWekslerら、2005年、米国特許第8,084,254 B2号、及び国際公開第2006/056879号で開示されるデバイスの体裁と類似している。先行技術のデバイスとは対照的に、本発明のデバイスは、同デバイスが、コンパートメントの1つに、ミクログリア細胞を含め、ヒト起源の細胞を含むという点において特徴づけられる血液脳関門in vitroモデルである。デバイス内に含まれる細胞は、好ましくはすべてヒト細胞である。少なくともデバイスの細胞の一部、特に内皮細胞は、好ましくは不死化細胞である。好ましくは、デバイスの細胞は、すべてヒト不死化細胞である。

本明細書で用いる場合、「ヒト細胞」とは、ヒト起源、すなわちヒトで当初見出された細胞に由来する細胞を指す。好ましい実施形態では、細胞は、ヒトの直接サンプリングにより取得されない。むしろ、ヒトからサンプリングされた細胞は、試験にとって十分な数、及び十分に均質な状態を含め、in vitro試験に適した、細胞の生成を可能にする条件で培養され、ヒトに見出される細胞のほとんどの特質を共有し、その特質のなかでも特に、ゲノムDNAは、ヒトゲノムDNAに見出される配列からなる又は実質的に構成される。従って、「ヒト細胞」は、ヒトを対象に、場合によっては選択プロセス後に、直接サンプリングされた細胞から得られる不死化細胞を指すこともある。「ヒト細胞」は、当業者にとって公知の技法により取得された多能性及び/又は未分化細胞を含め、ヒト胚性幹細胞、ヒト成人幹細胞であるかを問わず、幹細胞の培養及び/又は分化から得られた細胞を指す場合もある。特定の実施形態では、デバイスの細胞の提供は、ヒトを対象としたin vivo手順を含まない。特定の実施形態では、デバイスの細胞は、ヒト胚の破壊を通じて得られない。同様に、「脳細胞」とは、脳起源の細胞を指し、すなわち脳組織から得られたサンプルの細胞に由来し、また脳に見出される細胞と本質的な特質を共有する。

細胞培養用の容器は、例えば細胞培養チューブ、バイアル、若しくはフラスコ、又は好ましくは、細胞培養用のマルチウェルプレート、特に12ウェル及び24ウェルプレートのウェルであり得る。特定の実施形態では、本発明のデバイスは、細胞培養用のマルチウェルプレート、好ましくは12ウェル又は24ウェルプレートを含み、各ウェルは容器を構成するが(内皮細胞の層により分離した2つのコンパートメントを備え、一方のコンパートメントはミクログリア細胞を含む)、かかるデバイスは、別々の実験の同時実施を可能にする。容器は、好ましくは接着細胞の培養で用いられる従来型のコーティング物、好ましくはポリ-D-リジン-ラミニンでコーティングされる。

細胞の単層は、液体及び高分子にとって透過可能である物理的基材、例えば細胞培養に適するフィルター上で増殖可能である。そのようなフィルター上で細胞を増殖させると、細胞の層が細胞培養容器を2つのコンパートメントに分離するように、該細胞の層を配置することが可能になる。細胞層はBBBを模倣するように意図されているので、コンパートメントの一方は脳に対応し、他方のコンパートメントは、全身的な血流に対応する。前者は、本明細書では「脳コンパートメント」と呼ばれる場合があり、一方後者は「注入コンパートメント」と呼ばれる。用語「注入コンパートメント」は、単純化する目的で用いられ、デバイス又はその使用を、試験物質が前記コンパートメント内にアプライされる用途に限定するつもりはなく、状況によっては、試験物質を脳コンパートメント内にアプライすることが好ましい場合もある。

デバイス内に分離層を形成する内皮細胞は、好ましくはヒト細胞、好ましくは不死化ヒト細胞である。特定の実施形態では、分離層を形成する内皮細胞は、不死化ヒト脳血管内皮細胞である。

特に、かかる細胞は、Wekslerら、2005年の記載に従い、ヒト脳微小血管内皮細胞の不死化により取得可能であり、及び/又は前記公表文献で開示されるhCMEC/D3細胞株に類似した特徴を有する、又は内皮細胞は、hCMEC/D3細胞株に由来し得る。或いは、その他のヒト不死化BBB内皮細胞株、例えばhBMEC、TY10、及びBB19等も利用可能である。分離層は、好ましくは単層であり、またコンフルエントである、すなわち(単)層内の細胞間に空間が存在しない。細胞のコンフルエントな層を調製するために、細胞は、コンフルエンスに必要とされる数よりも少ない数で通常播種されるべきであり、そしてコンフルエンスに達するまで、通常数日間増殖させる。細胞の層は、コンパートメント間の分離が、高分子の受動的拡散に対して不透過性であるように、及び/又は一方のコンパートメントから他方に輸送される分子は、いずれも細胞層を通過しなければならないように配置される。

本発明のデバイス内のミクログリア細胞は、脳コンパートメント内に存在する。前記細胞は、好ましくはヒト細胞、好ましくはヒト不死化細胞である。かかる細胞は、CHME-5細胞又はSV40のT抗原によるヒト胎児ミクログリアの不死化により取得された細胞と類似する細胞(例えばPeudenierら、1991年の記載に従い)からなる可能性がある。或いは、初代細胞が利用可能である(例えばScienCell社、6076 Corte Del Cedro、Carlsbad、California-92011、米国から市販されている)。脳コンパートメント内の細胞は、分離層を形成する内皮細胞と接触を持たない場合もあれば、前記層と接触した状態で培養される場合もある。特定の実施形態によれば、内皮細胞とミクログリア細胞は接触状態になく、そのコンパートメント内では、ミクログリア細胞は内皮細胞とは反対側に配置される。

デバイスの脳コンパートメントは、ミクログリア細胞に付加してその他の細胞型を含み得る。追加の細胞は、好ましくはヒト細胞、好ましくはヒト不死化細胞、又はヒト不死化細胞から得られた細胞である。特に、その他の細胞型、例えばその他の脳細胞、特にニューロン若しくはアストロサイト、又はその両方等は、脳コンパートメント内に存在し得る。ヒトニューロン及びアストロサイトは、PaquetDurandら、2003年、Sandhuら、2003年、及び実施例セクションに記載されているように、Ntera-2clD/1細胞(ATCCから入手可能、CRL-1973を参照)の分化により取得され得る。或いは、初代細胞が利用可能である。

代替的な細胞源であるSK-N-SH D細胞は、特に本発明のデバイスの製造用として、本明細書で開示される。この細胞は、神経芽細胞腫細胞株SK-N-SH(ATCC HTB-11)から単離されたクローンであるが、特にEndoGRO(商標)培地(EndoGRO(商標)-LS #SCME 001、又はEndoGRO(商標)-MV #SCME004;メルク-ミリポア社、フランス)内で培養すると、ニューロン細胞の特徴を獲得する一方、DMEM Glutamax-I-High Glucose-Na Pyr等の従来型の細胞培養培地内でルーチン的に増殖させて維持される。かかる細胞は、従って増殖させ、維持するのに好都合であり、またEndoGRO(商標)等のふさわしい分化培地内に移すことにより、短時間でニューロン細胞に分化し得るが、この分化培地は、本モデルのインキュベーション培地としても利用可能である。従って、本発明は、CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes、Institut Pasteur、Paris、フランス)に2015年9月4日付けで、番号CNCM I-5010として預託されたSK-N-SHD細胞株を提供する。この細胞は、例えば薬理学的化合物が前記細胞に及ぼす効果をアッセイするためのニューロン細胞モデルとして、特に用いられるように提供される。より具体的には、この細胞は、本発明のデバイスの製造で用いられる、特に脳コンパートメント内播種用として提供される。本明細書に開示する実施形態のいずれにおいても、本発明のデバイスは、その脳コンパートメント内にSK-N-SH D細胞を含み得る。

当技術分野では、BBBモデルの脳コンパートメント内でミクログリア細胞を使用するのは、特にその炎症的性質及びそのBBB破壊能力(例えば、Carvalho da Fonsecaら、2014年を参照)に起因して通常避けられる。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、本発明のデバイスは、脳コンパートメント内にミクログリア細胞を15%以上、また24%以上をも含み得る(又は播種し得る)が、BBBとしてのその機能に有意な障害一切もたらさないことを明らかにした。特に、1.5%〜24%のミクログリア細胞を播種した本発明のBBBモデルは機能的であることが明らかにされた。ミクログリア細胞の割合が80%以上であるようなモデルであっても、完全に機能的である。

脳内では、ミクログリア細胞は、特に脳の領域に応じて(Kettenmann及びRansom、2012年)、細胞の1.5%〜24%を占め、また本発明のデバイスは、脳コンパートメントの総細胞含有量に対して、ミクログリア細胞が1.5%又は24%を占めても機能的であることが明らかにされている。脳コンパートメント内に細胞を播種する際には、この段階において、細胞をトリプシン処理して、これを細胞培養物から回収し、それを播種する必要があるので、細胞の定量及び混合が、好ましくは実施される。しかし、細胞の播種からデバイスの実験使用までの期間中に、少量の細胞分裂又は細胞死が生ずると予想されるので、播種時に規定される比は、デバイス内の最終比に極めて近い場合もあれば、過小評価される場合もある。

特定の実施形態では、ミクログリア細胞は、前記コンパートメント内の細胞の1.5%を占める。特定の実施形態では、ミクログリア細胞は、前記コンパートメント内の細胞の24%を占める。別の特定の実施形態では、ミクログリア細胞は、前記コンパートメント内の細胞の15%を占める。特定の実施形態では、ミクログリア細胞は、前記コンパートメント内の細胞の1.5%〜15%、1.5%〜24%、又は5%〜20%、又は10%〜20%を占める。特定の実施形態では、ミクログリア細胞は、脳コンパートメント内の細胞の1.5%〜5%又は20%〜24%を占める。

当業者は、脳コンパートメント内のミクログリア細胞の比は、細胞は前記コンパートメント内で増殖するので、特に異なる種類の細胞は、異なる増殖率及び/又は生存率を有し得るので変化し得ると認識する。特定の実施形態では、本発明のデバイスは、細胞添加時に、上記比のミクログリア細胞を脳コンパートメント内に含有する(換言すれば、本発明のデバイスの脳コンパートメントは、総細胞含有量に対して上記で開示した比で、ミクログリア細胞を含む細胞を用いて播種される)。特定の実施形態では、本発明のデバイスがアッセイで用いられるとき、ミクログリア細胞の比は、脳コンパートメント内において24%以上、50%以上、75%以上である。比は、アッセイ開始時に測定可能であり、及び/又は比は、アッセイ終了時にアッセイ可能である。好ましくは、比は、アッセイの全期間を通じて、10%〜100%、15%〜100%、24%〜100%、50%〜100%、70%〜100%、又は80%〜100%の範囲に収まる。特定の好ましい実施形態では、脳コンパートメント内のミクログリア細胞は、15%の比でデバイスに播種されるが、この比は、播種後2日目には80%又はそれ以上である。

一般的に言うと、本発明のデバイスを調製するのに必要とされる細胞の培養、操作、及び維持する方法は当業者にとって当たり前である。しかし、特に、hCMEC/D3等の内皮細胞とCHME等のミクログリア細胞との同時培養は、先行技術においていまだ実現されておらず、本発明者らは、特別な培養条件を開発した。特定の実施形態では、本発明のデバイスの細胞は、ウシ胎仔血清、ヒドロコルチゾン、bFGF、アスコルビン酸、化学的に定義された脂質、HEPES、及び任意選択でペニシリン-ストレプトマイシンが、好ましくは実施例セクションで開示される量とは有意に異ならない、特に50%を超えて異ならない、好ましくは25%、10%、好ましくは5%を超えて異ならない量で補充されたEBM-2を含む細胞培養培地内にある(又は細胞培養容器はかかる細胞培養培地を含有する)。特定の実施形態では、本発明のデバイスの脳若しくは注入コンパートメント、又は両コンパートメントは、EndoGRO(商標)-LC、又はEndoGRO(商標)-MV(メルク-ミリポア社、フランス)培地、又はSK-N-SHD細胞がニューロン細胞に分化するのに適する任意の培地を含む。好ましい実施形態では、両コンパートメントは、同一の培養培地を含む。細胞培養及び操作に関する追加のガイダンスは、本明細書で引用する公表文献、及び実施例セクションにおいて見出され得る。実施例セクションで開示される特別な技術的特徴及び実験条件は、デバイスを調製する方法の、及び/又は本発明のデバイスの好ましい実施形態を定義する。

特定の実施形態では、ミクログリア細胞(及び場合によってはその他の脳細胞)は、内皮細胞の単層及び/又はかかる細胞が播種されるフィルターと接触しない、又は前記細胞又はフィルター近傍に存在しない。

別の実施形態では、ミクログリア細胞は、内皮細胞及び/又はフィルターの下に配置される、或いはその近傍に配置される。

本発明のデバイスの調製方法は、本発明に含まれる。前記方法は、
- 内皮細胞、好ましくはヒト不死化脳内皮細胞を取得する工程、
- 前記内皮細胞を、細胞培養に適するフィルター上に播種する工程、及び次に
- 前記細胞を、前記フィルター上でコンフルエンスになるまで増殖させる工程、
の各工程と、
- ミクログリア細胞、好ましくはヒト不死化ミクログリア細胞を取得する工程、
- 任意選択で、その他の脳細胞、特にニューロン及び/又はアストロサイト、特にヒト不死化脳細胞の分化により取得されたニューロン及びアストロサイト、特にNtera-2clD/1及び/又はSK-N-SHD細胞を取得する工程、
- 前記ミクログリア細胞を、任意選択で他の脳細胞と共に細胞培養に適する容器内に播種し、好ましくは前記容器を上記のように補充されたEBM-2培地で充填する工程
の各工程と、
- 内皮細胞のコンフルエントな層を担持するフィルターを、ミクログリア細胞を播種した容器内に提供する、特に移動する工程、
- 前記フィルターが前記容器を2つのコンパートメントに分離するように、前記フィルターを配置する工程、
- ミクログリア細胞、及び任意選択でその他の細胞、特にその他の脳細胞を、容器内でそのように得られたコンパートメントの一方に提供する工程
の各工程を通常含む。

本発明のデバイスの使用は、本発明に含まれる。かかる使用は、ヒトBBBの挙動を模倣するin vitroデバイス(本明細書で用いる場合「BBBのin vitroモデル」)が利用可能であることが有利あり得ると考えられるような任意の方法を含む。かかる使用は、当業者には公知であり、特に脳の疾患又は状態の治療で用いられるように意図された薬物又は薬物候補、及び脳を含む診断手技、例えば脳イメージング手技で用いられるように意図された薬物又は物質に関する薬物開発の分野において一般的である。従って、本発明は、特にBBBを横断した分子が、ミクログリア、ニューロン、又はアストロサイト等のその他の脳実質細胞を標的とする能力を試験するための、BBBのin vitroモデルとしての本発明のデバイスの使用を含む。特定の実施形態は、試験方法、特に試験物質のBBBを横断する透過性を試験する方法、及び試験物質のBBBに対する毒性を試験する方法であり、試験物質を本発明のデバイスの細胞培養容器にアプライする工程、及び/又はデバイスの容器内で前記試験物質をインキュベートする工程、及び前記試験物質がBBBを透過するか、及び/又はBBBに対して毒性効果を有するか、及び/又は脳コンパートメントの特定の細胞を標的とするか判断する工程を含む。

試験物質は、当業者にとって明白であるように、あらゆる物質、特にin vivoで使用するように意図された物質(特にヒト以外の哺乳動物及び/又はヒトを対象として)、特に薬物又は診断薬として使用するために開発された物質であり得る。デバイスにアプライされ得る試験物質の量は、試験方法の目的に依存する。特に、一般的な実験条件では、透過性物質の一部分のみがBBBを横断して通常透過するので、BBBを横断する前記物質の透過性に関する試験方法では、最初にアプライされる量は、前記量の一部分(好ましくは0.1%を超える、より好ましくは0.5%、1%、2.5%、又は5%を超える、及びなおいっそうより好ましくは10%を超える)が、この物質を検出するのに利用可能な方法によって容易に検出可能な量であるべきである。一方、物質の量が非常に多量であると、しかるべき量の物質を用いた際には生物学的又は生理学的な関連性を有さないが大量に存在した場合には無視できなくなってしまう望ましくない効果を引き起こす可能性があり、これには、物質がBBBを透過するのを可能にする細胞輸送機構の飽和、又は細胞若しくは細胞外成分に対する物質の非特異的結合又は低アフィニティー結合に起因する効果が含まれる。

例えば、透過性を試験する場合、12-ウェルプレートに基づく本発明のデバイスのウェル内にアプライされるタンパク質の代表的な量は、0.1pgに等しい又はそれ以上、好ましくは1pg、2pg、又は5pgに等しい又はそれ以上、より好ましくは10pgに等しい又はそれ以上、及び10mg、1mg、100μg、10μg又は1μg未満、好ましくは100ng、10ng、又は1ng未満である。

毒性を試験する際には、当業者は、アプライされる試験物質の量は、前記物質の意図された用途においてBBBが曝露されると予想される前記物質の量の少なくとも最高量を通常反映すべきであると認識する。例えば、脳作用性薬(brain-acting drug)を試験する際には、毒性を有さないことが明らかになった際に、治療上有効な量の物質は、BBBに対して毒性を有さないと、該試験について結論付けることを可能にするために、最大治療効果を発揮すると期待される量よりも有意に高い量で、BBBに対する毒性を試験すべきである。物質が、その透過性の試験を含め、実験目的で用いられるように意図されている場合、透過性試験で用いられるように意図された最大量よりも多い量であらかじめ毒性について試験すれば、毒性試験で無毒性が明白な場合には、透過性試験の結果は毒性効果と無関係であると結論付けることができる、ということも成り立つ。一般的に、毒性試験においてアプライされる物質の量は、透過性試験においてアプライされる又はアプライされるように意図された物質の最大量の10倍、5倍、2倍、又は1倍である。特定の実施形態では、本発明の試験法は、試験物質のBBBに対する毒性を試験する方法についていくつかの工程、及び前記試験物質のBBBを横断する透過性を試験する方法についていくつかの工程を含み、この場合、透過性試験における量と比較して、少なくとも同一量、好ましくは少なくとも2倍又は5倍、及びより好ましくは少なくとも10倍量の前記試験物質が、毒性試験において本発明のデバイスにアプライされる。

BBBを横断する試験物質の透過性(又はBBBを横断する試験物質の能力)を試験する工程は、試験物質が当初アプライされなかったコンパートメント(「‘トランス'コンパートメント」)、特にミクログリア細胞を含むコンパートメント又は脳コンパートメントにおいて、前記試験物質の有無を判断する工程を含む。コンパートメント内に試験物質をアプライしたときから、他方のコンパートメント内でその有無を判断するまでの間に、しかるべき時間が通常置かれる。代表的な試験時間は、好ましくは10分〜4時間、好ましくは10分、30分、45分、1時間、90分、2時間、3時間、又は4時間の範囲である。好ましい実施形態では、方法は、前記試験物質の全身的血流から脳への透過性を試験する工程に関し、従って試験物質は、注入コンパートメント(すなわち、ミクログリア細胞を含まないコンパートメント)内に最初にアプライされ、その有無が脳コンパートメント内で検出される。

試験物質の有無を判断する工程は、'トランス'コンパートメント内の前記物質の量の定量と関係する場合もあれば、しない場合もある。前記判断は、'トランス'コンパートメントにおいてin situで実施され得る、すなわち'トランス'コンパートメントの内容物、又は前記内容物の一部分は、後続する検出/定量工程のために、前記コンパートメント内に留めたままにする。或いは、前記判断は、前記コンパートメントの内容物又は前記内容物のサンプルの回収後に実施され得るが、前記回収は、後続する検出/定量工程のために、ピペッティングする工程及び/又は吸引する工程、及び/さもなければ前記コンパートメント内の液体媒体を回収する工程、及び/又は前記培地内で懸濁状態の細胞を回収する工程、及び/又は特に、トリプシン処理により接着細胞を前記コンパートメントから回収する工程、及び試験管等の分離容器内の前記培地及び/又は細胞を移す工程を含む又はそれらからなる。特定の実施形態では、'トランス'コンパートメント内で前記試験物質の有無を判断する工程は、'トランス'コンパートメントについて、又はその内容物若しくは前記内容物のサンプルについて、有意な量の前記試験物質を検出する(但し、有意でない量は検出しない)方法、好ましくは非痕跡量の前記試験物質を検出する(但し、痕跡量は検出しない)方法を実施する工程、及び前記方法により、'トランス'コンパートメント内で前記試験物質が検出されるか又はされないか、その検出を判断する工程を含む。これらの実施形態では、試験物質が'トランス'コンパートメント内で検出される場合には、前記試験物質はBBBを横断して透過可能であり、またその逆も真であるという結論が、該方法から導かれる。

非痕跡量(及び/又は有意な量)の検出を可能にし、また痕跡量(及び/又は有意でない量)の検出は可能にしない方法として、特に免疫組織化学検査法、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ウェスタンブロッティング法、ラジオイムノアッセイ法、核酸の場合にはPCR法等が挙げられる。当業者は、従来方式の分子生物学検出法のほとんどは、該当分野の一般的知識を通じて採用されれば、痕跡量(及び/又は有意でない量)は通常検出されることなく、非痕跡量(及び/又は有意な量)の試験物質を検出し得ると認識する。しかし、極めて高感度な方法、例えばマススペクトロメトリー又は、核酸の場合はPCR等、及び関連する方法、特にネスト化PCR、及び微量の核酸を成功裏に増幅することが知られているその他の方法は、痕跡量の検出を引き起こすおそれがあり、当業者は、かかる方法は、決して低くはない量的閾値を検出用に設けたとしても、実際には透過性ではないのに、物質が透過性であると結論付けてしまうおそれがあると認識する。また、これは、痕跡量の例えばタンパク質を検出するために最適化された一部のELISAアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法等にも当てはまる。

特定の実施形態では、'トランス'コンパートメント内で前記試験物質の有無を判断する工程は、'トランス'コンパートメント、又はその内容物、又は前記内容物のサンプルについて、前記試験物質の量の定量を可能にする方法を実施する工程を含む。かかる実施形態では、定量は、好ましくは同一の方法を用いて、最初にアプライされた試験物質の量を測定するために、通常試験物質を本発明のデバイスにアプライする前に実施可能であり、及び/又は定量は、好ましくは同一の方法を用いて、試験物質が最初に注入されたコンパートメント内に残留する試験物質の量を測定するために実施可能である。量の正確な測定法が、いくつかの方法を通じて取得可能である場合、同一の方法を、異なる分画を定量化するのに用いる必要はない。少なくとも1つの分画において、試験物質量の測定が正確かどうか判断する適した方法が利用できない、又は実行可能でない場合には、できる限り正確に相対的な量を見積もるために、同一の方法が、好ましくはすべての分画において用いられる。

かかる実施形態では、BBBを横断して透過した物質の量は、最初に注入した物質の量又は透過しなかった物質の量と関連する相対的な用語で表され得る。これらの量のうちの2つが求まれば、検出可能な物質の総量が、例えば分解又は増幅によりインキュベーション期間中に変化しない限り、3番目は、容易に計算可能であり、またその両方の比も容易に計算される。推定値のみが確定可能な場合には、最初に注入した物質に対する透過した物質の比が、「少なくともx%」として表すことができるように、最初に注入した物質の量を多めに見積もり、また透過した物質の量を少な目に評価するのが通常好ましい。かかる実施形態から、前記物質の最初に注入した量の少なくとも0.1%、0.2%、又は0.5%が、しかるべき時間内に分離層を横断して透過した場合、好ましくは前記物質の少なくとも1%、2%、又は3%が透過した場合、より好ましくは前記物質の少なくとも5%、10%、又は20%が透過した場合には、試験物質はBBBを横断して透過可能であるという結論が導かれる。試験物質の定量を可能にする方法は、当業者にとって公知であり、ウェスタンブロッティング法、ラジオイムノアッセイ法、定量的ELISA、核酸の場合はqPCR又は半定量的PCR法、蛍光活性化細胞選別(FACS)等が該当する。

'トランス'コンパートメント内の試験物質の有無を判断する工程は、特に前記物質が注入コンパートメント内にアプライされる場合、前記コンパートメントのどの部位に物質が見出されるか、その場所を判断する工程を更に含み得る。部位とは、ここでは広い意味合いで用いられ、あらゆる特定の場所、又は場所の種類、又は環境、又は記載可能な機能的実体の意味を有し、例えば「細胞培養容器の表面(又は分子コーティング物)に吸着した」、「培地内の溶液に含まれる」、「[所与の細胞型の]細胞表面に結合した」、「所与の細胞コンパートメント、例えばリソゾーム内の」、「所与のタンパク質を含有する複合体内の」物質の物理化学的状態等を場合によっては含む。特定の実施形態では、方法は、前記試験物質が所与の細胞型と会合しているか、特に前記細胞型、特に脳コンパートメントの細胞型の細胞表面に内部移行している、及び/又はそれに結合しているどうか判断する追加工程を含む。特定の実施形態では、方法は、物質が所与の細胞型を標的とするか、すなわち前記細胞型と会合しているか、またコンパートメント内のその他の細胞とは会合していない又は有意に会合の程度が低いかどうかを、免疫組織化学検査により判断する工程を含む。試験物質が見出される部位の判断を可能にする方法は、当業者にとって公知であり、顕微鏡検査に基づく方法(特に免疫組織化学検査、蛍光顕微鏡検査、共焦点顕微鏡検査、電子顕微鏡検査等)、細胞の破壊を伴う、特定の細胞コンパートメントとの会合を判断する方法、例えば前記コンパートメントを分離するための細胞分画法及び/又はグラジエント遠心分離法等、多タンパク質複合体内のあるタンパク質の有無を判断する方法、例えば免疫沈降法等が挙げられる。

BBBに対する試験物質の毒性を試験する工程は、試験物質が、デバイスの分離層を構成する内皮細胞に対して毒性効果を有するか、その有無を判断する工程を含む。別の実施形態では、BBBに対する試験物質の毒性を試験する工程は、試験物質が、容器内に存在するその他の脳細胞に対して毒性効果を有するか、その有無を判断する工程を含む。前記物質は、注入コンパートメント、及び/又は脳コンパートメントにアプライされ、また毒性効果の判断は、試験物質を所定時間インキュベートした後に通常実施される。かかる方法の代表的なインキュベーション時間は、好ましくは2時間〜7日間、より好ましくは6時間〜4日間の範囲である。インキュベーション時間は、好ましくは1時間に等しい又はそれより長い、より好ましくは2時間又は4時間に等しい又はそれより長い、及びより好ましくは6時間又は12時間に等しい又はそれより長い。インキュベーション時間は、好ましくは7日間に等しい又はそれより短い、より好ましくは6日間又は5日間に等しい又はそれより短い、及びなおいっそうより好ましくは4日間、3日間、又は2日間に等しい又はそれより短い。毒性効果は、インキュベートしなかった細胞、又は同等の実験条件でインキュベートしたが、試験物質をアプライしなかった(又はBBBに対して毒性効果を有さないコントロール物質をアプライした)細胞と比較して、細胞に生存率の低下が認められる場合に検出され得る。細胞生存率は、当業者にとって公知の方法を用いて測定可能である。毒性効果を検出するその他の方法も当業者にとって公知であり、細胞死又はアポトーシスのマーカー、例えばタンパク質、及び/又は細胞死若しくはアポトーシスを経た細胞内に発現され、生存細胞では発現されない(又は生存細胞の場合よりも多量に発現される)遺伝子等を検出及び/又は定量する工程が挙げられる。

デバイスの内皮細胞又はその他の脳細胞に対する試験物質の毒性効果の存否を試験する方法について詳細に記載されるが、類似した方法が、デバイスの前記細胞及び/又はその他の細胞、特に脳コンパートメントの細胞に対して、試験物質が与えるその他の生物学的効果について試験するのに適用される。

(実施例1)
VHH及びVHH含有ポリペプチドの配列。
VHH A12と命名された、配列番号3の配列を備えるVHHは、VHH免疫ライブラリから選択された。VHH免疫ライブラリは、1997年にGhahroudiらが記載するように、依然に構築されていた。アルパカ1頭を、アルツハイマー病患者から単離されたヒト脳海馬抽出物で免疫化した。この抽出物は、異なるタンパク質を含有する。循環性Bリンパ球から抽出されたmRNAを逆転写した。従来型の抗体ではなく、VHHのみをコーディングするcDNAを選択するために、mRNAをFR1及びCH2領域に相補的なプライマーを活用して増幅した。VHH配列を、ファージ外被タンパク質III(pIII)と融合した状態で、ファージミドpHEN1にクローン化し、そして該ファージミドを用いて病原性大腸菌TG1を形質転換した。組換えVHHの発現を、IPTGで誘発した。ファージディスプレー技術によりパニングした後、個々のコロニーを選択、培養し、試験した。特定のVHHを選択したら、細菌培養物について、NcoI及びNotIにより、37℃で3時間、消化工程を実施した。消化生成物をアガロースゲルにロードし、プラスミドpHEN1ベクターからインサートを分離するために、電気泳動を180Vで45分間実施した。VHH配列に対応する400bpの分画を回収し、NcoI及びNotIを用いて消化しておいた別のプラスミドpASK-Iba2とのライゲーションを16℃で、一晩実施した。ライゲーションの場合、プラスミド/インサートの比は1/5であった。ウルトラコンピテントXL2細菌(Agilent technologies社)を、β-メルカプトエタノールを添加して最初に処理し、そして2分毎に軽く旋回させながら、4℃で10分間インキュベートした。DNA(30ng)、1μLを添加し、4℃で30分間インキュベートした。ヒート-パルスを42℃で30秒間実施し、細菌を、次に氷上で2分間インキュベートした。500μLの2YTを添加し、培養物を、37℃で1時間、撹拌しながらインキュベートした。200個の培養物をペトリ皿上に播き、37℃で、一晩インキュベートした。同操作は、細菌が良好に形質転換されるよう管理するために実施した。事前培養物を、2YT + A内、30℃で、一晩インキュベートした。事前培養物、1mLを100mLの2YT + Aを播種するのに用いた。OD550が0.5に等しくなったら、アンヒドロテトラサイクリン(最終濃度:200ng/mL)、10μLを添加し、そして20℃で、一晩振とうさせた。VHHが、細菌周辺細胞質内に発現し、それは、C-末端領域にストレプ-タグを備えていた。タグを活用して、製造業者の推奨に基づき、アフィニティークロマトグラフィーカラム、ストレプ-タクチンセファロース(Iba)を用いて、VHHを細菌抽出物から精製した。サンプルの純度を管理するために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動も実施可能であった。タンパク質を、クーマシーブリリアントブルーを用いて、撹拌しながらRTで1時間着色することにより可視化した。次に連続した水浴により脱色を実施した。アルツハイマー病患者から得られた脳抽出物(Sg τ 4697)に対応する1つの免疫ファージディスプレーライブラリ、Intiを用いて選択を実施した。Sg τ 4697スクリーニングにより単離されたクローン、61例の中から、2例のクローン、VHH-A12及びVHH-E8が大腸菌に発現し(図1)、更に特徴づけを行った。

NV3-Cyto(NV)配列(配列番号7)は、国際公開第2013068430号に、ニューロヴィータ3として開示されている。NV3は、遊離したカルボキシ末端(PDZ-BDを含有する)を維持しなければならないことを念頭に置き、NV3-Cyto配列をニューロカーゴ-ニューロヴィータ分子の-COOH部分に挿入した。前記ニューロヴィータ配列は、
CGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTaCATGGCCAGCAAACCCGCTTA(配列番号8)
の配列を備えた核酸により特にコードされ得る。

或いは、VHH含有ポリペプチドVHH3では、PDZ-BSの欠損により不活性化されたニューロヴィータペプチドが、前記VHH含有ポリペプチドのC-末端部に融合している。前記不活性化されたニューロヴィータは、配列番号9の配列を有し、
CGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTaCATGGCCAG 配列番号10)
の配列を備えた核酸によりコードされ得る。

ヒト脳タンパク質のいずれも認識しないVHH A12は、免疫処置されたアルパカファージディスプレーから単離された。その発現は良好であり、塩基性のpI(9.78)を有する。このVHHは、
EVQLQASGGGLAQPGGSLRLSVTVSGSIDVINNMAWYRQAPGNARELVATITSGFSTNYASSVKGRFTISRDNAKKAVYLQMNSLKPEDTADYYSKVHLIRLGAARAYDYWGQGTQVTVS(配列番号3)の配列を有し、
GAGGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCGTAACAGTCTCTGGAAGTATCGATGTTATTAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGCGCGCGAGTTGGTCGCCACAATTACTAGTGGTTTTAGCACAAACTATGCAAGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAAGCGGTATATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGATTATTACTCTAAGGTTCACTTAATACGTCTTGGGGCCGCGCGGGCGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCC(配列番号4)
の配列を備えた核酸により特にコード可能である。

ニューロン細胞に限定されたナノボディー分子の特異性を高めるために、CVS-NIV配列のGタンパク質に由来するRDP配列(すなわち、狂犬病由来のペプチド)を用いた(欧州特許第09290257.6号(2009年)、PCTIB2010000967(2010)、米国特許第13/263050号及び同第2012100116号)。2つの特別な配列、
TATACGATTTGGATGCCGGAAAATCCACGTCTGGGCATGTCGTGCGATATCTTTACCAACAGTCGCGGTAAACGCGCGAGCAAAGGG(配列番号2)、
の配列を備えた核酸により特にコードされるRDP1、YTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKG(配列番号1)、又はRDP2、KSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGGG(配列番号32)のいずれかが利用可能である。2つのペプチドは、RABVにより受容体として用いられる2つの異なるニューロン分子の認識に関与するエピトープを含むように設計されている(LafonM.、2005年)。ニューロカーゴ-ニューロヴィータ分子の第1のセットでは、RDP1のみが特別に作製された。利用可能なその他のニューロン細胞標的ペプチドとして、KSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPH(配列番号33)の配列、又はYTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGの配列(配列番号34)を備えたペプチドが挙げられる。

VHH含有ポリペプチドは、分子を標識するためにストレプ-タグ配列GGGSAWSHPQFEKAAA(配列番号5)を含み、これは、GGTGGAGGCTCAGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGCGGCCGCA(配列番号6)の配列を備えた核酸により特にコードすることが可能である。また、VHH含有ポリペプチドは、イニシエータメチオニンを含むMA配列(MAペプチド)を備えたペプチドも含有する(特に、ATGGCCの配列を備えた核酸によりコードされる)。

上記ペプチドは、以下の順序で融合している(N-末端からC-末端):MAペプチド、RDP1、VHH A12、ストレプタグ、NV。得られたポリペプチドは、本明細書ではVHH1と呼ぶが、
MAYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGEVQLQASGGGLAQPGGSLRLSVTVSGSIDVINNMAWYRQAPGNARELVATITSGFSTNYASSVKGRFTISRDNAKKAVYLQMNSLKPEDTADYYSKVHLIRLGAARAYDYWGQGTQVTVSGGGSAWSHPQFEKAAARRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQQTRL(配列番号11)の配列を有する。前記ポリペプチドは、
ATGGCCTATACGATTTGGATGCCGGAAAATCCACGTCTGGGCATGTCGTGCGATATCTTTACCAACAGTCGCGGTAAACGCGCGAGCAAAGGGGAGGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCGTAACAGTCTCTGGAAGTATCGATGTTATTAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGCGCGCGAGTTGGTCGCCACAATTACTAGTGGTTTTAGCACAAACTATGCAAGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAAGCGGTATATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGATTATTACTCTAAGGTTCACTTAATACGTCTTGGGGCCGCGCGGGCGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCGGTGGAGGCTCAGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGCGGCCGCACGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTACATGGCCAGCAAACCCGCTTATGATAA(配列番号12)の配列を備えた核酸により特にコード可能であり、3'末端に2つの終止コドンを含む。

NV3-Cyto PDZ-結合ドメイン(PDZ-BD)(又はPDZ-結合配列、PDZ-BS)を欠いている対応する分子は、本明細書ではVHH3と呼び、又はRDP1配列を欠いている分子は、本明細書ではVHH2と呼ぶが、これらをコントロールとして作成した。これらのポリペプチドは、下記の融合ペプチドに対応し、また下記の配列を有する、すなわち
VHH2: MAペプチド、VHH A12、ストレプタグ、NV;
MAEVQLQASGGGLAQPGGSLRLSVTVSGSIDVINNMAWYRQAPGNARELVATITSGFSTNYASSVKGRFTISRDNAKKAVYLQMNSLKPEDTADYYSKVHLIRLGAARAYDYWGQGTQVTVSGGGSAWSHPQFEKAAARRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQQTRL(配列番号13)
であり、この配列は、
ATGGCCGAGGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCGTAACAGTCTCTGGAAGTATCGATGTTATTAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGCGCGCGAGTTGGTCGCCACAATTACTAGTGGTTTTAGCACAAACTATGCAAGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAAGCGGTATATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGATTATTACTCTAAGGTTCACTTAATACGTCTTGGGGCCGCGCGGGCGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCGGTGGAGGCTCAGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGCGGCCGCACGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTACATGGCCAGCAAACCCGCTTATGATAA(配列番号14)の配列を備えた核酸により特にコード可能であり、3'末端に2つの終止コドンを含む;
VHH3: MAペプチド、RDP1、VHH A12、ストレプタグ、PDZ-BDが欠損したNV:
MAYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGEVQLQASGGGLAQPGGSLRLSVTVSGSIDVINNMAWYRQAPGNARELVATITSGFSTNYASSVKGRFTISRDNAKKAVYLQMNSLKPEDTADYYSKVHLIRLGAARAYDYWGQGTQVTVSGGGSAWSHPQFEKAAARRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQ(配列番号15)
であり、この配列は、
ATGGCCTATACGATTTGGATGCCGGAAAATCCACGTCTGGGCATGTCGTGCGATATCTTTACCAACAGTCGCGGTAAACGCGCGAGCAAAGGGGAGGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCGTAACAGTCTCTGGAAGTATCGATGTTATTAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGCGCGCGAGTTGGTCGCCACAATTACTAGTGGTTTTAGCACAAACTATGCAAGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAAGCGGTATATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGATTATTACTCTAAGGTTCACTTAATACGTCTTGGGGCCGCGCGGGCGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCGGTGGAGGCTCAGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAGCGGCCGCACGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTACATGGCCAGTGATAA(配列番号16)の配列を備えた核酸により特にコード可能であり、3'末端に2つの終止コドンを含む。

下記の順番の下記のペプチドの融合体からなるポリペプチド:MAペプチド、RDP1、VHH A12、NVも利用可能であり、
前記ポリペプチドは、
MAYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGEVQLQASGGGLAQPGGSLRLSVTVSGSIDVINNMAWYRQAPGNARELVATITSGFSTNYASSVKGRFTISRDNAKKAVYLQMNSLKPEDTADYYSKVHLIRLGAARAYDYWGQGTQVTVSRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWEVHGQQTRL(配列番号45)の配列を有し、
ATGGCCTATACGATTTGGATGCCGGAAAATCCACGTCTGGGCATGTCGTGCGATATCTTTACCAACAGTCGCGGTAAACGCGCGAGCAAAGGGGAGGTGCAGCTGCAGGCGTCTGGGGGAGGCTTGGCGCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCGTAACAGTCTCTGGAAGTATCGATGTTATTAATAACATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAATGCGCGCGAGTTGGTCGCCACAATTACTAGTGGTTTTAGCACAAACTATGCAAGCTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAAAGCGGTATATCTACAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGATTATTACTCTAAGGTTCACTTAATACGTCTTGGGGCCGCGCGGGCGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCCGCCGGGTAAACCGCAGTGAACCGACCCAGCACAATCTGCGTGGGACTGGTCGTGAGGTGTCCGTTACGCCACAGTCTGGCAAAATCATTAGCTCGTGGGAAGTACATGGCCAGCAAACCCGCTTATGATAA(配列番号46)の配列を備えた核酸により特にコードされ、3'末端に2つの終止コドンを含む。

すべての構築物は、遺伝子工学で用いられる標準手順により生み出される(Prehaud C.ら、2010年に短く記載されている)。

顕著なこととして、本明細書に開示のVHH A12の配列は、先行技術のVHHの配列とはいくつかの相違を示し、後者が比較的強い保存性を示す残基においてさえも相違が認められる。

(実施例2)
ニューロカーゴ-ニューロヴィータ分子のクローニング及び発現
ニューロカーゴ-ニューロヴィータ遺伝子配列(VHH1:配列番号12、VHH2:配列番号14、VHH3:配列番号16)を、Eurofin MWG Operon社により化学的に合成し、そしてテトラサイクリンプロモーターのコントロール下で、pASK-IBA2プラスミド(IBA、BioTAGnology社、米国)に挿入した。このプラスミドでは、ompAシグナル配列が発現したタンパク質を細胞膜周辺腔内に誘導し、転位プロセス期間中に切り取られる。細胞膜周辺腔では、適切に折り畳まれたジスルフィド結合形成タンパク質が、見出され得る。組換えプラスミドは、XL1-Blue病原性大腸菌(Stratagene社、米国)を形質転換するのに用いた。組換え細菌を、PCRにより同定し、グリセロールストックを作成した。P.Lafaye(2008年)の記載に従い、VHH含有ポリペプチドを発現させ、細菌周辺細胞質から精製した。或いは、タンパク質は、細胞質から直接抽出することも可能である。周辺細胞質抽出物を、マウス高アフィニティー抗ストレプタグmAb、例えばC23.21(P. Lafaye、Institut Pasteur biological collection)等を用いて、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより更に精製した。VHH含有ポリペプチドの発現を、mAb C23.21を用いたウェスタンブロッティング法によりモニターした。

更に、その二量体状態を呈するように、製造業者の説明に従い、精製されたニューロカーゴ-ニューロヴィータを、変性サンプル(NuPage(商標)LDS+DTT+沸騰)又は無処理サンプル(NuPage(商標) LDS)として、NuPage MES泳動バッファーを含むNuPage(商標)ゲル(Life Technologies社、フランス)に溶解した。ニューロカーゴ-ニューロヴィータ分子種を、抗ストレプタグmAb C23.21を用いたウェスタンブロッティング法により同定した(図1C)。

(実施例3)
VHH A12ニューラルの特徴付け
VHH A12は、下記の特徴を有することが明らかとなった:塩基性のpI(すなわち、pI>8.5;特にVHH単独の場合9.86、及びVHH1ポリペプチドの場合10.36);ウェスタンブロッティング法により、ヒト脳抽出物(すなわち、Sg τ4697)、及びマウス脳抽出物(すなわち、Tg 4510)、及びGFAP(すなわち、グリア線維性アストロサイトタンパク質)に対して無反応性;及び免疫組織化学検査により、Tg 4510マウス脳組織について免疫無反応性。

本発明のVHH(A12)の特異性を、脳タンパク質(VHH E9と同じH8/E9、Perruchiniら)を認識するコントロールVHHと比較して、ウェスタンブロッティング法により、異なる3抗原:ヒト脳抽出物(Sg τ 4697)、マウス脳抽出物(Tg 4510)、及びアストロサイトの特異的マーカーであるGFAPの精製後タンパク質について測定した。図2に示す通り、VHH A12ではバンドは検出されなかった。更に、VHH免疫組織化学検査を、NFTを担持するTg4510マウス組織(Grueningerら、2010年)から実施した。コントロールとして、特異的抗-NFTモノクロナール抗体、AT8は、Tg 4510マウスパラフィン切片を対象に、NFTの免疫検出を行った場合、優れた感度及び選択性を示した。対照的に、VHH A12ではラベリングは認められなかった(図1)。ウェスタンブロッティングでは、最初にポリアクリルアミドゲル電気泳動を、200Vで45分間実施した。次に、タンパク質を、30Vで1時間、ゲルからニトロセルロースメンブレンに移した。ニトロセルロースメンブレンを、2%のPBSミルクで、撹拌しながら1時間飽和させた。次に選択されたVHHを2%のPBSミルクで1μg/mlに稀釈し、これと共にメンブレンを1時間インキュベートし、PBSツイーンで3回、5分間洗浄した。ストレプ-タグを認識する二次マウスmAb C23-21(DI 2012-32高アフィニティーモノクロナール抗ストレプ-タグ抗体C23.21 ;Girard-blanc C.、Krey T.、Vasiliauskaite ieva、Nato F.、Lafaye P.、Dartevelle S.、Rey F.)を、1:2500で添加し、37℃で1時間インキュベートした。次に追加洗浄した後、ペルオキシダーゼで標識された抗マウスmAbを、1時間添加した。5分間の洗浄を3回、PBSツイーン中で実施した。次に、製造業者の説明書に従い、感光フィルム(Thermo Scientific社、Pierce(登録商標)ECLWestern Blotting Substrate)を用いて視覚化した。

(実施例4)
神経突起の伸長
神経突起伸長アッセイ法は、Prehaudら、2010年に広範に記載されている。ニューロスクリーン細胞(neuroscreen cell)(NS細胞)は、pC12サブクローンである。製造業者の説明書の記載に従い(http://www.cellomics.com/content/menu/Neuroscreen-1_Cells/)、RPMI培地内で細胞を増殖させた。NS細胞を72時間モニターし、time=0において200ng/mlのNGF(1ヒットのみ)、及びニューロカーゴ-ニューロヴィータ(10pg、time=6において、1ヒットのみ)を用いて処理した。神経突起の伸長(NO)は、SH-SY5Yに関する記載と同様に、基本的に認められたが、但し、NOは感染後72時間においてモニターされ、またNS細胞はそのフィーディング培地(Cellomics社、米国)内で常に増殖した点を除く。

NS細胞を、Cell insight (Cellomics社、米国)を用いて、四重ウェル上で画像化した。ニューロン1個当たりの平均神経突起長を、Neuronal profiling bioapplication(Cellomics社、米国)を用いて測定する。

(実施例5)
スクラッチアッセイ法(軸索再生)
スクラッチ誘発式のアッセイ法では、200mm2のNT2-N細胞(n=8)を、ポリ-D-リジン-ラミニンがコーティングされた細胞+(Sarstedt社、ドイツ)12ウェルプラスチックウェア上に播種し、そしてトリプシン処理後完全に回復させるために、2日間増殖させた。培地を、スクラッチング前4時間において変更し、10pgのニューロカーゴ-ニューロヴィータを、1ウェル毎に添加した。個々の創傷は、注射針(26GX1/2"、12-4.5)で作成した。少なくとも10回のスクラッチングをウェル毎に行った。或いは、ニューロカーゴ-ニューロヴィータを、スクラッチング前1時間において添加した。受傷後6日目に、細胞をPFA (4%)で固定し、クリスタルバイオレット溶液で染色した。細胞をDC 300FXカメラ(対物×20)を備えたLeica DM 5000B顕微鏡を用いて画像化し、そしてImageJ 1.38Xソフトウェア(Wayne Rasband、NIH、米国、http://rsb.info.nih.gov/ij/)及びそのプラグ-インNeuronJを用いて分析した。平均ニューロン再生割合(%)を8回の実験から求めた。

(実施例6)
AchR結合及び、フローサイトメトリーによりモニターした競合アッセイ、ニューロカーゴ-ニューロヴィータのNS細胞への進入
採用したフローサイトメトリー手順は、Prehaudら、2003年に記載されている。要するに、α7 AchR発現HEK 293細胞(Yamauchiら、2011年)、及び親のHEK 293細胞を10%のFBSを加えたDMEM high glucose(Life Technologies社、フランス)内で増殖させる。HEK 293細胞又はAchR発現HEK 293細胞を6ウェルプレートに播種した(1ウェル当たり1.e+06個の細胞)。播種後24時間において、細胞を氷上に配置し、染色バッファーを用いてフローサイトメトリー用に処理する前に、ニューロカーゴ-ニューロヴィータ、20pgで30分間処理した。或いは、競合アッセイの場合、細胞を、狂犬病ウイルス-CVS系統のU.V.不活性化された2.e+07個のPFU(Megretら、2005年の記載に従い)又は16μM αブンガロトキシン(Sigma社、米国)を用いて処理した。ニューロカーゴ-ニューロヴィータ分子の進入をモニターするために同一の実験を実施したが、但し、透過化処理バッファーを用いて、受容体に結合した分子及び細胞質内の分子の両方の検出を可能にした。細胞質の膜受容体に結合したニューロカーゴ-ニューロヴィータ分子を、Cy5結合抗マウス抗体(Jackson Laboratory社、米国)を加えた上記抗ストレプタグmAbを用いて検出した。

(実施例7)
ニューロン細胞(NS)成長円錐の運動性測定
NS細胞を、time=0において200ng/mlのNGF(1ヒットのみ)、及びニューロカーゴ-ニューロヴィータ(10pg、time=6において、1ヒットのみ)を用いて分化させた。コントロールとして、細胞を、ニューロカーゴ-ニューロヴィータを発現しない細菌の細菌性周辺細胞質抽出物で処理した。48時間目に、細胞を、PFA固定化し、0.3%のトリトンX100で透過化処理し、そして免疫蛍光検査用にすでに記載された通り(Prehaudら、2010年)処理した。核を、Hoescth 33342、マウス抗β3チューブリン抗体を含むβIIIチューブリン(G7121、Promega社、フランス)、及び抗マウスAlexa 488抗体(Jackson laboratory社、米国)、及びAlexa 546結合ファロイジンを含むFアクチンネットワーク(A22283、Life Technologies社、フランス)を用いて検出した。

(実施例8)
細胞遺伝子発現のリアルタイムPCR分析
RT-PCR遺伝子発現分析手順は、Prehaudら、2005年に広範に記載されている。ここでは、アッセイで用いた細胞培養プラスチックに起因して、cDNA分子は、200ng〜1μgの範囲のRNAを用いて作成した。この試験で用いられるプライマーは:TH(HSTH1SG、Qiagen社、ドイツ)、GFAP(F:CTGCTTCTTAACCCCAGTAAGCCA(配列番号39)、R:CAGCAGTGCCCTGAAGATTAGCAG(配列番号40))、AQP4(F:GGTATAGTCAATTCTTATTTGAAT(配列番号35)、R:CTTGAATCTCAATAGGTGCCCTTA(配列番号36))、PYGB(F:TCCTGCTGTGTCCTGAGGTGCATT(配列番号43)、R:GCCCAGATCCAGCATGCAAGGTGC(配列番号44))、NEFH(F:CCCCAGGCGATGGACAATTATGAT(配列番号41)、R:CACTTGGTTTTATTGCACAGAAGC(配列番号42))、CD200R(F:TTAACACTTCATGGCCTGTAAGA(配列番号37)、R:TGTGCCATTGCTCCAGTATTCTTG(配列番号38))、及びドイツ、Qiagen社製(HSSLC2A1-1、HSSLC7A5、HSSLC1A1-1、HSSLC38A5-1、HSSLC16A1、HSSLCO1C1、HSSLCABCB1-1、HSABCG2-1、HSABCC1-1、HSABCC2-1、HSABCC4-1、HSABCC5-1、HSLDLR-1、HSLRP1-1、HSINSR -1、HSLEPR-1、HSPVLAP-1、HSLU-1、HSTFRC-1、HSAGER1、HSSTRA6-1)である。

(実施例9)
ヒトBBBのin vitroモデルの構築
ヒト脳微小血管内皮細胞株(hCMEC/D3)の不死化を、Wekslerら、2005年により実施した。hCMEC/D3を、ウシ胎仔血清(5%、Eurobio社、フランス)、ヒドロコルチゾン(1.4μM、Sigma社、米国)、bFGF(1ng/mL、Sigma社、米国)、アスコルビン酸(5μg/mL、Sigma社、米国)、化学的に定義された脂質(1/100、Life technologies社、フランス)、HEPES(10mM、Life technologies社、フランス)、ペニシリン-ストレプトマイシン(Life technologies社、フランス)が補充されたEBM-2(Lonza社、スイス)中で増殖させた。細胞を、ラット-テールコラーゲンI(150μg/mL、R&D systems社、英国)でコーティングされた培養フラスコ(コーニング社、米国)上でルーチン的に培養し、1週間に2回スプリットした(トリプシン処理による)。分化した単層を、ラット-テールコラーゲンI-(150μg/mL、R&D systems社、英国)、及びフィブロネクチン(10μg/mL、Sigma社、米国)でコーティングされたポリエステルトランスウェル(直径12mm、ポアサイズ0.4μm、コーニング社、米国)上で得た。細胞を細胞25,000個/cm²の密度で播種し、5日間培養した。培養培地を、分化3日目に変更した。5日目に、in vitro内皮性血液脳関門を、デバイスの下部コンパートメントに播種されたミニブレイン細胞と共に培養した(すなわち、ミニブレイン-BBB)、或いは培地単独中に置かれた(BBB)。従って、ミニブレイン-BBBモデルは、内皮細胞に付加して、ニューロン、アストロサイト、及びミクログリア細胞を含む一方、BBBモデルは、内皮細胞のみを含む。

CHMEミクログリア細胞を、10%のFBSを加えたDMEM-F12(Life technologies社、フランス)中で増殖させ(Janabiら、1995年)、Prehaudら、2005年、Lafonら、2005年、及びMegretら、2007年の記載に従い、hNT2N/A(ニューロン-アストロサイト)を分化させ、そしてヒトテラトカルシノーマ細胞NTera/cl2D1から単離した。hNT2N/Aを、5%のFBSを加えたDMEM F12(Life technologies社、フランス)中で維持した。CHME及びhNT2N/A細胞を軽いトリプシン処理により単離し、そして脳の異なる領域のミクログリア対ニューロン-アストロサイトの比に一致させるために、0.015〜0.24の範囲の様々な比に混合した(Kettenmann及びRansom、2012年)。これらの同時培養細胞は、まとめてミニブレイン細胞と呼ぶが、これをポリ-D-リジン-ラミニンでコーティングされたCellBindプラスチックウェア(コーニング社、米国)上、EBM-2完全培地(すでに記載済み)内に播種した。24時間後、内皮細胞の単層を含有するトランスウェルを添加し、そしてシステムは、24時間後にいつでも使用できる状態になった。

(実施例10)
ナノボディーのミニブレイン-BBB横断及びニューロカーゴ-ニューロヴィータの横断及び標的化
1.5%のミクログリア細胞を含有するミニブレイン-BBBデバイスを播種した。播種後1日目に、Alexa 488結合抗GFAP VHH(VHHE9、Liら、2012年)を、上側チャンバーにアプライした(ナノボディー、10pg)。3及び24時間後、下部チャンバー内の細胞をPFA固定化し、0.3%のトリトン X100を用いて透過化処理した。Cellinsight(Cellomics社、米国)を用いて、写真をランダムに撮影した(>500)。蛍光焦点をモニターした。

或いは、ニューロカーゴ-ニューロヴィータ分子の場合、上記抗ストレプ-タグ抗体、及びAlexa 488結合抗マウス抗体(Life technologies社、フランス)で染色した後、蛍光焦点をモニターした。

ニューロカーゴ-ニューロヴィータ分子が標的とするニューロンの数を求めるために、細胞を、抗Neurofilalent 200KDa抗体(Sigma社、米国)及びAlexa 546結合抗ウサギ抗体でも染色した(Life technologies社、フランス)。

(実施例11)
ルシファーイエローによる限定的な傍細胞透過性の測定
hCMEC/D3細胞の限定的な傍細胞透過性を、その低透過性を非透過性蛍光マーカーであるルシファーイエロー(LY)(Sigma Aldrich社、L0259)と対比することにより評価した。要するに、フィルター上で培養した6日後に、hCMEC/D3単層を、10mMのhepes(Life technologies社、15630-080)、及び1mMのピルビン酸ナトリウム(Life technologies社、11360))が補充された輸送培地(HBSS CaMg(Gibco社、14025-100)、1.5mLをウェル毎に含有する12-ウェルプレートに移した(反管腔側のコンパートメント)。次に50μMのLYを含有する輸送培地、0.5mLを管腔コンパートメントに添加した。インキュベーションを、37℃、5% CO₂、95%湿度で実施した。15、25、及び45分後、インサートを、あらかじめ輸送培地、1.5mLを充填した新規ウェルに移した。45分後、各時点において、両方のコンパートメントから一定分量を採取し、蛍光分光光度計(Tecan Infinite F500)を用いてLYの濃度を測定した。

Siflinger-Birnboimら(1987年)の記載に従い、LYの内皮透過係数(P_e)を、センチメーター/分(cm/分)で計算した。濃度非依存性輸送パラメーターを得るために、排出原理(clearance principle)を用いる。要するに、排出された容積の平均値を時間に対してプロットし、直線回帰によりスロープを見積もる。インサート透過性(PS_f、コラーゲン以外コーティングされていないインサート)及びインサート+内皮細胞透過性(PS_t、コラーゲン及び細胞を含むインサート)の両方について、下記の式:1/PS_e=1/PS_t - 1/PS_fに基づき検討を行った。

内皮単層の透過性の値を、次にインサートの多孔膜(コーニング社、3460)の表面積で割り算して、分子の内皮透過係数(P_e)(cm.分-1)を得た。

経内皮電気抵抗(TEER)の測定
Wekslerら(2005年)がすでに記載しているように、HCMEC/D3のTEERを、Endogro-MV培地(SCME004、メルクミリポア社、フランス)内で培養してから5、6、及び7日間後に測定した。

(実施例12)
SK-N-SH D細胞株
SK-N-SH D細胞株は、ATCC HTB-11 SK-N-SHヒト神経芽細胞腫細胞株のサブ-クローンである。β3-チューブリン及びアクチン-F陽性細胞であるニューロン様の細胞として、自然に完全分化し得るサブ-クローンとして、分化培地内で単離された。この細胞株は、CNCM(Collection Nationale de Culture de Microorganismes、Institut Pasteur、Paris、フランス)に2015年9月4日付けで、番号CNCM I-5010として預託された。

SK-N-SH D細胞は、10%のウシ胎仔血清を加えたDMEM Glutamax- I - high glucose(4.5g/l)-Na Pyr(Life technologies社、#31966-021)中でルーチン的に増殖させる。細胞は、Endogro-LS(#SCME 001)又はEndogro-MV(#SCME004)培地(メルク-ミリポア社、フランス)内に移すと自発的に分化する。

これらの細胞を用いて脳コンパートメント内に構築されたBBBモデルであって、それ以外の点では上記モデルと類似し、類似した方法で構築されたBBBモデルは、本明細書に開示する用途において適合性を有するか試験を行ったところ良い結果が得られた。

特に、HCMEC-D3、及び脳コンパートメント内にSK-N-SH D細胞を含むBBBモデルを構築し、上記手順と類似した手順に従って試験した。本発明のVHH含有ポリペプチドを含むニューロヴィータは、このモデル内でインキュベートしたとき、P_eによる測定では透過性に変化をもたらさなかった。ニューロン細胞標的ペプチドを含むVHH含有ポリペプチドは、内皮細胞の層を横断し、また脳コンパートメント内の脳細胞を標的とすることが、蛍光顕微鏡検査により明らかにされた。HCMEC D3、及び脳コンパートメント内にSK-N-SH D細胞(ニューロン)、U 373MG MG(ECACC #08061901)細胞(アストロサイト、すなわちマクログリア細胞)、及びCHME(ミクログリア細胞)を含む更なるモデルの開発にも成功した。

[参考文献]

Claims

ラクダ重鎖抗体のVHHを含む又はそれからなるポリペプチであって、前記VHHが、
i)配列番号3の配列を有し、
ii)配列番号3の配列と少なくとも90%の同一性を有する、i)のVHHの配列変異体であり、又は
iii) i)若しくはii)のVHHの一部分であり、
血液脳関門を横断して透過可能であり、8.5に等しい若しくはそれ以上、好ましくは9に等しい若しくはそれ以上の等電点を有するポリペプチド。
前記一部分の配列の長さが、VHHフラグメントの配列の長さの少なくとも90%である、請求項1に記載のポリペプチド。
配列番号3の配列を備えるVHHフラグメントのCDR領域を含む、請求項1又は2に記載のポリペプチド。
VHH含有ポリペプチドであり、前記VHH又はその一部分が、追加のペプチドとインフレームで融合している、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
ニューロン細胞標的ペプチドを、好ましくはNH₂-末端部に含む、請求項4に記載のポリペプチド。
前記ニューロン細胞標的ペプチドは、配列番号1、及び配列番号32〜配列番号34からなる群の中から選択された配列からなる又はそれを含む、請求項5に記載のポリペプチド。
二量体化能力、特にホモ二量体化能力を有し、好ましくは、ホモ二量体化は、ジスルフィド架橋により達成される、請求項1から6のいずれか一項に記載のポリペプチド。
タギングペプチド又はアフィニティーペプチドを含む、請求項4から7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
インフレームで融合したエフェクターポリペプチド、特に細胞生存率、細胞周期の状態、アポトーシス、細胞生存率、細胞死、有糸分裂、細胞分化、細胞のサイズ又は形態、細胞増殖、神経突起伸長、細胞間の結合、細胞シグナル経路の活性化状態、シグナル伝達、細胞の移動性、細胞の運動性、疾患関連の状態、傷害後又は病変後に関連する状態、診断関連の状態に対する効果を有するエフェクターポリペプチドを含む、請求項4から8のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記エフェクターポリペプチドが、ニューロンの生存性及び/又は保護及び/又は運動性に対する効果を有し、並びに/或いは神経突起伸長を促進する、狂犬病ウイルスのGタンパク質に由来するペプチド、特に配列番号7の配列を有するペプチドからなる又はそれを含む、請求項9に記載のポリペプチド。
ペプチドスペーサーが、前記VHHと前記エフェクターポリペプチドとの間に挿入されている、請求項9又は10に記載のポリペプチド。
配列番号3等のVHH配列、配列番号1等のニューロン細胞標的ペプチド、配列番号7等のニューロヴィータ配列、及び任意選択で配列番号5等のタグ配列を含み、好ましくは、配列番号11及び配列番号45からなる群より選択される配列を有する、請求項1から11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
請求項1から12のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、特に配列番号4の配列、配列番号2の配列、配列番号8の配列、及び任意選択で配列番号6の配列を含むポリヌクレオチド、特に配列番号4、配列番号12、配列番号14、配列番号16、及び配列番号46の群の中から選択される配列からなるポリヌクレオチド。
請求項13に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
細菌中での前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現に適する、好ましくは、前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、前記細菌の周辺細胞質内において回収されるのを可能にする、請求項14に記載のベクター。
細胞又は細胞株、特に、請求項14若しくは15に記載のベクター及び/又は請求項13に記載のポリヌクレオチドを含有する細菌細胞。
in vivo投与に適する生理学的に許容される媒体と会合した、請求項1から12のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項13に記載のポリヌクレオチド、請求項14又は15に記載のベクター、請求項16に記載の細胞又は細胞株を含む組成物。
神経系疾患、特に神経変性疾患、脳卒中、外傷、病変、又は傷害の治療において、薬剤として使用するための、請求項1から12のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項13に記載のポリヌクレオチド、請求項14若しくは15に記載のベクター、請求項16に記載の細胞若しくは細胞株、又は請求項17に記載の組成物。