JP2017520674A - ポリエーテルアミンをグラフトすることにより多糖類を修飾する方法、その方法により修飾された多糖類、およびその多糖類を備え、温度感受性のレオロジー特性を有する製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、多糖類を修飾する方法に関する。この方法は、（ａ）ある多糖類を（好ましくは水とイソプロパノールとの組み合わせである）基剤(base)の存在下に、（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）ｂＲ’型の修飾されたポリエーテルアミン（ここで、Ｒ’はポリエーテルであり、ｂ＝１、２または３であり、Ｘはハロゲン（好ましくはＣｌまたはＢｒ）であり、Ｒはアルキル基（置換されていても良い）または芳香族基（置換されていても良い）である）と反応させる工程と、（ｂ）工程（ａ）により得られた生成物をＮａＣｌの存在下に膜分離法により少なくとも部分的に精製させる工程であって、該精製は、９〜１３（好ましくは１０〜１２）のｐＨで実行される、工程と、（ｃ）工程（ｂ）により得られた生成物を膜分離法により少なくとも部分的に精製する工程であって、該精製は、ｐＨ６〜８（好ましくは６．５〜７．５）における中和を行った後、必要な場合には前記生成物をフリーズドライさせ、該フリーズドライさせた生成物を（好ましくはエタノールで）洗浄した後に実行される、工程と、を有する。

Description

本発明は、広くは有機化学に関し、具体的には多糖類の化学に関する。より詳細には、本発明は、ポリエーテルアミンをグラフトすることによる、天然多糖類または人工多糖類の修飾に応用される。また、本発明は、それらの修飾された多糖類をハイドロゲルの形態で細胞培養用培地として用いる方法にも関する。このようなハイドロゲル製剤は、温度感受性のレオロジー特性を有し得る。その特性は、人間の体内に取り込んだかたちでの適用可能性や、獣医学への適用可能性を有し、また、（細胞、医薬品添加物、生検等の）生体標本の細胞培養・輸送への適用可能性をも秘める有益なものである。

ヒアルロン酸は、動物や人間の体内において最も広範に存在する多糖類の一つである。ヒアルロン酸は、微生物（特にStreptococcus equi）を発酵させることにより産業的規模で製造され得る。生体起源を有するこの製品は、ハイドロゲルを形成し得る、生体適合性・生分解性多糖類である。このため、この製品の体内での使用に適した分野（特に整形外科）を見出すべく研究が進められている。これにより、ヒアルロン酸（ＨＡ）ハイドロゲルが、劣化または損傷した軟骨の治療に体内で使用されることはよく知られている。最もよく知られている方法は、関節内補充療法（すなわち、ＨＡを滑液に添加するか、または滑液を完全にＨＡと取り換える治療法）である。体内での応用分野としては、皮膚科学への適用も検討されている。

ＨＡの化学修飾が提案されている。これにより新しく、特殊な特性を有するハイドロゲルを生成する手段が得られる。このような提案は、C.E. SchanteらによりCarbohydrate Polymers Journal、vol. 85、p. 469-489 (2011)に発表された「生体医学分野において広く適用可能な誘導体を合成するためのヒアルロン酸の化学修飾（Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives for a broad range of biomedical applications）と題する論文や、Zied SouguirによりUniversite de Rouenに２００６年に提出された「多糖類の機能化とそのｐＨ依存特性の研究 ("Fonctionnalisation de polysaccharides et etude de leurs proprietes ‘pH dependantes'" - Functionalization of polysaccharides and study of their 'pH dependent' properties)」と題された博士論文や、Kristoffer BergmanによりUpsalaに２００８年に提出された「ヒアルロン酸誘導体および組織工学用の注入可能ゲル（Hyaluronan Derivatives and Injectable Gels for Tissue Engineering）」と題された博士論文に詳細に記載されている。

しかしながら、このような化学修飾が、（修飾されたＨＡの代謝中に生成物の分解が起こる結果）直接的または間接的に毒性を誘導することがあってはならないし、また、このような化学修飾が製品の生分解性に有害であってもいけない。

ＨＡの化学修飾や、修飾されたＨＡの関節病治療への使用を扱った特許は多数存在する。例えば、ＥＰ １ ０９５ ０６４（Fidia）は多数のＨＡ誘導体を記載している。ＥＰ ２ ４５７ ５７４ Ａ１（Fidia Advanced Biopolymers）は、アミドであるＨＡ誘導体からの生体材料の調製と、関節内補充への試験的適用とを記載している。ＷＯ２００４／０２２６０３（LG Life Sciences）は、グリコール系重合体と架橋したＨＡ重合体を記載しており、ＫＲ １００７ ３７９５４ Ｂ１（Korea University）は、ＨＡのアクリル化された誘導体を記載している。最後の２つの文献は、得られた生成物の体内での使用を想定している。

ジェファーミン（登録商標）型ポリエーテルアミンおよびポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ））によるヒアルロン酸のグラフト化については、M. D’Esteらにより、Carbohydrate Polymers 90 journal (2012)、p. 1378-1385に発表された「温度感受性ヒアルロン酸ハイドロゲルの単一工程合成および特性評価（Single step synthesis and characterization of thermoresponsive hyaluronan hydrogels）」と題する論文に開示されている。

これらの修飾された（機能化された）ＨＡハイドロゲルの中には、温度感受性のレオロジー特性を有するものもある。これらの生成物に関して、活性構成要素を制御された量で放出することによる体内での適用可能性が検討されている。例えば、以下の文献を参照されたい。Mee Ryang KimおよびTae Gwan Park、「温度に応答し劣化し得るヒアルロン酸／ヒト成長ホルモンの制御された量の放出に用いるプルロニック酸ハイドロゲル（Temperature-responsive and degradable hyaluronic acid / Pluronic acid hydrogels for controlled release of human growth hormone）」、Journal of Controlled Release、 vol. 80、p. 69-77 (2002)、T.R. HoareおよびD.S. Kohane、「薬剤送達におけるハイドロゲル―進歩と挑戦 （Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges）」、Polymer、vol. 49 (2008)、p. 1993-2007、 C.C. Chenら、「アルギン酸からのセレギリンの経皮的送達―プルロニック複合体熱ゲル（Transdermal delivery of selegiline from alginate - Pluronic composite thermogels）」、International J of Pharmaceutics、vol. 415 (2010)、p. 25 119-128、およびS. Van Vlierbergheら、「組織工学用途での足場としてのバイオポリマー系ハイドロゲル検証（Biopolymer-Based Hydrogels as Scaffolds for Tissue Engineering Applications: A Review）」、 Biomacromolecules、2011、12、p. 1387-1408。

多糖類にグラフトする分子の選択が、生成物の物理化学的特性に決定的な影響を与えることが分かっている。より詳細には、ＥＰ １ ６５９ １４３（Teijin）は、ヒアルロン酸の温度感受性ハイドロゲルと、酸化プロピレンに基づく二次ポリエーテルアミン（ジェファーミン（登録商標）ＸＴＪ−５０７）とを記載している。目的とする用途は、軟骨の再生である。この文献で述べられた情報によれば、粘性遷移領域は、およそ１５℃の幅を有する温度範囲に亘るとされるが、そのような範囲は医学に適用するには広すぎる。

ポリエーテルアミンの選択が生成物の物理化学的特性に影響を及ぼしていると示唆する文献もある。例えば、G. Mocanuらにより、Carbohydrate Polymers、vol. 89、p. 578-585 (2012) に発表された「ジェファーミン側鎖を有する多応答性カルボキシメチル多糖類架橋ハイドロゲル（Multi-responsive carboxymethyl polysaccharide crosslinked hydrogels containing Jeffamine side-chains）」と題する論文は、ＨＡ以外の多糖類を含むハイドロゲルについて、ジェファーミン（登録商標）Ｍ−６００の感熱特性とＭ−２００５の感熱特性と（その酸化プロピレン／酸化エチレン比およびそのモル質量により識別される２つの生成物）の間には重大な違いがあることを示している。M. D’EsteらはCarbohydrate Polymers、vol. 90、p. 1378-1385 (2012)に発表された「温度感受性ヒアルロン酸ハイドロゲルの単一工程合成および特性評価（Single step synthesis and characterization of thermoresponsive hyaluronan hydrogels）」と題する論文において、ＨＡジェファーミン（登録商標）型ハイドロゲルについては、ジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５では十分な温度感受性が得られない一方、ジェファーミン（登録商標）Ｍ６００を有するハイドロゲルの温度感受性は、感知できるレベルだが、依然かなり低いことを述べている。

アセチル化または脱アセチル化により修飾されたキトサンの温度感受性ハイドロゲルもまた知られている。例えばＵＳ ２００９／０００４２７６（Mor Research Applications Ltd）を参照。またある種の多糖類を修飾することによりハイドロゲルを調製する手段が得られること、そのハイドロゲルの特性はｐＨに依存することも知られている。Zied Souguirによる上記論文、およびG. MocanuらによりCarbohydrate Polymers、vol. 87、p. 1440-1446 (2012)に発表された「新規なアニオン性で架橋された多応答性プルランハイドロゲル（New anionic crosslinked multi-responsive pullulan hydrogels）」と題する論文を参照のこと。

しかしながら、上記すべての場合において、体内で使用される場合にそれを取り巻く生体環境の関数としてのハイドロゲル特性の変動、具体的には、温度の関数としての該特性の変動は、相当微小であり、生成物の合成時に制御するのが相当難しいものである。

したがって、体内で使用可能であり、修飾され、生体適合性であり、かつ毒性の無い多糖類であって、具体的には、活性な構成要素および／または細胞を輸送し、および／または制御された量だけ放出するのに利用可能であり、より広い範囲で変動する感熱特性を有し、かつその合成中により容易に制御可能である、多糖類をより広い範囲で調製することを可能にする新規なアプローチが必要とされていることは明らかである。

本発明によれば、上記課題は、ポリエーテルアミンをグラフトすることにより修飾された多糖類を合成する新規な方法により解決される。このような問題を既存のポリエーテルアミンを用いて解決することは不可能であるため、本出願人は、まずその第一歩として、多糖類にグラフト可能な新規なポリエーテルアミン分子を開発すべきことを認識した。その結果、そのようなポリエーテルアミンをグラフトすることにより修飾された新規な多糖類は、特に有用な温度感受性のレオロジー特性を有する、新規な多糖類系製剤と共に調製可能である。

したがって、本発明の第１の目的は、多糖類を修飾する方法であって、
（ａ）ある多糖類を（好ましくは水とイソプロパノールとの組み合わせである）基剤の存在下に、
（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’型の修飾されたポリエーテルアミン
（ここで、Ｒ’はポリエーテルであり、ｂ＝１、２または３であり、Ｘはハロゲン（好ましくはＣｌまたはＢｒ）であり、Ｒはアルキル基（置換されていても良い）または芳香族基（置換されていても良い）である）
と反応させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）により得られた生成物をＮａＣｌの存在下に膜分離法により少なくとも部分的に精製させる工程であって、該精製は、９〜１３（好ましくは１０〜１２）のｐＨで実行される、工程と、
（ｃ）工程（ｂ）により得られた生成物を膜分離法により少なくとも部分的に精製させる工程であって、該精製は、ｐＨ６〜８（好ましくは６．５〜７．５）における中和を行った後、必要な場合には上記生成物をフリーズドライさせ、該フリーズドライさせた生成物を（好ましくはエタノールで）洗浄した後に実行される、工程と、
を有する、方法を提供することにある。

Ｒは好適にはアルキル基を表し、置換された基（例えばＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、またはＣ_１２）でも良く、または芳香族基（例えば、置換されたフェニル基）でも良い。

ある実施の形態において、上記修飾されたポリエーテルアミンはポリエーテルモノアミンであり、上記Ｒ’基は以下の構造を有する。

ここで、Ｚは（酸化エチレンの場合は）水素原子であり、（酸化プロピレンの場合は）メチルであり、好ましくは、ｘ＝１〜３、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝７〜１１（好ましくはｘ＝１およびｙ＝９）であるか、ｘ＝１７〜２１、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝２〜５（好ましくはｘ＝１９およびｙ＝３）であるか、ｘ＝５〜８、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝２５〜３２（好ましくはｘ＝６およびｙ＝２９）である。

好適には、上記ポリエーテルアミンＲ’は、約３００〜約３０００のモル質量を有し、さらに好ましくは約５００〜約２５００のモル質量を有しており、および/または上記ポリエーテルアミンは、酸化プロピレン／酸化エチレンのモル比が１０/１から１/１０の範囲内である。

本発明による方法のある好適な実施の形態において、上記工程（ａ）は、第四級アミンを用いてＰＳ多糖類の少なくとも１つのＰＳ−ＣＯＯＨカルボン酸機能を活性化させる工程であって、その後、上記修飾されたポリエーテルアミンが添加される工程である。

本発明による方法によれば、少なくとも１つの精製工程を有することにより、上記修飾された多糖類を薬学において適用し、人間の体内において適用することが可能になる。ここで、中和後に行われる、すべての精製工程は、好ましくは２０℃を下回る温度で行われ、より好ましくは０℃〜１５℃の温度で行われ、さらに好ましくは２℃〜８℃の温度で行われる。

本発明による多糖類修飾方法において、上記工程（ｃ）により得られた上記生成物をフリーズドライさせ、エタノールで洗浄させた後、乾燥させても良い。

好適には、ハイドロゲルにおいて用いるために調製する際に、上記多糖類は、中性多糖類（特にプルランおよびデキストラン）、天然アニオン性多糖類（特にアルギン酸、ヒアルロン酸、キタンサンガム、寒天、ペクチン、ヘパリン）、人工アニオン性多糖類（特にカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルプルナン）、天然カチオン性多糖類（特にキトサン）、人工カチオン性多糖類（特にジエチルアミノエチルセルロース、ジエチルアミノエチルデキストラン）、両親媒性多糖類、天然両性イオン性多糖類、化学修飾により得られた多糖類（特にカルボキシメチルキトサン）、およびこれらの多糖類の混合物からなる群から選択される。中でも、プルラン、キタンサン、アルギン酸およびヒアルロン酸が特に好適である。

本発明の他の目的は、本発明による方法により得られ得る、修飾された多糖類を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、本発明による上記修飾された多糖類のうち少なくとも１つと、水性液体と、を備えるハイドロゲルを提供することにある。上記水性液体は血清および/または細胞培養用培地を有し得る。

ある実施の形態において、本発明によるハイドロゲルは、好適には、３３℃〜３９℃の遷移温度を有する温度感受性のレオロジー特性を呈する。別の実施の形態では、本発明によるハイドロゲルは、４℃〜２０℃の遷移温度を有する温度感受性のレオロジー特性を呈する。

本発明のさらに他の目的は、本発明によるハイドロゲルを、細胞培養用培地または細胞輸送用培地に用いる方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、本発明によるハイドロゲルを、皮膚再生、塞栓剤、関節内補充剤、充填剤、術後癒着防止剤、または組織再生剤として用いられる組成物の調製に用いる方法を提供することにある。

本発明による上記多糖類修飾方法において用いられる、（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’型の修飾されたポリエーテルアミンは、現状は入手不可能なものであるが、ポリエーテルアミン（Ｈ_２Ｎ）_ｂＲ’をアシルハライドのハロゲン化物Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｘに反応させることにより、（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’型の修飾されたポリエーテルアミンを調製する方法により調製可能である。この方法は、
（ａ）アシルハライドのハロゲン化物Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｘ（ここで、Ｘはハロゲン（好ましくはＣｌまたはＢｒ）であり、Ｒはアルキル基（置換されていても良い）または芳香族基（置換されていても良い）である）を用いてポリエーテルアミン（Ｈ_２Ｎ）_ｂＲ’（ここで、Ｒ’はポリエーテルであり、ｂ＝１、２または３である）を得る工程と、
（ｂ）基剤（好ましくはＥｔ_３Ｎおよび/またはＮａＯＨである）の存在下にこれら２つの試薬を混合し、それにより得られた混合物を、好ましくは溶媒の不在下（具体的にはＤＭＦおよびＴＨＦの不在下）に、３５℃を下回る温度で、好ましくは２５℃を下回る温度で、さらに好ましくは２０℃を下回る温度で、最も好ましくは０℃〜１０℃の温度で反応させる工程と、
を有する。

この反応は、以下の反応式に従って行われる。

Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｘ＋（Ｈ_２Ｎ）_ｂ−Ｒ’→（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’
ここでｂ＝１、２または３であり、Ｘはハロゲン化物（好ましくはＣｌまたはＢｒ）であり、Ｒは（置換されていても良い）アルキル基（例えばＣ_６基）または（置換されていても良い）芳香族基（例えばフェニル基）であり（ただし、この芳香族基の機能分化は望ましくない）、Ｒ’は好ましくはＰＰＯ型または（ＰＥＯ）_ｘ−ｃｏ−（ＰＰＯ）_ｙ型のポリエステルを表す。上記ポリエーテルアミンは、ポリエーテルモノアミン（すなわちｂ＝１）でも、ポリエーテルジアミン（すなわちｂ＝２）でも、あるいはポリエーテルトリアミン（すなわちｂ＝３）でも良い。好ましくは、第一級アミンが用いられる。

この反応は、この反応により生じるＨＸを獲得する、好ましくはＥｔ_３Ｎおよび/またはＮａＯＨである基剤の存在下に行われる。

また、この反応は、好適には２０℃を下回る温度で、好ましくは０℃〜１０℃の範囲内の温度で行われる。

上記工程（ｂ）の後、反応に用いた培地を酸性水で洗浄しても良い。また、この方法により得られた上記修飾されたポリエーテルアミンを、アルコール（好ましくはイソプロパノール）の存在下に保存しても良い。

ポリエーテルアミンをグラフトすることにより修飾された多糖類を製造するには、一般式でいうとＨ_２Ｎ−Ｒ’で表されるポリエーテルモノアミン、具体的には以下の構造を有するポリエーテルモノアミンが好適には用いられる。

ここでＺ^１は水素原子（酸化エチレンの場合）、メチル（酸化プロピレンの場合）あるいはエチルまたはプロピルであり、ｘおよびｙは鎖長を表す。なお、ｘおよびｙは、ある与えられた分子については整数であるが、ある生成物が使用される状態においてはその生成物についての平均値を表し得る。その場合、互いに異なる長さの分子を含み得る。

ある実施の形態において、使用可能なポリエーテルアミンのモル質量は、約３００〜約３０００の範囲内で変動し得、好ましくは約５００〜約２５００の範囲内で変動可能である。また、ＰＯ／ＥＯのモル比は比較的広い範囲内で変動し得るが、例えば、１０/１から１/１０の範囲内である。

また、ポリエーテルジアミンも使用可能である。具体的には、ポリエーテルジアミンは以下の構造

を有するか、または以下の構造を有しても良い。

ここで、Ｚ^１、ｘおよびｙは上に述べたとおりであり、ｘおよびｙと同様に、ｚも上に述べたとおりの鎖長を表す。

さらにポリエーテルトリアミンを用いても良い。具体的には、ポリエーテルトリアミンは以下の構造を有しても良い。

ここで、Ｚ^１、ｘおよびｙは上に述べたとおりであり、ｘおよびｙと同様に、ｚもまた上に述べたとおりの鎖長を表す。Ｚ^２はハロゲン、またはＣ_１〜Ｃ_４の範囲内のアルキル（好ましくはメチルまたはエチル）である。ｎは０〜１２の範囲内の数であり、好ましくは、０、１または２である。

上記ポリエーテルアミンのモル質量は、好適には約３００〜約３０００の範囲内であり、より好ましくは約５００〜約２５００の範囲内である。上記ポリエーテルアミンが酸化プロピレンと酸化エチレンの混合物である場合、該ポリエーテルアミンは、好適には、１０/１から１/１０の範囲内の酸化プロピレン／酸化エチレンのモル比を有する。

ある好適な実施の形態、具体的にはポリエーテルモノアミンで実現される場合には、ｘは１〜７の範囲内で選択され、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝５〜１５（好ましくはｘ＝１〜３、かつｙ＝７〜１１）である。他の好適な実施の形態において、ｘは１５〜２５の範囲内で選択され，Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝１〜９（好ましくはｘ＝１７〜２１，かつｙ＝２〜５）である。またさらに他の好適な実施の形態において、ｘは３〜１１の範囲内で選択され、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝２１〜３５（好ましくはｘ＝５〜８、かつｙ＝２５〜３２）である。これらの好適な実施の形態は、本発明による上記方法により得られる修飾されたポリエーテルアミンの使用を目的として提供される。

上に述べたように修飾されたポリエーテルアミンを合成する、このような新規な方法を提供することが、本発明のさらに他の目的である。

本発明のさらに他の目的は、本発明による方法により得られ得る、（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’型（ここでｂ＝１、２または３である）の修飾されたポリエーテルアミンを提供することにある。これらのポリエーテルアミンは、具体的には上に述べたような修飾された多糖類を調製するのに有用である、中間合成生成物である。

最後に、本発明の目的は、本発明による修飾された多糖類を用いて多糖類を修飾することにある。

本発明による修飾された多糖類をグラフトとして用いることによって、新規な物理化学的特性を有するグラフトされた多糖類、具体的には、温度に依存する粘性を有するグラフトされた多糖類が結果として得られる。本発明によるポリエーテルアミンを用いることにより、より高いグラフト比が得られ得る。

ハイドロゲルを低温で精製することにより、ポリエーテルアミンを遊離させることなく、より純度が高く、毒性を有さないハイドロゲルが得られる。また、遊離ポリエーテルアミンが無いので、温度の関数としての粘性の変化が強められ、粘性遷移が起こる温度範囲が狭くなる。

本発明によるハイドロゲルは、温度感受性のレオロジー特性を有し、液体状態から、それらが３次元ナノ構造を構成するより高い粘性を有する状態へと遷移し得、細胞をそのような状態に保持し得る。また本発明によるハイドロゲルは、光学的に透明であり、それら細胞の光学的観察を可能にする。

図１は、本発明のある局面において、アシルハライドのハロゲン化物を用いた反応によりジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５型ポリエーテルアミンの修飾について行った試験に関し、修飾されたポリエーテルアミンの^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３中の）スペクトルを示す図である。ここで縦軸は正規化された強度を表す。 図２は、本発明のある局面において、アシルハライドのハロゲン化物を用いた反応によりジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５型ポリエーテルアミンの修飾について行った試験に関し、赤外線スペクトル（ＦＴ−ＩＲ）を示す。ここで、曲線（ａ）は当初のポリエーテルアミンに対応し、曲線（ｂ）は修飾されたポリエーテルアミンに対応し、縦軸は正規化された強度を表す。 図３は、本発明のある局面において、アシルハライドのハロゲン化物を用いた反応により予め修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５型ポリエーテルアミン（図１および図２に示すものと同様）を用いた多糖類グラフト試験（ヒアルロン酸の場合）に関し、修飾されたポリエーテルアミンによりグラフトされたヒアルロン酸（ＨＡ）の^１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ中の）スペクトルを示す図である。 図４は、本発明のある局面において、アシルハライドのハロゲン化物を用いた反応により予め修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５型ポリエーテルアミン（図１および図２に示すものと同様）を用いた多糖類グラフト試験（ヒアルロン酸の場合）に関し、グラフトされたＨＡの保存係数（弾性係数）Ｇ’（●）および損失係数（粘性係数）Ｇ”（▼）の変動を温度の関数として示す図である。グラフトされたＨＡの濃度は、ＲＰＭＩ培養培地では４０ｇ／ｌである。３７℃を下回る温度（約２９℃）では可逆であるゾルゲル転移に留意されたい。 図５は、本発明のある局面において、アシルハライドのハロゲン化物を用いた反応により予め修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５型ポリエーテルアミン（図１および図２に示すものと同様）を用いた多糖類グラフト試験（ヒアルロン酸の場合）に関し、グラフトされたＨＡの保存係数（弾性係数）Ｇ’（●）および損失係数（粘性係数）Ｇ”（▼）の変動を温度の関数として示す図である。グラフトされたＨＡの濃度は、ＲＰＭＩ培養培地では２０ｇ／ｌである。３７℃を下回る温度（約３４℃）では可逆であるゾルゲル転移に留意されたい。 図６は、本発明のある局面において、「実施例」セクションでより詳細に説明する試験に関し、２−ブロモ−２−メチルプロピオニルブロミドの作用（ウィリアムソン反応）により予め修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５型ポリエーテルアミンによりグラフトされた多糖類（この場合はＨＡ）について温度を関数とするＵＶ吸光度を示す図である。この図は、反応混合物に対してなされた測定を示す。 図７は、従来の技術において、「実施例」セクションでより詳細に説明する試験に関し、グラフトされていないヒアルロン酸について温度を関数として、保存係数（弾性係数）Ｇ’（曲線Ａ）および損失係数（粘性係数）Ｇ”（曲線Ｂ）の変動を比較して示す図である。ここで、グラフトされていないＨＡの濃度は、ＲＰＭＩ培養培地では４０ｇ／ｌであった。 図８は、本発明のある局面において、「実施例」セクションでより詳細に説明する試験に関し、２−ブロモ−２−メチルプロピオニルブロミドの作用（エステル化反応）により予め修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５型ポリエーテルアミンによりグラフトされたヒアルロン酸（グラフト比はモル比で２％）について温度を関数として、保存係数（弾性係数）Ｇ’（曲線Ａ）および損失係数（粘性係数）Ｇ”（曲線Ｂ）の変動を比較して示す図である。ここで、グラフトされたＨＡの濃度は、ＲＰＭＩ培養培地では４０ｇ／ｌであった。 図９は、本発明のある局面において、「実施例」セクションでより詳細に説明する試験に関し、２−ブロモ−２−メチルプロピオニルブロミドの作用（エステル化反応）により予め修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５型ポリエーテルアミンによりグラフトされたＨＡハイドロゲルの標本について、示差走査熱量測定（Differential Scanning Calorimetry（ＤＳＣ））曲線を示す図である。これらのハイドロゲルは、ＲＰＭＩ型の細胞培養用培地を用いて形成された。ここで、曲線Ａは、修飾されたジェファーミン（登録商標）によりグラフトされたＨＡハイドロゲルを示し、曲線Ｂは、修飾されたジェファーミン（登録商標）を比較例として示し、曲線Ｃは、ジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５を比較例として示す。

本発明による修飾された多糖類は、市販されていないポリエーテルアミン誘導体をグラフトすることにより修飾を施した場合に、最良の結果が得られるものである。しかし、以下の詳細な説明ではまず、多糖類にグラフト可能な修飾されたポリエーテルアミンを得るための一般的な方法をセクションＡにおいて述べた後に、多糖類のエステル化を行うことにより、温度感受性のレオロジー特性を有する多糖類を得る、２種類のグラフト方法をセクションＢおよびセクションＣにおいてそれぞれ述べることとする。これら２つの方法によれば、ほぼ同じ生成物が得られる。そして最後に、これらの生成物の使用法をセクションＤにおいて述べることとする。
Ａ アシルハライドのハロゲン化物を用いた反応によるポリエーテルアミンの修飾
この反応は以下の反応式に従って行われる。

Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｘ＋（Ｈ_２Ｎ）_ｂ−Ｒ’→（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’
ここでｂ＝１、２または３であり、Ｘはハロゲン（好ましくはＣｌまたはＢｒ）であり、Ｒは（置換されていても良い）アルキル基（例えばＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、またはＣ_１２）または（置換されていても良い）芳香族基（例えば置換されたフェニル基）であり（ただし、この芳香族基の機能分化は望ましくない）、Ｒ’は好ましくはＰＰＯ型または（ＰＥＯ）_ｘ−ｃｏ−（ＰＰＯ）_ｙ型のポリエステルを表す。上記ポリエーテルアミンは、ポリエーテルモノアミン（すなわちｂ＝１）でも、ポリエーテルジアミン（すなわちｂ＝２）でも、あるいはポリエーテルトリアミン（すなわちｂ＝３）でも良い。好ましくは、第一級アミンが用いられる。

この反応は、この反応により生じるＨＸを獲得する、好ましくはＥｔ_３Ｎおよび/またはＮａＯＨである基剤の存在下に行われる。温度は、３５℃を下回るものとし、好ましくは２５℃を下回り、さらに好ましくは２０℃を下回り、最も好ましくは０℃〜１０℃の範囲内にあるものとする。約４℃の温度が適温である。

ポリエーテルアミンＨ_２Ｎ−Ｒ’と、アシルハライドのハロゲン化物Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｘとの反応は、好ましくは溶媒の不在下に行われる。この反応の後、酸性水を用いた洗浄を一回行うことにより、混合物を精製する。この洗浄により、未反応アミンと、反応により生成したＨＸ酸（またはその塩）とを除去する。

以下の反応図は、ポリエーテルモノアミンを用いたこの反応のある好適な実施の形態を示す。

ここで、Ｘはハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ等）であり、
Ｒはアルキル、芳香族等であり、
Ｒ’はＰＰＯまたは（ＰＥＯ）ｘ−ｃｏ−（ＰＰＯ）ｙである。

ポリエーテルジアミンを用いてもよい。

ここで、Ｘはハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ等）であり、
Ｒはアルキル、芳香族等であり、
Ｒ”はＰＰＯまたは（ＰＥＯ）ｘ−ｃｏ−（ＰＰＯ）ｙである。

ポリエーテルトリアミンを用いてもよい。

ここで、Ｘはハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ等）であり、
Ｒはアルキル、芳香族等であり、
Ｒ’’’はＰＰＯまたは（ＰＥＯ）ｘ−ｃｏ−（ＰＰＯ）ｙである。

本願明細書において、ＰＰＯは酸化ポリプロピレンを意味し、ＰＥＯは酸化ポリエチレンを意味し、（ＰＥＯ）_ｘ−ｃｏ−（ＰＰＯ）ｙはＰＯ（酸化プロピレン）とＥＯ（酸化エチレン）の共重合体を表す。Ｅｔ_３Ｎはトリエチルアミンの略称である。

具体的には、使用されるポリエーテルアミンＨ_２Ｎ−Ｒ’、Ｒ”（ＮＨ_２）_２、およびＲ’’’（ＮＨ_２）_３は、ジェファーミン（登録商標）ブランドの製品であり、詳しくはジェファーミン（登録商標）Ｍ６００、ジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５、ジェファーミン（登録商標）Ｍ２０７０、ジェファーミン（登録商標）Ｄ２０００等であり得る。これらの製品はすべて液体であり、反応は溶媒不在下で行われ得る。得られたＸ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’製品の粘性は、通常、開始材料であるポリエーテルアミンＨ_２Ｎ−Ｒ’の粘性よりも高い。ポリエーテルジアミンおよびポリエーテルトリアミンについても同様である。

この反応が（ＤＭＦやＴＨＦ等の）溶媒無しで行われることにより、複数の効果が得られる。すなわち、これらの溶媒は高価でありかつ毒性を有するので、製品からは後に排除されなければならない。なぜなら、製品は、その最終的な用途（細胞培養で用いられることも体内で用いられることもあるが）を危険なものにするいかなる分子にも汚染されてはいけないからである。

この製品はイソプロパノール（溶液状）内に保存され得る。この溶媒は、製品の後の用途に依存して選択される。この製品は、その特異性および純度を証明することを目的として、ＮＭＲおよび赤外分光法により特性評価され得る。

本発明による方法によれば、複数の効果が得られる。まず、本発明によれば、高い純度を有し、広範囲に亘る修飾されたポリエーテルアミンが利用可能となる。また、たとえ極微量でも、本発明によるポリエーテルアミンの使用への障害となり得る、有機溶媒（ＤＭＦやＴＨＦ等）無しで、修飾された多糖類を薬学目的で、あるいは体内で使用することを目的として調製することが可能になる。

以下、本発明による修飾されたポリエーテルアミンの用途について説明する。以下の説明は、この新しいクラスの化合物を合成中間体として用いる産業上の利用可能性を例証することを目的とし、具体的には、薬学、細胞生物学または医学において使用可能である、物理的、物理化学的、および化学的に有用な多種多様の特性を有する修飾された多糖類を得ることを目的とするものである。
Ｂ）ウィリアムソンの反応による多糖類の修飾
この方法は、本発明による方法（具体的には上記工程１）により得られ得る修飾されたポリエーテルアミンを、具体的には、温度感受性のレオロジー特性を有する多糖類を得るために、多糖類へとグラフトすることを目的とする。その代わりになる方法（方法Ｃ）については後に述べる。

この反応は、（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’型の修飾されたポリエーテルアミン（例えば、（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’型の修飾されたポリエーテルモノアミン、（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_２Ｒ’型の修飾されたポリエーテルジアミン、または（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_３Ｒ’型の修飾されたポリエーテルトリアミン）を多糖類の−ＯＨ基（ＰＳ−ＯＨ）にグラフトすることを含む。これにより、（ＰＳ−Ｏ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’型の修飾された多糖類（例えば、修飾されたポリエーテルモノアミンの場合は（ＰＳ−Ｏ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’型の修飾された多糖類、修飾されたポリエーテルジアミンの場合は（ＰＳ−Ｏ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_２Ｒ’型の修飾された多糖類、修飾されたポリエーテルトリアミンの場合は（ＰＳ−Ｏ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_３Ｒ’型の修飾された多糖類）が得られる。ここで、上記多糖類とグラフト物との間のグラフト点を形成する酸素原子は、上記多糖類のＯＨ基に由来する。

この反応図式において、符号Ｘ、ＲおよびＲ’は、方法Ａについて既に述べたものと同様のものを表す。

この反応は、好ましくは、水とイソプロパノールとの混合液中で行われ、上記方法Ａにより得られた生成物を直接利用する。

以下の図式は、この反応のある好適な実施の形態を示す。

ここで、Ｘはハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ等）であり、
Ｒはアルキル、芳香族等であり、
Ｒ’はＰＰＯまたは（ＰＥＯ）ｘ−ｃｏ−（ＰＰＯ）ｙである。

細胞培養用培地（ＲＰＭＩ）において流動学的測定により行った物理化学的分析、および２種類の濃度（４０ｇ／ｌおよび２０ｇ／ｌ）について温度の関数として行った保存係数（Ｇ’）および損失係数（Ｇ”）の測定の結果、３７℃未満の温度について、可逆ゾルゲル転移が見られる。
Ｃ）エステル化による多糖類の修飾
この方法は、本発明による方法（例えば上記工程１）により得られ得る、上記修飾されたポリエーテルアミンを多糖類へとグラフトすることにより、具体的には温度感受性のレオロジー特性を有する多糖類を得ることを目的とする。この方法は、上記方法Ｂに代わり得る方法である。

この反応は、第四級アミドを用いて多糖類ＰＳのカルボン酸機能ＰＳ−ＣＯＯＨを活性化させることを含み、好ましくは、テトラブチルアミン（ＴＢＡ）をＰＳ−ＣＯＯ⁻機能へと誘導し、その後、（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’型の修飾されたポリエーテルアミンを多糖類の上記−ＣＯＯ⁻基へとグラフトすることにより、（ＰＳ−ＣＯＯ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’型の修飾された多糖類を得ることを含む。ここで、上記多糖類とグラフト物との間のグラフト点を形成する酸素原子は、上記多糖類のＣＯＯＨ基に由来する。

この反応図式において、符号Ｘ、ＲおよびＲ’は、方法Ａについて既に述べたものと同様のものを表す。

この反応は、好ましくは、水とイソプロパノールとの混合液中で行われ、上記方法Ａにより得られた生成物を直接利用する。温度としては、２５℃を上回るのが好適であり、好ましくは４０℃〜９５℃、より好ましくは５５℃〜９０℃の範囲内であり、約７０℃の温度が最も適切である。

以下の図式は、この反応のある好適な実施の形態を示す。

方法Ｂおよび方法Ｃに共通するコメント
ａ）精製
方法Ｂまたは方法Ｃを用いて得られた反応生成物は、それを体内で用いるものとする場合、精製する必要がある。この精製は、好適には、ＮａＣｌの存在下に行われ、そのｐＨ値により区別される少なくとも２つの工程で行われる。

第１の精製工程は、ダイアフィルトレーションのような膜分離法を用いて、９〜１３のｐＨ値（好ましくは１０〜１２のｐＨ値、より好ましくは１１程度のｐＨ値）で、少なくとも部分的に（可能であれば全体的に）行われる。このｐＨ値においては、恐らくポリエーテルアミンの第四級アンモニウムの機能により中和され、ポリエーテルアミン内のアンモニウムと、カルボン酸多糖類との間のイオン結合を排除することにより、未反応のポリエーテルアミン分子（多糖類にグラフトされていない分子）が排除される。未反応のポリエーテルアミンには、通常、その後ハイドロゲルを細胞培養で用いる際に問題となる細胞毒性を有しており、ハイドロゲルを体内で用いる際には、常に受容されないものである。

第２の精製工程は、中和の後、細胞培養に適用すること、または体内で使用することを目的として、好ましくは７程度のｐＨ（これは通常ハイドロゲルを後で用いる際のｐＨである）で行われる。この第２の精製工程もまた、ダイアフィルトレーションのような膜分離法、あるいはその他の適切な技術を用いて、部分的または全体的に行われ得る。中間的ｐＨでのこの第２工程は、フリーズドライの後、行われ得る（その後、粉はエタノールで洗浄されることにより、残留するポリエーテルアミン基やその他の副生産物を除去する）。

膜分離は公知の手法により行われ得る。１０ｋＤａ〜３０ｋＤａ程度の分画分子量（Molecular Weight Cut-Off (ＭＷＣＯ)）、例えば１２ｋＤａ〜１４ｋＤａの分画分子量を有する膜をソーセージモードで用いて行われ得る。透析は、水または水とエタノールの混合物（例えば、水とエタノールを体積比２/３〜１/３で混合したもの）を対象に行われ得る。その透析中にｐＨ値の低下が認められる。

本発明のある非常に好適な局面によれば、少なくとも１回の精製工程（かつ好ましくは、中和以前の少なくともすべての精製工程、さらに好ましくは、中和以後の少なくとも１回の（好ましくはすべての）精製工程）は、２０℃を下回る温度、好ましくは０℃〜１５℃の範囲内の温度、さらに好ましくは２℃〜８℃の範囲内の温度、具体的には、４℃程度の温度で行われる。

本出願人は、周囲温度においては、反応混合物は混濁しており、精製を阻害する塊を周囲温度では形成する傾向があることを認めた。しかし、ハイドロゲルを体内で用いるためには、純度の高い生成物を得る必要がある。一方、従来技術による多くの多糖類とは異なり、上記低温で精製された本発明による生成物は、ゲル化後も半透明であり続ける。

本出願人は、上記凝集体の形成には、修飾されていない（自由な）ポリエーテルアミンが関与しており、その凝集体の中に捕獲されるのでないかという考えに傾いている（とはいえこの考えに限定されるわけではないが）。なぜなら、上記凝集体は、ハイドロゲルを十分に精製した後、消滅するからである。

また、本出願人は、残留（未反応で自由な）ポリエーテルアミンの毒性は別として、ポリエーテルアミンをグラフトすることにより、修飾された多糖類の精製を最大化することには別の理由があることを見出した。すなわち、温度の関数として粘性の変化を示す、自由なポリエーテルアミンがハイドロゲル中に存在することにより、精製されたハイドロゲルよりも広い温度範囲に亘って、より粘性の低い勾配が広がることになることを見出した。

このようにして精製された生成物は、（例えば−２０℃で）冷凍され、フリーズドライ処理を施された後、エタノールで（例えば２回）洗浄され、（好ましくは４０℃で真空中において）乾燥される。

最終生成物は、乾燥した粉の形態である。この粉は、所要量を水性媒体中に分散させることにより、ハイドロゲルに変換され得る。そのような水性媒体としては、細胞培養液が挙げられる。例えば、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute）として知られる培養培地を用いることができる。その水性媒体は、成長因子のような添加物や、薬学的に活性な構成要素（例えば抗生物質）および血清の少なくとも一方を有し得る。
ｂ）使用可能な多糖類
本発明の枠組みにおいては、異なる複数種類の多糖類を使用可能であり、それらの多糖類は方法Ｂまたは方法Ｃによるグラフトにより修飾可能である。これらの多糖類は、中性多糖類（例えばプルランおよびデキストラン）、天然アニオン性多糖類（例えばアルギン酸、ヒアルロン酸、キタンサンガム、寒天、ペクチン、ヘパリン）、人工アニオン性多糖類（例えばカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルプルナン）、天然カチオン性多糖類（特にキトサン）、人工カチオン性多糖類（例えばジエチルアミノエチルセルロース、ジエチルアミノエチルデキストラン）、両親媒性多糖類、天然両性イオン性多糖類、および化学修飾により得られた多糖類（例えばカルボキシメチルキトサン）からなる群に属し得る。

温度感受性のレオロジー特性を有するグラフトされた多糖類を調製するには、プルラン、キタンサン、アルギン酸およびヒアルロン酸（ＨＡ）型の多糖類が特に好ましい。異なる複数の濃度で行われた細胞培養試験の結果、これらの生成物には毒性は無いことが証明され、これらの系において細胞の増殖が起こることが証明される。

これらの多糖類もまた、生体適合性および生分解性を有する。

例えば、公知の生体適合性を有するヒアルロン酸（ＨＡ）を用いることができる。その（立体排除クロマトグラフィーや、光の複数角度拡散屈折率測定法により決定される）モル質量数が典型的には１０^３ｇ／ｍｏｌから１０^６ｇ／ｍｏｌを超える範囲である、商業的に入手可能な細菌起源をもつＨＡ（Streptococus equi）を用いることができる。
ｃ）グラフト比
本発明による方法によれば、２０モル％以下の高いグラフト比を得ることができる。本出願人は、これほど高いグラフト比を得ることを可能にする公知の方法が他にあるとは認識していない。温度感受性のレオロジー特性を有する多糖類として生成物を用いるためには、グラフト比は、５モル％〜２０モル％の範囲内であることが好適であり、好ましくは５モル％〜１５モル％の範囲内であり、更に好ましくは１０モル％〜１５モル％の範囲内であると良い。グラフト比が１５モル％を超え、２０モル％以下であるグラフトされた系においては、レオロジー特性の温度感受性は低下する傾向にある。
ｄ）ポリエーテルアミンの選択
本発明の目的にとって好ましいポリエーテルアミン（この「ポリエーテルアミンの選択」セクションは方法Ａ、ＢおよびＣのいずれにも適用される）は、酸化プロピレン（ＰＯ）と酸化エチレン（ＥＯ）とからなる、複数種類のポリエーテルの共重合体である。これらの酸化プロピレンが存在することにより、巨大分子は疎水性・温度感受性のものとなり、温度の関数として水性溶液内に析出を生じることになる。この遷移の温度は、中でもＰＯ／ＥＯ相対量に依存する。

本発明において用いられるポリエーテルアミンは、好ましくは、第一級アミンである。

一般には、（特に方法Ｂおよび方法Ｃの場合）ポリエーテルモノアミンが好ましく、具体的には以下の構造を有するポリエーテルモノアミンが好適には用いられる。

ここでＺ^１は水素原子（酸化エチレンの場合）、またはメチル（酸化プロピレンの場合）であり、ｘおよびｙは鎖長を表す。なお、ｘおよびｙは、ある与えられた分子については整数であるが、ある生成物が使用される状態においては平均値を表し得る。その場合、互いに異なる長さの分子を含み得る。

使用可能なポリエーテルアミンのモル質量は、約３００〜約３０００の範囲内であり得、好ましくは約５００〜約２５００の範囲内であり得る。また、ＰＯ／ＥＯのモル比は比較的広い範囲内で変動し得るが、例えば、１０/１から１/１０の範囲内である。

例えば、以下のポリエーテルモノアミンを使用可能である。

ｘ＝１〜３、Ｚ^１＝ＣＨ_３かつｙ＝７〜１１（好ましくはｘ＝１およびｙ＝９）であるか、ｘ＝１７〜２１，Ｚ^１＝ＣＨ_３かつｙ＝２〜５（好ましくはｘ＝１９およびｙ＝３）であるか、ｘ＝５〜８、Ｚ^１＝ＣＨ_３かつｙ＝２５〜３２（好ましくはｘ＝６およびｙ＝２９）であるポリエーテルモノアミン。

また、ポリエーテルジアミンも使用可能である。具体的には、ポリエーテルジアミンは以下の構造

を有するか、または以下の構造を有しても良い。

ここで、Ｚ^１、ｘおよびｙは上に述べたとおりであり、ｘおよびｙと同様に、ｚも上に述べたとおりの鎖長を表す。

さらにポリエーテルトリアミンを用いても良い。具体的には、ポリエーテルトリアミンは以下の構造を有しても良い。

ここで、Ｚ^１、ｘおよびｙは上に述べたとおりであり、ｘおよびｙと同様に、ｚも上に述べたとおりの鎖長を表す。Ｚ^２はハロゲン、またはＣ_１〜Ｃ_４の範囲内のアルキル（好ましくはメチルまたはエチル）である。ｎは０〜１２の範囲内の数であり、好ましくは、０、１または２である。

例えば、Ｈｕｎｔｓｍａｎ社によりジェファーミン（登録商標）ブランド（Ｍシリーズ）として販売されているポリエーテルモノアミン、ジェファーミン（登録商標）ブランド（ＤシリーズまたはＥＤシリーズ）として販売されているポリエーテルジアミン、あるいはジェファーミン（登録商標）ブランド（Ｔシリーズ）として販売されているポリエーテルトリアミンを用いることが可能である。
Ｄ）本発明によるグラフト化により修飾された多糖類ハイドロゲルの用途
本発明によるグラフト化により修飾された多糖類ハイドロゲルは、体外的であっても体内的であっても、生物学や医学の分野において利用可能である。これらのハイドロゲルは、水や、緩衝された水性溶液、生理学的血清、標準的または特殊な細胞培養用培地のような水性液体を用いて調製され得る。

このように生物学や医学の分野において利用可能であるのは、本発明によれば、修飾された多糖類が、毒性を有する残留物をすべて除去されるように非常に効率よく精製され得るからである。いくつかの用途、特に体内での用途（整形外科、美容形成外科（特に注射式のしわ取り）、皮膚科）は、本発明による修飾された多糖類がもつレオロジー特性により可能になる。

体外的な用途は、具体的には人間および動物の細胞用の細胞培養用培地としての用途や、具体的には人間または動物の細胞用の細胞培養組成物としての用途を含む。詳細には、これらのハイドロゲルは、マイクロ流体システムにおいても利用可能である。また、これらのハイドロゲルは、細胞保管および／または輸送培地（あるいは培地組成物）としても利用可能であり、具体的には動物または人間の細胞の生検または外移片・培地としても利用可能である。本発明によるハイドロゲルは、それらの成長および増殖に貢献する諸条件の下に培養される細胞を埋め込んだ３次元ネットワークを有する。

体内的な用途は、皮膚再生、塞栓剤、関節内補充剤、充填剤、術後癒着防止剤、組織再生剤、あるいはこれらの薬剤の組成物としての用途を含む。

具体的には、これらの利用可能性はすべて、本発明によるハイドロゲルの温度感受性を活用可能である。

以下、本発明による温度感受性のレオロジー特性を有する修飾された多糖類ハイドロゲルの典型的な用途を述べる。このハイドロゲルは、３次元細胞培養用培地として利用可能であるように細胞培養用培地中に可溶化され、かつそれらの細胞は、周囲温度で温度感受性ゲル中に析出する。システムの温度を（例えば培養器の温度である３７℃以下の温度に）上昇させると、細胞はハイドロゲルの内部で隔離される。温度感受性のある重要な特性は、システムがゲル状である時に顕微鏡分析が可能であるように光学的に透明であることである。その後、細胞は、システム内の懸濁液中で成長し、このシステム中で増殖する。しかる後、次に周囲温度に遷移する時期が訪れると、細胞の回収・分析が可能になる。

温度感受性のレオロジー特性を有するハイドロゲルは、細胞（幹細胞、初代細胞および木質化細胞）の輸送に用いられ得、３７℃程度の温度で標本を採取する（生検の場合等）際にも用いられ得る。これらの貴重な標本は、輸送時に衝撃・振動に曝されるので、到着時に損傷していることがよくある。温度感受性のレオロジー特性を有するハイドロゲルは、当該ハイドロゲル中で細胞または標本（生検等）を隔離することにより、発送時処理に起因するそのような衝撃による影響を抑制することができる。いったん宛先人が標本を受け取れば、培地を液体化する周囲温度に戻しさえすればよく、その中に含まれる細胞または標本を容易に回収することが可能になる。

また、温度感受性のレオロジー特性を有するハイドロゲルは、再生医療（例えば軟骨の再生）に用いられ得る。現状では、軟骨再生に用いられる主な技術の一つとしては、マイクロフラクチャーが挙げられる。医師は、第III級または第IV級の病変に苦しむ患者の軟骨の下にある骨に穴を開ける。開けられたこれらの穴により、幹細胞を含む血液が流出することになる。これらの幹細胞は、軟骨を再生する能力を持つ。しかしながら、この技術には、細胞が必ずしも負傷部位に留まるわけではなく、分散し得るという問題がある。マイクロフラクチャー時に温度感受性のレオロジー特性を有するハイドロゲルに、幹細胞を含む血液（または幹細胞を豊富に含むか、通常濃度で含む別の生体培地）を注入すると、それらの細胞を病変部位に局在化させ、軟骨の再生を促進することが可能になる。

実施例
以下の実施例は、当業者に本発明を実施可能とするために、単に例を示すことを目的として述べるにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
Ｉ．ポリエーテルアミン誘導体の合成に適用可能な例

実施例１：ｘ＝６、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝２９のポリエーテルモノアミンの、トリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下、クロロアセチルクロリドによる修飾
ポリエーテルモノアミン（ｘ＝６、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝２９であり、約２０００ｇ／ｍｏｌの分子質量を有するジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５ブランドとして入手可能な製品）１００ｇ（５０ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）６．７ｍｌ（５０ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌの体積を有する反応炉に加えた。その後、このようにして得られた混合物を４℃の冷水浴に入れ、強い磁気撹拌を加えながら、クロロアセチルクロリド３．９６ｍｌ（５０ｍｍｏｌ）を滴下により添加した。このようにして得られた反応混合物を２時間静置した。２時間経過後、２-プロパノール１００ｍｌを加えた。その後、混合物を分離漏斗に移し、酸性のｐＨ（ｐＨ＝３）を有する水２００ｍｌを加えた。相分離の後、修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５を含む有機相を回収した。

実施例２：ｘ＝６、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝２９のポリエーテルモノアミンの、ソーダ（ＮａＯＨ）の存在下、クロロアセチルクロリドによる修飾
ポリエーテルモノアミン（ｘ＝６、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝２９であり、ジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５ブランドとして入手可能な製品）１００ｇ（５０ｍｍｏｌ）、およびソーダ（ＮａＯＨ）の５０ｍｍｏｌ溶液中の２ｍｌを２５０ｍｌの体積を有する反応炉に加えた。その後、このようにして得られた混合物を４℃の冷水浴に入れ、強い磁気撹拌を加えながら、クロロアセチルクロリド３．９６ｍｌ（５０ｍｍｏｌ）を滴下により添加した。このようにして得られた反応混合物を２時間静置した。２時間経過後、２-プロパノール１００ｍｌを加えた。その後、混合物を分離漏斗に移し、酸性のｐＨ（ｐＨ＝３）を有する水２００ｍｌを加えた。相分離の後、修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５を含む有機相を回収した。

実施例３：ｘ＝１、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝９のポリエーテルモノアミンの、トリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下、２-ブロモ-２-メチルプロピオニルブロミド（ＢＩＢＢ）による修飾
ポリエーテルモノアミン（ｘ＝１、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝９であり、約６００ｇ／ｍｏｌの分子質量を有するジェファーミン（登録商標）Ｍ６００またはＸＴＪ−５０５ブランドとして入手可能な製品）１００ｇ（１６６ｍｍｏｌ）、およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）２２．５ｍｌ（１６６ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌの体積を有する反応炉に加えた。その後、このようにして得られた混合物を４℃の冷水浴に入れ、強い磁気撹拌を加えながら、クロロエチルクロリド２０．５ｍｌ（１６６ｍｍｏｌ）を滴下により添加した。このようにして得られた混合物を２時間静置した。２時間経過後、２-プロパノール１００ｍｌを反応混合物に加えた。その後、混合物を分離漏斗に移し、酸性のｐＨ（ｐＨ＝３）を有する水２００ｍｌを加えた。相分離の後、修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ６００を含む有機相を回収した。

追加の実施例
上に述べた手順のいずれかに従って、以下の修飾されたポリエーテルモノアミンを作製した。

基本のポリエーテルモノアミン
（ａ）Ｚ＝ＣＨ_３、ｘ＝６、ｙ＝２９（ジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５ブランドとして商業的に入手可能）
（ｂ）Ｚ＝ＣＨ_３、ｘ＝１、ｙ＝９（ジェファーミン（登録商標）Ｍ６００ブランドとして商業的に入手可能）
（ｃ）Ｚ＝Ｈ（ＥＯの場合）またはＣＨ_３（ＰＯの場合）、ｘ＝６、ｙ＝３５（ジェファーミン（登録商標）Ｍ２０７０）
これら３つのポリエーテルモノアミンのそれぞれを以下の反応により修飾した。

（ａ１、ｂ１、ｃ１）：クロリルアセチルクロリド
（ａ２、ｂ２、ｃ２）：α−ブロモイソブチリルブロミド
（ｃ１、ｃ２、ｃ３）：６−ブロモヘキサノイルクロリド
これらの合成は、ポリエーテルジアミンやポリエーテルトリアミンでもなし得ることを確認した。

ＩＩ．ポリエーテルアミン誘導体による多糖類の修飾に適用可能な実施例
実施例４：２−ブロモ−２−メチルプロピオニルブロミドにより修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５の、ウィリアムソン反応によるヒアルロン酸（ＨＡ）上へのグラフト
ＨＡ１ｇ（２．５ｍｍｏｌ）を、反応炉に機械的撹拌を加えながら、水１００ｍ中で可溶化した。その溶液を７０℃に加熱した。次に、ＮａＯＨ（０．２ｍｏｌ）０．８ｇを水５ｍｌ中に溶解させ、これにより得られたソーダ溶液をヨウ化ナトリウム０．５ｇを有する培地に加えた。１５分後、修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５溶液１１ｍｌをイソプロパノールに加えた。このようにして得られた反応混合物を７０℃で４時間加熱し、ＮａＣｌ２ｇを加えた後、ＨＣｌ（１Ｍ）を添加することによりｐＨを１１に調整した。この混合物を４℃で１２時間静置した。

精製は、４℃でダイアフィルトレーションを行うことによりなされた。温度を関数とする反応混合物のＵＶ吸光度測定（図６参照）によれば、凝集体の形成による混濁相の存在を示す吸光度の上昇が示される。この観察結果によれば、この混合物は周囲温度では精製され得ないことが示唆される。

ダイアフィルトレーションシステムは、反応混合物を効率よく精製するために４℃に設定した。精製は３つの工程で行った。ダイアフィルトレーションは、ｐＨ＝１１で開始し、開始溶液の全容積を３回通過させた。次に溶液をｐＨ＝７で中和し、その溶液の全容積を４回通過させた。導電性を点検した後、ダイアフィルトレーションを停止した。標本を冷凍した後、フリーズドライした。その後、凍結乾燥物を無水エタノールで洗浄し、最後に真空下で乾燥させた。

実施例５：２−ブロモ−２−メチルプロピオニルブロミドにより修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５の、エステル化反応によるヒアルロン酸（ＨＡ）上へのグラフト
ＨＡ１ｇ（２．５ｍｍｏｌ）を、反応炉に機械的撹拌を加えながら、水１００ｍ中で可溶化した。その後、ＨＣｌ（１Ｍ）を加えることにより、この溶液のｐＨを調整した。次に、このようにして得られた混合物を２４時間純水に対して透析させた。透析後、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＢＡＯＨ）を添加することにより、溶液をｐＨ＝７に中和させた。グラフト反応を起こさせるため、中和されたＨＡの溶液を７０℃に加熱した。次に、修飾されたジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５溶液１１ｍｌをイソプロパノールに加えた。このようにして得られた反応混合物を次に７０℃で１２時間加熱した。ＮａＣｌ２ｇを加えた後、この混合物を４℃で１２時間静置した。本実施例５において用いた精製方法は、実施例４で用いたものと同様であった。

実施例６：多糖類ハイドロゲルの温度を関数とするレオロジー特性
濃度４０ｇ／ｌのＲＰＭＩ培養培地中で、異なる複数の多糖類ハイドロゲルの弾性係数Ｇ’および粘性係数Ｇ”を温度の関数として測定した。その結果を図７および図８に示す。

修飾されていないＨＡ（図７）については、測定の結果、このシステムは温度感受性の転移（ゲル化）を全く示さず、温度の関数としての係数値の低下が観察されるのみであることが示されている。これは、重合体には典型的に見られる現象である。

本発明による方法を用いて修飾されたＨＡ（グラフト比２％を有するＢＩＢＢ−ジェファーミン（登録商標）Ｍ−２００５）については、測定の結果、このシステムは温度感受性の転移（ゲル化）を全く示さず（図８参照）、温度の関数としての係数値の低下が観察されるのみであることが示されている。

実施例７：細胞培養用ハイドロゲルにおける可逆ゾルゲル転移
本発明による修飾されたジェファーミン（登録商標）型ポリエーテルアミンによりグラフトされたＨＡハイドロゲルを、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute Medium）として知られる培養培地を用いて調製した。２０℃で得られた清澄な液体は、３７℃でゲル化するが、清澄でありかつ半透明のままである。この液体の固体化は可逆性である。

実施例８：細胞培養用ハイドロゲルの可逆ゾルゲル転移
本発明による修飾されたジェファーミン（登録商標）２００５型ポリエーテルアミンによりグラフトされたＨＡハイドロゲルを、スルホン酸４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタン（ＨＥＰＥＳ）により緩衝されたＤＭＥＭ（Dulbecco/Vogt modified Eagle’s Minimal Essential Medium）型培地内にハロゲン酸（グラフト比１０％のＢＩＢＢ−ジェファーミン（登録商標）Ｍ−２００５）を用いて調製した。この細胞培養用培地は、ＨＤＭＥＭまたはｈＤＭＥＭとして知られている。

示差走査熱量測定（Differential Scanning Calorimetry（ＤＳＣ））の温度記録図を２℃・min^-1のレートで作製した。この技術によれば、エンタルピーの変化を温度の関数として測定する。このようにして記録された温度記録図を図９に曲線Ａとして示す。ハロゲン酸により修飾されたジェファーミン（登録商標）について同様に得られた温度記録図（曲線Ｂ）およびジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５について同様に得られた温度記録図（曲線Ｃ）も比較のため記録した。

温度が１０℃から４０℃に上昇するにつれて、吸熱現象が観測される。これは恐らく
疎水性会合の形成によるものと推定される。

なお、すべてのピークが同一の温度に位置しているわけではない。ピーク温度を比較すれば、ハロゲン酸を用いてポリエーテルアミンを修飾することにより、その転移温度（疎水性会合が形成される温度）が約２９℃から約１８℃に低下することが分かる。また、これにより、グラフト後、ＨＡ型多糖類上のポリエーテルアミンが修飾されることも分かる。このシステムの転移の温度は、修飾されていないポリエーテルアミンの転移温度よりも、修飾されたポリエーテルアミンの転移温度のほうに近い。

この振る舞いは、４０℃から１０℃への冷却相（グラフ上には不図示）での発熱現象により可逆である。

実施例９：種々の多糖類への修飾されたポリエーテルモノアミンのグラフト
以上の実施例について述べたアプローチを用いて、以下の修飾された多糖類を調製した。

（ｉ）ａ−ブロモイソブチリルブロミドを用いた反応により修飾され、Ｚ＝ＣＨ_３、ｘ＝６、ｙ＝２９（ジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５ブランドとして商業的に入手可能）に対応するポリエーテルモノアミンをベースとする、
― 多糖類＝モル比で２％〜２１％のグラフト比を有するヒアルロン酸（ＨＡ）
― 多糖類＝１％のグラフト比を有するアルギン酸
― 多糖類＝４％のグラフト比を有するプルラン
― 多糖類＝２％のグラフト比を有するキサンタン
（ｉｉ）６−ブロモヘキサノイルクロリドを用いた反応により修飾され、Ｚ＝ＣＨ_３、ｘ＝６、ｙ＝２９（ジェファーミン（登録商標）Ｍ２００５ブランドとして商業的に入手可能）に対応するポリエーテルモノアミンをベースとする、
― 多糖類＝モル比で２％〜１０％のグラフト比を有するヒアルロン酸（ＨＡ）
― 多糖類＝５％のグラフト比を有するアルギン酸
― 多糖類＝１０％のグラフト比を有するジエチルアミノエチルプルラン（ＤＥＡＥ−プルラン）
（ｉｉｉ）６−ブロモヘキサノイルクロリドを用いた反応により修飾され、Ｚ＝ＣＨ_３、ｘ＝１、ｙ＝９（ジェファーミン（登録商標）Ｍ６００ブランドとして商業的に入手可能）に対応するポリエーテルモノアミンをベースとする、
― 多糖類＝モル比で１％のグラフト比を有するヒアルロン酸（ＨＡ）
（ｉｖ）ａ−ブロモイソブチリルブロミドを用いた反応により修飾され、Ｚ＝Ｈ（ＥＯの場合）またはＺ＝ＣＨ_３（ＰＯの場合）、ｘ＝６、ｙ＝３５（ジェファーミン（登録商標）Ｍ２０７０ブランドとして商業的に入手可能）に対応するポリエーテルモノアミンをベースとする、
― 多糖類＝モル比で１８％のグラフト比を有するヒアルロン酸（ＨＡ）
通常の体温（約３７℃）程度において転移する温度感受性のレオロジー特性を有するハイドロゲルとして用いるのに最良の結果は、６−ブロモヘキサノイルクロリドを用いた反応により修飾され、Ｚ＝Ｈ（ＥＯの場合）またはＺ＝ＣＨ_３（ＰＯの場合）、ｘ＝６、ｙ＝３５（ジェファーミン（登録商標）Ｍ２０７０ブランドとして商業的に入手可能）に対応するポリエーテルモノアミンをベースとする多糖類において、グラフトされたＨＡが３〜１０％（モル比で）の場合に達成された。

Claims (20)

1. 多糖類を修飾する方法であって、
   （ａ）ある多糖類を（好ましくは水とイソプロパノールとの組み合わせである）基剤(base)の存在下に、（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’型の修飾されたポリエーテルアミン（ここで、Ｒ’はポリエーテルであり、ｂ＝１、２または３であり、Ｘはハロゲン（好ましくはＣｌまたはＢｒ）であり、Ｒはアルキル基（置換されていても良い）または芳香族基（置換されていても良い）である）と反応させる工程と、
   （ｂ）工程（ａ）により得られた生成物をＮａＣｌの存在下に膜分離法により少なくとも部分的に精製させる工程であって、該精製は、９〜１３（好ましくは１０〜１２）のｐＨで実行される、工程と、
   （ｃ）工程（ｂ）により得られた生成物を膜分離法により少なくとも部分的に精製させる工程であって、該精製は、ｐＨ６〜８（好ましくは６．５〜７．５）における中和を行った後、必要な場合には前記生成物をフリーズドライさせ、該フリーズドライさせた生成物を（好ましくはエタノールで）洗浄した後に実行される、工程と、
   を有する、方法。
2. Ｒはアルキル基を表し、置換された基（好ましくはＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、またはＣ_１２）でも良く、または置換された芳香族基（好ましくはフェニル基）でも良い、請求項１に記載の方法。
3. 前記ポリエーテルＲ’は以下の構造を有し、
   ここで、Ｚは（酸化エチレンの場合は）水素原子であり、（酸化プロピレンの場合は）メチルであり、好ましくは、ｘ＝１〜３、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝７〜１１（好ましくはｘ＝１およびｙ＝９）であるか、ｘ＝１７〜２１，Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝２〜５（好ましくはｘ＝１９およびｙ＝３）であるか、ｘ＝５〜８、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝２５〜３２（好ましくはｘ＝６およびｙ＝２９）であり、
   前記ポリエーテルアミンは、好ましくは約３００〜約３０００のモル質量を有し、さらに好ましくは約５００〜約２５００のモル質量を有しており、
   前記ポリエーテルアミンは、酸化プロピレン／酸化エチレンのモル比が１０/１から１/１０の範囲内である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記工程（ａ）は、第四級アミンを用いてＰＳ多糖類の少なくとも１つのＰＳ−ＣＯＯＨカルボン酸機能を活性化させる工程であって、その後、前記修飾されたポリエーテルアミンが添加される工程である、請求項３に記載の方法。
5. 中和後に行われる少なくとも１つの精製工程、好ましくはすべての精製工程は、２０℃を下回る温度で行われ、好ましくは０℃〜１５℃の温度で行われ、さらに好ましくは２℃〜８℃の温度で行われる、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
6. 前記工程（ｃ）により得られた前記生成物をフリーズドライさせ、エタノールで洗浄させた後、乾燥させる、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
7. 前記多糖類は、中性多糖類（特にプルランおよびデキストラン）、天然アニオン性多糖類（特にアルギン酸、ヒアルロン酸、キタンサンガム、寒天、ペクチン、ヘパリン）、人工アニオン性多糖類（特にカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルプルナン）、天然カチオン性多糖類（特にキトサン）、人工カチオン性多糖類（特にジエチルアミノエチルセルロース、ジエチルアミノエチルデキストラン）、両親媒性多糖類、天然両性イオン性多糖類、化学修飾により得られた多糖類（特にカルボキシメチルキトサン）、およびこれらの多糖類の混合物からなる群から選択され、好ましくは、プルラン、キタンサン、アルギン酸およびヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法により得られ得る、修飾された多糖類。
9. 請求項８に記載の多糖類のうち少なくとも１つと、水性液体と、により形成されたハイドロゲルであって、前記水性液体は血清および/または細胞培養用培地を有し得る、ハイドロゲル。
10. ３３℃〜３９℃の遷移温度、または４℃〜２０℃の遷移温度を有する温度感受性のレオロジー特性を呈する、請求項９に記載のハイドロゲル。
11. 請求項９または１０に記載のハイドロゲルを、細胞培養用培地または細胞輸送用培地に用いる方法。
12. 請求項９または１０に記載のハイドロゲルを、皮膚再生、塞栓剤、関節内補充剤、充填剤、術後癒着防止剤、または組織再生剤として用いられる組成物の調製に用いる方法。
13. ポリエーテルアミン（Ｈ_２Ｎ）_ｂＲ’をアシルハライドのハロゲン化物Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｘに反応させることにより、（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’型の修飾されたポリエーテルアミンを調製する方法であって、
    （ａ）アシルハライドのハロゲン化物Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｘ（ここで、Ｘはハロゲン（好ましくはＣｌまたはＢｒ）であり、Ｒはアルキル基（置換されていても良い）または芳香族基（置換されていても良い）である）を用いてポリエーテルアミン（Ｈ_２Ｎ）_ｂＲ’（ここで、Ｒ’はポリエーテルであり、ｂ＝１、２または３である）を得る工程と、
    （ｂ）基剤（好ましくはＥｔ_３Ｎおよび/またはＮａＯＨである）の存在下にこれら２つの試薬を混合し、それにより得られた混合物を、好ましくは溶媒の不在下（具体的にはＤＭＦおよびＴＨＦの不在下）に、好ましくは３５℃を下回る温度で、より好ましくは２０℃を下回る温度で、さらに好ましくは０℃〜１０℃の温度で反応させる工程と、
    を有する方法。
14. 前記工程（ｂ）の後、反応に用いた培地を酸性水で洗浄する、請求項１３に記載の方法。
15. 前記修飾されたポリエーテルアミンを、アルコール（好ましくはイソプロパノール）の存在下に保存する、請求項１３または１４に記載の方法。
16. 前記ポリエーテルアミン（Ｈ_２Ｎ）_ｂＲ’は以下の構造を有するポリエーテルモノアミンである
    （ここでＺは水素原子、メチル基またはエチル基であり、ｘおよびｙは整数である）、請求項１３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
17. 前記ポリエーテルアミンのモル質量は、約３００〜約３０００の範囲内であり、好ましくは約５００〜約２５００の範囲内であり、および/または
    前記ポリエーテルアミンは、酸化プロピレン／酸化エチレンのモル比が１０/１から１/１０の範囲内である、請求項１３〜１６のいずれか１つに記載の方法。
18. ｘ＝１〜７、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝５〜１５（好ましくはｘ＝１〜３、かつｙ＝７〜１１）であるか、またはｘ＝１５〜２５，Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝１〜９（好ましくはｘ＝１７〜２１，かつｙ＝２〜５）であるか、またはｘ＝３〜１１、Ｚ＝ＣＨ_３かつｙ＝２１〜３５（好ましくはｘ＝５〜８、かつｙ＝２５〜３２）である、請求項１７に記載の方法。
19. 請求項１３〜１８のいずれか一つに記載の方法により得られ得る、（Ｘ−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ）_ｂＲ’型の修飾されたポリエーテルアミン。
20. 請求項１９に記載の修飾されたポリエーテルアミンを多糖類の修飾に用いる方法。