JP2017521049A - レンチウイルスベクター - Google Patents

Abstract

本発明は、プロモーターと導入遺伝子とを含む、呼吸器系パラミクソウイルス由来のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）及び融合（Ｆ）タンパク質でシュードタイプ化されたレンチウイルス遺伝子導入ベクター；並びにそれを作製する方法に関する。本発明はまた、遺伝子療法における、特に、嚢胞性線維症（ＣＦ）などの呼吸器疾患の治療のための前記ベクターの使用に関する。

Description

本発明は、プロモーターと導入遺伝子とを含む、呼吸器系パラミクソウイルス（respiratory paramyxovirus）由来のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ，hemagglutinin-neuraminidase）及び融合（Ｆ，fusion）タンパク質でシュードタイプ化されたレンチウイルス遺伝子導入ベクター；並びにそれを作製する方法に関する。本発明はまた、遺伝子療法における、特に、嚢胞性線維症（ＣＦ，Cystic Fibrosis）などの呼吸器疾患の治療のための前記ベクターの使用に関する。

レンチウイルスは、レトロウイルス科のウイルス属に属し、長い潜伏期間を特徴とする。レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡ中に有意な量のウイルスＲＮＡを送達することができ、非分裂細胞に感染することができるレトロウイルス間でも独特の能力を有し、したがって、それらは遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。

レンチウイルスベクター、特に、ＨＩＶ−１に由来するものは、広く研究されており、頻繁に用いられるベクターである。レンチウイルスベクター主鎖の進化及びウイルスが組換えＤＮＡ分子（導入遺伝子）を標的細胞に送達する能力は多くの用途におけるその使用をもたらした。ウイルスベクターの２つの可能な適用は、遺伝子療法及びインビトロでの組換えタンパク質産生における機能的遺伝子の回復を含む。

シュードタイプ化は、外来ウイルスエンベロープタンパク質と共にウイルス又はウイルスベクターを産生する方法である。そのようなものとして、外来ウイルスエンベロープタンパク質を用いて、ウイルス粒子の宿主指向性又は増大／低下した安定性を変化させることができる。例えば、シュードタイプ化により、エンベロープタンパク質の特徴を特定することができる。頻繁に用いられるタンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ，Vesicular stomatitis virus）の糖タンパク質Ｇ、短いＶＳＶ−Ｇである。

導入遺伝子の効率的で制御可能なレトロウイルス発現は、イントロン配列の存在を必要とすることが理解される。しかしながら、そのようなイントロンのレトロウイルスベクターへの組込みは、用いられる多段階の方法のために複雑で時間消費的な方法を含む。

現在まで、ウイルス遺伝子導入剤は、反復投与の成功を妨げる宿主適応免疫応答のため、幹細胞集団の形質導入なしでは疾患の治療にとって有用ではなかった。

さらに、気道上皮への遺伝子導入は、元々予測されたものよりも困難であることがわかった。例えば、リソホスファチジルコリン又はエチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’’−四酢酸などの界面活性剤の使用による、例えば、気道に形質導入するために上皮の完全性の破壊を必要とするレンチウイルスシュードタイプの使用は、敗血症のリスクの増大と関連していた。

気道上皮への遺伝子導入から利益を得る臨床設定の一例は、嚢胞性線維症（ＣＦ）の治療である。ＣＦは、気道上皮細胞中で塩化物チャネルとして作用する、ＣＦ膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ，CF transmembrane conductance regulator）遺伝子中の変異により引き起こされる致死的遺伝子障害である。ＣＦは、再発性胸部感染症、気道分泌物の増加、及び最終的には、呼吸器不全を特徴とする。英国では、現在の死亡時中央年齢は、約２５歳である。多くの遺伝子型について、基本的欠陥を標的とする治療はない；症状軽減のための現在の治療には、療法を毎日自己投与する時間が必要である。遺伝子療法は、低分子薬物と違って、ＣＦＴＲ変異クラスとは無関係であり、したがって、全ての罹患したＣＦ個体に適用可能である。しかしながら、現在まで、臨床使用のための要件を満たしたウイルスベクターはなく、それは他の疾患、特に、他の多くの呼吸器疾患にも適用される。

これに関して、少なくとも３つの大きな問題に遭遇している。少なくとも部分的には、多くのウイルスベクターのためのそれぞれの受容体は気道上皮の側底面に主に局在化されると考えられるため、遺伝子導入効率は一般的に低い。第２に、呼吸器粘液層の浸透は一般に少ない。最後に、自己再生上皮の長期治療にとって必須の、ウイルスベクターを反復的に投与する能力は限られている。

臨床適用のためのベクターの投与は、別の関連する因子である。したがって、臨床的に関連するデバイス（例えば、気管支鏡及びネブライザー）の使用によるウイルスの安定性を、治療効能のために維持しなければならない。

遺伝子療法のための潜在的な標的の別の例は、α１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症である。Ａ１ＡＴ欠損症は、肺疾患及び肝疾患を引き起こし得る遺伝性障害である。症状としては、息切れ／喘鳴、運動能力の低下、体重減少、再発性呼吸器感染症、疲労及び起立時の頻脈が挙げられる。罹患した個体は肺気腫を生じることが多い。Ａ１ＡＴ欠損症を有する約１０〜１５％の患者が、肝疾患を発症する。Ａ１ＡＴ欠損症を有する個体はまた、肝細胞癌を発症するリスクがある。

Ａ１ＡＴは、主に肝臓で産生され、次いで、肺に輸送される分泌型タンパク質であり、ほんの少量は肺自体でも産生される。Ａ１ＡＴの主な機能は、好中球エラスターゼに結合し、中和する。Ａ１ＡＴ遺伝子療法は、Ａ１ＡＴ欠損症、ＣＦ及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ，chronic obstructive pulmonary disease）を有する患者において治療的に有用である可能性があり、Ａ１ＡＴの増加又は導入は肺機能を改善し得る。

Ａ１ＡＴ療法はまた、肝臓及び膵臓などの他の組織／臓器に対するＡ１ＡＴ欠損症の効果のため、１型及び２型糖尿病、急性心筋梗塞、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片拒絶、移植片対宿主（ＧｖＨ，graft versus host）疾患、多発性硬化症及び感染症、特に、ウイルス感染症などの非呼吸器／非肺疾患の治療にとって潜在的に有益である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Lewis Mol. Med. 2012; 18:957-970を参照されたい）。

Ａ１ＡＴ欠損症は、治療閾値レベルが明確に定義されているため、遺伝子療法のための魅力的な標的疾患である。肺気腫／ＣＯＰＤを発症するリスクがある対象におけるＡ１ＡＴレベルの比較により、血清中での１１μＭの防御閾値レベルが決定され、１１μＭ未満のレベルは、利用可能な場合、タンパク質増強療法を開始するための閾値として用いられる。肺上皮は障壁を構成し、したがって、気道表面被覆液における治療閾値は１．１μＭであると考えられるため、気道被覆液中のＡ１ＡＴレベルは血清レベルの約１０％に過ぎない（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる、Ferraroti et al. Thorax.2012 Aug;67(8):669-74及びAbusriwil & Stockley 2006 Current Opinion in Pulmonary Medicine 12:125-131を参照されたい）。

プールされたヒト血液から単離されたＡ１ＡＴタンパク質の６つのＦＤＡに認可された市販の製剤が、重症のＡ１ＡＴ欠損症を有する患者の治療のために米国で臨床使用されている（毎週の静脈内注射による）。酵素補充療法（ＥＲＴ，Enzyme replacement therapy）は高価であり（約１００，０００＄／年）、ＥＲＴタンパク質増強療法に関する生化学的有効性は証明されているが、臨床的有効性を証明するのはより困難であった。Ａ１ＡＴ ＥＲＴは、全ての国において現在利用可能であるわけではなく、英国においても現在利用可能ではない。さらに、部分的には、これまでのところ観察される適度の臨床的有効性の原因となり得る、現在の療法を用いて十分に持続的な組織レベルを達成するのは困難である。

遺伝子療法のための他の魅力的な標的としては、心血管疾患及び血液障害、特に、血友病（Ａ及びＢ）、フォン・ヴィレブランド病及び第VII因子欠損症などの血液凝固欠損症が挙げられる。

血友病、特に、血友病Ａは、遺伝子療法のための魅力的な標的である。血友病Ａは、第VIII因子（ＦVIII，Factor VIII）の欠損又は変異により引き起こされる遺伝性出血障害である。その遺伝性は、性別と関連し、ほぼ全ての患者が男性である。出血は、典型的には、関節へのものである。筋肉、粘膜組織及び中枢神経系（ＣＮＳ，central nervous system）への出血は稀であるが、起こり得る。疾患の重症度は、ＦVIIIのレベルに反比例する：１％未満（０．０１ＩＵ／ｍｌ未満）は、最小の傷害後に出血する重篤な疾患をもたらす；１〜５％（０．０１ＩＵ／ｍｌ〜０．０５ＩＵ／ｍｌ）は、軽度の傷害後に出血する中程度の疾患を引き起こす；５％を超える（０．０５ＩＵ／ｍｌを超える）と、大きな外傷又は手術後にのみ出血する軽度の疾患を引き起こす。

Lewis Mol. Med. 2012; 18:957-970 Ferraroti et al. Thorax.2012 Aug;67(8):669-74 Abusriwil & Stockley 2006 Current Opinion in Pulmonary Medicine 12:125-131

したがって、上記の１又は２以上の問題を回避することができる遺伝子療法ベクターが必要である。

本発明者らは、プロモーターと導入遺伝子とを含む、呼吸器系パラミクソウイルス由来のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）及び融合（Ｆ）タンパク質でシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターを開発した。典型的には、ベクターの主鎖は、ＳＩＶ１又はアフリカミドリザルＳＩＶ（ＳＩＶ−ＡＧＭ）などのサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ，simian immunodeficiency virus）由来である。好ましくは、本発明のウイルスベクターの主鎖は、ＳＩＶ−ＡＧＭである。ＨＮ及びＦタンパク質は、それぞれ、シアル酸に結合し、標的細胞へのベクター進入のための細胞融合を媒介するように機能する。本発明者らは、この特異的にＦ／ＨＮシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターが気道上皮に効率的に形質導入し、気道上皮細胞の提唱される寿命を超える期間にわたって持続する導入遺伝子発現をもたらすことができることを発見した。重要なことに、本発明者らはまた、再投与が効能の喪失をもたらさないことも見出した。これらの特徴は、本発明のベクターを、（ｉ）呼吸器の細胞内の；（ii）呼吸器の内腔に分泌される；及び（iii）循環系に分泌される治療タンパク質の発現におけるその使用により疾患を治療するための魅力的な候補にする。

本発明は、プロモーターと導入遺伝子とを含む、呼吸器系パラミクソウイルス由来のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）及び融合（Ｆ）タンパク質でシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターを提供することにより、上記の必要性の１又は２以上に対処する。一実施形態において、プロモーターは、好ましくは、ハイブリッドヒトＣＭＶエンハンサー／ＥＦ１ａ（ｈＣＥＦ）プロモーターである。本発明はまた、前記ベクターを製造する方法、前記ベクターを含む組成物、及び療法におけるその使用も提供する。

本発明のベクターは、効率的な遺伝子導入によって、より高く持続的な遺伝子発現を可能にする。上記で同定された問題は、（ｉ）上皮の完全性を破壊しない気道形質導入；（ii）永続的な遺伝子発現；（iii）慢性毒性の欠如；及び（iv）効率的な反復投与を行うことができるＦ／ＨＮシュードタイプ化レンチウイルスベクターを提供する本発明によって対処される。好ましくは、治療的に有効なレベルでの、長期的／持続的で安定な遺伝子発現を、本発明のベクターの反復用量を用いて達成することができる。あるいは、単回用量を用いて、所望の長期的発現を達成することができる。

公知のレンチウイルスベクターとは対照的に、本発明のレンチウイルスベクターは、効率的な気道細胞取込み、導入遺伝子発現の増強を示し、反復投与時の効能の喪失を被らない。

したがって、有利には、本発明のレンチウイルスベクターを、遺伝子療法において用いることができる。例として、本発明のベクターの効率的な気道細胞取込み特性は、それらを、呼吸器疾患を治療するのに高度に好適なものにする。本発明のレンチウイルスベクターを遺伝子療法の方法において用いて、治療タンパク質の分泌を促進することもできる。さらなる例として、本発明は、呼吸器の内腔又は循環系への治療タンパク質の分泌を提供する。したがって、本発明のベクターの投与及び気道細胞によるその取込みは、治療タンパク質を産生するための「工場」としての肺（又は鼻若しくは気道）の使用を可能にし、次いで、分泌され、治療レベルで全身循環に進入し、そこでそれは所望の細胞／組織に移動して治療効果を惹起することができる。細胞内又は膜タンパク質とは対照的に、そのような分泌型タンパク質の産生は、形質導入される特定の疾患標的細胞に依拠せず、これは有意な利点であり、高レベルのタンパク質発現を達成する。したがって、心血管疾患及び血液障害、特に、血液凝固欠損症などの呼吸器疾患ではない他の疾患を、本発明のベクターによって治療することもできる。

例として、アルファ−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）は、主に肝臓で産生され、次いで、肺に輸送される分泌型抗プロテアーゼであり、ほんの少量は肺自体でも産生される。Ａ１ＡＴの主な機能は、好中球エラスターゼに結合し、これを中和／阻害することである。本発明によるＡ１ＡＴを用いる遺伝子療法は、Ａ１ＡＴ欠損患者、並びに嚢胞性線維症又は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの他の肺疾患と関連し、酵素補充療法により遭遇するいくつかの問題を克服する機会を提供する。

本発明者らは、嚢胞性線維症患者に由来の喀痰試料中の好中球エラスターゼ（ＮＥ，neutrophil elastase）とＡ１ＡＴとの有意な相関があることを以前に示したが、これは身体がＮＥチャレンジに応答してＡ１ＡＴを産生することを示している。本発明者らはまた、ＮＥと、末梢気道疾患のマーカーである肺クリアランス指数との統計的に有意な相関があることも示し、これは、ＮＥの増加が肺機能に対する負の影響を有することを暗示している。本明細書で提示されるように、本発明者らは、ここで、驚くべきことに、本発明のレンチウイルスベクターがインビボで高濃度のＡ１ＡＴ及び長期的な（少なくとも９０日）Ａ１ＡＴ発現を達成することができることを示した。したがって、Ａ１ＡＴを用いる遺伝子療法は、ＮＥを中和し、嚢胞性線維症及び／又はＣＯＰＤを有する患者の肺機能を改善する（及び本明細書に記載の他の適応症における治療効果を有する）ことができる。したがって、本発明は、Ａ１ＡＴ導入遺伝子の投与並びに限定されるものではないが、Ａ１ＡＴ欠損症、嚢胞性線維症及び／又はＣＯＰＤなどの状態の遺伝子療法のための本明細書に記載のレンチウイルスベクターの使用に関する。鼻上皮及び／又は肺への直接的なレンチウイルスＡ１ＡＴの投与は、酵素補充療法により現在直面するいくつかの制限を克服し（ヒト血液から単離され、毎週静脈内投与されるＡ１ＡＴ）、標的組織（肺／鼻上皮）中での安定で長く続く発現、容易な投与及び制限のない利用性を提供することができる。

いくつかの実施形態において、本発明のレンチウイルスベクターによる形質導入は、肺の内腔並びに循環中への組換えタンパク質の分泌をもたらす。この１つの利益は、治療タンパク質が間質に達するということである。Ａ１ＡＴ欠損症の場合、この部位ではＮＥ阻害も必要とされるため、これは有利である。したがって、Ａ１ＡＴ遺伝子療法は、他の疾患適応においても有益であってよく、その非限定的な例としては、１型及び２型糖尿病、急性心筋梗塞、虚血性心疾患、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片拒絶、移植片対宿主（ＧｖＨ）疾患、多発性硬化症、肝疾患、肝硬変、血管炎並びに細菌及び／又はウイルス感染症などの感染症が挙げられる。

Ａ１ＡＴは、例えば、糖尿病、移植片対宿主疾患及び炎症性腸疾患の前臨床モデルにおける、いくつかの他の抗炎症効果及び組織保護効果を有する。本発明による形質導入後の肺及び／又は鼻におけるＡ１ＡＴの産生は、したがって、これらの適応症などにより広く適用可能であり得る。

本発明による分泌型タンパク質の遺伝子療法を用いて治療することができる疾患の他の例としては、心血管疾患及び血液障害、特に、血友病（Ａ及びＢ）、フォン・ヴィレブランド病及び第VII因子欠損症などの血液凝固欠損症が挙げられる。

いくつかの実施形態において、血友病Ａを、本発明にしたがって治療することができる。疾患の重症度は、ＦVIIIのレベルと反比例し、２〜５％（０．０２〜０．０５ＩＵ／ｍｌ）のＦVIIIの増加が治療的に有効であるのに十分である。

いくつかの実施形態において、鼻は、以下の理由：（ｉ）炎症細胞及び痰などの細胞外障壁が鼻ではあまり顕著ではないこと；（ii）ベクター投与の容易性；（iii）必要とされるベクターの量が少ないこと；並びに（iv）倫理的配慮のうちの少なくとも１つから、本発明の遺伝子療法ベクターを用いた治療タンパク質のための好ましい産生部位である。したがって、本発明のレンチウイルスベクターを用いる鼻上皮細胞の形質導入は、所望の治療導入遺伝子の効率的（高レベル）で長く続く発現をもたらすことができる。

本発明のベクターは、長期的遺伝子発現を可能にし、治療タンパク質の長期的発現をもたらす。本明細書で記載される語句「長期的発現」、「持続的発現」及び「永続的発現」は互換的に用いられる。本発明による長期的発現は、少なくとも４５日、少なくとも６０日、少なくとも９０日、少なくとも１２０日、少なくとも１８０日、少なくとも２５０日、少なくとも３６０日、少なくとも４５０日、少なくとも７３０日又はそれ以上にわたる、好ましくは治療レベルでの、治療遺伝子及び／又はタンパク質の発現を意味する。好ましくは、長期的発現は、少なくとも９０日、少なくとも１２０日、少なくとも１８０日、少なくとも２５０日、少なくとも３６０日、少なくとも４５０日、少なくとも７２０日又はそれ以上、より好ましくは、少なくとも３６０日、少なくとも４５０日、少なくとも７２０日又はそれ以上にわたる発現を意味する。この長期的発現を、反復用量又は単回用量によって達成することができる。

反復用量を、１日２回、毎日、週２回、毎週、毎月、２カ月毎、３カ月毎、４カ月毎、６カ月毎、毎年、２年毎、又はそれ以上投与してもよい。投薬を、必要な限り長く、例えば、少なくとも６カ月、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、１０年、１５年、２０年、又はそれ以上、治療される患者の生涯にわたるまで継続してもよい。

本発明のものなどのレンチウイルスベクターは、形質導入される細胞のゲノム中に組み込まれ、長く続く発現をもたらし、それらを幹細胞／前駆細胞の形質導入にとって好適なものにすることができる。肺においては、再生能力を有するいくつかの細胞型が、誘導気道及び肺胞中の特定の細胞系列を維持するのを担うものとして同定されている。これらのものとしては、上気道における基底細胞及び粘膜下腺管細胞、気管支気道におけるクララ細胞及び神経内分泌細胞、終末細気管支における気管支肺胞幹細胞並びに肺胞におけるII型肺細胞が挙げられる。したがって、理論によって束縛されるものではないが、本発明のベクターは、所望の導入遺伝子を、上気道における基底細胞及び粘膜下腺管細胞、気管支気道におけるクララ細胞及び神経内分泌細胞、終末細気管支における気管支肺胞幹細胞並びに肺胞におけるII型肺細胞などの、１又は２以上の長寿命気道上皮細胞又は細胞型に導入することによって、前記導入遺伝子の長期的遺伝子発現をもたらすと考えられる。

したがって、本発明のレンチウイルスベクターは、肺（気道及び呼吸器を含む）内の再生能力を有する１又は２以上の細胞又は細胞株を形質導入して長期的遺伝子発現を達成することができる。好ましい実施形態において、本発明のレンチウイルスベクターは、上気道／呼吸器中のものなどの基底細胞を形質導入する。基底細胞は、上皮の維持及び傷害後の修復のプロセスにおける中心的な役割を有する。さらに、基底細胞は、ヒト呼吸上皮に沿って広く分布し、その相対分布は３０％（大きい方の気道）〜６％（小さい方の気道）の範囲である。

本発明のレンチウイルスベクターを用いて、患者への投与の前に、ｅｘ ｖｉｖｏで単離され拡張された幹細胞／前駆細胞を形質導入することができる。好ましくは、本発明のレンチウイルスベクターは、インビボで肺（又は気道／呼吸器）内の細胞を形質導入するために用いられる。

本発明のベクターは、高レベルの遺伝子発現を可能にし、高レベル（好ましくは、治療レベル）の治療タンパク質の発現をもたらす。発現を、任意の適切な方法（定性的又は定量的、好ましくは、定量的）によって測定し、濃度を任意の適切な測定単位、例えば、ｎｇ／ｍｌで示すことができる。本発明による高レベルの発現は、少なくとも１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも３０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも４０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも６０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも７０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも８０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも９０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも６００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも７００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも８００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも９００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１，０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２，０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも３，０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも４，０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも５，０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１０，０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも１５，０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも２０，０００ｎｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度での治療遺伝子及び／又はタンパク質の発現を意味してもよい。治療的発現を、これらの同じ値を用いて定義することができる。

本発明のレンチウイルスベクターは、典型的には、患者に投与した場合、導入遺伝子の高い発現レベルを提供する。高い発現及び治療的発現という用語は、本明細書では互換的に用いられる。

本発明による高レベルの発現は、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約２００ｎＭ、少なくとも約３００ｎＭ、少なくとも約４００ｎＭ、少なくとも約５００ｎＭ、少なくとも約６００ｎＭ、少なくとも約７００ｎＭ、少なくとも約８００ｎＭ、少なくとも約９００ｎＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約６μＭ、少なくとも約７μＭ、少なくとも約８μＭ、少なくとも約９μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約１１μＭ、少なくとも約１２μＭ、少なくとも約１３μＭ、少なくとも約１４μＭ、少なくとも約１５μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約２５μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約７５μＭ、又は少なくとも約１００μＭ又はそれ以上の濃度での治療的遺伝子及び／又はタンパク質の発現を意味してもよい。治療的発現を、これらの同じ値を用いて定義することができる。

本発明による高レベルの発現は、対応する内因性（欠損性）ｍＲＮＡの発現レベルと比較して少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％又はそれ以上の治療的遺伝子の発現（典型的には、ｍＲＮＡ発現によって測定される）を意味してもよい。治療的発現を、これらの同じ値を用いて定義することができる。例えば、内因性ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの典型的な発現レベルを、肺細胞１個あたりのｍＲＮＡのコピー数を単位として、例えば、肺細胞１個あたり１コピーの内因性ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ、肺細胞１個あたり２コピーの内因性ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ、肺細胞１個あたり３コピーの内因性ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ、肺細胞１個あたり４コピーの内因性ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ、肺細胞１個あたり５コピーの内因性ＣＦＴＲ ｍＲＮＡ、又はそれ以上、好ましくは、肺細胞１個あたり２コピーの内因性ＣＦＴＲ ｍＲＮＡと定量することができる。機能的ＣＦＴＲ遺伝子などの、本発明の治療遺伝子の発現を、細胞１個あたりのｍＲＮＡコピーを単位として、又は任意の他の適切な単位で内因性（機能不全）ＣＦＴＲ遺伝子などの内因性遺伝子と比較して定量することができる。

本発明による高レベルの発現は、治療遺伝子及び／又はタンパク質の野生型レベルと比較して少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれ以上の濃度での治療遺伝子及び／又はタンパク質の発現を意味してもよく、ここで野生型レベルは疾患のない正常な個体におけるレベルである。いくつかの実施形態において、野生型発現は、１００％として示され、遺伝子発現の任意の改善はそれと比較して測定される。非限定的な例として、疾患のない正常な個体において、機能的遺伝子の発現が１００％として示され、疾患がある個体において、機能的遺伝子の発現が０％である場合、その遺伝子又はタンパク質の発現の治療レベルは、治療遺伝子及び／又はタンパク質の野生型レベルと比較して少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又はそれ以上であってもよい。別の非限定的な例として、疾患のない正常な個体において、機能的遺伝子の発現が１００％として示され、疾患がある個体において、機能的遺伝子の発現が５０％である場合、その遺伝子又はタンパク質の発現の治療レベルは、治療遺伝子及び／又はタンパク質の野生型レベルと比較して少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれ以上であってもよい。

Ａ１ＡＴなどの分泌型タンパク質について、典型的には、肺又は上皮被覆液中での濃度（ＢＡＬを用いて測定される）は、血清中でのものの約１０倍である。非限定的な例として、肺又は上皮被覆液中の分泌型タンパク質の濃度が７５０ｎｇ／ｍｌの領域にある場合、そのタンパク質の血清濃度は７５ｎｇ／ｍｌの領域にある。

本発明の治療遺伝子及び／又はタンパク質の発現レベルを、必要に応じて、肺組織、上皮被覆液及び／又は血清／血漿中で測定することができる。したがって、高い、及び／又は治療的な発現レベルは、肺、上皮被覆液及び／又は血清／血漿中での濃度を指してもよい。

非限定的な例として、ＣＦＴＲの治療的発現レベルは、典型的には、内因性（欠損性）ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの発現レベルと比較して治療的ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの１〜５％である。

別の非限定的な例として、Ａ１ＡＴの治療的発現レベルは、典型的には、上皮被覆液中では少なくとも約１μＭ、及び／又は血清中では少なくとも約０．１μＭである。好ましい実施形態において、上皮被覆液中のＡ１ＡＴの治療的発現レベルは少なくとも約１．１μＭである、及び／又は本発明によるＡ１ＡＴの治療的血清発現レベルは少なくとも約１１μＭである。別の非限定的な例として、上皮被覆液（ＥＬＦ、すなわち、肺中の気道及び空隙を被覆する流体）中のＡ１ＡＴの治療的発現レベルは、７０μｇ／ｍｌ（２００μｇ／ｍｌのＥＬＦ中のＡＴＴ（Ａ１ＡＴ）の「正常な」標的レベルと比較して）である。

別の非限定的な例として、ＦVIIIタンパク質の治療的発現レベルは、典型的には、血友病に罹患していない正常な個体における発現レベルの少なくとも約１〜３％又は少なくとも約１〜６％である。

本発明のベクター中に含まれる治療遺伝子を改変して、発現を容易にすることができる。例えば、遺伝子配列は、遺伝子発現を容易にするために、ＣｐＧ枯渇化された及び／又はコドン最適化された形態にあってもよい。この方法で遺伝子配列を改変するための標準的な技術は、当技術分野で公知である。

本発明のベクター中に含まれるプロモーターを、特異的に選択及び／又は改変して、治療遺伝子の発現の調節をさらに改良することができる。再度、好適なプロモーター及びその改変のための標準的な技術は、当技術分野で公知である。非限定的な例として、本発明における使用にとって適したいくつかの好適な（ＣｐＧ非含有）プロモーターは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるPringle et al. (J. Mol. Med. Berl. 2012, 90(12): 1487-96)に記載されている。

本発明のベクターを改変して、遺伝子発現を停止させることができる。この方法でベクターを改変するための標準的な技術は、当技術分野で公知である。非限定的な例として、Ｔｅｔ応答性プロモーターが広く用いられている。

本発明のベクターはまた、気管支鏡、噴霧ボトル及びネブライザーなどの臨床的に関連する送達デバイスを通過させた場合、形質導入能力のほんのわずかな低下と共に、剪断力に対する顕著な抵抗性を示す。

一実施形態において、本発明は、プロモーターと導入遺伝子との間に位置するイントロンを有しない、プロモーターと導入遺伝子とを含むＦ／ＨＮレンチウイルスベクターを提供する。一実施形態において、本発明のベクターは、呼吸器の細胞に送達される。実施形態において、レンチウイルスはＳＩＶである。一実施形態において、プロモーターはハイブリッドヒトＣＭＶエンハンサー／ＥＦ１ａ（ｈＣＥＦ）プロモーターである。典型的には、本発明の前記プロモーターは、ｈＣＥＦプロモーターのヌクレオチド５７０〜７０９に対応するイントロン及びヌクレオチド７２８〜７３３に対応するエクソンを欠く。本発明のｈＣＥＦプロモーター配列の好ましい例は、配列番号６により提供される。プロモーターはＣＭＶプロモーターであってもよい。ＣＭＶプロモーター配列の例は、配列番号１７により提供される。導入遺伝子発現のための他のプロモーターは当技術分野で公知であり、本発明のレンチウイルスベクターにとってのその好適性は、当技術分野で公知の日常的な技術を用いて決定される。他のプロモーターの非限定的な例としては、ＵｂＣ及びＵＣＯＥが挙げられる。本明細書に記載されるように、プロモーターを改変して、本発明の導入遺伝子の発現をさらに調節することができる。

一実施形態において、導入遺伝子はＣＦＴＲをコードする。ＣＦＴＲ ｃＤＮＡの例は、配列番号７により提供される。

一実施形態において、導入遺伝子はＡ１ＡＴをコードする。Ａ１ＡＴ導入遺伝子の例は、配列番号１５により、又は配列番号２６の相補配列により提供される。配列番号１５は、ヒト細胞中での翻訳を増強するために本発明者らによって設計されたコドン最適化されたＣｐＧ枯渇化Ａ１ＡＴ導入遺伝子である。そのような最適化は、遺伝子発現を最大１５倍増強することが示されている。したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、又はからなるポリヌクレオチドを提供する。非改変型（野生型）Ａ１ＡＴ遺伝子配列と比較して翻訳を増強する同じ技術的効果を有する同じ配列のバリアント（本明細書で定義される）も、本発明によって包含される。本発明はさらに、配列番号２７のポリペプチドにより例示されるような、前記Ａ１ＡＴ導入遺伝子によりコードされるポリペプチド、前記Ａ１ＡＴ導入遺伝子を含むプラスミド（特に、本明細書に定義されるベクターゲノムプラスミド）及びレンチウイルスベクターを提供する。好ましい実施形態において、本発明によるＡ１ＡＴ遺伝子療法に関する本発明の態様は、配列番号１５のＡ１ＡＴ導入遺伝子配列を使用する。

一実施形態において、導入遺伝子は、ＦVIIIをコードする。ＦVIII導入遺伝子の例は、配列番号１６及び配列番号３０により、又は配列番号２８及び配列番号３１の対応する相補配列により提供される。

本発明における使用にとって好適なレンチウイルスベクターとしては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ，Human immunodeficiency virus）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ，Feline immunodeficiency virus）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ，Equine infectious anaemia virus）、及びビスナ／マエディウイルスが挙げられる。本発明の一実施形態において、ＳＩＶベクター、好ましくは、ＳＩＶ−ＡＧＭが用いられる。別の実施形態において、ＨＩＶベクターが用いられる。

本発明のレンチウイルスベクターは、呼吸器系パラミクソウイルス由来のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）及び融合（Ｆ）タンパク質でシュードタイプ化される。一実施形態において、呼吸器系パラミクソウイルスは、センダイウイルス（マウスパラインフルエンザウイルス１型）である。

本発明の一実施形態において、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼコンピテント（ＩＣ，integrase-competent）である。代替的な実施形態において、レンチウイルスベクターはインテグラーゼ欠損性（ＩＤ，integrase-deficient）である。

本発明の別の実施形態において、本発明の導入遺伝子は、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１１、ＤＮＡＩ１、及びＤＮＡＩ２、又は他の公知の関連遺伝子のいずれか１又は２以上である。

本発明の一実施形態において、呼吸器上皮が、ベクターの送達のために標的化される。この実施形態において、導入遺伝子は、アルファ−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＦＴＰＢ，Surfactant Protein B）、又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ，Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor）をコードする。別の実施形態において、導入遺伝子は、感染性因子に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ，monoclonal antibody）をコードする。一実施形態において、導入遺伝子は、抗ＴＮＦアルファをコードする。さらなる実施形態において、導入遺伝子は、炎症、免疫又は代謝状態に関与する治療タンパク質をコードする。

本発明の一実施形態において、ベクターは、循環系に分泌されるタンパク質を産生させるために呼吸器の細胞に送達される。この実施形態において、導入遺伝子は、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第Ｘ因子、第XI因子及び／又はフォン・ヴィレブランド因子をコードする。そのようなベクターを、疾患、特に、心血管疾患及び血液障害、好ましくは、血友病などの血液凝固欠損症の治療において用いることができる。別の実施形態において、導入遺伝子は、感染性因子に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をコードする。一実施形態において、導入遺伝子は、リソソーム蓄積症などの、炎症、免疫又は代謝状態に関与するタンパク質をコードする。

本発明によれば、プロモーターと導入遺伝子との間に位置するイントロンを有しない、ｈＣＥＦプロモーターとＣＦＴＲ導入遺伝子とを含むＦ／ＨＮ−ＳＩＶレンチウイルスベクターが提供される。同様に、ベクターゲノム（pDNA1）プラスミド（例えば、図１Ａに例示され、配列番号１の配列を有する、本明細書に記載のpGM326）中のプロモーターと導入遺伝子との間にはイントロンが存在しない。

本発明はまた、プロモーターと導入遺伝子との間に位置するイントロンを有しない、ｈＣＥＦプロモーターとＡ１ＡＴ導入遺伝子とを含むＦ／ＨＮ−ＳＩＶレンチウイルスベクターも提供する。そのようなレンチウイルスベクターを、Ａ１ＡＴ導入遺伝子とプロモーターとを保有するプラスミドを用いて、本明細書に記載の方法によって産生することができる。同様に、ベクターゲノム（pDNA1）プラスミド中のプロモーターとＡ１ＡＴ導入遺伝子との間にはイントロンが存在しない。そのようなプラスミドの例示的配列は、配列番号９（図１５Ａに例示される、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ｓｏＡ１ＡＴ）に示される。

本発明はまた、プロモーターと導入遺伝子との間に位置するイントロンを有しない、（ｉ）ｈＣＥＦプロモーター又はＣＭＶプロモーター；及び（ii）ＦVIII導入遺伝子を含むＦ／ＨＮ−ＳＩＶレンチウイルスベクターも提供する。そのようなレンチウイルスベクターを、ＦVIII導入遺伝子とプロモーターとを保有するプラスミドを用いて、本明細書に記載の方法によって産生することができる。同様に、ベクターゲノム（pDNA1）プラスミド中のプロモーターとＦVIII導入遺伝子との間にはイントロンが存在しない。そのようなプラスミドの例示的配列は、配列番号１１〜１４（図２２Ａ〜Ｅに例示される）に示される。

上記のレンチウイルスベクターは、導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、遺伝子産物、例えば、タンパク質をコードする核酸配列を含む。

例えば、一実施形態において、ＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ又はＦVIIIをコードする核酸配列は、それぞれ、ＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ又はＦVIII核酸配列に対する少なくとも９０％（少なくとも９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％など）の配列同一性を有する核酸配列を含む（又はからなる）。さらなる実施形態において、ＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ又はＦVIIIをコードする核酸配列は、それぞれ、ＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ又はＦVIII核酸配列に対する少なくとも９５％（少なくとも９５、９６、９７、９８、９９又は１００％など）の配列同一性を有する核酸配列を含む（又はからなる）。一実施形態において、ＣＦＴＲをコードする核酸配列は配列番号７により提供され、Ａ１ＡＴをコードする核酸配列は配列番号１５により、若しくは配列番号２６の相補配列により提供され、並びに／あるいはＦVIIIをコードする核酸配列は配列番号１６及び配列番号３０により、若しくは配列番号２８及び配列番号３１のそれぞれの相補配列、又はそのバリアントにより提供される。

本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、バリアント配列も包含する。したがって、本発明の導入遺伝子によりコードされるポリペプチドは、それぞれ、機能的なＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ又はＦVIIIポリペプチド配列に対する少なくとも９０％（少なくとも９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％など）の配列同一性を有してもよい。さらなる実施形態において、ＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ又はＦVIII導入遺伝子のアミノ酸配列は、それぞれ、機能的なＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ又はＦVIIIポリペプチド配列に対する少なくとも９５％（少なくとも９５、９６、９７、９８、９９又は１００％など）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む（又はからなる）。一実施形態において、本発明の導入遺伝子によりコードされるＡ１ＡＴタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２７のアミノ酸配列、又はそのバリアントを含む（又はからなる）。好ましくは、本発明の前記バリアントＡ１ＡＴタンパク質は、配列番号２７との少なくとも９０％（少なくとも９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％など）、より好ましくは、少なくとも９５％又はそれ以上の配列同一性を有する。

一実施形態において、ＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ又はＦVIIIをコードする核酸配列は、それぞれ、ＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ又はＦVII相補的ＤＮＡ配列を含む（又はからなる）。一実施形態において、ＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ又はＦVIII導入遺伝子は、配列最適化されたＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ又はＦVIII（ｓｏＣＦＴＲ２、ｓｏＡ１ＡＴ又はＦVIII）である。例は、それぞれ、配列番号７、配列番号１５及び配列番号１６により提供される。例示的な相補配列最適化されたＡ１ＡＴ配列は、配列番号２６により示される。例示的な相補配列最適化されたＦVIII配列は、配列番号２８及び配列番号３１により示される。

本発明の一実施形態において、Ｆ／ＨＮベクター導入遺伝子発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ，cytomegalovirus）プロモーターにより駆動される。別の実施形態において、ベクター導入遺伝子発現は、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーターにより駆動される。好ましい実施形態において、ベクター導入遺伝子発現は、ハイブリッドヒトＣＭＶエンハンサー／ＥＦ１ａ（ｈＣＥＦ）プロモーターにより駆動される。一実施形態において、ｈＣＥＦプロモーターは、ＡＧ、ＴＧ又はＧＴのいずれか１つで置き換えられた全てのＣＧジヌクレオチドを有する。したがって、一実施形態において、ｈＣＥＦプロモーターは、ＣｐＧを含まない。

一実施形態において、レンチウイルスベクターを、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ｓｏＣＦＴＲ２−ＩＣプラスミドを用いて産生することができる。この実施形態において、ＣＦＴＲはｈＣＥＦプロモーターの制御下で発現される。このレンチウイルスベクターは、ＳＩＶ Ｆ／ＨＮエレメント、並びにｈＣＥＦプロモーターの制御下のＣＦＴＲを含むインテグラーゼコンピテント発現カセットを含むため、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ｓｏＣＦＴＲ２−ＩＣを含むと記載することができる。本発明のこのレンチウイルスベクターは、過度の免疫応答を誘導することなく、気道細胞中で長く続く、反復性の、高レベルの発現をもたらすことができる。結果として、本発明は、インビボでの遺伝子療法、例えば、ＣＦ肺疾患の治療のためのＣＦ肺へのＣＦＴＲ遺伝子導入の効率的な手段を提供する。

好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターを、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ｓｏＡ１ＡＴプラスミドを用いて産生することができる。この実施形態において、Ａ１ＡＴは、ｈＣＥＦプロモーターの制御下で発現される。このレンチウイルスベクターは、ＳＩＶ Ｆ／ＨＮエレメント、並びにｈＣＥＦプロモーターの制御下のＡ１ＡＴを含む発現カセットを含むため、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ｓｏＡ１ＡＴを含むと記載することができる。本発明のこのレンチウイルスベクターは、過度の免疫応答を誘導することなく、気道細胞中で長く続く、反復性の、高レベルの発現をもたらすことができる。結果として、本発明は、インビボでの遺伝子療法、例えば、その後循環系に分泌される（本明細書に記載のように）Ａ１ＡＴの産生のための患者の肺又は鼻へのＡ１ＡＴ遺伝子導入の効率的な手段を提供する。したがって、このベクター及びＡ１ＡＴ導入遺伝子を含む本発明の他のベクターを、Ａ１ＡＴ欠損症、又は本明細書に記載の他の適応症の治療において用いることができる。

別の好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターを、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＨＦVIII−Ｖ３、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＨＦVIII−Ｖ３、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＨＦVIII−Ｎ６−ｃｏ及び／又はＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＨＦVIII−Ｎ６−ｃｏプラスミドを用いて産生することができる。ＨＦVIIIとは、ヒトＦVIIIを指す。この実施形態において、ＦVIIIは、ｈＣＥＦ又はＣＭＶプロモーターの制御下で発現される。これらのレンチウイルスベクターは、ＳＩＶ Ｆ／ＨＮエレメント、並びにｈＣＥＦ／ＣＭＶプロモーターの制御下にＦVIIIを含む発現カセットを含むため、それぞれ、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＨＦVIII−Ｖ３、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＨＦVIII−Ｖ３、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＨＦVIII−Ｎ６−ｃｏ及びＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＨＦVIII−Ｎ６−ｃｏを含むと記載することができる。Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＨＦVIII−Ｖ３、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＨＦVIII−Ｖ３、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＨＦVIII−Ｎ６−ｃｏ及び／又はＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＨＦVIII−Ｎ６−ｃｏプラスミドを用いて産生されるウイルスベクター産物はまた、ｖＧＭ１２６、ｖＧＭ１２７、ｖＧＭ１４２及びｖＧＭ１２９としても知られる（図２２を参照されたい）。本発明のこれらのレンチウイルスベクターは、過度の免疫応答を誘導することなく、気道細胞中で長く続く、反復性の、高レベルの発現をもたらすことができる。結果として、本発明は、インビボでの遺伝子療法、例えば、その後循環系に分泌される（本明細書に記載のように）ＦVIIIの産生のための患者の肺又は鼻へのＦVIII遺伝子導入の効率的な手段を提供する。したがって、これらのベクター及びＦVIII導入遺伝子を含む本発明の他のベクターを、血友病、又は本明細書に記載の他の適応症の治療において用いることができる。

本発明のレンチウイルスベクターは、プロモーターと導入遺伝子との間にイントロンを含有しない。同様に、本発明のベクターゲノムプラスミド（本明細書に記載の前記レンチウイルスベクターを生成するために用いられる）もまた、プロモーターと導入遺伝子との間にイントロンを含有しない。したがって、本発明は、一実施形態において、ｈＣＥＦプロモーターと、発現させようとするコード配列との間にイントロンを提供しない。１つの好ましい実施形態において、発現させようとするコード配列は、ＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ及び／又はＦVIII核酸配列である。

一実施形態において、本発明のベクターは、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ，central polypurine tract）及びウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ，Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element）を含む。一実施形態において、ＷＰＲＥ配列は、配列番号８により提供される。

一実施形態において、本発明のベクターは、遺伝子療法のために用いられる。一実施形態において、治療される疾患は、ＣＦである。本発明の別の実施形態において、治療される疾患は、原発性線毛運動障害（ＰＣＤ，Primary Ciliary Dyskinesia）である。一実施形態において、ベクターは、急性肺傷害を治療するために用いられる。本発明の一実施形態において、治療される疾患は、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）欠損症、アルファ１−アンチトリプシン欠損症（Ａ１ＡＤ）、肺胞タンパク症（ＰＡＰ，pulmonary alveolar proteinosis）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。別の実施形態において、疾患は炎症、免疫又は代謝状態である。

治療される疾患は、心血管疾患又は血液障害、特に、血液凝固欠損症であってもよい。したがって、いくつかの実施形態において、治療される疾患は、血友病Ａ、血友病Ｂ、又は血友病Ｃ、第VII因子欠損症及び／又はフォン・ヴィレブランド病である。さらに別の実施形態において、治療される疾患は、炎症疾患、感染症又はリソソーム蓄積症などの代謝状態である。

本発明によるＡ１ＡＴ遺伝子療法を用いて治療することができる疾患の非限定的な例としては、１型及び２型糖尿病、急性心筋梗塞、虚血性心疾患、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片拒絶、移植片対宿主（ＧｖＨ）疾患、多発性硬化症、肝疾患、肝硬変、血管炎並びに細菌及び／又はウイルス感染症などの感染症が挙げられる。

本発明の一態様において、ベクターは、疾患を治すための導入遺伝子を提供することにより疾患を効率的に治療することができる。例えば、根底にある変異とは無関係に、ＣＦ患者における肺疾患を改善又は防止するためのＣＦＴＲ遺伝子の機能的コピーの挿入。

本発明の別の実施形態において、レンチウイルス産生方法が提供される。この実施形態において、本発明の方法は、拡張性のあるＧＭＰ適合法である。したがって、本発明の方法は、高力価の精製されたＦ／ＨＮベクターの生成を可能にする。

本発明の方法は、以下のステップ：
（ａ）細胞を浮遊状態で増殖させるステップ；
（ｂ）１又は２以上のプラスミドを、前記細胞にトランスフェクトするステップ；
（ｃ）ヌクレアーゼを添加するステップ；
（ｄ）レンチウイルスを採取するステップ；
（ｅ）トリプシンを添加するステップ；及び
（ｆ）精製ステップ
を含む。

本発明の方法の一実施形態において、１又は２以上のプラスミドは、ベクターゲノム、Ｇａｇ−Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、Ｆ及びＨＮを提供する。したがって、それぞれ、ベクターゲノム、Ｇａｇ−Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、Ｆ及びＨＮのそれぞれのための５つのプラスミドが存在してもよい。本発明の好ましい５プラスミド法において、ベクターゲノムプラスミドは、導入遺伝子を含む、最終的なレンチウイルスベクター中にパッケージングされる全ての遺伝物質をコードする。典型的には、ベクターゲノムプラスミド中に見出される遺伝物質のほんの一部が、最終的にウイルス中にある。このベクターゲノムプラスミドを、本明細書では「pDNA1」と呼ぶことができる。他の４つのプラスミドは、Ｇａｇ−Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、Ｆ及びＨＮタンパク質をコードする製造プラスミドである。これらのプラスミドを、それぞれ、「pDNA2a」、「pDNA2b」、「pDNA3a」及び「pDNA3b」と呼ぶことができる。

本発明の一実施形態において、レンチウイルスは、ＳＩＶ１などのＳＩＶ、好ましくは、ＳＩＶ−ＡＧＭである。一実施形態において、Ｆ及びＨＮタンパク質は、センダイウイルスなどのパラミクソウイルスに由来する。一実施形態において、ベクターゲノムプラスミド（pDNA1）は、導入遺伝子と導入遺伝子プロモーターとを含む。

ＣＦＴＲに関する特定の実施形態において、５つのプラスミドは、図１Ａ〜１Ｅを特徴とし、したがって、pDNA1は図１ＡのpGM326プラスミドであり、pDNA2aは図１ＢのpGM299プラスミドであり、pDNA2bは図１ＣのpGM299プラスミドであり、pDNA3aは図１ＤのpGM301プラスミドであり、pDNA3bは図１ＥのpGM303プラスミドである。この実施形態において、最終的なＣＦＴＲ含有レンチウイルスベクターを、ｖＧＭ０５８と呼ぶことができる（実施例を参照されたい）。ｖＧＭ０５８ベクターが、本発明の好ましい実施形態である。

Ａ１ＡＴに関する実施形態において、５つのプラスミドは、図１５Ａ（したがって、プラスミドpDNA1はpGM407であってもよい）及び図１Ｂ〜Ｅ（特定のＣＦＴＲ実施形態について上記された通り）を特徴としてもよい。

ＦVIIIに関する実施形態において、５つのプラスミドは、図２２Ｃ〜Ｆ（したがって、プラスミドpDNA1はpGM411、pGM412、pGM413又はpGM414であってもよい）及び図１Ｂ〜Ｅを特徴としてもよい。

本発明のこれらの実施形態において、図１Ａで定義されるプラスミドは配列番号１により表される；図１Ｂで定義されるプラスミドは配列番号２により表される；図１Ｃで定義されるプラスミドは配列番号３により表される；図１Ｄで定義されるプラスミドは配列番号４により表される；図１Ｅで定義されるプラスミドは配列番号５により表される；図１５Ａで定義されるプラスミドは配列番号９により表される；並びに図２２Ｂで定義されるＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＨＦVIII−Ｖ３、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＨＦVIII−Ｖ３、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＨＦVIII−Ｎ６−ｃｏ及び／又はＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＨＦVIII−Ｎ６−ｃｏプラスミドは、それぞれ、配列番号１１〜１４により表される。

本発明の５プラスミド法において、５つのプラスミド全部が最終的なレンチウイルスベクターの形成に寄与する。レンチウイルスベクターの製造中に、ベクターゲノムプラスミド（pDNA1）は、ウイルス製造にとって重要である、エンハンサー／プロモーター、Ｐｓｉ、ＲＲＥ、ｃＰＰＴ、ｍＷＰＲＥ、ＳＩＮ ＬＴＲ、ＳＶ４０ポリＡ（図１Ａを参照されたい）を提供する。pDNA1の非限定的な例としてpGM326を用いた場合、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０ポリＡ、ｃｏｌＥ１ Ｏｒｉ及びＫａｎＲが本発明のレンチウイルスベクター（例えば、ｖＧＭ０５８）の製造において含まれるが、最終的なウイルスベクター中には見出されない。pGM326由来のＲＲＥ、ｃＰＰＴ（セントラルポリプリン配列）、ｈＣＥＦ、ｓｏＣＦＴＲ２（導入遺伝子）及びｍＷＰＲＥは、最終的なウイルスベクター中に見出される。ＳＩＮ ＬＴＲ（長末端反復配列、ＳＩＮ／ＩＮ自己不活化）及びＰｓｉ（パッケージングシグナル）を、最終的なウイルスベクター中に見出すことができる。

本発明の他のレンチウイルスベクターについて、他のベクターゲノムプラスミド（pDNA1）由来の対応するエレメントが製造にとって必要である（しかし、最終的なベクター中には見出されない）、又は最終的なウイルスベクター中に存在する。

pDNA3a及びpDNA3b由来のＦ及びＨＮタンパク質（好ましくは、センダイＦ及びＨＮタンパク質）は、最終的なレンチウイルスベクターによる標的細胞の感染、すなわち、患者の上皮細胞（典型的には、本明細書に記載の肺又は鼻細胞）の進入にとって重要である。pDNA2a及びpDNA2bプラスミドの産物は、ウイルス形質導入、すなわち、宿主のゲノムへのレンチウイルスＤＮＡの挿入にとって重要である。プロモーター、調節エレメント（ＷＰＲＥなど）及び導入遺伝子は、標的細胞内での導入遺伝子発現にとって重要である。

一実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｆ）は、順次実施される。一実施形態において、細胞はＨＥＫ２９３細胞又は２９３Ｔ／１７細胞である。一実施形態において、細胞は動物成分非含有（無血清）培地中で増殖される。一実施形態において、トランスフェクションは、PEIPro（商標）の使用によって実施される。一実施形態において、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ、例えば、Benzonase（登録商標）である。一実施形態において、トリプシン活性は、TrypLE Select（商標）などの、動物源を含まない組換え酵素によって提供される。

本発明の一実施形態において、ヌクレアーゼの添加は、採取前の段階で行われる。代替的な実施形態において、ヌクレアーゼの添加は、採取後の段階で行われる。別の実施形態において、トリプシンの添加は、採取前の段階で行われる。別の実施形態において、トリプシンの添加は、採取後の段階で行われる。

一実施形態において、精製ステップは、クロマトグラフィーステップを含む。この実施形態において、混合様式のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ，size exclusion chromatography）が用いられる。一実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーが用いられる。この実施形態において、溶出ステップのために塩勾配を用いない。

一実施形態において、この方法は、本発明のレンチウイルスベクターを産生するために用いられる。この実施形態において、本発明のベクターは、ＣＦＴＲ、Ａ１ＡＴ及び／又はＦVIII遺伝子を含む。代替的な実施形態において、本発明のベクターは、上記の遺伝子のいずれか、又は上記タンパク質をコードする遺伝子を含む。

本発明の方法の一実施形態において、図１Ａ〜１Ｅ、図１５Ａ及び／又は図２２Ｃ〜２２Ｆにより提供される１又は２以上の特定のプラスミド構築物の任意の組合せを用いて、本発明のベクターを提供する。

本発明はさらに、本発明のレンチウイルスを対象に投与するステップを含む、疾患を治療する方法を提供する。この実施形態において、本発明は、肺疾患の治療における使用のための本発明のレンチウイルスベクターを提供する。一実施形態において、疾患は慢性疾患である。特定の実施形態において、ＣＦを治療する方法が提供される。他の実施形態において、原発性線毛運動障害（ＰＣＤ）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）欠損症、アルファ１−アンチトリプシン欠損症（Ａ１ＡＤ）、肺胞タンパク症（ＰＡＰ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を治療する方法が提供される。別の実施形態において、疾患は炎症、免疫又は代謝状態である。

別の実施形態において、疾患は、心血管疾患又は血液障害、特に、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、第VII因子欠損症及び／若しくはフォン・ヴィレブランド病などの血液凝固欠損症、炎症疾患、感染症又はリソソーム蓄積症などの代謝状態であってもよい。

疾患は、１型及び２型糖尿病、急性心筋梗塞、虚血性心疾患、関節リウマチ、炎症性腸疾患、移植片拒絶、移植片対宿主（ＧｖＨ）疾患、多発性硬化症、肝疾患、肝硬変、血管炎並びに細菌及び／又はウイルス感染症などの感染症であってもよい。

本発明のレンチウイルスベクターを、所望の治療効果を達成するのに適切な任意の用量で投与することができる。臨床医又は医師であれば、適切な用量を、標準的な技術を用いて、及びその研究の通常の過程の中で決定することができる。好適な用量の非限定的な例としては、１×１０^８形質導入単位（ＴＵ，transduction unit）、１×１０^９ＴＵ、１×１０^１０ＴＵ、１×１０^１１ＴＵ又はそれ以上が挙げられる。

本発明はまた、上記のレンチウイルスベクターと、薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供する。薬学的に許容される担体の非限定的な例としては、水、生理食塩水、及びリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。しかしながら、いくつかの実施形態において、組成物は凍結乾燥形態にあり、その場合、それはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，bovine serum albumin）などの安定剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、長期保存を容易にするために、チオマーサル又はアジ化ナトリウムなどの保存剤と共に組成物を製剤化することが望ましい。

本発明のベクターを、任意の適切な経路により投与することができる。本発明の組成物（上記の通り）を、対象の呼吸器系に指向させるのが望ましいことがある。呼吸器中の感染部位への治療／予防組成物又は薬剤の効率的な伝送を、経口又は鼻内投与により、例えば、エアロゾル（例えば、鼻腔用スプレー）として、又はカテーテルにより達成することができる。典型的には、本発明のレンチウイルスベクターは、臨床的に関連するネブライザー、カテーテル及びエアロゾルなどの中で安定である。

鼻内投与のための製剤は、点鼻剤又は鼻腔用スプレーの形態にあってもよい。鼻内製剤は、１００〜５０００μｍの範囲、例えば、５００〜４０００μｍ、１０００〜３０００μｍ又は１００〜１０００μｍのおよその直径を有する液滴を含んでもよい。あるいは、容量を単位とすれば、液滴は約０．００１〜１００μｌ、例えば、０．１〜５０μｌ又は１．０〜２５μｌ、又は例えば、０．００１〜１μｌの範囲にあってもよい。

エアロゾル製剤は、粉末、懸濁液又は溶液の形態を取ってもよい。エアロゾル粒子のサイズは、エアロゾルの送達能力と関連する。より小さい粒子は、より大きい粒子よりも呼吸気道をさらに下へ移動して肺胞に向かうことができる。一実施形態において、エアロゾル粒子は、気管支、細気管支、及び肺胞の全長に沿った送達を容易にするための直径分布を有する。あるいは、粒子径分布を選択して、呼吸気道、例えば、肺胞の特定の部分を標的とすることができる。薬剤のエアロゾル送達の場合、粒子は０．１〜５０μｍ、好ましくは１〜２５μｍ、より好ましくは１〜５μｍのおよその範囲の直径を有してもよい。

エアロゾル粒子は、ネブライザー（例えば、口を介する）又は鼻腔用スプレーを用いる送達のためのものであってもよい。エアロゾル製剤は、場合により、推進剤及び／又は界面活性剤を含有してもよい。

本明細書で用いられる用語「核酸配列」と「ポリヌクレオチド」は互換的に用いられ、任意の長さ制限を暗示しない。本明細書で用いられる用語「核酸」と「ヌクレオチド」は互換的に用いられる。用語「核酸配列」及び「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）及びＲＮＡ配列を包含する。用語「導入遺伝子」と「遺伝子」も互換的に用いられ、両用語は標的タンパク質をコードするその断片又はバリアントを包含する。

本発明の導入遺伝子は、その天然の環境から取り除かれた核酸配列、組換え又はクローニングされたＤＮＡ単離物、及び化学的に合成されたアナログ又は異種の系により生物学的に合成されたアナログを含む。

本発明のポリヌクレオチドを、当技術分野で公知の任意の手段によって調製することができる。例えば、大量のポリヌクレオチドを、好適な宿主細胞中での複製によって産生することができる。所望の断片をコードする天然又は合成ＤＮＡ断片を、原核又は真核細胞中に導入し、その中で複製することができる、組換え核酸構築物、典型的には、ＤＮＡ構築物中に組み込むことができる。通常、ＤＮＡ構築物は、酵母又は細菌などの単細胞宿主中での自己複製にとって好適であるが、培養された昆虫、哺乳動物、植物又は他の真核細胞株のゲノム内への導入及び組込みを意図することもできる。

本発明のポリヌクレオチドを、化学的合成により、例えば、ホスホラミダイト法又はトリエステル法により産生し、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成装置上で実施することもできる。二本鎖断片を、適切な条件下で相補鎖を合成し、鎖を一緒にアニーリングするか、又は適切なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加することにより、化学的合成の一本鎖産物から取得することができる。

核酸配列に適用した場合、本発明の文脈における用語「単離された」とは、ポリヌクレオチド配列がその天然の遺伝子環境から取り除かれており、したがって、他の外来の、又は望ましくないコード配列を含まず（しかし、プロモーター及びターミネーターなどの天然の５’及び３’非翻訳領域は含んでもよい）、遺伝子操作されたタンパク質産生系内での使用にとって好適な形態にあることを示す。そのような単離された分子は、その天然の環境から分離されたものである。

遺伝子コードの縮重性を考慮すれば、本発明のポリヌクレオチド間でかなりの配列変化が可能である。所与のアミノ酸の全ての可能なコドンを包含する縮重コドンは、以下に記載される。

当業者であれば、それぞれのアミノ酸をコードする全ての可能なコドンを代表する、縮重コドンを決定するときに可撓性が存在することを理解できる。例えば、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、バリアントアミノ酸配列をコードしてもよいが、当業者であれば、本発明のアミノ酸配列を参照することによってそのようなバリアント配列を容易に同定することができる。

「バリアント」核酸配列は、参照核酸配列（又はその断片）に対する実質的な相同性又は実質的な類似性を有する。他の核酸（又はその相補鎖）と最適に整列させたときに（適切なヌクレオチド挿入又は欠失を用いて）、ヌクレオチド塩基の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％又は９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在する場合、核酸配列又はその断片は、参照配列と「実質的に相同」（又は「実質的に同一」）である。核酸配列の相同性決定のための方法は、当技術分野で公知である。

あるいは、「バリアント」と参照配列がストリンジェント（例えば、高度にストリンジェント）なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができる場合、「バリアント」核酸配列は、参照配列（又はその断片）と実質的に相同（又は実質的に同一）である。核酸配列のハイブリダイゼーションは、当業者により容易に理解されるように、塩基組成、相補鎖の長さ、及びハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数に加えて、塩濃度（例えば、ＮａＣｌ）、温度、又は有機溶媒などの条件によって影響される。好ましくは、ストリンジェントな温度条件が用いられ、一般に、３０℃を上回る、典型的には、３７℃を上回る、好ましくは、４５℃を上回る温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、通常、１０００ｍＭ未満、典型的には、５００ｍＭ未満、好ましくは、２００ｍＭ未満である。ｐＨは、典型的には７．０〜８．３である。パラメータの組合せがいずれか単一のパラメータよりもはるかに重要である。

核酸配列同一性パーセンテージを決定する方法は当技術分野で公知である。例えば、核酸配列同一性を評価する場合、規定数の連続するヌクレオチドを有する配列を、本発明の核酸配列の対応する部分由来の核酸配列（同じ数の連続するヌクレオチドを有する）と整列させることができる。核酸配列同一性パーセンテージを決定するための当技術分野で公知の手段としては、ヌクレオチドＢＬＡＳＴが挙げられる。

当業者であれば、異なる種が「優先的コドン使用」を示すことを理解できる。本明細書で用いられる用語「優先的コドン使用」とは、ある特定の種の細胞中で最も頻繁に用いられ、したがって、それぞれのアミノ酸をコードする可能なコドンを代表する１つ又はいくつかを好むコドンを指す。例えば、アミノ酸トレオニン（Ｔｈｒ）を、ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、又はＡＣＴによりコードさせることができるが、哺乳動物宿主細胞中では、ＡＣＣは最も一般的に用いられるコドンである；他の種においては、異なるコドンが優先的であってもよい。特定の宿主細胞種に優先的なコドンを、当技術分野で公知の様々な方法によって本発明のポリヌクレオチド中に導入することができる。組換えＤＮＡへの優先的コドン配列の導入は、例えば、特定の細胞型又は種内でのタンパク質翻訳をより効率的にすることによってタンパク質の産生を増強することができる。

したがって、本発明の一実施形態において、核酸配列は、宿主細胞中での発現のためにコドン最適化される。

所望のポリヌクレオチドの「断片」は、前記完全長ポリヌクレオチドの配列由来の一連の連続するヌクレオチドを含む。例えば、所望のポリヌクレオチドの「断片」は、前記ポリヌクレオチドの配列由来の少なくとも３０個の連続するヌクレオチド（例えば、前記ポリヌクレオチドの少なくとも３５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０又は１０００個の連続する核酸残基）を含んでもよい（又はからなってもよい）。断片は、少なくとも１つの抗原決定基を含んでもよい、及び／又は所望の対応するポリペプチドの少なくとも１つの抗原エピトープをコードしてもよい。典型的には、本明細書に定義される断片は、完全長ポリヌクレオチド又はポリペプチドと同じ機能を保持する。

ここで、本発明を、ほんの一例として、添付の図面を参照して説明する。
本発明において用いられる例示的プラスミドを示す図である。図１Ａ〜図１Ｅは、本発明のベクターの産生のために用いられるプラスミドの略図を示す。本発明の一実施形態において、図１Ａは、本発明の手段を提供する。 ４×１０^８ＴＵのＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰをかん流させたマウス鼻組織中でのＦ／ＨＮ−ＳＩＶ導入遺伝子発現及び治療後の示された日数で決定されたＥＧＦＰ発現の持続期間を示す図である。鼻組織をベクター希釈剤（ＰＢＳ）でかん流させた陰性対照を示す。 治療後１年で示すことによる、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ導入遺伝子発現の一貫性を示す図である。ＥＧＦＰ発現を、治療後３６０日での１０匹の独立したマウスにおいて決定した。 Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ導入遺伝子発現の細胞分布を示す図である。ＥＧＦＰ発現を、治療後３０日でマウス鼻腔の組織切片（鼻の先端から２ｍｍ）中で決定した。ＥＧＦＰ陽性細胞は、白点状のシグナルを産生する。 マウス鼻のＦ／ＨＮ−ＳＩＶ治療により形質導入された細胞型を示す図である。マウス鼻腔中で形質導入された細胞の６９％は、線毛呼吸上皮細胞であった。形質導入された他の細胞型は、嗅上皮中の神経細胞（２１％）及び扁平上皮細胞（７％）を含んでいた。 マウス鼻へのＦ／ＨＮ−ＳＩＶの反復投与を示す図である。１用量のＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｘ又は２用量のＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ、次いで、１用量のＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｘを２８日間隔で形質導入された（図１のように）マウス鼻組織。したがって、マウス鼻へのＦ／ＨＮ−ＳＩＶの反復投与は、遺伝子発現レベルを変化させない。導入遺伝子発現を、主要な非ウイルス遺伝子導入製剤（ＧＬ６７Ａと複合体化したＣＭＶ−Ｌｕｘプラスミド）と比較する。 ヒト気液界面（ＡＬＩ）呼吸器細胞培養物の形質導入を示す図である。ヒトＡＬＩ培養物に、示された感染多重度（ＭＯＩ，multiplicity of infection）でＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−Ｌｕｘを形質導入し、治療後５日目でＬｕｘ発現について画像化した。 Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶが機能的なＣＦＴＲ発現を指示することができることを示す図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、５００ＭＯＩでＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＣＦＴＲを形質導入し、ＣＦＴＲ機能的活性をヨウ化物流出により決定した。Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰは、陰性対照として役立った。 Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶが、ヒツジ及びヒトの一次肺細胞並びにマウス肺を効率的に形質導入することを示す図である。図９Ａは、ヒト鼻刷子細胞（ＭＯＩ２５０）並びにｅｘ ｖｉｖｏで培養されたヒト及びヒツジ肺スライス（１Ｅ７ ＴＵ／スライス）のＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｘによる形質導入が、形質導入後２４〜４８時間で実質的なルシフェラーゼ導入遺伝子発現をもたらすことを示す。図９Ｂ及び図９Ｃは、気液界面で培養された（約１×１０^５の）一次ヒトＣＦ肺細胞（ＣＦ ｈＡＬＩ）の、ＣＭＶ−及びｈＣＥＦ導入遺伝子プロモーターを含有する（３Ｅ７ ＴＵの）Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｓｏＣＦＴＲ２ベクターによる形質導入を示す。（Ｂ）形質導入後６〜８日でのベクターコピー数（内因性ＣＦＴＲ ＤＮＡのコピーあたりのプロウイルスＤＮＡのコピー）。（Ｃ）形質導入後６〜８日でのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ発現レベル（％ＶＥ：内因性ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの１コピーあたりのＣＦＴＲ ｍＲＮＡのコピー数×１００）。（Ｃ）中の水平線は、治療閾値であると考えられる、５％ＶＥの標的発現レベルを表す。インテグラーゼ欠損型（ＩＤ）又はインテグラーゼコンピテント型（ＩＣ若しくは標識なし）のＣＭＶ−、ＥＦ１ａＳ及びｈＣＥＦプロモーターを含有するＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＥＧＦＰＬｕｘベクターのインビボでの送達後、気道細胞導入遺伝子発現を鼻（Ｄ）及び肺（Ｅ）マウス上皮中で決定した（ｎ＝６〜１０／群）。ルシフェラーゼ導入遺伝子発現の時間経過を、反復的インビボ生物発光画像化によりモニタリングし、送達用量に対して正規化した。図９Ｆは、形質導入後１４日目でのインビボでのマウス形質導入後の代表的な生物発光画像を示す。図９Ｇは、形質導入後５〜６日での非ＣＦ ｈＡＬＩのインビトロでの形質導入後の代表的な生物発光画像を示す。図９Ｈは、１．６Ｅ８ ＴＵのＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＥＧＦＰＬｕｘ（ｖＧＭ０２０）の送達後のマウス鼻上皮における形質導入後１４日でのＥＧＦＰ発現を示す。ＥＧＦＰを、免疫組織化学により可視化し、核をＤＡＰＩにより可視化した。図９Ｉは、反復的生物発光画像化によりモニタリングし、送達用量に対して正規化した、非ＣＦ ＡＬＩ中でのルシフェラーゼ導入遺伝子発現の時間経過を示す。 Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶがインビボでヒツジ肺を効率的に形質導入することを示す図である。図Ａは、ヒツジ肺へのモデルウイルス送達に対して、本発明者らが直接的な気管支鏡による観察下で近位気道にアクリフラビンを注入した（約５分間にわたって３×１００μＬアリコート）ことを示す。アクリフラビンの分布は、死後に解剖された橙色の気道によって理解することができる。アクリフラビンは誘導気道に大きく制限され、肺胞領域には存在しないことに留意されたい。矢印は、およその注入部位を示す。定規上の数字はｃｍである。図１０Ｂは、ヒツジ肺のダイアグラム表示である（気管中心／上）。緑色の丸印は、（Ａ）中の領域を表す。（Ｂ）において、線は、ｎ＝３の個々のヒツジ（動物コードＴ１２１、Ｔ１５６及びＴ２５１）に３×１００μＬアリコートの２．２Ｅ９ ＴＵ／ｍＬ（合計６．６Ｅ８ ＴＵ）のＦ／ＨＮ ＳＩＶ ＣＭＶ−ＥＧＦＰＬｕｘを送達するための気管支鏡の通過を示す。送達後７日目で、５〜６個の組織試料ブロックを、死後、注入部位から約１ｃｍ間隔で採取した。ブロックを、２〜３個のほぼ等価な試料に分割し、（Ｃ）タンパク質含量に対して正規化されたルシフェラーゼアッセイ；及び（Ｄ）内因性ＣＦＴＲ ｍＲＮＡレベルに対して正規化された定量的ＲＴ−ＰＣＲにより導入遺伝子発現について分析した。（Ｃ）における水平線は、非ウイルス遺伝子導入ベクターで処置された試料中で認められた最も高いルシフェラーゼ活性、及び（Ｄ）治療閾値であると考えられる、５％ＶＥの標的発現レベルを表す。 Ｆ／ＨＮ ＳＩＶベクターの産生及び精製を示す図である。Ｆ／ＨＮ ＳＩＶベクターを、本発明の拡張可能な方法を用いて、ｐＨ制御されたWAVE Bioreactor（GE社）中、１Ｌのスケールにて浮遊状態で増殖させた２９３Ｔ細胞の５プラスミド（pDNA）ＰＥＩ媒介性一過的トランスフェクションにより産生した。ベクターを深層／エンド濾過（GE/Pall社）により清澄化し、夾雑する核酸をBenzonase（登録商標）（Merck社）を用いて除去し、ベクターをTrypLE Select（商標）（Life Technology社）で活性化し、陰イオン交換膜クロマトグラフィー（Pall社）及び接線流濾過（Spectrum社）により精製及び濃縮した。全てのプロセス容器、容器及びカラムは、単回使用のｃＧＭＰ準拠であった。プラスミドＤＮＡを除く全ての試薬は、動物源を含まないｃＧＭＰ準拠であった。様々なベクター構成（導入遺伝子プロモーター、導入遺伝子、インテグラーゼ状態）からのデータを示す。物理的及び機能的力価を、Ｑ−ＰＣＲを用いて決定した。（Ａ）最初に清澄化された採取物及び最終精製産物からの物理的力価。中央プロセス収率は約４４％である。（Ｂ）最終産物の機能的力価。中央機能的力価は産物１ｍＬあたり約２×１０^９ＴＵであり、バイオリアクター容量１Ｌあたり約３×１０^９ＴＵである。標的の生産性及び収率を超えていた。収率が低い場合、ＣＦＴＲベクターはＣＭＶ導入遺伝子プロモーターを使用する。収率が高い場合、ＣＦＴＲベクターはＥＦ１ａＳ及びｈＣＥＦ導入遺伝子プロモーターを使用する。（Ｃ）最終産物粒子：感染性比は緊密にクラスター化し、他の高品質ベクター製造業者（Oxford BioMedica社、BlueBirdBio社）からの値と類似する。中央粒子：感染性比は約３００である。産物の一貫性を、製造方法のＱｂＤに基づく規制当局の認可への最終的な移行を支援する「実験設計」法の使用により達成した。（Ｄ）最終産物の機能的力価は、初期の物理的力価と強く相関し、これは、方法ステップを制限するベクター濃度がない非飽和プロセス条件を示しており、精製スケールアップが効率的であることを示唆する。 形質導入されたマウスの挿入部位（ＩＳ，insertion site）プロファイリング及び生存を示す図である。図１２Ａ〜Ｆは、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶを形質導入されたマウス肺及びＶＳＶ−Ｇ−ＨＩＶベクターを形質導入されたマウス網膜からのＩＳプロファイルの比較を提供する（Bartholomae et al, Mol Ther (2011) 19:703-710）。（Ａ、Ｃ、Ｅ）に関するＩＳプロファイルは、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶを形質導入された２匹のマウス由来の肺ＤＮＡのディープシークエンシングに由来するものであり、（Ｂ、Ｄ、Ｆ）については網膜ＶＳＶ−Ｇ−ＨＩＶ ＩＳ配列に由来するものであった（Schmidt laboratory社）。（Ａ、Ｂ）Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザにより生成されたカリオグラム上にプロットされた凝集したＩＳ部位（肺、２８６２；網膜、２６２）。（Ｃ、Ｄ）転写開始部位（ＴＳＳ，transcription start site）までのＩＳ距離。それぞれの距離ビンにおけるＩＳ数はバーの上に示される。典型的なＩＳはいくつかのＴＳＳの近くにあるため、その和は分析されるＩＳの総数を超える。ＵＣＳＣゲノムブラウザ及びＧＲＥＡＴゲノム分析装置（great.stanford.edu）の使用により、グラフを生成した。（Ｅ、Ｆ）染色体あたりのランダムな挿入頻度（菱形）と観察された挿入頻度（四角）とのQuickMap（www.gtsg.org）比較。（Ｇ）バッファーで処置されたマウス（明るい灰色の線、２４カ月のデータ）と比較した、前駆体Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶベクター（接着細胞を用いて公知の方法にしたがって製造されたウイルスベクター：黒色の線、２４カ月のデータ）及び現行世代のベクター（ＧＴＣ：暗い灰色の線、８カ月のデータ）で処置されたマウスの生存。鼻をすすることによりバッファー又は約１Ｅ７ ＴＵのウイルスで処置されたマウスを含む様々な実験から凝集したデータ。 ＣｐＧに富む導入遺伝子によるレンチウイルス遺伝子導入を用いた、ｈＣＥＦ媒介性呼吸器導入遺伝子発現−投与後の日数に対する導入遺伝子発現（平均放射輝度ｐ／ｓ／ｃｍ^２／ｓｒ）を示す図である。対照（ナイーブな肺）と比較して高レベルのＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼレポーター遺伝子発現が、投与後少なくとも１６８日間にわたって肺（四角）と鼻（丸）の両方において観察された。 本発明のＣＦＴＲレンチウイルスベクター（ｖＧＭ０５８）によるヒト腸オルガノイドの形質導入の効果を示す図である。左手のパネルは、ホルスコリンにより誘導された腫れが、ｖＧＭ０５８形質導入オルガノイド中で有意に（ｐ＜０．００１）減少した。右手のパネルにおいては、Ａ５４９細胞にｖＧＭ０５８又は対照ウイルスを形質導入し、放射性ヨウ化物流出アッセイを用いてＣＦＴＲ機能を定量した。有意な（ｐ＜０．０５）レベルのＣＦＴＲ媒介性ヨウ化物流出がｖＧＭ０５８形質導入細胞中で検出された。 図１５Ａは、本発明のＡ１ＡＴベクターの産生に用いられるプラスミドの略図を示す。本発明の一実施形態において、図１５Ａは本発明の手段を提供する。図１５Ｂは、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする対照プラスミドを示す。 Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶがＡＬＩ培養物中でヒト一次肺細胞を効率的に形質導入することを示す図である。特に、ヒトＡＬＩ培養物の形質導入は、形質導入後少なくとも８０日にわたって実質的なルシフェラーゼ導入遺伝子発現をもたらす。それぞれの点は、示された時点でｎ＝６ＡＬＩからの培地中のＲＬＵ／μｌの平均値を表す。垂直のバーは、平均の標準誤差を表す。 ＳＩＶ１ ｈＣＥＦ−ｓｏｇＬｕｘ（図１７Ａ）及びＳＩＶ１ ｈＣＥＦ−ｓｏｈＡＡＴ（図１７Ｂ）によるヒト肺スライス（ｎ＝６／群）の形質導入後の遺伝子発現を示す図である。高レベルの発現が観察された。それぞれの点は、示された時点でのｎ＝６肺スライスからの培地中のＲＬＵ／μｌの平均値を表す。垂直のバーは、平均の標準誤差を表す。 インビボでのレンチウイルス媒介性遺伝子導入（ＳＩＶ１ ｈＣＥＦ−ｓｏＧＬｕｘ）後のＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの長期的発現（１２カ月を超える）を示す図である。Ａ：肺組織ホモジェネート；Ｂ：気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液；Ｃ：血清。それぞれの点は、示された時点で採取された動物の１群（ｎ＝５又は６／群）におけるＲＬＵ／μｌの平均値を表す。 インビボでのレンチウイルス媒介性遺伝子導入（ＳＩＶ１ ｈＣＥＦ−ｓｏｈＡＡＴ）後のＡ１ＡＴ発現の高レベルの発現を示す図である。それぞれの点は、１匹の動物を表す。水平線は各群の中央値を表す。 インビボでのレンチウイルス媒介性遺伝子導入（ＳＩＶ１ ｈＣＥＦ−ｓｏｈＡＡＴ）後の上皮被覆液中のＡ１Ａ１のレベルを示す図である。インビボでのレンチウイルス媒介性遺伝子導入（ＳＩＶ１ ｈＣＥＦ−ｓｏｈＡＡＴ）。 図２２Ａは、本発明のＦVIIIベクターの産生のために用いられるＦVIII ｃＤＮＡ構築物の略図を示す。図２２Ｂは、本発明のウイルスベクターを示す。本発明の一実施形態において、図２２Ｂは本発明の手段を提供する。図２２Ｃ〜Ｆは、本発明のＦVIIIベクターの産生のために用いられるpDNA1プラスミドの略図を示す。本発明の一実施形態において、図２２Ｃ〜Ｆは、本発明の手段を提供する。 バッチ１（Ａ）及びバッチ２（Ｂ）に関するｖＧＭ１４２（ＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ−ＦVIII−Ｎ６−ｃｏ）によるＨＥＫ２９３Ｔの形質導入効率を示す図である。グラフは、形質導入後４８及び７２時間でのそれぞれのＭＯＩに関するＦVIII活性を示す。それぞれの記号は、独立した実験（ｎ＝５〜６回の実験）を表す。水平のバーは、群平均±ＳＤを示す。分析を、未処置の対照との複数回の比較と共に一元配置Ａｎｏｖａ（GraphPad Prism）を用いて実施した。^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 インビボ系（マウスモデル）におけるｖＧＭ１４２の評価を示す図である。Ａ：肺；Ｂ：ＢＡＬ液；Ｃ：血漿。グラフは、群１〜３（群１及び２ − １０日の処置、３用量／週の１００μｌベクター／マウス（用量の総量は１匹あたり３に等しい）；群３ − ２８日の処置、３用量／週の１００μｌベクター／マウス（用量の総量は１匹あたり１２に等しい））に関する異なる治療に対するｈＦVIIIのレベル（正常レベルのパーセンテージとして）を示す。それぞれの記号は、個々のマウス（１．４×１０^６ＴＴＵ／マウスの合計ベクター用量で処置された群１（ｎ＝４）；１．５７×１０^８ＴＴＵ／マウスの合計ベクター用量で処置された群２（ｎ＝３）及び３．３６×１０^８ＴＴＵ／マウスの合計ベクター用量で処置された群３（ｎ＝４））を表す。水平のバーは、平均ＦVIII：Ａｇレベル±ＳＤを示す。処置された群間の複数回の比較と共に一元配置Ａｎｏｖａ（GraphPad Prism）を用いて、分析を実施した。^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

［実施例］
ここで、本発明を以下の実施例を参照して説明する。これらのものは、本発明の範囲に対する限定ではなく、当業者であれば、好適な等価物を本発明の範囲内で用いることができることを理解できる。したがって、実施例は、本発明の構成部分であり、そこに記載される個々の態様は、独立に、又は任意の組合せで開示されると考えることができる。

細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ、Freestyle293F（Life Technologies社、Paisley、UK）及び２９３Ｔ／１７細胞（CRL-11268；ATCC、Manassas、VA）を、１０％ウシ胎仔血清を含有し、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）又はFreestyle（商標）２９３発現培地（Life Technologies社）を添加したDulbeccoの最少Eagle培地（Invitrogen社、Carlsbad、CA）中で維持した。

プラスミド構築
pCAGGS-Fct4及びpCAGGS-SIVct+HNを以下のように構築した：
（ｉ）プラスミドSIVct/HNは、ＳｅＶ ＨＮタンパク質のエクトドメイン及び膜貫通領域に融合されたＳＩＶａｇｍ ＴＭＰ（リバース）の細胞質尾部をコードする遺伝子を含有する。３つのオリゴヌクレオチド対を合成した：対１、5'-TCGAGATGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGGAGCAACGACGGAGGTGAAGGACCAGACGCCAACGACCC-3'（配列番号１８）及び5'-CCGGGGGTCGTTGGCGTCTGGTCCTTCACCTCCGTCGTTGCTCCTGATTTTTAACTCAGACCACATC-3'（配列番号１９）；対２、5'-CCGGGGAAAGGGGGTGCAACACATCCATATCCAGCCATCTCTACCTGTTTATGGACAGA-3'（配列番号２０）及び5'-ACCCTCTGTCCATAAACAGGTAGAGATGGCTGGATATGGATGTGTTGCACCCCTTTCC-3'（配列番号２１）；並びに対３、5'-GGGTTAGGTGGTTGCTGATTCTCTCATTCACCCAGTGGG-3'（配列番号２２）及び5'-GATCCCCACTGGGTGAATGAGAGAATCAGCAACCACCTA-3'（配列番号２３）。これらのオリゴヌクレオチド対をアニーリングさせ、pBluescript KS+（Stratagene社）のXhoI及びBamHI部位にクローニングして、pKS+SIVctを得た。pCAGGS-SIVct/HNを、pCAGGSベクター中のXhoI部位中に野生型ＨＮ遺伝子（ＨＮｗｔ）を保有する、pKS+SIVct由来の１６０ｂｐのXhoI-DraIII断片及びpCAGGS-HN由来の１．５ｋｂｐのDraIII-Bsu36I断片を、pCAGGSのXhoI及びBsu36I部位にクローニングすることにより構築した。ＨＮタンパク質の細胞質尾部がＳＩＶａｇｍ ＴＭＰの細胞質尾部で置き換えられるように、このプラスミドを構築した。

pCAGGS-SIVct+HNの構築のために、ＳＩＶａｇｍ ＴＭＰの細胞質尾部と、ＨＮタンパク質のＮ末端とをコードする遺伝子を、プライマー対5'-GAGACTCGAGATGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGG-3'（配列番号２４）及び5'-AGAGGTAGACCAGTACGAGTCACGTTTGCCCCTATCACCATCCCTAACCCTCTGTCATAAAC-3'（配列番号２５）を用いてpCAGGS-SIVct/HNからＰＣＲにより最初に増幅した。得られるＰＣＲ断片を、pKS+SIVctのXhoI及びAccI部位にクローニングして、pKS+SIVct-Hを生成した。次いで、pKS+SIVct-H由来のXhoI-DraIII断片及びpCAGGS-HN由来のDraIII-Bsu36I断片を、pCAGGSのXhoI及びBsu36I部位にクローニングして、pCAGGS-SIVct+HNを得た。

ｃＰＰＴ及びＷＰＲＥ配列を、ＳＩＶ由来遺伝子導入プラスミド中に挿入した。用いたＷＰＲＥ配列の例は、配列番号８に提供される。

プラスミドpGM101は、ｃｏｌＥ１複製起点、カナマイシン耐性遺伝子及びプロモーターを含有し、合成遺伝子合成（GeneArt社、Regensburg、Germany；現在はLife Technologies Ltd社）により作出された。

pBS/CG2-Rc/s-CMV-D U（Nakajima et al. 2000 Human Gene Therapy 11:1863）由来のハイブリッドＣＭＶ／ＳＩＶ Ｒ Ｕ５ ＬＴＲ、部分的Ｇａｇ、ＲＲＥ、ｃＰＰＴ、ＳＩＮ Ｕ３及びＲ配列をＰＣＲにより増幅し、pGM169（Hyde et al. Nature Biotechnology 26:549）からＰＣＲにより増幅されたｈＣＥＦエンハンサー／プロモーター配列及びNheI-ApaI制限酵素断片上でpGM169から単離されたｓｏＣＦＴＲ２ ｃＤＮＡと共にpGM101中に挿入して、pGM326を作出した。

関連するエクソン／イントロン配列、ＳＩＶ ＧａｇＰｏｌ及びＲＲＥ配列と一緒のＣＭＶエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター並びにＳＶ４０ポリＡ／複製起点を、pCAGGS/Sagm-gtr（Nakajima et al. 2000 Human Gene Therapy 11:1863）からＰＣＲによって増幅して、pGM297を作出した。関連するエクソン／イントロン配列と一緒のＣＭＶエンハンサー／プロモーター及びpCI（Promega社、Madison、WI、USA）由来のＳＶ４０ポリＡ配列を、BglII-BamHI制限酵素断片上に単離し、ＰＣＲにより増幅されたpCAGGS/Sagm-gtrに由来するＳＩＶ Ｒｅｖ配列をpGM101中に挿入して、pGM299を作出した。

関連するエクソン／イントロン配列と一緒のＣＭＶエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター、Ｆｃｔ４ ｃＤＮＡ及びpCAGGS-Fct4に由来するＳＶ４０ポリＡ／起点を、遺伝子合成、ＰＣＲ及び制限酵素断片組換えの組合せによってSalI-HindIII制限酵素断片上で単離し、pGM101中に挿入して、pGM301を作出した。

関連するエクソン／イントロン配列と一緒のＣＭＶエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター、ＳＩＶｃｔ＋ＨＮ ｃＤＮＡ及びpCAGGS-SIVct+HN由来のＳＶ４０ポリＡ／起点を、遺伝子合成、ＰＣＲ及び制限酵素断片組換えの組合せによってSalI-HindIII制限酵素断片上で単離し、pGM101中に挿入して、pGM303を作出した。

本発明の他のpGMプラスミドは、標準的な技術を用いて、また、上記開示にしたがって作製した。

これらのプラスミドＤＮＡアセンブリ手法を通じて、制限酵素及びＰＣＲポリメラーゼは、New England Biolabs社（Ipswich、MA、USA）から供給されたものであり、ＤＮＡ精製試薬はQiagen社（Limburg、Netherlands）により供給されたものであった。

ＳＩＶベクターの産生
４プラスミド系：
複製欠損性自己不活化ＳＩＶベクターを、少し改変して構築した。簡単に述べると、２９３Ｔ／１７細胞（１５ｃｍ直径の培養皿）に、製造業者の推奨にしたがってLipofectamine/Plus試薬（Invitrogen社）に複合体化された４つのプラスミドをトランスフェクトすることにより、ＳｅＶ−Ｆ／ＨＮシュードタイプ化ＳＩＶベクターを産生した［プラスミド−１：ＧＦＰ、ルシフェラーゼ（ｌｕｘ）レポーター遺伝子、又はＧＦＰ−ＣＦＴＲ融合構築物を保有する１０μｇのＳＩＶ由来導入プラスミド、プラスミド−２：３μｇのパッケージングプラスミド、プラスミド−３：２μｇのpCAGGS-Fct4、プラスミド４：２μｇのpCAGGS-SIVct+HN；図１Ａ〜Ｅは、本発明のベクターの産生のために用いられるプラスミドの略図を示す］。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ＳＩＶベクターを、同様のプロトコールを用いて産生したが、pCAGGS-Fct4及びpCAGGS-SIVct+HNの代わりにpVSV-Gプラスミド（２μｇ；Clontech社、Mountain View、CA）を用いた。トランスフェクション後１２時間で、培養培地を、５ｍｍｏｌ／ｌの酪酸ナトリウムを含有する３０ｍｌの無血清Dulbecco改変Eagle培地で置き換えた。酪酸ナトリウムは、ヒストンデアセチラーゼを阻害するようにベクター産生を刺激する。ＳＩＶベクターを含有する培養上清を、トランスフェクションの４８時間後に採取し、０．４５μｍのフィルター膜を通して濾過し、高速遠心分離（４℃、２０，０００ｇで４時間、Avanti JA18ローター；Beckman Coulter社、Brea、CA）によってさらに濃縮した。ベクターペレットを、ＰＢＳ（Invitrogen社）中に懸濁して１００〜２００倍の濃度にし、−８０℃で保存した。

５プラスミド系（好ましい）：
FreeStyle（商標）293 Expression Medium中で培養されたＨＥＫ２９３Ｔ又は２９３Ｔ／１７細胞に、以下の特徴：pDNA1（例えば、pGM326；図１Ａ）はレンチウイルスベクターｍＲＮＡをコードする；pDNA2a（例えば、pGM297；図１Ｂ）はＳＩＶ Ｇａｇ及びＰｏｌタンパク質をコードする；pDNA2b（例えば、pGM299；図１Ｃ）はＳＩＶ Ｒｅｖタンパク質をコードする；pDNA3a（例えば、pGM301；図１Ｄ）はセンダイウイルス由来Ｆｃｔ４タンパク質［Kobayashi et al., 2003 J. Virol. 77:2607］をコードする；並びにpDNA3b（例えば、pGM303；図１Ｅ）はPEIpro（Polyplus社、Illkirch、France）と複合体化したセンダイウイルス由来ＳＩＶｃｔ＋ＨＮ［Kobayashi et al., 2003 J. Virol. 77:2607］をコードする、を有する５つのプラスミドの混合物をトランスフェクトすることにより、ＳｅＶ−Ｆ／ＨＮシュードタイプ化ＳＩＶベクターを産生した。

トランスフェクションの１２〜２４時間後に、細胞培養培地に、酪酸ナトリウムを添加した。酪酸ナトリウムはヒストンデアセチラーゼを阻害することによりベクター産生を刺激し、５つのプラスミドによりコードされるＳＩＶとセンダイウイルスの融合タンパク質成分の発現の増加をもたらす。トランスフェクションの４４〜５２時間後及び／又は６８〜７６時間後に、細胞培養培地に、５ユニット／ｍＬのBenzonase Nuclease（Merck Millipore社、Nottingham、UK）を添加した。ＳＩＶベクターを含有する培養上清を、トランスフェクションの６８〜７６．５時間後に採取し、０．４５μｍの膜を通す濾過により清澄化した。ＳＩＶベクターを、トリプシン活性を含有するプロテアーゼ、例えば、TrypLE Select（商標）などの動物源非含有組換え酵素を用いる消化により処置する。続いて、典型的にはＳＩＶベクターを、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は接線流濾過限外濾過／透析濾過によりさらに精製及び濃縮する。

これと同じ方法を用いて、Ａ１ＡＴ及びＦVIII導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターを生成し、図１５Ａ及び図２２Ｂのプラスミドを、図１Ａのものと置き換えて、適切な導入遺伝子を提供した（実施例１５及び２０を参照されたい）。

ベクターの力価測定
方法１：
リアルタイム逆転写酵素−ＰＣＲを用いて、粒子力価を決定した。QIAampウイルスＲＮＡミニキット（QIAGEN社、Strasse、Germany）を用いてウイルスＲＮＡを精製し、Superscript II（Invitrogen社）を用いて逆転写した。QuantiTectプローブＰＣＲシステム（QIAGEN社）及びＷＰＲＥ配列に広がる１３１ヌクレオチド（ｂｐ）を増幅するためのプライマー（フォワードプライマー：5'-ggatacgctgctttaatgcc-3'、リバースプライマー：5'-acgccacgttgcctgacaac-3'）を、ABI PRISM 7700 Sequence Detector System（PE Applied Biosystems社、Foster City、CA）中で製造業者のプロトコールにしたがって用いた。ＳＩＶ遺伝子導入プラスミドＤＮＡ（３×１０^４〜２×１０^６分子）を、標準物質として用いた。

ベクターストックの連続希釈液による２９３Ｔ細胞の形質導入及びＧＦＰ蛍光による形質導入された細胞の定量（Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＧＦＰ及びＶＳＶ−Ｇ−ＳＩＶ−ＧＦＰについて）又は抗ルシフェラーゼ抗体を用いる染色（Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｌｕｘについて）により、形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）を決定した。

方法２（好ましい）：
典型的には、リアルタイム逆転写酵素−ＰＣＲを用いて、粒子力価（ＶＰ／ｍＬ）を決定した。QIAampウイルスＲＮＡミニキット（QIAGEN社、Strasse、Germany）を用いてウイルスＲＮＡを精製し、逆転写酵素（Life Technologies社）を用いて逆転写した。ABI PRISM 7700 Sequence Detector System（Life Technologies社）中で、ＷＰＲＥ配列の一部を増幅するプライマーを用いるTaqMan定量的ＰＣＲシステム（Life Technologies社）。インビトロで転写されたＷＰＲＥ ＲＮＡ分子を、定量標準物質として用いた。

２９３Ｔ／１７又はFreestyle 293F細胞へのＳＩＶベクターの連続希釈液の形質導入及びABI PRISM 7700 Sequence Detector System（Life Technologies社）中で、ＷＰＲＥ配列の一部を増幅するプライマーを用いるTaqMan定量的ＰＣＲシステム（Life Technologies社）によるプロウイルスＤＮＡを含有するＷＰＲＥの定量によって、形質導入単位（ＴＵ／ｍＬ）を決定した。ＷＰＲＥ配列を含有するプラスミドＤＮＡ分子を、定量標準物質として用いた。

基底細胞に富むｔＥＣ培養物の生成
マウス気管上皮細胞（ｔＥＣ）を、以下のように単離した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスを処分し、滅菌手術器具を用いて喉頭から主気管支枝まで、気管を切除した。組織を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｐ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓ）及び２．５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（Ａ）を含む冷Ham's F-12培地（Ham's F12/PSA培地）を含有するチューブに入れ、氷上で保持した。滅菌組織培養フード中で、気管を、付着した筋肉及び結合組織から除去し、縦方向に切断して、内部の呼吸上皮を露出させ、Ｆ−１２培地中の０．１５％プロナーゼ溶液（１５ｍｌのチューブ中の約５ｍｌ）中に入れた。組織消化を、４℃で一晩（１５〜１８ｈ）行った。酵素反応を遮断するために、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を組織消化物に添加した。より多くの細胞を分離させるために、チューブを穏やかに反転させた後、１０％ＦＢＳ／Ham's F-12/PS溶液を含有する新しいチューブに気管を入れ、以前のように反転させた。このステップをさらに２回繰り返した。４つのチューブの内容物を一緒にプールし、４℃、５００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離した。ペレットをＤＮａｓｅ溶液（ＦＢＳ／Ham's F-12/PS溶液中の０．５ｍｇ／ｍｌの未精製膵臓ＤＮａｓｅ＋１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、約２００μｌ／気管）中に再懸濁し、氷上で５分間インキュベートし、以前のように遠心分離した。

上清を除去した後、ｔＥＣを、ヒト及びマウスの気道前駆細胞の単離及び増殖のために特に設計された抗生物質及び抗真菌剤を含有しない製剤であるProgenitor Cell Targeted（ＰＣＴ）培地（CnT-17、CELLnTEC社、Bern、Switzerland）中に再懸濁した。次いで、ｔＥＣを、Primaria組織培養皿（Becton Dickinson Labwere社、Franklin Lakes、NJ、USA）中に入れ、３７℃、５％ＣＯ_２中で３〜４ｈインキュベートした。非接着細胞を収集し、４℃、５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、血球計中で計数した。基底細胞に富む培養物を生成するために、ｔＥＣをＰＣＴ培地中に懸濁し、Nunclon（商標）Δプレート（Nunc A/S社、Roskilde、Denmark）上に播種し、４×１０^３細胞／ｃｍ^２の推奨された播種密度で、５０μｇ／ｍｌの１型ラット尾部コラーゲンで被覆した。また、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（１５ｍＭ）及びＮａＨＣＯ３（３．４ｍＭ）を添加したＤＭＥＭ／Ham's F-12を含有する、対照基本培地中でもｔＥＣを培養した。プレートを、３７℃で５％ＣＯ_２と共にインキュベートした。ＰＣＴ培地中での拡張の前後でのｔＥＣ集団中の基底細胞の割合を決定するために、サイトスピン調製物を、抗ＫＲＴ５抗体及び適切な二次抗体で染色した。

産生されたｔＥＣのプールは、完全に分化した細胞（クララ細胞及び線毛細胞）と基底細胞の両方を含んでいた。一度、浸透膜上に播種されたら、ｔＥＣは、基底細胞増殖並びに分泌細胞及び線毛細胞への再分化の結果として、気液界面（ＡＬＩ）培養系を生成することができた。基底細胞拡張のための代替的で迅速なプロトコールを確立するために、気道前駆細胞を未分化の状態に維持しながら、それらの増殖を支援するように特に製剤化された、市販の特許で守られたProgenitor Cell Targeted（ＰＣＴ）培地を用いて２次元（２Ｄ）ｔＥＣ培養物を評価した。陰性対照として、ｔＥＣを、特定の増殖因子を添加せずに基本培地製剤に曝露した。コラーゲンで被覆されたプラスチック表面上に播種され（４×１０^３細胞／ｃｍ^２）、ＰＣＴ培地に曝露されたｔＥＣは、急速に増殖することができ、５〜８日以内に集密になったが、増殖因子欠損対照培地に曝露されたｔＥＣは接着及び増殖することができなかった。ＰＣＴ培地の使用が基底細胞集団の実質的な富化をもたらしたかどうかを確立するために、ｔＥＣを約８０％の集密度（ｎ＝６ウェル）で採取し、基底細胞の特異的マーカーである抗ケラチン５（Ｋｒｔ５）抗体で固定及び処置した。新鮮に単離されたｔＥＣを、対照として用いた（ｎ＝３のユニークな調製物）。ＰＣＴ培地中での拡張後のＫｒｔ５陽性基底細胞の割合（７８±１．４％）は、ｔＥＣの新鮮に単離されたプール中でのもの（３３±０．６％）よりも高かったが、これは、マウス気道基底細胞を、市販の培地を用いて、ｔＥＣの混合プールから選択的かつ迅速に拡張することができることを示している。

Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＧＦＰによる基底細胞に富むｔＥＣ培養物のｅｘ ｖｉｖｏでの形質導入
Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶベクターがｅｘ ｖｉｖｏで基底細胞を効率的に形質導入することができるかどうかを決定するために、実施例５で調製されたｔＥＣを、ＰＣＴ培地中で７日間にわたって約７０％集密まで増殖させ、ＭＯＩ１００で緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子を保有するＦ／ＨＮ−ＳＩＶ（Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＧＦＰ）を形質導入し、５％ＣＯ_２と共に３日間、３７℃でインキュベートした。野生型及びＧＦＰトランスジェニック動物に由来するｔＥＣを、同じ条件下で培養し、それぞれ、陰性（ウイルス形質導入なし）及び陽性対照群として用いた（ｎ＝３〜６ウェル／群）。

ＧＦＰ陽性細胞の割合を定量するために、基底細胞に富むｔＥＣ培養物をアキュターゼ酵素（CELLnTEC社）で分離させ、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中に再懸濁し、ＦＡＣＳ分析にかけ、平均で２０．２７７±２．４７８細胞／群と計数した。Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶベクターは、基底細胞に富むｔＥＣの２６％±０．９％を形質導入した（非形質導入対照と比較した場合、ｐ＜０．０００１）。

形質導入されたＧＦＰ発現細胞が基底細胞であるかどうかを評価するために、感染の３日後の細胞を、Ｋｒｔ５及びＧＦＰに対する抗体で二重染色した。培養細胞の免疫蛍光染色により、約４０％のＫｒｔ５発現細胞がＧＦＰレポーター遺伝子も発現することが示され、これは、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶベクターがｅｘ ｖｉｖｏで前駆基底細胞を形質導入することができることを示している。

マウスの鼻へのインビボでの投与
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（雌、６〜８週齢）を用いた。マウスを麻酔し、温めた台の上に背部を上にして水平に入れ、細いカテーテル（外径０．５ｍｍ未満）を、左鼻孔中に鼻の先端から約２．５ｍｍ挿入した。次いで、シリンジポンプ（Cole-Parmer社、Vernon Hills、IL）を用いて、ベクター（１００μｌ）を鼻上皮上で７５分間、ゆっくりとかん流した（１．３μｌ／ｍｉｎ）。左鼻孔へのウイルスのかん流にもかかわらず、本発明者らは、鼻腔全体を通る溶液の分散に起因する、左と右の両方の鼻孔におけるトランスフェクションを日常的に観察する。ＰＢＳ及びLimberis et al., 2002により記載されたような、１％リソホスファチジルコリンで予め条件付けられたＶＳＶ−Ｇ−ＳＩＶを形質導入されたマウスを対照として用いた。示された時点（形質導入後３〜３６０日）で、マウスを処分してＧＦＰ発現を可視化した。図２に示されるように、ＧＦＰ発現は形質導入後、少なくとも４４９日間観察されたが、陰性対照はＧＦＰ発現を示さなかった。図３に示されるように、Ｆ／ＮＨ−ＳＩＶベクターを用いる導入遺伝子発現は、１０匹の独立に試験したマウスにおける形質導入後少なくとも３６０日間の観察可能なＧＦＰ発現と一致していた。

同様に、図１３に示されるように、ｈＣＥＦプロモーターを含む本発明のＦ／ＨＮ−ＳＩＶベクターによる形質導入は、ＣｐＧに富むレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）の長期的発現をもたらした。対照と比較して高レベルの発現が、形質導入後少なくとも１６９日間にわたって肺と鼻の両方において観察された。

反復投与実験において、マウス群に、１用量のＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｌｕｘ（単回用量群）、又は２用量のＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＧＦＰ（０日目、２８日目）、次いで、５６日目にＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｌｕｘ（反復用量群）を形質導入した。重要なことは、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｌｕｘを受けるマウス（単回用量群）及び５６日目にＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｌｕｘを受けるマウス（反復用量群）は、類似する年齢のものであり、同時に形質導入されたということであった。Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｌｕｘ投与の３０日後に、遺伝子発現を分析した。比較のために、マウスに、以前に記載されたように（Griesenbach, U. et al., Methods Mol Biol. 2008; 433:229-42）ルシフェラーゼレポーター遺伝子に複合体化された陽イオン脂質ＧＬ６７Ａをトランスフェクトし、トランスフェクションの２日後にルシフェラーゼ発現を測定した。

図６に示されるように、マウスの鼻へのＦ／ＨＮ−ＳＩＶの反復投与は、遺伝子発現レベルを変化させない。導入遺伝子発現を、主要な非ウイルス遺伝子導入製剤（ＧＬ６７Ａと複合体化したCMV-Luxプラスミド）と比較する。

挿入部位プロファイリングを、形質導入されたマウス上で行って、生存時間を上記の図１２の説明に記載されたように精査した。本発明のＦ／ＨＮ−ＳＩＶベクターを用いる形質導入は、存在するＦ／ＨＮ−ＳＩＶベクター又は陰性（バッファーのみ）対照と比較して、マウスの生存に対するいかなる有害効果も有さないことが観察された（図１２Ｇを参照されたい）。

ポリドカノール処置による鼻上皮細胞の誘導再生
いくらか改変した記載の方法（Borthwick et al., Am J Respir Cell Mol Biol. 2001 Jun; 24(6):662-70）に従うポリドカノール処置により、鼻上皮細胞を剥ぎ取った。簡単に述べると、マウスを麻酔し、１０μｌのポリドカノール（２％）を、「鼻をすすること」によりボーラスとして鼻に投与した。鼻上皮細胞の剥離及び再生を確認するために、鼻組織を１０μｌの２％（ＰＢＳ中のｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリドカノール（ノナエチレングリコールモノ−ドデシルエーテル；SIGMA社、St Louis、MO）でかん流し、組織学的分析を、処置の２４時間及び７日後に行った（ｎ＝３／群）。可能な前駆細胞又は幹細胞の形質導入を分析するために、本発明者らは、マウスの鼻上皮にＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＧＦＰ（４×１０^８ＴＵ／マウス）ベクターを最初に投与した。形質導入の７日後、鼻組織を１０μｌの２％（ＰＢＳ中のｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリドカノールでかん流し、この処置を３週間後に再度繰り返した。組織切片を、ベクター投与の５８日後（最後のポリドカノール処置の３０日後）に分析した。

生物発光画像
マウスに、画像化の１０分前に、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン（Xenogen社、Alameda、CA）を腹腔内注射し、イソフルランで麻酔した。生きているマウスからの生物発光（光子／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）を、ソフトウェアプログラムLiving Image（Xenogen社）を用いて、１０分間にわたって４のビニングでIVIS50システム（Xenogen社）を用いて測定した。解剖学的局在化のために、光強度を表す偽色画像（青色：最小強度、赤色：最大強度）を、Living Imageソフトウェアを用いて生成し、グレースケールの参照画像に対して重ね合わせた。鼻における生物発光を定量するために、規定の領域（赤色のボックス）中での光子放出を、定量のために標準化された領域に印を付けることにより測定した。赤色のボックスのサイズを一定に保持し、図面に示されるように動物の頭部上に置いた。重要なことに、偏りを避けるためにグレースケールの参照画像を用いて、その領域に印を付けた。

ＧＦＰ発現の組織学的評価及び／又は基底細胞検出のための組織調製物
マウスを処分し、皮膚を除去した。頭部を眼のレベルで切断し、皮膚、顎、舌、及び鼻の柔らかい先端を注意深く除去した。鼻腔におけるＧＦＰ発現のｉｎ ｓｉｔｕでの画像化のために、蛍光立体顕微鏡（Leica社、Ernst Leitz Optische Werke、Germany）を用いて、ＧＦＰ蛍光を検出した。続いて、組織を室温で一晩、４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）中で固定した後、脱灰のために２０％ＥＤＴＡ中に浸した（ｐＨ７．５で５日間）。ＥＤＴＡ溶液を、少なくとも１日おきに交換した。脱灰後、組織を室温で一晩、１５％スクロース中でインキュベートした後、Tissue Mount（Chiba Medical社、Soka、Japan）中に埋め込んだ。１０マイクロメートルの切片を、それぞれのマウスの頭部の６つの異なる位置で切断した（鼻骨の先端から約０〜６ｍｍ）。ＧＦＰ発現を、蛍光顕微鏡（Leica社）を用いて観察した。細胞型の定量及び同定を、×４０又は×６３の対物レンズを用いて、マウス１匹あたり６つのレベルで実施した。蛍光顕微鏡を用いて鼻上皮の構造を捕捉するには、長時間の画像露出が必要であった。これにより、ＧＦＰ陽性細胞のピクセル飽和が得られ、ＧＦＰ陽性細胞を、本発明者ら、及び他者がより高い倍率の下で観察する一般的な緑色の外見よりも、ほぼ白色に見えるようにした。

Ｆ／ＮＨ−ＳＩＶ導入遺伝子発現の細胞分布を、組織切片中で精査した。具体的には、ＥＧＦＰ発現を、処置後３０日で、マウス鼻腔（鼻の先端から２ｍｍ）の組織切片中で決定した。図４は、ＥＧＦＰ発現の位置を示す（図４、白色の点状シグナル）。

図５は、マウスの鼻の／ＮＨ−ＳＩＶ導入遺伝子処置により形質導入された細胞型を示す。マウス鼻腔において形質導入された細胞の６９％が、線毛呼吸上皮細胞であった。他の形質導入された細胞型は、嗅上皮中の神経細胞（２１％）及び扁平上皮細胞（７％）を含んでいた。

ポリドカノール処置後の基底細胞を検出するために、Envisionキット（Dako社、Glostrup、Denmark）を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に基づく免疫染色を実施した。簡単に述べると、スライドを、メタノール中の０．６％過酸化水素で１５ｍｉｎ処置し、水道水中で洗浄し、１．５％正常ヤギ血清（Abcam社）と共に３０ｍｉｎインキュベートした。次いで、スライドを、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧ（キットと共に提供）と共に３０ｍｉｎインキュベートした後、ウサギポリクローナル抗サイトケラチン５抗体（１：５００）（Abcam社）と共に１ｈインキュベートした。次いで、切片をＰＢＳ中で洗浄し、ペルオキシダーゼ基質３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）（キットと共に提供）と共に５ｍｉｎインキュベートした。最後に、スライドを、蒸留したＨ_２Ｏ中で洗浄し、水性Harrisヘマトキシリン（ＢＤＨ）で１５秒間対抗染色し、水道水中で洗浄した後、蒸留したＨ_２Ｏ中で洗浄した。

ＧＦＰ陽性の形質導入された鼻上皮細胞及びＫｒｔ５陽性基底細胞の免疫蛍光検出を、以下の一次及び二次抗体：ヤギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（１：２５０）（Abcam社）、ウサギモノクローナル抗ＫＲＴ５抗体（１：５００）（Abcam社）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ロバ抗ヤギＩｇＧ（１：２００）（Invitrogen社、Paisley、UK）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：２００）（Invitrogen社）を用いて実施した。抗体の性能を改善するために、切片を、１００℃の水浴上で２０ｍｉｎのクエン酸バッファー（１０ｍＭクエン酸、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）中での熱媒介性抗原回収にかけた。染色された切片を、ＤＡＰＩを含むProLong（登録商標）Gold Antifade Reagent（Invitrogen社）中に載せ、以前のように共焦点顕微鏡で分析した（全てZeiss社）。ＧＦＰ陽性基底細胞（上皮層内での形態及び位置に基づく同定）を、合計１３個の切片／マウス上で定量した。推定ＧＦＰ陽性基底細胞を示した切片を、抗ＫＲＴ５抗体と抗ＧＦＰ抗体とを用いる二重染色のために選択して、基底細胞表現型を確認した。

ＡＬＩ培養物の形質導入
ＡＬＩ培養物として増殖させた完全に分化した気道上皮細胞を、Epithelix社（Geneva、Switzerland）から購入した。ＡＬＩに、約２５〜約３００ＴＵ／細胞の範囲の感染多重度でＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｌｕｘをトランスフェクトした。６時間後、ウイルスを除去し、ＡＬＩを１０〜２６日間インキュベートした。側底培地を、このインキュベーション期間に４８時間毎に交換した。特定の時点で、ＡＬＩを１００μｌのレポーター溶解バッファー中に溶解し、製造業者の指示書にしたがってLuciferase Assay System（Promega社、Southampton、UK）を用いてルシフェラーゼ発現を定量した。培養物の総タンパク質含量を、BioRadタンパク質アッセイキット（BioRad社、Hemel Hempstead、UK）を用いて定量した。それぞれの試料を２連でアッセイした。次いで、ルシフェラーゼ発現を、総タンパク質１ｍｇあたりの相対光単位として提示した。生物発光画像化のために、ＰＢＳ中の１００μｇのルシフェリンを、頂端膜に添加した。

図７に示されるように、ＡＬＩ培養物中の細胞に、ルシフェラーゼ発現により証明される通り、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−Ｌｕｘが上手く形質導入された。ルシフェラーゼ発現は、ＭＯＩ２５と比較してＭＯＩ２５０でより高かった。

ヨウ化物流出アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、５００ＴＵ／細胞の感染多重度でＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＧＦＰ−ＣＦＴＲ又はＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＧＦＰ対照ウイルスをトランスフェクトし、２日間培養した。以前に記載されたように（Derand, R., et al., 2003）、^１２５ヨウ化物流出の速度を測定することにより、ＣＦＴＲ塩化物チャネル活性をアッセイした。^１２５ヨウ化物流出速度を、ホルスコリン／ＩＢＭＸ添加の時間に対して正規化した（時間０）。時間に対して^１２５ヨウ化物流出の速度をプロットすることにより、曲線を構築した。アゴニスト刺激後の^１２５ヨウ化物流出の累積レベルを反映させるために、全ての比較は時間−^１２５ヨウ化物流出曲線下面積に基づく。曲線下面積を、台形公式により算出した。実験を２連で実施した（ｎ＝６ウェル／群／実験）。

図８に示されるように、Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶは、機能的なＣＦＴＲ発現を指示することができ、相対^１２５ヨウ化物流出は０．６５であった。対照的に、ＧＬ６７Ａプラスミドベクターは、０．３３のより低い^１２５ヨウ化物流出値を達成した。

ヒツジ及びヒトの一次肺細胞並びにマウス肺の形質導入
Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶは、ヒツジ及びヒトの一次肺細胞並びにマウス肺を効率的に形質導入する。

Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｘを用いて、ｅｘ ｖｉｖｏで培養されたヒト鼻刷子細胞（ＭＯＩ２５０）並びにヒト及びヒツジ肺スライス（１×１０^７ＴＵ／スライス）を形質導入した。図９Ａに示されるように、ヒト鼻刷子細胞と、ヒト及びヒツジ肺スライスの両方の形質導入は、形質導入の２４〜４８時間後に実質的なルシフェラーゼ導入遺伝子発現（ヒト鼻刷子細胞についてはタンパク質１ｍｇあたり２×１０^２ＲＬＵ、ヒト肺スライスについてはタンパク質１ｍｇあたり１×１０^７ＲＬＵ及びヒツジ肺スライスについてはタンパク質１ｍｇあたり２×１０^７ＲＬＵの範囲の平均値）をもたらした。

気液界面で培養された一次ヒトＣＦ肺細胞（ＣＦ ｈＡＬＩ、約１×１０^５個）に、ＣＭＶ−及びｈＣＥＦ導入遺伝子プロモーターを含有する（３×１０^７ＴＵの）Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｓｏＣＦＴＲ２ベクターを形質導入した。形質導入後６〜８日で、ベクターコピー数（内因性ＣＦＴＲ ＤＮＡのコピーあたりのプロウイルスＤＮＡのコピー）を測定した。ＣＭＷとｈＣＥＦプロモーターは両方とも、少なくとも１×１０^１のベクターコピー数を達成することができた（図９Ｂ）。

形質導入後６〜８日でのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ発現レベル（％ＶＥ：内因性ＣＦＴＲ ｍＲＮＡの１コピーあたりのＣＦＴＲ ｍＲＮＡのコピー数×１００）も測定した。図９Ｃ中の水平の点線は、５％ＶＥの標的発現レベルを表し、治療閾値であると考えられる。Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｓｏＣＦＴＲ−ＣＭＶとＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｓｏＣＦＴＲ２−ｈＣＥＦは両方とも、この標的より有意に高い発現を誘導した（それぞれ、４０５８３±１０６８７及び１８５０９±１３５８８の範囲、平均±ＳＤ、ｎ＝４）。

インテグラーゼ欠損型（ＩＤ）又はインテグラーゼコンピテント型（ＩＣ又は標識なし）気道細胞中にＣＭＶ、ＥＦ１ａ及びｈＣＥＦプロモーターを含有するＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＥＧＦＰＬｕｘベクターのインビボでの送達後、導入遺伝子発現を、鼻（図９Ｄ）及び肺（図９Ｅ）マウス上皮中で決定した（ｎ＝６〜１０／群）。ルシフェラーゼ導入遺伝子発現の時間経過を、インビボでの生物発光画像化の反復によりモニタリングし、送達用量に対して正規化した。試験した５つのベクターのうちの４つ（ｖＧＭ０１２ ＣＭＷ、ｖＧＭ０１４ ＥＦ１ａ、ｖＧＭ０２０ ｈＣＥＦ及びｖＧＭ０７６ ｈＣＥＦ ＩＤ）は、実験の時間経過全体にわたって標的レベルを超える鼻における発現を達成した。第５のベクター、ｖＧＭ０７４ ＣＭＶ ＩＤは、実験の時間経過全体にわたって許容される発現レベルを超える鼻における発現を達成した。

試験した５つのベクターのうちの２つ（ｖＧＭ０１４ ＥＦ１ａ及びｖＧＭ０２０ ｈＣＥＦ）は、実験の時間経過全体にわたって標的レベルを超える肺における発現を達成した。１つのベクター、ｖＧＭ０１２ ＣＭＷは、実験の時間経過全体にわたって許容される発現レベルを超える肺における発現を達成した。

形質導入後１４日目でのインビボでのマウス形質導入後に生物発光を検出した。代表的な画像を図９Ｆに示す。ｖＧＭ０２０ ｈＣＥＦベクターは、試験した５つのベクターのうち、最も高いレベルのインビボでの発現を達成した。

形質導入後５〜６日目での非ＣＦ ｈＡＬＩのインビトロでの形質導入後に生物発光も検出した。代表的な画像を図９Ｇに示す。再度、ｖＧＭ０２０ ｈＣＥＦベクターは、試験した５つのベクターのうち、最も高いレベルの発現を達成した。

図９Ｈは、免疫組織化学により可視化された（ＤＡＰＩで核染色された）、１．６×１０^８ＴＵのＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＥＧＦＰＬｕｘ（ｖＧＭ０２０）の送達後、マウス鼻上皮中での形質導入後１４日目でのＥＧＦＰ発現を示す。

非ＣＦ ＡＬＩ中でのルシフェラーゼ導入遺伝子発現の時間経過を、生物発光画像化の反復によりモニタリングし、送達用量に対して正規化した。図９Ｉに示されるように、ｖＧＭ０１４ ＥＦ１ａ及びｖＧＭ０２０ ｈＣＥＦベクターは、最も高いレベルの発現を達成した。

Ｆ／ＨＮ−ＳＩＶはまた、インビボでヒツジ肺を効率的に形質導入する。直接的な気管支鏡による観察下で近位気道にアクリフラビンを注入した（約５分間にわたって３×１００μＬアリコート）。アクリフラビンの分布は、死後に解剖された橙色の気道によって理解することができる（図１０Ａ）。

アクリフラビンは誘導気道に大きく制限され、肺胞領域には存在しなかった。図１０Ａ中の矢印は、およその注入部位を示す。定規上の数字はｃｍである。

図１０Ｂは、ヒツジ肺のダイアグラム表示である（気管中心／上）。丸印は、（図１０Ａ）中の領域を表す。図１０Ｂにおいて、矢印は、ｎ＝３の個々のヒツジ（動物コードＴ１２１、Ｔ１５６及びＴ２５１）に３×１００μＬアリコートの２．２Ｅ９ ＴＵ／ｍＬ（合計６．６Ｅ８ ＴＵ）のＦ／ＨＮ ＳＩＶ ＣＭＶ−ＥＧＦＰＬｕｘを送達するための気管支鏡の通過を示す。送達後７日目で、５〜６個の組織試料ブロックを、死後、注入部位から約１ｃｍ間隔で採取した。

試料ブロックを、２〜３個のほぼ等価な試料に分割し、導入遺伝子発現について分析し、その結果を、タンパク質含量に対して正規化されたルシフェラーゼアッセイとして図１０Ｃに；及び内因性ＣＦＴＲ ｍＲＮＡレベルに対して正規化された定量的ＲＴ−ＰＣＲとして図１０Ｄに示す。図１０Ｃ中の水平線は、非ウイルス遺伝子導入ベクターで処置された試料中で認められた最も高いルシフェラーゼ活性を表し、図１０Ｄ中では、５％ＶＥの標的発現レベル（治療閾値であると考えられる、上記参照）を表す。それぞれの処置群について、平均は非ウイルスベクター比較（図１０Ｃ）よりも高く、また、標的５％ＶＥ閾値を超える発現を達成した。

ヒトＣＦ腸オルガノイドを用いて測定されたＣＦＴＲの発現及び機能
ヒトＣＦ腸オルガノイドを、Dekkers JF et al,（Nature Medicine 2013, 19(7): 939-945）により記載されたように生成した。簡単に述べると、腸生検を、ＥＤＴＡ含有溶液中で洗浄して、腺窩細胞を分離させた。次いで、腺窩細胞に、ｖＧＭ０５８（約１×１０^７形質導入単位）又は対照ウイルス（ｎ＝３ウェル／条件）を形質導入し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に埋め込み、３〜４日間、オルガノイドを形成させた。細胞内ｃＡＭＰレベルを増加させ、それによって、ＣＦＴＲを活性化するホルスコリン（約５μＭのホルスコリン）にオルガノイドを曝露することにより、ＣＦＴＲ機能を評価した。ＣＦＴＲ活性化に応答して、オルガノイドは水の取込み及び膨張をもたらす塩化物輸送を増大させる。共焦点生細胞顕微鏡（LSM710、Zeiss社、×５対物レンズ）により、オルガノイド（最少１０個／ウェル）を直接分析した。ホルスコリンにより刺激されたオルガノイドの膨張を、Volocity画像化ソフトウェア（Improvision社）を用いて自動的に定量した。ホルスコリン処置のｔ＝０でのものと比較した総オルガノイド面積（ｘｙ平面）の増大を算出し、平均化した。ホルスコリンにより誘導された膨張は、対照と比較してｖＧＭ０５８形質導入オルガノイドにおいて有意に（ｐ＜０．００１）増大した（図１４Ａを参照されたい）。有意なレベルのＣＦＴＲ媒介性ヨウ化物流出（ｐ＜０．０５）が、本明細書に開示されるヨウ化物流出アッセイを用いてｖＧＭ０５８形質導入細胞（図１４Ｂ）中でも検出された（実施例１２を参照されたい）。

Ａ１ＡＴのためのレンチウイルスベクターの生成
ＳＩＶ主鎖並びに実施例２及び３に上記された５プラスミド法（ＣＦＴＲレンチウイルスのため）を用いて、また、本明細書に記載のｈＣＥＦプロモーターを用いて、レンチウイルスベクターを調製した。２つの別々のレンチウイルス構築物を生成した：１つはヒトアルファ−１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）導入遺伝子を有し、１つはＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｘ）導入遺伝子を有する（図１５Ａ及びＢ、それぞれ、配列番号９及び配列番号１０を参照されたい）。これらのベクター内に含まれるｃＤＮＡをコドン最適化し、ＣｐＧ枯渇化させた。

ｌｕｘレポーター遺伝子レンチウイルスベクターを用いる気液界面（ＡＬＩ）培養
完全に分化した野生型ヒトＡＬＩ培養物（MucilAir）を、Epithelix SARL社（Geneva、CH）から購入した。ＡＬＩを３７℃及び５％ＣＯ_２で培養し、側底培養培地を２〜３日毎に交換した。培養培地を、さらなる分析まで−２０℃で保存した。

１００μｌのウイルス（１×１０^７Ｔａｑｍａｎトランスフェクション単位（ＴＴＵ））を先端面上にピペッティングすることにより、ＡＬＩを形質導入した（０日目）。３７℃で４時間のインキュベーション後にウイルスを除去し、側底培地を交換した。

形質導入後の示された時点で、ＡＬＩの先端面を、滅菌ＰＢＳと共に１時間インキュベートすることにより洗浄した。洗浄液を除去し、さらなる分析まで−２０℃で保存した。

Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼアッセイ（New England Biolabs社、Ipswich、USA）を、製造業者の推奨にしたがって実施した。１５μｌの試料を２連で分析し、Appliskanプレートリーダー中で発光を決定した。Ｇｌｕｘ発現を、流体１μｌあたりのＲＬＵ（ＲＬＵ＝相対光単位）として表した。

図１６はその結果を提供し、各点は示された時点でのｎ＝６のＡＬＩからの培地中のＲＬＵ／μｌの平均値を表す（エラーバーにより示される標準誤差）。ヒト気液界面中でのレンチウイルス媒介性遺伝子導入は、分泌型レポータータンパク質Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼの長期的発現をもたらした。

Ａ１ＡＴ及びｌｕｘレポーター遺伝子レンチウイルスベクターを用いる肺スライス培養物中での導入遺伝子発現
Moreno L et al, Respir Res 2006 Aug 21;7:111に記載のように、精密切断されたヒト肺スライスを調製した。肺スライスを、１２ウェルの組織培養プレート（ウェルあたり１個のスライス）中、１ｍｌの培地に入れ、３７℃及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。培地を毎日交換し、さらなる分析まで−２０℃で保存した。

０日目に、肺スライス（ｎ＝６／群）に、培地中で１０００μｌの最終容量に希釈されたＳＩＶ ｈＣＥＦ−ｓｏｇＬｕｘ（１×１０^６ＴＴＵ）又はＳＩＶ１ ｈＣＥＦ−ｓｏｈＡＡＴ（２×１０^６ＴＴＵ）ウイルスを形質導入し、４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を交換し、さらなる分析のために−２０℃で保存した。

Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ発現を、上記のように決定した（実施例１６）。図１７Ａに示されるように、分泌型レポータータンパク質Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼの高レベルの発現は、ヒト肺スライス中でのレンチウイルス媒介性遺伝子導入に続いた。ＡＡＴ（本明細書ではＡ１ＡＴとも呼ばれる）発現を、製造業者の推奨にしたがって実施されるサンドイッチＥＬＩＳＡ（Abcam社、Cambridge、UK）を用いて決定した。５０μｌの試料を２連でアッセイし、マイクロプレートリーダー上、４５０ｎｍで測定した。図１７Ｂに示されるように、アルファ−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ／Ａ１ＡＴ）の高レベルの発現は、ヒト肺スライス中でのレンチウイルス媒介性遺伝子導入に続いた。

Ａ１ＡＴ及びｌｕｘレポーター遺伝子レンチウイルスベクターのマウス鼻へのインビボでの投与
マウス肺の形質導入：
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Charles River社、UK）を、イソフルランで麻酔し、Xenariou S et al, Gene Ther 2007 May;14(9): 768-75に記載のように鼻注入により１００μｌのウイルスを与えた。動物に１〜５用量を与え、毒性の兆候について毎日観察した。

Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼについて、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、イソフルランを用いて０日目に麻酔し、鼻注入により単回１００μｌ用量のＳＩＶ１ ｈＣＥＦ−ｓｏＧｌｕｘウイルス（１×１０^６ＴＴＵ）を与えた。対照動物を、試験において用いられるウイルス調製物の主な構成成分ＤＭＥＭ（組織培養培地）で処置した。

Ａ１ＡＴについて、雌Ｃ５７ｂｌ／６マウス（ｎ＝５／群）を、１０日間隔で３用量のＳＩＶ１ ｈＣＥＦ−ｓｏｈＡＡＴ（１００μｌ／用量、６．８×１０^７ＴＴＵ；合計用量２．４×１０^８ＴＴＵ）で処置した。対照動物に、１００μｌの滅菌ＰＢＳ（試験において用いられたレンチウイルス産生バッチの主な構成成分）を、それぞれの投薬点で注入した。

３回目の用量の１０日後、動物を屠殺し、肺組織ホモジェネート、気管支肺胞洗浄液及び血清をＡＡＴ発現について分析した。

さらに、Ａ１ＡＴの長期的発現を精査した。実験の１〜５日目に、Ｃ５７ｂｌ／６マウスを、鼻注入により１００μｌのＳＩＶ１ ｈＣＥＦ−ｓｏｈＡＡＴで処置した（合計で５用量の４×１０^５ＴＴＵ、すなわち、２×１０ｅ^６ＴＴＵ／動物）。対照動物に、試験において用いられるレンチウイルス産生バッチの主な構成成分である１００μｌのＤＭＥＭ（組織培養培地）を注入した。動物を、形質導入後の様々な時点で屠殺し、肺組織ホモジェネート、気管支肺胞洗浄液及び血清をＡＡＴ発現について分析した。

マウス組織収集：
マウスを、形質導入後の示された時点で屠殺した。左心室を穿刺することにより血液を収集し、７６０ｇ_ａｖで１０分間遠心分離して、血清を調製した。次いで、血清を−８０℃で凍結した。

首を切断し、気管にカニューレを挿入し、縫合糸を用いてそれを所定の位置に固定することによって、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施した。５００μｌのＰＢＳを肺に注入し、３回吸引して、上皮層の完全な洗浄液を得た。試料を液体窒素中ですぐに簡易凍結し、さらなる分析のために−８０℃で保存した。

次いで、肺を切断して液体窒素中で簡易凍結した後、溶解マトリックスＤチューブ（MP Biomedicals社）中でホモジェナイズし、FastPrep装置（ThermoFisher Scientific社、Waltham、MA、USA）中、４ｍ／ｓで４５秒間遠心分離し、さらなる分析のために−８０℃で保存した。

ＡＡＴ（Ａ１ＡＴ）及びＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇｌｕｘ）発現を、上記の実施例１６及び実施例１７に記載のように決定した。単回用量の実施例１５のｌｕｘレポーター遺伝子レンチウイルスベクターによるマウス気道細胞のインビボでの形質導入は、肺ホモジェネート（図１８Ａ）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ、図１８Ｂ）及び血清（図１８Ｃ）中での、分泌型レポータータンパク質であるＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼの長期的発現（少なくとも１２カ月）をもたらした。

Ａ１ＡＴの高レベルの発現が、インビボでのＡＡＴ（Ａ１ＡＴ）遺伝子のレンチウイルス媒介性導入（図１９）後に肺ホモジェネート、ＢＡＬ及び血清中で観察され、対応する陰性（ＰＢＳ）対照と比較して、肺ホモジェネート及びＢＡＬ中ではＡＡＴ（Ａ１ＡＴ）発現の１００倍の増加が観察された。ＡＡＴ（Ａ１ＡＴ）発現の有意な増加（少なくとも１桁分）は、血清中でも観察された。

さらに、アルファ−１−アンチトリプシンの長期的発現（少なくとも９０日）が、インビボでのＡＡＴ（Ａ１ＡＴ）遺伝子のレンチウイルス媒介性遺伝子導入後に肺ホモジェネート（図２０Ａ）、ＢＡＬ（図２０Ｂ）及び血清（図２０Ｃ）中で観察された。

尿素アッセイ
Ｃ５７ｂｌ／６マウス（ｎ＝５／群）を、１０日間隔で３用量のＳＩＶ１ ｈＣＥＦ−ｓｏｈＡＡＴで処置した（１００μｌ／用量、６．８×１０^７ＴＴＵ；合計用量２．４×１０^８ＴＴＵ）。対照動物には、各投薬点で１００μｌの滅菌ＰＢＳ（試験において用いられるレンチウイルス産生バッチの主な構成成分）を注入した。

３回目の用量の１０日後、動物を屠殺し、肺組織ホモジェネート、気管支肺胞洗浄液及び血清をＡ１ＡＴ発現について分析した。

尿素アッセイ（Abcam社、Cambridge、UK）を、製造業者の指示書にしたがって実施した。

第１に、マウス血清及びＢＡＬ液試料の連続希釈液を調製し、さらなる実験における使用にとって適切な希釈率を決定するために分析した。

第２に、単一のマウス由来の対応する血清及びＢＡＬ液試料（ｎ＝１４）を分析して、上皮被覆液に対するＢＡＬの希釈効果と等価な、血清及びＢＡＬ液中の尿素濃度間の倍数差を算出した（Rennard SI et al, J Appl Physiol (1985).1986 Feb;60(2):532-8に記載のように）。ＢＡＬの平均希釈率は４１倍（２４〜８８倍の範囲）であった。

この希釈効果を考慮して、上皮被覆液中のＡＡＴ（Ａ１ＡＴ）の濃度を算出した。具体的には、気管支肺胞洗浄液中のＡＡＴの濃度に希釈係数を掛けて、上皮被覆液中の「真の」ＡＡＴ濃度の見積もり値を提供した。

上皮被覆液（ＥＬＦ、すなわち、肺中の気道及び空隙を被覆する流体）中のＡＴＴ（Ａ１ＡＴ）の「防御」標的レベルは７０μｇ／ｍｌ（２００μｇ／ｍｌのＥＬＦ中のＡＴＴ（Ａ１ＡＴ）の「正常」標的レベルと比較）である。図２１に示されるように、上皮被覆液中のアルファ−１−アンチトリプシンの治療レベルは、インビボでのＡＴＴ（Ａ１ＡＴ）レンチウイルス媒介性遺伝子導入に続いた。

ＦVIIIのためのレンチウイルスベクターの生成
４つの異なるＦVIIIレンチウイルスベクターを、ＳＩＶ主鎖と、実施例２及び実施例３（ＣＦＴＲレンチウイルスについて）並びに実施例１５（Ａ１ＡＴレンチウイルスについて）に上記された５プラスミド法とを用いて調製した。プロモーター−導入遺伝子プラスミドは、それぞれ、配列番号１１〜配列番号１４を有する。

ＳＩＶ配列は、プロモーターとｃＤＮＡを除いて、ＣＦＴＲ構築物（実施例２及び実施例３）と同一であった。ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）又は組織特異的ｈＣＥＦＩプロモーター／エンハンサーを、示されたように用いて（図２２）、ＦVIII導入遺伝子の発現を駆動した。

ＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ−ＦVIII−Ｎ６−ｃｏは、ＢＤＤドメインが欠失され、コドン最適化された２２６アミノ酸の６Ｎ−グリコシル化断片で置き換えられた野生型ヒトＦVIII ｃＤＮＡを含有していた。

ＳＩＶ−ＦVIII−Ｖ３は、２２６アミノ酸のグリコシル化部位が欠失され、Ｂドメイン内の６Ｎ−グリコシル化トリプルを発現する１７アミノ酸のペプチドで置き換えられた野生型ヒトＦVIII ｃＤＮＡを含有する（McIntosh et al., Blood 2013 121(17); 3335-3344）。

インビボ及びインビトロでのモデルにおけるｈＦVIII抗原及び活性レベルの定量
マウスモデルにおけるヒトＦVIII抗原レベルを、製造業者のプロトコールにしたがって酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により定量した。簡単に述べると、血漿、ＢＡＬ及び肺を、Asserachrom（FVIII:Ag）Elisa（Stago Diagnostics社、France）を用いてＦVIII抗原の存在について分析した。

試料を１：２に希釈し、室温で２時間、マウスモノクローナル抗ヒト第VIII因子断片で被覆された９６ウェルプレート上でインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼと結合した抗マウス二次抗体をプレートに添加し、ＲＴで２時間、インキュベーションを実施した。ｈＦVIII：Ａｇレベルを、ＴＭＢ基質を用いて４５０ｎｍで分光光度的に決定した（データは示さない）。

別のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、インビトロでのＨＥＫ２９３Ｔモデル（ＦVIII：Ｃ、Affinity Biological社、Canada）におけるＦVIII活性を評価した。ＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ−ＦVIII−Ｎ６又はＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ−ＦVIII−Ｎ３によるＨＥＫ２９３Ｔの形質導入の４８及び７２時間後に、上清を収集した。ＦVIII活性を、２連でアッセイされた５０μｌの上清を用いて製造業者の指示書に従うことにより評価した。陰性対照として、未処置のＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清を試験した。ｈＦVIII活性を、正常なヒトのプールされた血漿の連続希釈液を用いて生成された標準曲線から算出した（13th British Standard for blood coagulation Factor VIII concentrate, Human; NIBSC）。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、２つの異なるバッチのｖＧＭ１４２（バッチ１ − ５．９×１０^８ＴＴＵ／ｍｌ及びバッチ２ − ２．８×１０^８ＴＴＵ／ｍｌ）を形質導入した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、３つの異なるＭＯＩ（ＭＯＩ１；１０；１００）でｖＧＭ１４２バッチ１ベクター（図２３Ａ）及びｖＧＭ１４２バッチ２ベクター（図２３Ｂ）を形質導入し、形質導入の４８及び７２時間後に収集した。

図２３から明らかなように、形質導入の４８時間後と７２時間後の両方において、ｖＧＭ１４２のバッチ１とバッチ２の両方についてＭＯＩの増大と共にＦVIII活性の増大が観察された。さらに、ＦVIII活性は、試験したそれぞれのＭＯＩについて４８時間から７２時間まで増大した。

マウス鼻へのＦVIII及びｌｕｘレポーター遺伝子レンチウイルスベクターのインビボでの投与
マウス肺の形質導入：
全ての動物手順を、Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ Ａｃｔ（１９８６）の下でＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ ａｎｄ Ｐｅｒｓｏｎａｌライセンス規則の条件及び制限にしたがって実施した。

６〜８週齢野生型Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（Charles River社、UK）を、イソフルランを用いて麻酔し、以前に記載のように（Griesenbach et al., 2012）、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）中の１００μｌのウイルスを与え、ＦVIII抗原の存在を評価した。

２つの実験（群１及び群２）において、マウスは３用量（１日おき）のＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ−ＦVIII−Ｎ６（ｖＧＭ１４２）を受け、１回目の用量の１０日後に処分された。群１（ｎ＝４）を、１．４×１０^６ＴＴＵ／マウスの合計ベクター用量で処置した。群２（ｎ＝３）を、１．５７×１０^８ＴＴＵ／マウスの合計ベクター用量で処置した。

１つの実験（群３）において、マウスは１２用量（１日おき）のＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ−ＦVIII−Ｎ６（ｖＧＭ１４２）で処置され、１回目の用量の２８日後に処分した。群３（ｎ＝４）を、３．３６×１０^８ＴＴＵ／マウスの合計ベクター用量で処置した。

血漿、ＢＡＬ液及び肺を収集した（実施例１４に記載の通り）。簡単に述べると、マウスを、形質導入後の示された時点で屠殺した。次いで、血液を心臓から３．２クエン酸三ナトリウム抗凝固剤収集チューブ中に収集した後、２０００〜２５００ｘｇで遠心分離して、血漿を取得した。室温でマウス肺にＰＢＳ（５００μｌ）の３連続設備を適用することにより、ＢＡＬ液を収集した。上清を−８０℃で保存した。肺を収集し、組織ホモジェナイゼーションの前に−８０℃で保存した。

次いで、ＦVIII発現の存在を評価した。ＦVIIIレベルを、ＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ−ＦVIII−Ｎ６処置後１０及び／又は２８日で３つの独立した実験において別々に収集された肺組織ホモジェネート（図２４Ａ）、ＢＡＬ液（図２４Ｂ）及び血漿（図２４Ｃ）中で評価した。処置群間の複数の比較を用いる一元配置Ａｎｏｖａ（GraphPad Prism）を用いて分析を実施した（^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。

図２４Ａから明らかであるように、３つ全ての処置群が、対応する対照（Ｄ−ＰＢＳ）と比較して肺組織内のｈＦVIIIレベルの観察可能な増加をもたらした。群３の２８日の処置は、群１及び群２の１０日の処置と比較してｈＦVIII発現の有意な増加をもたらした。同様の結果が、ＢＡＬ液試料について観察されたが（図２４Ｂ）、これらの試料中では、群１と比較して群２においてｈＦVIIIレベルも有意に増加していた。群３処置は、血漿中のｈＦVIIIレベルの有意な増加をもたらした（図２４Ｃ）。

本発明によるレンチウイルスベクターの製造方法
ＨＥＫ２９３細胞を、Freestyle Expression Media（化学的に規定された、動物源及びタンパク質非含有）中で浮遊状態で増殖させ、細胞数をモニタリングする。グルコース濃度を決定し、約３５ｍＭまで滴定する。pDNA/PEIPro（商標）のトランスフェクション混合物を調製し、細胞を０．３３ｍｇのpDNA/1E9細胞でトランスフェクトした。

細胞数を再度モニタリングし、さらなるFreestyle Expression Mediaを添加する。グルコース濃度を再度決定し、約３５ｍＭまで滴定する。５μ／ｍＬのBenzonase（登録商標）を添加することができ、３段階のインラインウイルス清澄化を実施する。Benzonase（登録商標）を添加した後、TrypLE Select（商標）を添加する。ウイルスを０℃に冷却し、その後のステップの全部について湿った氷上で保持する。非ウイルス粒子状物質を濾過した後（ｍＰＥＳ ０．４５μｍフィルター）、ウイルスをMustang（登録商標）Q XT（清澄化されたウイルス１Ｌあたり３ｍＬの膜）上にロードした後、０．１５Ｍ ＮａＣｌ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５で洗浄し、１．０Ｍ ＮａＣｌ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５で溶出する。ウイルス画分を収集し、Freestyle培地を用いて０．１〜０．２初期容量に希釈する。上記で添加しなかった場合、TrypLE Select（商標）をここで添加することができ、上記に加えて、又は上記の代わりに、この段階でBenzonase（登録商標）を添加してもよい。

Ｓｐｅｃｔｒｕｍ接線流濾過（ＴＦＦ）を実施し（約０．１〜０．０５初期容量までのＵＦ＝ＨＶ；ＤＦ保持液×５製剤化バッファーに対するＨＶ；約０．００１〜０．００２初期容量までのＵＦ）、保持液を収集する。２回目のＴＦＦステップを実施し、ＤＦ及び／又は最後のＵＦに関する少ない方のＴＦＦ単位を用いることができる。さらなるステップは、混合様式／ＳＥＣ及び０．４５μｍ又は０．２μｍ滅菌濾過を含んでもよい。

図１１は、Ｆ／ＨＮ ＳＩＶベクターの産生及び精製を記載する。Ｆ／ＨＮ ＳＩＶベクターを、本発明の拡張可能な方法を用いて、ｐＨ制御されたWAVE Bioreactors（GE社）中、１Ｌスケールで浮遊状態で増殖させた２９３Ｔ細胞の５プラスミド（pDNA）ＰＥＩ媒介性一過的トランスフェクションにより産生した。ベクターを、深層濾過／エンド濾過（GE社/Pall社）により清澄化し、夾雑する核酸をBenzonase（登録商標）（Merck社）を用いて除去し、ベクターをTrypLE Select（商標）（Life Technology社）で活性化し、陰イオン交換膜クロマトグラフィー（Pall社）及び接線流濾過（Spectrum社）により精製及び濃縮した。全てのプロセス容器、容器及びカラムは、単回使用のｃＧＭＰ準拠物であった。プラスミドＤＮＡを除く全ての試薬は、動物源を含まないｃＧＭＰ準拠物であった。様々なベクター構成（導入遺伝子プロモーター、導入遺伝子、インテグラーゼ状態）からのデータを示す。物理的及び機能的力価を、Ｑ−ＰＣＲを用いて決定した。

上記の図１１の説明で考察される本発明のこの例示的方法の結果を参照されたい。

配列番号の説明
配列番号１ 図１Ａで定義されるプラスミド（pDNA1 pGM326）
配列番号２ 図１Ｂで定義されるプラスミド（pDNA2a pGM297）
配列番号３ 図１Ｃで定義されるプラスミド（pDNA2b pGM299）
配列番号４ 図１Ｄで定義されるプラスミド（pDNA3a pGM301）
配列番号５ 図１Ｅで定義されるプラスミド（pDNA3b pGM303）
配列番号６ 例示されるｈＣＥＦプロモーター
配列番号７ 例示されるＣＦＴＲ導入遺伝子（ｓｏＣＦＴＲ２）
配列番号８ 例示されるＷＰＲＥコンピテント（ｍＷＰＲＥ）
配列番号９ 図１５で定義されるＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ｓｏＡ１ＡＴプラスミド（pDNA1 pGM407）
配列番号１０ 図１５で定義されるＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ｓｏｇＬｕｘプラスミド（pDNA1 pGM358）
配列番号１１ 図２２Ｃで定義されるＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＨＦVIII−Ｖ３プラスミド（pDNA1 pGM411）
配列番号１２ 図２２Ｄで定義されるＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＨＦVIII−Ｖ３プラスミド（pDNA1 pGM413）
配列番号１３ 図２２Ｅで定義されるＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ＣＭＶ−ＨＦVIII−Ｎ６−ｃｏプラスミド（pDNA1 pGM412）
配列番号１４ 図２２Ｆで定義されるＦ／ＨＮ−ＳＩＶ−ｈＣＥＦ−ＨＦVIII−Ｎ６−ｃｏプラスミド（pDNA1 pGM414）
配列番号１５ 例示されるＡ１ＡＴ導入遺伝子
配列番号１６ 例示されるＦVIII導入遺伝子（Ｎ６）
配列番号１７ 例示されるＣＭＶプロモーター
配列番号１８ pCAGGS-Fct4の構築のためのプライマー
配列番号１９ pCAGGS-Fct4の構築のためのプライマー
配列番号２０ pCAGGS-Fct4の構築のためのプライマー
配列番号２１ pCAGGS-Fct4の構築のためのプライマー
配列番号２２ pCAGGS-Fct4の構築のためのプライマー
配列番号２３ pCAGGS-Fct4の構築のためのプライマー
配列番号２４ pCAGGS-SIVct+HNの構築のためのプライマー
配列番号２５ pCAGGS-SIVct+HNの構築のためのプライマー
配列番号２６ 例示されるＡ１ＡＴ導入遺伝子に対する相補鎖
配列番号２７ 例示されるＡ１Ａ１ペプチド
配列番号２８ 例示されるＦVIII導入遺伝子（Ｎ６）に対する相補鎖
配列番号２９ 例示されるＦVIIIペプチド（Ｎ６）
配列番号３０ 例示されるＦVIII導入遺伝子（Ｖ３）
配列番号３１ 例示されるＦVIII導入遺伝子（Ｖ３）に対する相補鎖
配列番号３２ 例示されるＦVIIIペプチド（Ｖ３）
配列番号３３ 例示されるＣＭＶプロモーターに対する相補鎖

配列

Claims (27)

1. 呼吸器系パラミクソウイルス由来のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）及び融合（Ｆ）タンパク質でシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターであって、プロモーターと導入遺伝子とを含み、前記プロモーターと前記導入遺伝子との間に位置するイントロンを欠く、前記レンチウイルスベクター。
2. ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベクター、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ベクター、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベクター、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）ベクター、及びビスナ／マエディウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１に記載のレンチウイルスベクター。
3. ＳＩＶベクターである、請求項１又は２に記載のレンチウイルスベクター。
4. 呼吸器系パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項１〜３のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
5. プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１ａ（ＥＦ１ａ）プロモーター、及びハイブリッドヒトＣＭＶエンハンサー／ＥＦ１ａ（ｈＣＥＦ）プロモーターからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
6. ハイブリッドヒトＣＭＶエンハンサー／ＥＦ１ａ（ｈＣＥＦ）プロモーターを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
7. 導入遺伝子が、ＣＦＴＲ、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１１、ＤＮＡＩ１、及びＤＮＡＩ２、アルファ−１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＦＴＰＢ）、第VIII因子、フォン・ヴィレブランド因子又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
8. 導入遺伝子がＣＦＴＲをコードする、請求項１〜７のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
9. 導入遺伝子がＡ１ＡＴをコードする、請求項１〜７のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
10. 導入遺伝子がＦVIIIをコードする、請求項１〜７のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
11. プロモーターがｈＣＥＦプロモーターであり、導入遺伝子がＣＦＴＲをコードする、請求項１〜７のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
12. プロモーターがｈＣＥＦプロモーターであり、導入遺伝子がＡ１ＡＴをコードする、請求項１〜７及び９のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
13. プロモーターがｈＣＥＦ又はＣＭＶプロモーターであり、導入遺伝子がＦVIIIをコードする、請求項１〜７及び９のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
14. 以下のステップを含む、レンチウイルスを産生する方法。
    （ａ）細胞を浮遊状態で増殖させるステップ；
    （ｂ）１又は２以上のプラスミドを、前記細胞にトランスフェクトするステップ；
    （ｃ）ヌクレアーゼを添加するステップ；
    （ｄ）レンチウイルスを採取するステップ；
    （ｅ）トリプシンを添加するステップ；及び
    （ｆ）精製ステップ；
15. ステップ（ａ）〜（ｆ）が、順次実施される、請求項１４に記載の方法。
16. 細胞が、ＨＥＫ２９３Ｔ又は２９３Ｔ／１７細胞である、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. ヌクレアーゼの添加が、採取前の段階にある、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
18. トリプシンの添加が、採取後の段階にある、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
19. 精製ステップが、クロマトグラフィーステップを含む、請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
20. 請求項１〜１３のいずれかに記載のレンチウイルスベクターを対象に投与するステップを含む、疾患を処置する方法。
21. 疾患が、嚢胞性線維症（ＣＦ）；原発性線毛運動障害（ＰＣＤ）；サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）欠損症；アルファ１−アンチトリプシン欠損症（Ａ１ＡＤ）；肺胞タンパク症（ＰＡＰ）；及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）から選択される肺疾患である、請求項２０に記載の方法。
22. 導入遺伝子が第VIII因子であり、疾患が血友病である、請求項２０に記載の方法。
23. ＣＦの治療における使用のための、請求項１〜７、８及び１１のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
24. Ａ１ＡＴ欠損症の治療における使用のための、請求項１〜７、９及び１２のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
25. 血友病の治療における使用のための、請求項１〜７、１０及び１３のいずれかに記載のレンチウイルスベクター。
26. 請求項１〜１３のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞。
27. 請求項１〜１３のいずれかに記載のベクターと、薬学的に許容される担体とを含む組成物。