WO2016005700A1 - Procédé de modification de polysaccharides par greffage de polyétheramines, polysaccharides ainsi modifiés et préparations les comportant et présentant des propriétés rhéologiques thermosensibles - Google Patents

Procédé de modification de polysaccharides par greffage de polyétheramines, polysaccharides ainsi modifiés et préparations les comportant et présentant des propriétés rhéologiques thermosensibles Download PDF

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polyetheramine
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polysaccharide
residue
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Zied SOUGUIR
Elise Demange
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Definitions

  • the invention relates to organic chemistry, more particularly to polysaccharide chemistry. It relates more specifically to the modification of natural or synthetic polysaccharides by grafting polyetheramines. It also relates to the use of these modified polysaccharides in the form of a hydrogel as a cell culture medium. These hydrogel preparations may have thermosensitive rheological properties, which are of interest for their intracorporeal use in human and veterinary medicine, for cell culture and the transport of biological samples (cells, explants, biopsies, etc.). State of the art
  • hyaluronic acid One of the most common polysaccharides in the animal and human body is hyaluronic acid. It can be manufactured on an industrial scale by fermentation using microorganisms (in particular Streptococcus equi). This product of biological origin is a biocompatible and biodegradable polysaccharide, which can form hydrogels. For these reasons, intracorporeal uses have been sought for this product, particularly in orthopedics. Thus, the intracorporeal use of hydrogels of hyaluronic acid (HA) for the treatment of worn or damaged cartilage is well known; the best known method is viscosupplementation (i.e. addition of HA to synovial fluid, or total replacement of synovial fluid by HA). Intracorporeal use in dermatology has also been considered.
  • HA hyaluronic acid
  • I 095 064 (Fidia) describes a number of HA derivatives.
  • EP 2 457 574 A1 (Fidia Andvanced Biopolymes) describes the preparation of biomaterials from derivatives of HA which are amides, and tests of their use in viscosupplementation.
  • WO 2004/022603 (LG Life Sciences) discloses HA polymers crosslinked with glycol based polymers, while KR 1007 37954 B1 (Korea University) describes an acrylated derivative of HA; these two documents envisage the intracorporeal use of the products obtained.
  • patent application EP 1 659 143 discloses thermosensitive hydrogels of hyaluronic acid and a propylene oxide-based secondary polyetheramine (Jeffamine® XTJ-507).
  • the intended application is the regeneration of cartilage.
  • the viscosity transition zone is spread over a temperature range of about 15 ° C., which is too wide for an application in medicine.
  • Heat-sensitive hydrogels of chitosan modified by acetylation or deacetylation are also known, see US 2009/0004276 (Mor Research Applications Ltd). It is also known that the modification of certain polysaccharides makes it possible to prepare hydrogels whose properties depend on pH, see the thesis quoted by Zied Souguir and the publication of G. Mocanu et al., "New anionic crosslinked multi-responsive pullulan hydrogels" , published in Carbohydrate Polymers, vol. 87, p. 1440-1446 (2012).
  • a first object of the invention is a method for modifying polysaccharides, in which:
  • the product obtained in the presence of NaCl is purified, at least in part, by a membrane separation method, said purification being carried out at a pH of between 9 and 13 (and preferably between 10 and 12);
  • step (c) the product resulting from step (b) is purified, at least in part, by a membrane separation method, said purification being carried out after neutralization at a pH of between 6 and 8 (preferably between 6.5 and 7.5), optionally after lyophilization and washing of the lyophilized product (preferably with ethanol).
  • R advantageously represents an alkyl residue, possibly substituted (for example a residue in C 1, C 2 , C 3 , C 4 , C 5 , C 6 , C 7 , C 8 , C 9 , C 10 -C n or C 12), or a aromatic residue (for example a phenyl residue), possibly substituted.
  • said modified polyetheramine is a polyethermonoamine in which the radical R 'has the following structure: z
  • Advantageously leadite polyetheramine R ' has a molar mass of between about 300 and about 3000, and even more preferably between about 500 and about 2500, and / or said polyetheramine having a molar ratio of [propylene oxide] / [oxide of ethylene] of between 10/1 and 1/10.
  • the process according to the invention may comprise at least one purification step, and preferably all purification steps after neutralization, is carried out at a temperature below 20 °. C, preferably between 0 ° C and 15 ° C, and even more preferably between 2 ° C and 8 ° C.
  • the product resulting from stage (c) may be lyophilized, washed with ethanol and dried.
  • said polysaccharide is selected from the group formed by neutral polysaccharides (and especially by pullulan and dextran), natural anionic polysaccharides (and in particular: alginate, hyaluronic acid, xanthan gum, agar agar gum, pectins, heparin), synthetic anionic polysaccharides (and in particular: carboxymethylcellulose, carboxymethylpullunane), natural cationic polysaccharides (and in particular chitosan), cationic synthetic polysaccharides (and especially: diethylaminoethylcellulose, diethylamonithyldextran), amphiphilic polysaccharides, zwitterionic polysaccharides natural or obtained by chemical modification (and in particular carboxymethylchitosan), or mixtures of these polysaccharides.
  • Pullulan, xanthan, alginate and hyaluronic acid are particularly preferred.
  • Another subject of the invention is a modified polysaccharide obtainable by the process according to the invention.
  • Yet another subject of the invention is a hydrogel formed by at least one modified polysaccharide according to the invention and an aqueous liquid.
  • Said aqueous liquid may comprise serum and / or cell culture medium.
  • the hydrogel according to the invention advantageously has thermosensitive rheological properties with a transition temperature of between 33 and 39 ° C. In another embodiment, it has thermosensitive rheological properties with a transition temperature of between 4 and 20 ° C.
  • Yet another object of the invention is the use of a hydrogel according to the invention in a medium for cell culture or in a medium for the transport of cells.
  • Yet another subject of the invention is the use of a hydrogel according to the invention for the preparation of a composition intended to be used as a cutaneous dressing, embolizing agent, viscosupplementation agent, filler, post-surgical adhesion limiting agent, or tissue regenerating agent.
  • Said modified polyetheramines of the type (XRC (O) NH) b R ' which are used in the method for modifying polysaccharides according to the invention do not exist in the state of the art, and can be prepared by a new process of preparing a modified polyetheramine (XRC (O) NH) b R 'by reacting a polyetheramine (H 2 N) b R' with a halogenated acyl halide XRC (O) X, wherein:
  • the two reactants are mixed in the presence of a base, preferably Et 3 N and / or NaOH, and the mixture is allowed to react at a temperature below 35 ° C., preferably below 25 ° C., even more preferably less than 20 ° and optimally between 0 ° C and 10 ° C, preferably in the absence of solvent (and preferably in the absence of DMF and THF).
  • a base preferably Et 3 N and / or NaOH
  • b is 1, 2 u 3, where X is halogen (preferably Cl or Br );
  • R represents a possible substituted alkyl radical (for example a C 6 residue), or an aromatic radical (for example a phenyl radical) which may be substituted (but the functionalization of the aromatic radical is not preferred); and
  • R ' represents a polyether, preferably of the PPO or (PEO) x -co- (PPO) y type .
  • the reaction is carried out in the presence of a base, preferably Et 3 N and / or NaOH, which captures the HX resulting from the reaction.
  • a base preferably Et 3 N and / or NaOH
  • the reaction is advantageously carried out at a temperature below 20 ° C., preferably between 0 ° C. and 10 ° C.
  • the reaction medium can be washed with acidified water.
  • the modified polyetheramine obtained by this process can be stored in the presence of an alcohol (preferably isopropanol).
  • an alcohol preferably isopropanol.
  • the polyetheramines H 2 N- ' are preferred, and in particular those having the following structure:
  • Z 1 is a hydrogen atom (in the case of ethylene oxide) or a methyl (in the case of propylene oxide), or an ethyl or propyl
  • x and y indicate the length of the chains , knowing that for a given molecule, x and y are integers, but on a given product as it will be used (which may have molecules whose length may not be identical) x and y represent mean values.
  • the molar mass of the usable polyetheramines may range from about 300 to about 3000, and a range of 500 to 2500 is preferred.
  • the molar ratio of PO / EO may vary within fairly wide limits, for example / 1 and 1/10.
  • polyetherdiamines and in particular those which have the following structure:
  • Z 1 , x and y have the meaning indicated above, and z represents, as x and y, and as explained above, the length of the chain.
  • Z 2 is hydrogen or C 1 -C 4 alkyl, preferably methyl or ethyl.
  • the number n can range from 0 to 12, and is preferably 0, 1 or 2.
  • Said polyetheramine advantageously has a molar mass of between about 300 and about 3,000, and even more preferentially between about 500 and about 2,500.
  • said polyetheramine advantageously a molar ratio of [propylene oxide] / [ethylene oxide] of between 10/1 and 1/10.
  • These modified polyetheramines are useful synthetic intermediates for the preparation of modified polysaccharides, and especially as described above.
  • a last object of the invention is the use of a modified polyetheramine according to the invention for modifying a polysaccharide.
  • Figures 1 to 6, 8 and 9 illustrate various aspects of the invention
  • Figure 7 relates to the state of the art.
  • Figures 1 and 2 relate to an attempt to modify a Jeffamine® M2005 type polyetheramine by reaction with a halogenated acyl halide.
  • the vertical axis represents the normalized intensity.
  • Figure 1 shows the 1 H NMR Spectrum (in CDCl 3 ) of the modified polyetheramine.
  • FIGS. 3 to 5 relate to a grafting test of a polysaccharide (in this case hyaluronic acid) with a Jeffamine® M2005-type polyetheramine which has been previously modified by reaction with a halide of a halogenated acyl ( and which is the same as that of Figures 1 and 2).
  • Figure 3 shows the 1 H NMR spectrum (in D 2 0) of a hyaluronic acid (HA) grafted by the modified polyetheramine.
  • FIGS. 4 and 5 show the variation of the modulus of conservation (elastic modulus) G '( ⁇ ) and the loss (viscous modulus) G "(T) of the grafted HA as a function of the temperature: the concentration of grafted HA is 40 g in the RPMI culture medium (FIG. 4) or 20 g / l (FIG. 5) The reversible sol-gel transition is noted for a temperature below 37 ° C. (approximately 29 ° C. for FIG. 34 ° C for Figure 5).
  • FIG. 6 shows the UV absorbance as a function of temperature for a polysaccharide (in this case HA) grafted with a Jeffamine® M2005 type polyetheramine which had been previously modified by the action of 2-Bromo-2-methylpropionylbromide ( Williamson's reaction). The figure represents a measurement made on the reaction mixture.
  • FIGS. 7 and 8 compare the variation of conservation modulus (elastic modulus) G '(curve A) and loss (viscous modulus) G "(curve B) as a function of temperature for ungrafted hyaluronic acid (FIG.
  • FIG. 9 shows DSC (Differential Scanning Calorimetry) curves for a sample of HA hydrogel grafted with a Jeffamine® M2005 type polyetheramine which had been previously modified by the action of the Bromo-2-methylpropionylbromide (esterification reaction); these hydrogels were formed with a RPMI type cell culture medium.
  • Curve A Hydrogel of HA grafted by a modified Jeffamine ®.
  • Curve B Modified Jeffamine ® (for comparison).
  • Curve C Jeffamine ® M2005 (for comparison).
  • section A As the polysaccharides modified according to the invention which give the best results are modified by grafting of polyetheramine derivatives which are not commercially available, a general method is first described here (section A) to obtain modified polyetheramines which are susceptible to be grafted onto polysaccharides, then two methods (sections B and C) of grafting by esterification of the polysaccharide are described, making it possible to obtain polysaccharides with thermosensitive rheological properties. These two methods give substantially the same products. Finally, we describe (section D) the use of these products.
  • R represents an alkyl radical, possibly substituted (for example a residue in Ci, C 2, C 3 , C 4 , C 5 , C 6 , C 7 , C 8 , C 9 , C 10 C 11 or C 12), or an aromatic residue (eg a phenyl residue), possibly substituted (but functionalization of the aromatic residue is not preferred); and R 'represents a polyether, preferably of the PPO or (PEO) x -co- (PPO) y type.
  • the reaction proceeds in the presence of a base, preferably Et 3 N and / or NaOH, which captures the HX resulting from the reaction.
  • the temperature is below 35 ° C, preferably below 25 ° C, and even more preferably below 20 ° C, and optimally between 0 ° C and 10 ° C; a temperature of about 4 ° C is suitable.
  • the reaction of the polyetheramine H 2 NR 'with the halide of a halogenated acyl XRC (O) X is carried out without a solvent.
  • the mixture is purified by simply washing with acidic water: this washing removes the unreacted amine and the acid HX (or its salt) which results from the reaction.
  • R alkyl, aromatic, ...
  • R ': PPO or (PEO) x-co- (PPO) y may also use a polyether
  • R alkyl, aromatic, ...
  • R alkyl, aromatic, ...
  • R '" PPO or (PEO) x-co- (PPO) y
  • PPO polypropylene oxide and PEO stands for polyethylene oxide
  • PEO polyethylene oxide
  • PEO polyethylene oxide
  • (PEO) x -co- (PPO) is a copolymer between PO (propylene oxide) and EO (ethylene oxide).
  • Et 3 N means triethylamine.
  • polyetheramine H 2 NR 'or R "(NH 2 ) 2 or R'" (NH 2 ) 3 may be used in particular products available under the trademark Jeffamine ®, and in particular products Jeffamine ® M600, Jeffamine ® M2005, Jeffamine ® M2070, Jeffamine ® D2000 .
  • the product can be stored in isopropanol (in the form of solution), this solvent being chosen according to the subsequent use of the product.
  • the product can be characterized by NMR and Infrared spectroscopy to demonstrate its identity and purity.
  • This method according to the invention has many advantages. It gives access to a broad spectrum of modified polyetheramines, with good purity. It can be carried out without organic solvents (such as DMF, THF) which could be liable, even in trace amounts, to hinder the use of the polyetheramines according to the invention for the preparation of modified polysaccharides intended for pharmaceutical use. or intracorporeal.
  • organic solvents such as DMF, THF
  • This method is intended to graft the modified polyetheramine, obtainable by the method according to the invention, and obtained in particular by the example according to step 1 described above, on a polysaccharide to obtain in particular polysaccharides with rheological properties. heat sensitive.
  • An alternative method is presented below (method C).
  • the reaction comprises the grafting of a modified polyetheramine of the type (XR-C (O) NH) b R '(for example an XRC (0) NHR' type modified polyetheraminoamine, or a modified polyetherdiamine of the type (XRC (0) NH) 2 R ', or alternatively a modified polyethertriamine of the type (XRC (O) NH) 3 R') on a -OH group of a polysaccharide (PS -OH), which leads to a modified polysaccharide of the type (PS -GOLD-
  • reaction is preferably carried out in a mixture of water and isopropanol, employing directly the product of method A described above.
  • R alkyl, aromatic, ...
  • R ' PPO or (PEO) x-co- (PPO) y
  • This method aims to graft the modified polyetheramine, obtainable by the process according to the invention, obtained for example according to step 1 described above, on a polysaccharide to obtain in particular polysaccharides with thermosensitive rheological properties. This is an alternative to Method B presented above.
  • the reaction includes the activation of the carboxylic function-COOH PS PS of a polysaccharide with a quaternary amine, and preferably tetrabutylamine (TBA), leading to a -COO function "followed by the grafting of a modified polyetheramine of the type (XRC (O) NH) b R 'on said -COO " group of the polysaccharide, which leads to a modified polysaccharide of the type (-COO-RC (O) NH) b R', in which l
  • TSA tetrabutylamine
  • the reaction is preferably carried out in a mixture of water and isopropanol, employing directly the product of method A described above.
  • a temperature above 25 ° C preferably between 40 ° C and 95 ° C, and even more preferably between 55 ° C and 90 ° C, a temperature of about 70 ° C is preferred.
  • the reaction product from method B or C must be purified if it is intended for intracorporeal use.
  • This purification is advantageously in the presence of NaCl and in at least two stages which are distinguished by their pH.
  • a first purification step is carried out at a pH of between 9 and 13 (preferably between 10 and 12, and even more preferentially about 1 1), preferably at least partly (and possibly all) by a separation method. membrane such as diafiltration. It is at this pH that the unreacted polyetheramine molecules (ie which have not been grafted onto the polysaccharide) are removed, probably by neutralization of the quaternary ammonium functions of the polyetheramine and elimination of the ionic bonds between the ammonium of the polyetheramine.
  • the unreacted polyetheramine generally exhibits cellular toxicity which hinders the subsequent use of the hydrogel in cell culture, and which would in any case be unacceptable for the intracorporeal use of the hydrogel.
  • a second purification step is performed after neutralization, preferably at a pH of about 7, which is generally the pH at which the hydrogel will be used later, whether in cell culture or for intracorporeal applications.
  • This second purification step may also be made, partially or totally, by a membrane separation method such as diafiltration, or by another suitable technique.
  • This second step at neutral pH can be done after lyophilization (the powder is then washed with ethanol to remove residues of free polyetheramines and other by-products).
  • the membrane separation can be carried out in a known manner, for example with membranes having a MWCO value ("molecular weight cut-off") of about 10 kDa to 30 kDa, for example between 12 kDa to 14 kDa in coil mode.
  • Dialysis can be done against water and / or against a mixture of water and ethanol (for example with the volume ratio: water 2/3, ethanol 1/3). There is a decrease in pH during dialysis.
  • At least one purification step (and preferably at least all the purification steps before neutralization, and even more preferably also at least one (and preferably all) purification steps after neutralization) is (are) carried out at a temperature below 20 ° C, preferably between 0 ° C and 15 ° C, and even more preferably between 2 ° C and 8 ° C, especially at a temperature of about 4 ° C.
  • the Applicant has observed that at room temperature the reaction mixture is cloudy and tends to form aggregates at room temperature which hinder purification; however, obtaining a pure product is necessary for any intracorporeal use of the hydrogel.
  • the product according to the invention purified at low temperature as indicated above, is translucent after gelation, unlike many polysaccharide hydrogels of the state of the art.
  • the Applicant tends to think (without being bound by this theory) that the unmodified (free) polyetheramine participates in the formation of said aggregates in which it could be trapped, since the aggregates disappear after a sufficient purification of the hydrogel.
  • the Applicant has found that apart from the toxicity of the residual polyetheramine (unreacted, free), there is another reason for optimally purifying the polysaccharide modified by grafting a polyetheramine: the presence of free polyetheramine in hydrogels which show a change in viscosity as a function of temperature leads to a lower viscosity gradient and spread over a wider temperature range compared to a purified hydrogel.
  • the purified product is frozen (for example at -20 ° C.) and lyophilized, then washed with ethanol (for example twice) and dried (preferably at 40 ° C. under vacuum).
  • the final product is in the form of a dry powder. It can be converted into a hydrogel by dispersing it in a desired amount of an aqueous medium.
  • Said aqueous medium may be a cell culture medium.
  • the culture media known as RPMI (Roswell Park Memorial Institute).
  • the aqueous medium may include additives, such as growth factors and / or pharmaceutically active ingredients (such as antibiotics), and serum.
  • polysaccharides can be used to be modified by grafting according to method B or according to method C.
  • These polysaccharides can belong to the neutral polysaccharide groups (for example pullulan, dextran), anionic polysaccharides natural (for example: alginate, hyaluronic acid, xanthan gum, agar agar, pectin, heparin), synthetic anionic polysaccharides (for example carboxymethylcellulose, carboxymethylpullunan), natural cationic polysaccharides (especially chitosan), cationic polysaccharides synthetic (for example diethylaminoethylcellulose, diethylamonithyldextran), amphiphilic polysaccharides, zwitterionic polysaccharides natural or obtained by chemical modification (for example carboxymethylchitosan).
  • neutral polysaccharide groups for example pullulan, dextran
  • anionic polysaccharides natural for example: alginate, hy
  • polysaccharides of the pullulan, xanthan, alginate and hyaluronic acid type are the polysaccharides which are particularly preferred for preparing grafted polysaccharides with thermosensitive rheological properties. Cell culture tests at different concentrations show the non-toxicity of these products as well as the proliferation of cells in these systems.
  • these polysaccharides are biocompatible and biodegradable.
  • hyaluronic acid which has a well-known biocompatibility
  • An HA of bacterial origin (Streptococcus equi) which is commercially available with a molar mass in number which typically varies from 10 3 to more than 10 6 g / mol can be used (determined by steric exclusion chromatography, diffusion of the multi-angle light and refractometry).
  • the method according to the invention makes it possible to obtain high levels of grafting, which can reach 20% molar.
  • the Applicant knows no known method which allows to obtain so high grafting rates.
  • the polyetheramines preferred in the context of the present invention are copolymers of polyethers type composed of propylene oxide (PO) and aluminum oxide. ethylene (EO).
  • PO propylene oxide
  • EO ethylene
  • the presence of these propylene oxides renders the macromolecule hydrophobic and thermosensitive, resulting in an aqueous solution precipitation depending on the temperature. The temperature of this transition depends inter alia on the relative amount PO / EO.
  • polyetheramines used in the present invention are preferably primary amines.
  • polyether monoamines and in particular those having the following structure:
  • Z 1 is a hydrogen atom (in the case of ethylene oxide) or a methyl (in the case of propylene oxide) and x and y indicate the length of the chains, knowing that for a given molecule, x and y are integers, but on a given product as it will be used (which may have molecules whose length may not be the same) x and y represent mean values.
  • the molar mass of the polyetheramines that can be used can vary from about 300 to about 3000, and a range of between 500 and 2500 is preferred.
  • the molar ratio of PO / EO can vary within fairly wide limits, for example between 10/1 and 1/1. 10.
  • polyetheramines may be used:
  • polyetherdiamines and in particular those which have the following structure:
  • Z 1 , x and y have the meaning indicated above, and z represents, as x and y, and as explained above, the length of the chain.
  • Z 2 is hydrogen or C 1 -C 4 alkyl, preferably methyl or ethyl.
  • the number n can range from 0 to 12, and is preferably 0, 1 or 2.
  • the graft-modified polysaccharide hydrogels according to the invention can be used in biology and medicine, extracorporeally or intracorporeally. These hydrogels can be prepared with water or with aqueous liquids, such as: buffered aqueous solutions, physiological saline, usual or specific cell culture media.
  • the extracorporeal uses comprise the use as culture medium of cells, in particular animal or human cells, or the use in a culture medium composition of cells, in particular animal and human cells.
  • These hydrogels can in particular also be used in microfluidic systems. They also include the use as a medium (or in a composition of a medium) of storage and / or transport of cells, biopsies or explants, especially animal cells. or human.
  • the hydrogels according to the invention have a three-dimensional network which accommodates the cells to be cultivated under conditions conducive to their growth and multiplication.
  • Intracorporeal uses include use as skin dressing, embolizing agent, viscosupplementation agent, filler, post-surgical adhesion limiting agent, tissue regenerative agent, or in the composition of such agents. These applications make it possible in particular to take advantage of the thermosensitive properties of the hydrogel according to the invention.
  • thermosensitive rheological properties For use as a three-dimensional cell culture medium, the hydrogel is solubilized in the cell culture medium, and the cells are deposited in the heat-sensitive gel at room temperature. During the increase in temperature (passage to 37 ° C, temperature of the incubator) of the system, the cells will be sequestered inside the hydrogel.
  • One of the important characteristics of the thermosensitive is its optical transparency when the system is in gel form, allowing a microscopic analysis. The cells can then develop in suspension inside the system and proliferate in this system. During a new transition at room temperature the cells can be recovered and analyzed.
  • thermosensitive rheological hydrogel can also be used to transport cells (strains, primers and lines) or specimens (such as biopsies) at a temperature of about 37 ° C. Indeed, these precious samples undergo shocks during the transport due to shaking and often arrive altered.
  • the hydrogel with thermosensitive rheological properties then makes it possible to limit the impact of these shakes due to the handling of the items by sequestering the cells or samples (such as biopsies) inside the hydrogel. Once the sample has been received by the recipient, a transition at room temperature will suffice to liquefy the medium and thus easily recover the cells or samples it contains.
  • the hydrogel with thermosensitive rheological properties can also be used in regenerative medicine, for example during the regeneration of a cartilage.
  • modified polyetheramines according to the invention makes it possible to obtain grafted polysaccharides with new physicochemical characteristics, and in particular with a viscosity which depends on the temperature. Indeed, the use of polyetheramines according to the invention makes it possible to obtain higher grafting rates.
  • the purification of the hydrogels at low temperature makes it possible to obtain more pure, non-toxic hydrogels without free polyetheramine.
  • the absence of free polyetheramine also enhances the variation of viscosity as a function of temperature and narrows the temperature range in which the viscosity transition occurs.
  • the hydrogels according to the invention may have thermosensitive rheological properties, passing from a liquid state to a state with a higher viscosity in which they constitute a three-dimensional nanostructure; in this state they can accommodate cells. They are optically transparent and thus allow the optical observation of said cells.
  • Example 4 Grafting of Jeffamine® M2005 modified with 2-Bromo-2-methylpropionyl bromide on hyaluronic acid (HA) by the Williamson reaction.
  • HA hyaluronic acid
  • a reactor 1 g (2.5 mmol) of HA was solubilized in 100 ml of water with mechanical stirring. The solution was heated to 70 ° C. Then 0.8 g of NaOH (0.2 mol) was dissolved in 5 ml of water, and this sodium hydroxide solution was added to the medium with 0.5 g of sodium iodide. After 15 minutes 11 ml of the modified Jeffamine® M2005 solution in isopropanol was added. The reaction mixture was heated at 70 ° C for 4 h, then 2 g of NaCl was added and the pH adjusted to 1 L by addition of HCl (1 M). The mixture was kept at 4 ° C for 12 h.
  • Example 5 Grafting of Jeffamine® M2005 modified with 2-Bromo-2-methylpropionyl bromide on hyaluronic acid (HA) by the esterification reaction.
  • 1 g (2.5 mmol) of HA is solubilized in a reactor in 100 ml of water with mechanical stirring.
  • the pH of the solution is adjusted to 2 by addition of HCl (1M).
  • TAAOH tetrabutylammonium hydroxide
  • the neutralized HA solution was heated to 70 ° C.
  • 1 ml of the modified Jeffamine® M2005 solution in isopropanol was added.
  • the reaction mixture was heated at 70 ° C for 12 h.
  • 2 g of NaCl was added, and the mixture was kept at 4 ° C for 12 h.
  • Example 6 Rheological properties of hydrogels of polysaccharides as a function of the temperature
  • the elastic modulus G 'and the viscous modulus G "of different polysaccharide hydrogels as a function of temperature were measured at a concentration of 40 g / l in the RPMI culture medium. The results are shown in FIGS. .
  • a modified Jeffamine® type polyetheramine grafted HA hydrogel was prepared with a culture medium known as Roswell Park Memorial Institute Medium. A clear, translucent liquid is obtained at 20 ° C., which is a gel at 37 ° C., but remains clear and translucent. The solidification of the liquid is reversible. EXAMPLE 8 Reversible sol-gel transition of a hydrogel for cell culture
  • a HA hydrogel grafted with a Jeffamine ® 2005 polyetheramine modified according to the invention was prepared by a halide acid (BIBB-Jeffamine® M-2005 with a grafting rate of 10%) in a medium of the DMEM type (in English: "DulbeccoA / ogt modified Eagle's Minimal Essential Medium") buffered with 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethane sulfonic acid (HEPES); this cell culture medium is known as HDMEM or hDMEM.
  • DMEM type in English: "DulbeccoA / ogt modified Eagle's Minimal Essential Medium”
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethane sulfonic acid
  • DSC Differential Scanning Calorimetry
  • the peaks are not at the same temperature.
  • the comparison of the peak temperatures shows that the modification of the polyetheramine by a halide acid decreases its transition temperature (formation of hydrophobic associations) from about 29 ° C to about 18 ° C. It also shows that after grafting this modified polyetheramine on a HA type polysaccharide the system transition temperature is closer to that of the modified polyetheramine than that of the unmodified polyetheramine.
  • the behavior is reversible with an exothermic phenomenon during the cooling phase of 40 ° C to 10 ° C (not shown in the graph).
  • Polysaccharide alginate with a grafting rate of 1%
  • ⁇ Polysaccharide hyaluronic acid (HA) with a grafting rate of between 2% and 10% (molar)
  • Polysaccharide diethylaminoethylpullulane (DEAE-pullulan) with a grafting rate of 10%
  • ⁇ Polysaccharide hyaluronic acid (HA) with a grafting rate of 18% (molar).

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Abstract

Procédé de modification des polysaccharides, dans lequel : (a) on fait réagir un polysaccharide avec une polyétheramine modifiée de type (X-R-C(O)NH)bR' (où R' représente un polyéther et b = 1, 2 ou 3 et X représente un halogène, de préférence Cl ou Br, R représente un reste alkyle, possiblement substitué, ou un reste aromatique, possiblement substitué), en présence d'une base, de préférence en présence d'eau et d'isopropanol, (b) on purifie le produit obtenu en présence de NaCI, au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée à un pH compris entre 9 et 13 (et de préférence entre 10 et 12); (c) on purifie le produit issu de l'étape (b), au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée après neutralisation à un pH compris entre 6 et 8 (de préférence entre 6,5 et 7,5), éventuellement après lyophilisation et lavage du produit lyophilisé (de préférence à l'éthanol).

Description

Procédé de modification de polysaccharides par greffage de polyétheramines, polysaccharides ainsi modifiés et préparations les comportant et présentant des propriétés rhéologiques thermosensibles Domaine technique de l'invention
L'invention concerne la chimie organique, plus particulièrement la chimie des polysaccharides. Elle concerne plus précisément la modification de polysaccharides naturels ou synthétiques par greffage de polyétheramines. Elle concerne également l'utilisation de ces polysaccharides modifiés sous la forme d'un hydrogel comme milieu de culture de cellules. Ces préparations d'hydrogels peuvent présenter des propriétés rhéologiques thermosensibles, qui sont intéressantes pour leur utilisation intra-corporelle en médecine humaine et vétérinaire, pour la culture cellulaire et le transport d'échantillons biologiques (cellules, explants, biopsies...). Etat de la technique
Un des polysaccharides les plus répandus dans le corps animal et humain est l'acide hyaluronique. Il peut être fabriqué à l'échelle industrielle par fermentation à l'aide de microorganismes (notamment Streptococcus equi). Ce produit d'origine biologique est un polysaccharide biocompatible et biodégradable, qui peut former des hydrogels. Pour ces raisons des utilisations intracorporelles ont été recherchées pour ce produit, notamment en orthopédie. Ainsi, l'utilisation intracorporelle d'hydrogels d'acide hyaluronique (HA) pour le traitement de cartilages usés ou abîmés est bien connue ; le procédé le plus connu est la viscosupplémentation (i.e. l'ajout de HA au liquide synovial, ou le remplacement total du liquide synovial par le HA). L'utilisation intracorporelle en dermatologie a également été envisagée.
Il est apparu l'idée de modifier chimiquement le HA. Cela permet de générer des hydrogels présentant des propriétés nouvelles et particulières. Cela est décrit en détail dans la publication « Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives fora broad range of biomecical applications » par CE. Schanté et al., parue dans la revue Carbohydrate Polymers, vol. 85, p. 469-489 (201 1 ), dans la thèse de doctorat de Zied Souguir (« Fonctionnalisation de polysaccharides et étude de leurs propriétés 'pH dépendantes' »), Université de Rouen, 2006, et dans la thèse de doctorat de Kristoffer Bergman « Hyaluronan Derivatives and Injectable Gels for Tissue Engineering », Upsala 2008.
Cependant, une telle modification chimique ne doit pas induire une toxicité, directe ou indirecte (i.e. par le biais des produits de décomposition au cours de la métabolisation de ΙΉΑ modifié), et ne doit pas nuire à la biodégradabilité du produit. De nombreux brevets traitent de la modification chimique de HA et de l'utilisation de HA modifié pour le traitement de pathologies des articulations. A titre d'exemple, EP
I 095 064 (Fidia) décrit un certain nombre de dérivés de HA. EP 2 457 574 A1 (Fidia Andvanced Biopolymes) décrit la préparation de biomatériaux à partir de dérives des HA qui sont des amides, et des essais de leur utilisation dans la viscosupplémentation. WO 2004/022603 (LG Life Sciences) décrit des polymères de HA réticulés avec des polymères à base de glycol, alors que KR 1007 37954 B1 (Korea University) décrit un dérivé acrylé de HA ; ces deux documents envisagent l'utilisation intracorporelle des produits obtenus.
Le greffage de l'acide hyaluronique par de polyétheramines de type Jeffamine ® et par des poly(N-isopropylacrylamides) (PNIPAM) est connu de l'article « Single step synthesis and characterization of thermoresponsive hyaluronan hydrogels » par M. D'Esté et al., paru dans la revue Carbohydrate Polymers 90 (2012), p. 1378-1385.
Certains de ces hydrogels de HA modifiés (fonctionnalisés) montrent des propriétés rhéologiques thermosensibles. Des applications intracorporelles pour la libération contrôlée de principes actifs ont été envisagées pour ces produits, voir par exemple les publications suivantes : Mee Ryang Kim et Tae Gwan Park, « Temperature-responsive and degradable hyaluronic acid / Pluronic acid hydrogels for controlled release of human growth hormone ajournai of Controlled Release, vol. 80, p. 69-77 (2002) ; T.R. Hoare et D.S.Kohane, « Hydrogels in drug delivery : Progress and challenges", Polymer, vol. 49 (2008), p. 1993-2007 ; C.C.Chen et a\.,« Transdermal delivery of selegiline from alginate- Pluronic composite thermogels », International J of Pharmaceutics, vol. 415 (2010), p. 1 19-128 ; S. Van Vlierberghe et al., « Biopolymer-Based Hydrogels As Scaffolds for Tissue Engineering Applications : A Review », Biomacromolecules, 201 1 , 12, p. 1387-1408.
II apparaît que le choix des molécules greffées sur le polysaccharide est critique pour les caractéristiques physico-chimiques du produit. Plus particulièrement, la demande de brevet EP 1 659 143 (Teijin) décrit des hydrogels thermosensibles d'acide hyaluronique et d'une polyétheramine secondaire à base d'oxyde de propylène (Jeffamine ® XTJ-507). L'application visée est la régénération du cartilage. Selon l'enseignement de ce document, la zone de transition de viscosité s'étale sur une plage de température d'une largeur d'environ 15°C, ce qui est trop large pour une application en médecine.
Plusieurs publications suggèrent que le choix de la polyétheramine peut avoir une influence sur les propriétés physico-chimiques du produit. A titre d'exemple, l'article de G. Mocanu et al., « Multi-responsive carboxymethyl polysaccharide crosslinked hydrogels containing Jeffamine side-chains » paru dans Carbohydrate Polymers, vol. 89, p. 578-585 (2012) montre, pour un hydrogel contenant un polysaccharide autre que HA, une différence notable des propriétés thermosensibles entre les Jeffamines ® M-600 et M- 2005 (deux produits qui se distinguent par leur rapport Oxyde de propylène / Oxyde d'éthylène et leurs masse molaires). La publication « Single step synthesis and characterization of thermoresponsive hyaluronan hydrogels » par M. d'Esté et al. (Carbohydrate Polymers, vol. 90, p. 1378-1385 (2012)) montre pour un hydrogel de type HA - Jeffamine ® que la Jeffamine ® M2005 ne conduit pas à une thermosensibilité significative, alors que la thermosensibilité de l'hydrogel avec la Jeffamine ® M600 est perceptible mais assez faible.
On connaît également des hydrogels thermosensibles de chitosane modifié par acétylation ou désacétylation, voir US 2009/0004276 (Mor Research Applications Ltd). On sait par ailleurs que la modification de certains polysaccharides permet de préparer des hydrogels dont certaines propriétés dépendent du pH, voir la thèse citée de Zied Souguir et la publication de G. Mocanu et al., « New anionic crosslinked multi-responsive pullulan hydrogels », parue dans Carbohydrate Polymers, vol. 87, p. 1440-1446 (2012).
Cependant, dans tous ces cas, la variation des propriétés de l'hydrogel en fonction de l'environnement biologique dans lequel il se trouve dans le cas d'une utilisation intra- corporelle, et notamment la variation de ses propriétés en fonction de la température, est assez faible et assez difficile à contrôler lors de la synthèse du produit.
Il existe clairement un besoin pour une nouvelle approche permettant de préparer une gamme plus large de polysaccharides modifiés, biocompatibles, non toxiques, susceptibles d'être utilisés de manière intra-corporelle, et notamment utilisables pour le transport et/ou la libération contrôlée de principes actifs et/ou de cellules, qui présentent des propriétés thermosensibles montrant une variation plus large et qui sont plus faciles à contrôler lors de leur synthèse. Objets de l'invention
Selon l'invention le problème est résolu par une nouvelle voie de synthèse de polysaccharides modifiés par greffage de polyétheramines. La demanderesse s'est rendu compte que les polyétheramines disponibles ne permettaient pas de résoudre le problème, et qu'il fallait d'abord développer de nouvelles molécules de polyétheramines susceptibles d'être greffées sur un polysaccharide. Cela lui a permis ensuite de préparer de nouveaux polysaccharides modifiés par greffage desdites polyétheramines, ainsi que de nouvelles préparations à base de polysaccharides ainsi modifiés qui présentent des propriétés rhéologiques thermosensibles particulièrement intéressantes. Ainsi un premier objet de l'invention est un procédé de modification des polysaccharides, dans lequel :
(a) on fait réagir un polysaccharide avec une polyétheramine modifiée de type (X-R- C(0)NH)bR'
(où R' représente un polyéther et b = 1 , 2 ou 3 et X représente un halogène, de préférence Cl ou Br, R représente un reste alkyle, possiblement substitué, ou un reste aromatique, possiblement substitué),
en présence d'une base, de préférence en présence d'eau et d'isopropanol,
(b) on purifie le produit obtenu en présence de NaCI, au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée à un pH compris entre 9 et 13 (et de préférence entre 10 et 12) ;
(c) on purifie le produit issu de l'étape (b), au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée après neutralisation à un pH compris entre 6 et 8 (de préférence entre 6,5 et 7,5), éventuellement après lyophilisation et lavage du produit lyophilisé (de préférence à l'éthanol).
R représente avantageusement un reste alkyle, possiblement substitué (par exemple un reste en Ci , C2 , C3, C4 , C5, C6, C7, C8, C9, Ci0 Cn ou C12), ou un reste aromatique (par exemple un reste phényle), possiblement substitué.
Dans un mode de réalisation ladite polyétheramine modifiée est une polyéthermonoamine dans laquelle le reste R' présente la structure suivante :
Figure imgf000005_0001
z
où Z est un atome hydrogène (dans le cas de l'oxyde d'éthylène) ou un méthyle (dans le cas de l'oxyde de propylène), et où, de manière préférée, x=1 à 3, Z=CH3 et y = 7 à 1 1 (avec x=1 et y=9 préféré) ; x=17 à 21 , Z=CH3 et y = 2 à 5 (avec x=19 et y = 3 préféré); x=5 à 8, Z=CH3 et y = 25 à 32 (avec x=6 et y=29 préféré).
De manière avantageuse leadite polyétheramine R' présente une masse molaire comprise entre environ 300 et environ 3000, et encore plus préférentiellement entre environ 500 et environ 2500, et/ou ladite polyétheramine présentant un rapport molaire de [oxyde de propylène] / [oxyde d'éthylène] compris entre 10/1 et 1/10.
Dans un mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention on active d'abord au moins une fonction carboxylique PS-COOH du polysaccharide PS à l'aide d'une aminé quaternaire, puis on ajoute ladite polyétheramine modifiée. Pour permettre l'utilisation du polysaccharide modifié dans des utilisations pharmaceutique ou intracorporelles, le procédé selon l'invention peut comporter au moins une étape de purification, et de préférence toutes les étapes de purification après neutralisation, est effectuée à une température inférieure à 20°C, de préférence comprise entre 0°C et 15°C, et encore plus préférentiellement entre 2°C et 8°C.
Dans le procédé de modification des polysaccharides selon l'invention, le produit issu de l'étape (c) peut être est lyophilisé, lavé à l'éthanol et séché.
Avantageusement, en vue de son utilisation dans un hydrogel, ledit polysaccharide est sélectionné dans le groupe formé par les polysaccharides neutres (et notamment par le pullulane et le dextrane), les polysaccharides anioniques naturels (et notamment : alginate, acide hyaluronique, gomme xanthane, gomme d'agar agar, pectines, héparine), les polysaccharides anioniques de synthèse (et notamment : carboxyméthylcellulose, carboxyméthylpullunane), les polysaccharides cationiques naturels (et notamment le chitosane), les polysaccharides cationiques de synthèse (et notamment : diéthylaminoéthylcellulose, diéthylamoniéthyldextrane), les polysaccharides amphiphiles, les polysaccharides zwitterioniques naturels ou obtenus par modification chimique (et notamment le carboxyméthylchitosane), ou par des mélanges de ces polysaccharides. On préfère particulièrement le pullulan, le xanthane, l'alginate et l'acide hyaluronique.
Un autre objet de l'invention est un polysaccharide modifié susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.
Encore un autre objet de l'invention est un hydrogel formé par au moins un polysaccharide modifié selon l'invention et un liquide aqueux. Ledit liquide aqueux peut comprendre du sérum et/ou un milieu de culture de cellules.
Dans un mode de réalisation, l'hydrogel selon l'invention présente avantageusement des propriétés rhéologies thermosensibles avec une température de transition comprise entre 33 et 39°C. Dans un autre mode de réalisation il présente des propriétés rhéologies thermosensibles avec une température de transition comprise entre 4 et 20°C.
Encore un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un hydrogel selon l'invention dans un milieu pour la culture cellulaire ou dans un milieu pour le transport de cellules.
Encore un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un hydrogel selon l'invention pour la préparation d'une composition destinée à être utilisé en tant que pansement cutanée, agent d'embolisation, agent de viscosupplémentation, agent de comblement, agent limitant l'adhésion post chirurgicale, ou agent de régénération tissulaire.
Lesdits polyétheramines modifiées de type (X-R-C(0)NH)bR' qui sont utilisées dans le procédé de modification de polysaccharides selon l'invention n'existent pas dans l'état de la technique, et peuvent être préparées par un nouveau procédé de préparation d'une polyétheramine modifiée de type (X-R-C(0)NH)bR' par réaction d'une polyétheramine (H2N)bR' avec un halogénure d'un acyle halogéné X-R-C(0)X, dans lequel :
(a) on approvisionne une polyétheramine (H2N)bR' (où R' représente un polyéther et b = 1 , 2 ou 3) et un halogénure d'acyle halogéné X-R-C(0)X (où X représente un halogène, de préférence Cl ou Br, R représente un reste alkyle, possiblement substitué, ou un reste aromatique, possiblement substitué),
(b) on mélange les deux réactifs en présence d'une base, de préférence Et3N et/ou NaOH, et laisse le mélange réagir à une température inférieure à 35°C, de préférence inférieure à 25°C, encore plus préférentiellement inférieure à 20° et de manière optimale entre 0°C et 10°C, de préférence en l'absence de solvant (et de préférence en l'absence de DMF et THF).
La réaction se déroule selon le schéma suivant :
X-R-C(0)X + (H2N)b-R' -- > (X-R-C(0)NH)bR' où b est égal à 1 , 2 u 3, où X représente un halogène (de préférence Cl ou Br) ; R représente un reste alkyle, possible substitué (par exemple un reste en C6), ou un reste aromatique (par exemple un reste phényle), possible substitué (mais la fonctionnalisation du reste aromatique n'est pas préférée) ; et R' représente un polyéther, de préférence de type PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y. La polyétheramine peut être une polyéthermonoamine (avec b = 1 ), ou une polyétherdiamine (avec b = 2), ou une polyéthertriamine (avec b=3). On utilise de préférence des aminés primaires.
La réaction se déroule en présence d'une base, de préférence Et3N et/ou NaOH qui capte le HX résultant de la réaction.
La réaction est effectuée avantageusement et à une température inférieure à 20°C, de préférence comprise entre 0°C et 10°C.
A l'issue de l'étape (b) on peut effectuer un lavage du milieu réactionnel à l'eau acidifiée. La polyétheramine modifiée obtenue par ce procédé peut être conservée en présence d'un alcool (de préférence isopropanol). D'une manière générale, pour la fabrication des polysaccharides modifiées par greffage de polyétheramines on préfère les polyéthermonoamines H2N- ', et en particulier celles qui présentent la structure suivante :
Figure imgf000008_0001
où Z1 est un atome hydrogène (dans le cas de l'oxyde d'éthylène) ou un méthyle (dans le cas de l'oxyde de propylène), ou encore un éthyle ou propyle, et x et y indiquent la longueur des chaînes, sachant que pour une molécule donnée, x et y sont des nombres entiers, mais sur un produit donné tel qu'il sera utilisé (qui peut comporter des molécules dont la longueur peut ne pas être identique) x et y représentent des valeurs moyennes.
Dans un mode de réalisation la masse molaire des polyétheramines utilisables peut varier entre environ 300 et environ 3000, et on préfère une plage comprise entre 500 et 2500. Le rapport molaire de PO/EO peut varier dans des limites assez larges, par exemple entre 10/1 et 1/10.
Mais on peut également utiliser des polyétherdiamines, et en particulier celles qui présentent la structure suivante :
Figure imgf000008_0002
ou la structure suivante :
Figure imgf000008_0003
où Z1, x et y ont la signification indiquée ci-dessus, et z représente, comme x et y, et comme cela est expliqué ci-dessus, la longueur de la chaîne. On peut également utiliser des polyéthertriamines, et en particulier celles qui présentent la structure suivante :
Figure imgf000009_0001
où Z1, x et y ont la signification indiquée ci-dessus, et z représente, comme x et y, et comme cela est expliqué ci-dessus, la longueur de la chaîne. Z2 est hydrogène ou un alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle. Le nombre n peut compris entre 0 et 12, et est de préférence 0, 1 ou 2.
Ladite polyétheramine présente avantageusement une masse molaire comprise entre environ 300 et environ 3000, et encore plus préférentiellement entre environ 500 et environ 2500. Dans le cas ou ladite polyétheramine est un mélange d'oxyde de propylène et d'oxyde de éthylène, ladite polyétheramine présente avantageusement un rapport molaire de [oxyde de propylène] / [oxyde d'éthylène] compris entre 10/1 et 1/10.
Dans un mode de réalisation avantageux, et en particulier pour les polyéthermonoamines, on choisit x=1 à 7, Z=CH3 et y = 5 à 15 (avec x=1 à 3 et y=7 à 1 1 préféré). Dans un autre mode de réalisation avantageux on choisit x=15 à 25, Z=CH3 et y = 1 à 9 (avec x = 17 à 21 et y = 2 à 5 préféré). Dans encore un autre mode de réalisation avantageux on choisit x = 3 à 1 1 , Z=CH3 et y = 21 à 35 (avec x = 5 à 8 et y = 25 à 32 préféré). Ces modes de réalisation avantageux sont établis en vue de l'utilisation des polyétheramines modifiées qui résultent du procédé selon l'invention.
Ce nouveau procédé de synthèse de polyétheramines modifiées tel que décrit ci-dessus représente un autre objet de la présente invention.
Un autre objet de l'invention sont des polyétheramines modifiées de type (X- - C(0)NH)bR' (avec b = 1 , 2 ou 3) susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'invention. Ces polyétheramines modifiées sont des produits intermédiaires de synthèse intéressants pour la préparation de polysaccharides modifiés, et notamment tel que décrit ci-dessus. Ainsi, un dernier objet de l'invention est l'utilisation d'une polyétheramine modifiée selon l'invention pour modifier un polysaccharide.
Description des figures
Les figures 1 à 6, 8 et 9 illustrent différents aspects de l'invention, la figure 7 concerne l'état de la technique.
Les figures 1 et 2 se rapportent à un essai de modification d'une polyétheramine de type Jeffamine ® M2005 par réaction avec un halogénure d'un acyle halogéné. L'axe vertical représente l'intensité normalisée.
La figure 1 montre le Spectre 1H RMN (dans CDCI3) de la polyétheramine modifiée.
La figure 2 montre les spectres infrarouge (FT-IR) : la courbe (a) correspond à la polyétheramine de départ, la courbe (b) à la polyétheramine modifiée. Les figures 3 à 5 se rapportent à un essai de greffage d'un polysaccharide (en l'occurrence l'acide hyaluronique) avec une polyétheramine de type Jeffamine ® M2005 qui a été préalablement modifiée par réaction avec un halogénure d'un acyle halogéné (et qui est le même que celui des figures 1 et 2). La figure 3 montre le spectre 1H RMN (dans D20) d'un acide hyaluronique (HA) greffé par la polyétheramine modifiée.
Les figures 4 et 5 montrent la variation des modules de conservation (module élastique) G' (·) et de perte (module visqueux) G"(T ) du HA greffé en fonction de la température : la concentration de HA greffé est de 40g/l dans le milieu de culture RPMI (figure 4) ou de 20 g/l (figure 5). On note la transition sol - gel réversible pour une température inférieure à 37°C (environ 29°C pour la figure 4, environ 34°C pour le figure 5).
Les figures 6 à 9 se rapportent à des essais décrits en grand détail dans la section « Exemples ».
La figure 6 montre l'absorbance UV en fonction de la température pour un polysaccharide (en l'occurrence HA) greffé par une polyétheramine de type Jeffamine ® M2005 qui avait été préalablement modifiée par l'action du 2-Bromo-2-méthylpropionylbromure (réaction de Williamson). La figure représente une mesure effectuée sur le mélange réactionnel. Les figures 7 et 8 comparent la variation des modules de conservation (module élastique) G' (courbe A) et de perte (module visqueux) G" (courbe B) en fonction de la température pour l'acide hyaluronique non greffé (figure 7) et pour l'acide hyaluronique greffé (taux de greffage : 2% molaires) par une polyétheramine de type Jeffamine ® M2005 qui avait été préalablement modifiée par l'action du 2-Bromo-2- méthylpropionylbromure (réaction d'estérification) (figure 8). Dans les deux cas, la concentration de HA (greffé ou non) était de 40 g/l dans le milieu de culture RPMI.
La figure 9 montre des courbes DSC (calorimétrie différentielle par balayage, en anglais « Differential Scanning Calorimetry ») pour un échantillon d'hydrogel de HA greffé par une polyétheramine de type Jeffamine ® M2005 qui avait été préalablement modifiée par l'action du 2-Bromo-2-méthylpropionylbromure (réaction d'estérification) ; ces hydrogels ont été formés avec un milieu de culture cellulaire de type RPMI.
Courbe A : Hydrogel de HA greffé par une Jeffamine ® modifiée.
Courbe B : Jeffamine ® modifiée (à titre de comparaison).
Courbe C : Jeffamine ® M2005 (à titre de comparaison).
Description détaillée de l'invention
Les polysaccharides modifiés selon l'invention qui donnent les meilleurs résultant étant modifiés par greffage de dérivés de polyétheramines qui ne sont pas disponibles dans le commerce, on décrit ici d'abord une méthode générale (section A) pour obtenir des polyétheramines modifiées qui sont susceptibles d'être greffés sur des polysaccharides, puis on décrit deux méthodes (sections B et C) de greffage par estérification du polysaccharide permettant d'obtenir des polysaccharides à propriétés rhéologiques thermosensibles. Ces deux méthodes donnent sensiblement les mêmes produits. Et enfin on décrit (section D) l'utilisation de ces produits.
A) Modification de polyétheramine par réaction avec un halogénure d'un acyle halogéné Cette réaction se déroule selon le schéma suivant :
X-R-C(0)X + (H2N)b-R' -- > (X-R-C(0)NH)bR'
où b est égal à 1 , 2 ou 3, où X représente un halogène (de préférence Cl ou Br) ; R représente un reste alkyle, possiblement substitué (par exemple un reste en Ci , C2 , C3, C4 , C5, C6, C7, C8, C9, C10 C11 ou C12), ou un reste aromatique (par exemple un reste phényle), possiblement substitué (mais la fonctionnalisation du reste aromatique n'est pas préférée) ; et R' représente un polyéther, de préférence de type PPO ou (PEO)x-co- (PPO)y. La polyétheramine peut être une polyéthermonoamine (avec b = 1 ), ou une polyétherdiamine (avec b = 2), ou une polyéthertriamine (avec b=3). On utilise de préférence des aminés primaires.
La réaction se déroule en présence d'une base, de préférence Et3N et/ou NaOH, qui capte le HX résultant de la réaction. La température est inférieure à 35°C, de préférence inférieure à 25°C, et encore plus préférentiellement inférieure à 20°C, et de manière optimale comprise entre 0°C et 10°C ; une température d'environ 4°C convient. De manière préférée la réaction de la polyétheramine H2N-R' avec l'halogénure d'un acyle halogéné X-R-C(0)X s'effectue sans solvant. Après la réaction, le mélange est purifié par simple lavage à l'eau acide : ce lavage enlève l'aminé non réagie et l'acide HX (ou son sel) qui résulte de la réaction.
Le schéma suivant montre un mode de réalisation avantageux de cette réaction utilisant une polyéthermonoamine :
.0 Et3N ou NaOH O
X— ^ - +I- M H2 MN—- RR'' » X— R
X N-R'
4°C H
X : Halogène (Cl, Br,...)
R: alkyle, aromatique,...
R': PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y peut également utiliser une polyétherd
Figure imgf000012_0001
R: alkyle, aromatique,...
R": PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y
On peut également utiliser une
O NH2
\ + H2N-R"'-NH2
X : Halogène (Cl, Br,...)
Figure imgf000012_0002
R: alkyle, aromatique,...
R'": PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y
PPO signifie ici polypropylène oxyde et PEO signifie polyéthylène oxyde, et le (PEO)x-co- (PPO)y est un copolymère entre PO (propylène oxyde) et EO (éthylène oxyde). Le sigle Et3N signifie triéthylamine. Comme polyétheramine H2N-R' ou R"(NH2)2 ou R'"(NH2)3 on peut utiliser notamment des produits disponibles sous la marque Jeffamine ®, et en particulier les produits Jeffamine ® M600, Jeffamine ® M2005, Jeffamine ® M2070, Jeffamine ® D2000...). Tous ces produits sont des liquides, et la réaction peut se dérouler sans solvant ; en règle générale le produit X-R-C(0)NHR' obtenu présente une viscosité plus grande que la polyétheramine H2N-R' de départ. La même remarque s'applique aux polyétherdiamines et polyéthertriamines.
L'absence de solvant (tel que : DMF, THF) pour la réaction a plusieurs avantages : ces solvants sont coûteux, et ils sont toxiques et doivent ensuite être éliminés du produit car il faut éviter de contaminer le produit avec des molécules qui risquent de gêner pour son usage final (qui peut être un usage en culture cellulaire ou même un usage intracorporel).
Le produit peut être conservé dans l'isopropanol (sous la forme de solution), ce solvant étant choisi en fonction de l'usage ultérieur du produit. Le produit peut être caractérisé par spectroscopies RMN et Infrarouge pour démontrer son identité et sa pureté.
Ce procédé selon l'invention présente de nombreux avantages. Il donne accès à un large spectre de polyétheramines modifiées, avec une bonne pureté. Il peut être effectué sans solvants organiques (tels que le DMF, THF) qui pourraient être susceptibles, même à l'état de traces, de gêner l'utilisation des polyétheramines selon l'invention pour la préparation de polysaccharides modifiés destinés à une utilisation pharmaceutique ou intracorporelle. Nous décrivons maintenant l'utilisation des polyétheramines modifiées selon l'invention afin de démontrer l'application industrielle de cette nouvelle classe de composés comme intermédiaires de synthèse, et en particulier dans le but d'obtenir des polysaccharides modifiés présentant des propriétés physiques, physico-chimques et chimiques variées et intéressantes pour une utilisation en pharmacie, biologie cellulaire ou médecine.
B) Modification de polysaccharides par la réaction de Williamson
Cette méthode vise à greffer la polyétheramine modifiée, susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, et obtenue notamment par l'exemple selon l'étape 1 décrite ci- dessus, sur un polysaccharide pour obtenir notamment des polysaccharides à propriétés rhéologiques thermosensibles. Une méthode alternative est présentée ci-dessous (méthode C). La réaction comprend le greffage d'une polyétheramine modifiée de type (X-R- C(0)NH)bR' (par exemple une polyéthermonoamine modifiée de type X-R-C(0)NHR', ou une polyétherdiamine modifiée de type (X-R-C(0)NH)2R', ou encore une polyéthertriamine modifiée de type (X-R-C(0)NH)3R') sur un groupement -OH d'un polysaccharide (PS -OH), ce qui conduit à un polysaccharide modifié de type (PS -O-R-
C(0)NH)bR', (dans le cas d'une polyéthermonoamine modifiée le polysaccharide modifié peut être de type PS -0-R-C(0)NHR', dans le cas d'une polyétherdiamine modifiée le polysaccharide modifié peut être de type (PS -0-R-C(0)NH)2R', et dans le cas d'une polyéthertriamine modifiée le polysaccharide modifié peut être de type (PS -O-R- C(0)NH)3R'), dans lequel l'atome d'oxygène qui constitue le point de greffage entre le polysaccharide et le greffon provient du groupement OH du polysaccharide.
Dans ce schéma réactionnel les symboles X, R et R' ont la même signification que celle décrite en relation avec la méthode A ci-dessus.
La réaction se déroule de préférence dans un mélange d'eau et d'isopropanol, en employant directement le produit de la méthode A décrite ci-dessus.
Le schéma suivant montre un mode de réalisation avantageux de cette réaction:
Figure imgf000014_0001
R: alkyle, aromatique,...
R': PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y
Les analyses physicochimiques réalisés dans un milieu de culture cellulaire (RPMI) par des mesures rhéologiques, des modules de conservation (G') et modules de perte (G") en fonction de la température pour deux concentrations (40 et 20 g/1) montrent la transition sol gel réversible pour des températures inférieurs à 37°C.
C) Modification de polvsaccharides par estérification
Cette méthode vise à greffer la polyétheramine modifiée, susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, obtenue par exemple selon l'étape 1 décrite ci-dessus, sur un polysaccharide pour obtenir notamment des polysaccharides à propriétés rhéologiques thermosensibles. Il s'agit d'une alternative à la méthode B présentée ci-dessus. La réaction comprend l'activation de la fonction carboxylique PS-COOH d'un polysaccharide PS à l'aide d'un amine quaternaire, et de préférence du tetrabutylamine (TBA), conduisant à une fonction -COO" , suivi du greffage d'une polyétheramine modifié de type (X-R-C(0)NH)bR' sur ledit groupement -COO" du polysaccharide, ce qui conduit à un polysaccharide modifié de type ( -COO-R-C(0)NH)b R', dans lequel l'atome d'oxygène qui constitue le point de greffage entre le polysaccharide et le greffon provient du groupement COOH du polysaccharide.
Dans ce schéma réactionnel les symboles X, R et R' ont la même signification que celle décrite en relation avec la méthode A ci-dessus.
La réaction se déroule de préférence dans un mélange d'eau et d'isopropanole, en employant directement le produit de la méthode A décrite ci-dessus. On préfère une température au-dessus de 25°C, de préférence comprise entre 40°C et 95°C, et encore plus préférentiellement entre 55°C et 90°C, une température d'environ 70°C convient bien.
Le schéma suivant montre un mode de réalisation avantageux de cette réaction:
Figure imgf000015_0001
X : Halogène (Cl, Br,...)
panol
Figure imgf000015_0002
Remarques communes aux méthodes B et C : a) Purification
Le produit de la réaction issu de la méthode B ou C doit être purifié s'il est destiné à un usage intracorporel. Cette purification se fait avantageusement en présence de NaCI et en au moins deux étapes qui se distinguent par leur pH. Une première étape de purification est effectuée à un pH compris entre 9 et 13 (de préférence entre 10 et 12, et encore plus préférentiellement environ 1 1 ), de préférence au moins en partie (et possiblement dans sa totalité) par une méthode de séparation membranaire telle que la diafiltration. C'est à ce pH que les molécules de polyétheramine non réagies (i.e. qui n'ont pas été greffés sur le polysaccharide) sont éliminées, probablement par neutralisation des fonctions ammonium quaternaires de la polyétheramine et élimination des liaisons ioniques entre l'ammonium de la polyétheramine et le carboxylate du polysaccharide ; la polyétheramine non réagie présente en général une toxicité cellulaire qui gêne pour l'utilisation ultérieure de l'hydrogel en culture cellulaire, et qui serait en tous cas inacceptable pour l'utilisation intracorporelle de l'hydrogel.
Une deuxième étape de purification est effectuée après neutralisation, de préférence à un pH d'environ 7, qui est en règle générale le pH auquel l'hydrogel sera utilisé ultérieurement, que ce soit en culture cellulaire ou pour des applications intracorporelles. Cette deuxième étape de purification peut également être faite, partiellement ou en totalité, par une méthode de séparation membranaire telle que la diafiltration, ou par une autre technique appropriée. Cette deuxième étape à pH neutre peut être faite après lyophilisation (la poudre étant ensuite lavée à l'éthanol pour enlever des restes de polyétheramines libres et d'autres sous-produits).
La séparation membranaire peut être effectuée de manière connue, par exemple avec des membranes présentant une valeur de MWCO (« molecular weight cut-off ») d'environ 10 kDa à 30 kDa, par exemple entre 12 kDa à 14 kDa en mode boudin. La dialyse peut être faite contre de l'eau et/ou contre un mélange d'eau et d'éthanol (par exemple avec le rapport volume : eau 2/3, éthanol 1/3). On observe une baisse du pH au cours de la dialyse. Selon un aspect très avantageux de l'invention au moins une étape de purification (et préférentiellement au moins toutes les étapes de purification avant la neutralisation, et encore plus préférentiellement aussi au moins une (et de préférence toutes) les étapes de purification après neutralisation) est (sont) effectuée(s) à une température inférieure à 20°C, de préférence comprise entre 0°C et 15°C, et encore plus préférentiellement entre 2°C et 8°C, notamment à une température d'environ 4°C.
En effet, la demanderesse a observé qu'à la température ambiante le mélange réactionnel est trouble et tend à former des agrégats à température ambiante qui gênent la purification ; or, l'obtention d'un produit pur est nécessaire pour toute utilisation intracorporelle de l'hydrogel. En revanche, le produit selon l'invention, purifié à basse température comme indiqué ci-dessus, est translucide après gélification, contrairement à de nombreux hydrogels de polysaccharide de l'état de la technique.
La demanderesse tend à penser (sans vouloir être enfermée par cette théorie) que la polyétheramine non modifiée (libre) participe à la formation desdits agrégats dans lesquels il pourrait se trouver emprisonné, puisque les agrégats disparaissent après une purification suffisante de l'hydrogel. La demanderesse a trouvé qu'en dehors de la toxicité de la polyétheramine résiduelle (non-réagie, libre), il existe une autre raison pour purifier au mieux le polysaccharide modifié par greffage d'une polyétheramine : la présence de polyétheramine libre dans les hydrogels qui montrent une variation de la viscosité en fonction de la température conduit à un gradient de la viscosité plus faible et étalé sur une plage de température plus large comparé à un hydrogel purifié.
Le produit purifié est congelé (par exemple à -20°C) et lyophilisé, puis lavé à l'éthanol (par exemple deux fois) et séché (de préférence à 40°C sous vide). Le produit final se présente sous la forme d'une poudre sèche. Il peut être transformé en hydrogel en le dispersant dans une quantité voulue d'un milieu aqueux. Ledit milieu aqueux peut être un milieu de culture cellulaire. A titre d'exemple on peut utiliser les milieux de culture connus sous le sigle RPMI (Roswell Park Mémorial Institute). Le milieu aqueux peut comprendre des additifs, tels que des facteurs de croissance et/ou des principes pharmaceutiquement actifs (tels que des antibiotiques), et du sérum. b) Polysaccharides utilisables
Dans le cadre de la présente invention, différents types de polysaccharides peuvent être utilisés pour être modifiés par greffage selon la méthode B ou selon la méthode C. Ces polysaccharides peuvent appartenir aux groupes des polysaccharides neutres (par exemple pullulane, dextrane), des polysaccharides anioniques naturels (par exemple : alginate, acide hyaluronique, gomme xanthane, gomme d'agar agar, pectines, héparine), des polysaccharides anioniques de synthèse (par exemple carboxyméthylcellulose, carboxyméthylpullunane), des polysaccharides cationiques naturels (notamment le chitosane), des polysaccharides cationiques de synthèse (par exemple diéthylaminoéthylcellulose, diéthylamoniéthyldextrane), des polysaccharides amphiphiles, des polysaccharides zwitterioniques naturels ou obtenus par modification chimique (par exemple carboxyméthylchitosane). Les polysaccharides de type pullulan, xanthane, alginate, acide hyaluronique (ce dernier étant abrégé HA) sont les polysaccharides particulièrement préférés pour préparer des polysaccharides greffés à propriétés rhéologiques thermosensibles. Des tests en culture cellulaire à différentes concentrations montrent la non-toxicité de ces produits ainsi que la prolifération des cellules dans ces systèmes.
Par ailleurs, ces polysaccharides sont biocompatibles et biodégradables. A titre d'exemple, on peut utiliser l'acide hyaluronique (HA), qui présente une biocompatibilité bien connue. On peut utiliser un HA d'origine bactérienne (Streptococcus equi) qui est dans le commerce avec une masse molaire en nombre qui varie typiquement de 103 à plus de 106 g/mol (déterminée par chromatographie d'exclusion stérique, diffusion de la lumière multi-angle et réfractométrie). c) Taux de greffage
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des taux de greffage élevés, qui peuvent atteindre 20% molaires. La demanderesse ne connaît aucun procédé connu qui permet d'obtenir des taux de greffage si élevés. Pour l'utilisation des produits comme polysaccharides à propriétés rhéologiques thermosensibles on préfère un taux de greffage compris entre 5% et 20% molaire, de préférence entre 5% et 15%, et encore plus préférentiellement entre 10% et 15%. En effet, dans certains systèmes greffés, au-delà de 15 à 20% l'effet de thermosensibilité des propriétés rhéologiques tend à diminuer. d) Choix des polyétheramines
Les polyéthermamines préférées dans le cadre de la présente invention (et la présente section « Choix des polyétheramines » concerne les méthodes A, B et C) sont des copolymères de type polyéthers composés d'oxyde de propylène (PO) et d'oxyde d'éthylène (EO). La présence de ces oxydes de propylène rend la macromolécule hydrophobe et thermosensible, entraînant en solution aqueuse une précipitation en fonction de la température. La température de cette transition dépend entre autres de la quantité relative PO/EO.
Les polyétheramines utilisées dans la présente invention sont de préférence des aminés primaires. D'une manière générale (et en particulier pour les méthodes B et C) on préfère les polyéthermonoamines, et en particulier celles qui présentent la structure suivante :
Figure imgf000019_0001
où Z1 est un atome hydrogène (dans le cas de l'oxyde d'éthylène) ou un méthyl (dans le cas de l'oxyde de propylène) et x et y indiquent la longueur des chaînes, sachant que pour une molécule donnée, x et y sont des nombres entiers, mais sur un produit donné tel qu'il sera utilisé (qui peut comporter des molécules dont la longueur peut ne pas être identique) x et y représentent des valeurs moyennes.
La masse molaire des polyétheramines utilisables peut varier entre environ 300 et environ 3000, et on préfère une plage comprise entre 500 et 2500. Le rapport molaire de PO/EO peut varier dans des limites assez larges, par exemple entre 10/1 et 1/10.
A titre d'exemple, on peut utiliser les polyéthermonoamines suivantes :
x=1 à 3, Z1=CH3 et y = 7 à 1 1 (avec x=1 et y=9 préféré) ; x=17 à 21 , Z1=CH3 et y = 2 à
(avec x=19 et y = 3 préféré); x=5 à 8, Z1=CH3 et y = 25 à 32 (avec x=6 et y=29 préféré).
Mais on peut également utiliser des polyétherdiamines, et en particulier celles qui présentent la structure suivante :
Figure imgf000019_0002
Z1 ou la structure suivante
Figure imgf000019_0003
z1 z1 z1 où Z1, x et y ont la signification indiquée ci-dessus, et z représente, comme x et y, et comme cela est expliqué ci-dessus, la longueur de la chaîne. On peut également utiliser des polyéthertriamines, et en particulier celles qui présentent la structure suivant
Figure imgf000020_0001
où Z1, x et y ont la signification indiquée ci-dessus, et z représente, comme x et y, et comme cela est expliqué ci-dessus, la longueur de la chaîne. Z2 est hydrogène ou un alkyle en Ci à C4, de préférence méthyle ou éthyle. Le nombre n peut compris entre 0 et 12, et est de préférence 0, 1 ou 2.
On peut utiliser par exemple les polyéthermonoamines commercialisées sous la marque Jeffamine ® (série M), ou les polyétherdiamines commercialisées sous la marque Jeffamine ® (série D, ED), ou encore les polyéthertriamines commercialisése sous la marque Jeffamine ® (série T), par la société Huntsman.
D) Utilisation d'hvdrogels de polysaccharides modifiés par greffage selon l'invention
Les hydrogels de polysaccharides modifiés par greffage selon l'invention peuvent être utilisés en biologie et médecine, de manière extracorporelle ou de manière intracorporelle. Ces hydrogels peuvent être préparés avec de l'eau ou avec des liquides aqueux, tels que : les solutions aqueux tamponnées, le sérum physiologique, les milieux de culture cellulaire usuels ou spécifiques.
Ces utilisations en biologie et en médecine sont rendues possibles grâce à la possibilité de purifier les polysaccharides modifiés selon l'invention de manière très efficace, afin d'éliminer tout résidu toxique. Certaines utilisations, notamment intra-corporelles, sont également rendues possibles grâce à la rhéologie des polysaccharides modifiés selon l'invention (orthopédie, cosmétologie (par exemple comblement de rides, dermatologie).
Les utilisations extracorporelles comprennent l'utilisation en tant que milieu de culture de cellules, notamment animales ou humaines, ou l'utilisation dans une composition de milieu de culture de cellules, notamment animales et humaines. Ces hydrogels peuvent être notamment aussi utilisés dans des systèmes microfluidiques. Elles comprennent également l'utilisation comme milieu (ou dans une composition de milieu) de stockage et/ou de transport de cellules, de biopsies ou d'expiants, notamment de cellules animales ou humaines. Les hydrogels selon l'invention présentent un réseau tridimensionnel qui accueille les cellules à cultiver dans des conditions propices à leur croissance et multiplication. Les utilisations intracorporelles comprennent l'utilisation comme pansement cutanée, agent d'embolisation, agent de viscosupplémentation, agent de comblement, agent limitant l'adhésion post chirurgicale, comme agent de régénération tissulaire, ou dans la composition de tels agents. Ces applications permettent en particulier de tirer profit des propriétés thermosensibles de l'hydrogel selon l'invention.
Nous décrivons ici une utilisation typique d'un hydrogel de polysaccharide modifié avec propriétés rhéologiques thermosensibles selon l'invention. Pour son utilisation comme milieu de culture cellulaire tridimensionnelle, on solubilisé l'hydrogel dans le milieu de culture des cellules, et on dépose les cellules dans le gel thermosensible à température ambiante. Lors de l'augmentation en température (passage à 37°C, température de l'incubateur) du système, les cellules seront séquestrées à l'intérieur de l'hydrogel. Une des caractéristiques importantes du thermosensible est sa transparence optique lorsque le système est sous forme de gel, permettant une analyse microscopique. Les cellules pourront alors se développer en suspension à l'intérieur du système et proliférer dans ce système. Lors d'une nouvelle transition à température ambiante les cellules pourront être récupérées et analysées. L'hydrogel à propriétés rhéologiques thermosensibles est utilisable aussi pour transporter les cellules (souches, primaires et lignées) ou les prélèvements (tels que des biopsies) à une température d'environ 37°C. En effet, ces échantillons précieux subissent lors du transport des chocs dû aux secousses et arrivent souvent altérées. L'hydrogel à propriétés rhéologiques thermosensibles permet alors de limiter l'impact de ces secousses dû à la manutention des envois en séquestrant les cellules ou prélèvements (tels que les biopsies) à l'intérieur de l'hydrogel. Une fois l'échantillon réceptionné par son destinataire, il suffira d'une transition à température ambiante pour liquéfier le milieu et récupérer ainsi facilement les cellules ou prélèvements qu'il contient. L'hydrogel à propriétés rhéologiques thermosensibles peut également être utilisé en médecine régénérative, par exemple lors de la régénération d'un cartilage. Actuellement, une des principales techniques utilisées pour la régénération du cartilage est la micro fracture. Le praticien effectue sur un patient atteint d'une lésion de grade III ou IV un poinçonnement de l'os sous-jacent du cartilage. Ces poinçonnements entraînent un épanchement sanguin contenant des cellules souches. Ces cellules souches ont la capacité de régénérer le cartilage. Cependant, un problème de cette technique est que les cellules ne restent pas toujours sur le site lésé et se dispersent. L'injection d'un hydrogel à propriétés rhéologiques thermosensibles chargés de sang comportant des cellules souches (ou d'un autre milieu biologique, enrichi en cellules souches ou contenant des cellules souches) lors de la microfracture permettrait de localiser les cellules sur le site de la lésion et de favoriser la régénération du cartilage. E) Avantages de l'invention
L'utilisation de polyétheramines modifiées selon l'invention comme greffon permet d'obtenir des polysaccharides greffés avec de nouvelles caractéristiques physicochimiques, et en particulier avec une viscosité qui dépend de la température. En effet, l'utilisation de polyétheramines selon l'invention permet d'obtenir des taux de greffage plus élevés.
La purification des hydrogels à basse température permet d'obtenir des hydrogels plus purs, non toxiques, sans polyétheramine libre. L'absence de polyétheramine libre accentue aussi la variation de la viscosité en fonction de la température et rétrécit l'intervalle de température dans lequel se produit la transition de viscosité.
Les hydrogels selon l'invention peuvent présenter des propriétés rhéologiques thermosensibles, passant d'un état liquide à un état à plus forte viscosité dans lequel ils constituent une nanostructure tridimensionnelle ; dans cet état ils peuvent accueillir des cellules. Ils sont optiquement transparents et permettent ainsi l'observation optique desdites cellules.
Exemples
Les exemples qui suivent sont donnés à titre d'illustration uniquement, pour permettre à l'homme du métier d'exécuter l'invention. Ils ne limitent pas la portée de l'invention.
I. Exemples portant sur la synthèse de dérivés de polyétheramines
Exemple 1 : Modification d'une polyéthermonoamine avec x=6, Z=CH3 et y=29 par le chlorure de chloroacetyle en présence de triéthylamine (TEA)
On a introduit dans un réacteur d'un volume de 250 ml 100 gr (50 mmol) de polyéthermonoamine (x=6, Z=CH3 et y=29, produit disponible sous la marque Jeffamine ® M2005, masse moléculaire environ 2000 g/mol) et 6,7 ml (50 mmol) de triéthylamine (TEA). Le mélange a été placé dans un bain de glace à 4°C, et on a ajouté, en goutte à goutte et sous forte agitation magnétique, 3,96 ml (50 mmol) de chlorure de chloroacetyle. Le mélange réactionnel a été maintenu pendant 2 heures. Après 2 heures on a ajouté 100ml de 2-propanol. Ensuite le mélange a été transvasé dans une ampoule à décanter, et on a ajouté 200 ml d'eau à pH acide (pH = 3). Après la séparation de phase, on a récupéré la phase organique contenant la Jeffamine ® M2005 modifiée.
Exemple 2 : Modification d'une polyéthermonoamine avec x=6, Z=CH3 et y=29 par le chlorure chloroacetyle en présence de soude (NaOH)
On a introduit dans un réacteur d'un volume de 250 ml 100 gr (50 mmol) de polyéthermonoamine (x=6, Z=CH3 et y=29, produit disponible sous la marque Jeffamine ® M2005) et 2 ml d'une solution de soude à 50 mmol de NaOH. Le mélange a été placé dans un bain de glace à 4°C, et on a ajouté, en goutte à goutte et sous forte agitation magnétique, 3,96 ml (50 mmol) de chlorure chloroacetyle. Le mélange réactionnel a été maintenu pendant 2 heures. Après 2 heures ont a ajouté 100ml de 2-propanol. Ensuite le mélange a été transvasé dans une ampoule à décanter, et on a ajouté 200 ml d'eau à pH acide (pH = 3). Après la séparation de phase, on a récupéré la phase organique contenant la Jeffamine ® M2005 modifiée.
Exemple 3 : Modification d'une polyéthermonoamine avec x=1 , Z=CH3 et y=9 par le 2- Bromo-2-methylpropionyl bromure (BIBB) en présence de triéthylamine (TEA)
On a introduit dans un réacteur d'un volume de 250 ml 100 gr (166 mmol) de polyéthermonoamine (x=1 , Z=CH3 et y=9, produit disponible sous la marque Jeffamine ® M600 ou XTJ-505, masse moléculaire environ 600 g/mol) et 22,5 ml (166 mmol) de triéthylamine (TEA). Le mélange a été placé dans un bain de glace à 4°C, et on a ajouté, en goutte à goutte et sous forte agitation magnétique, 20,5 ml (166 mmol) de chlorure de chloroethyle. Le mélange a été maintenu pendant 2 heures. Après 2 heures on a ajouté 100ml de 2-propanol au mélange réactionnel. Ensuite le mélange a été transvasé dans une ampoule à décanter, et on ajouté 200 ml d'eau à pH acide (pH = 3). Après la séparation de phase, on a récupéré la phase organique contenant la Jeffamine ® M600 modifiée. Exemple complémentaire :
Selon l'une des procédures décrites ci-dessus, on a réalisé les polyéthermonoamines modifiées suivantes : Polyethermonoamine de base :
(a) Z = CH3, x = 6, y = 29 (dans le commerce sous la marque Jeffamine ® M2005)
(b) Z = CH3, x = 1 , y = 9 (dans le commerce sous la marque Jeffamine ® M600)
(c) Z = H (pour EO) ou CH3 (pour PO), x = 6, y = 35 (Jeffamine ® M2070)
Chacune de ces trois polyéthermonoamines a été modifiée par la réaction avec :
(a1 , b1 , d ) : le chlorure de chlorylacetyl
(a2, b2, c2) : le bromure de a-bromoisobutyryl
(d , c2, c3) : le chlorure de 6-bromohexanoyl.
On a par ailleurs vérifie que ces synthèses peuvent être effectués avec des polyétherdiamines et polyéthertriamines. II Exemples portant sur la modification de polysaccharides par les dérivés de polvétheramine
Exemple 4 : Greffage de Jeffamine ® M2005 modifiée par le 2-Bromo-2-methylpropionyl bromure sur l'acide hyaluronique (HA) par la réaction de Williamson. Dans un réacteur on a solubilisé 1 g (2,5 mmol) de HA dans 100 ml d'eau sous agitation mécanique. La solution a été chauffée à 70°C. Ensuite on a dissout 0,8 g de NaOH (0,2 mol) dans 5 ml d'eau, et cette solution de soude a été ajoutée au milieu avec 0,5 g d'iodure de sodium. Après 15 minutes on a ajouté 1 1 ml de la solution de Jeffamine ® M2005 modifiée dans de l'isopropanol. Le mélange réactionnel a été chauffé à 70°C pendant 4 h, ensuite on a ajouté 2 g de NaCI et ajusté le pH à une valeur de 1 1 par addition de HCI (1 M). Le mélange a été conservé à 4°C pendant 12 h.
La purification a été obtenue par diafiltration à 4°C. Les mesures de l'absorbance en fonction de la température par UV du mélange réactionnel (figure 6) montrent une augmentation de l'absorbance, ce qui indique la présence d'une phase trouble dû à la formation d'agrégats. Cette observation implique qu'il n'est pas possible de purifier le mélange à température ambiante.
Pour purifier les mélanges réactionnels de manière efficace le système de diafiltration a été placé à 4°C. La purification a été réalisée en 3 étapes. On a commencé la diafiltration à pH = 1 1 en passant 3 fois le volume de la solution initiale. Ensuite on a neutralisé la solution à pH = 7 et on a passé 4 fois le volume de la solution. Après contrôle de la conductivité on a arrêté la diafiltration. L'échantillon a été congelé et ensuite lyophilisé. Le lyophilisât a été lavé avec de l'éthanol absolu et enfin séché sous vide.
Exemple 5 : Greffage de Jeffamine ® M2005 modifiée par le 2-Bromo-2-methylpropionyl bromure sur l'acide hyaluronique (HA) par la réaction d'estérification. Dans un réacteur on solubilise 1 g (2,5 mmol) de HA dans 100 ml d'eau sous agitation mécanique. Ensuite le pH de la solution est ajusté à 2 par addition de HCI (1 M). Le mélange est dialysé contre l'eau pure pendant 24 heures. Après dialyse la solution est neutralisée à pH=7 par l'addition de tetrabutylammonium hydroxide (TBAOH). Pour la réaction de greffage, la solution du HA neutralisée a été chauffée à 70 °C. Ensuite on a jouté 1 1 ml de la solution de Jeffamine ® M2005 modifiée dans de l'isopropanol. Le mélange réactionnel a été est chauffé à 70°C pendant 12 h. Ensuite on a ajouté 2 g de NaCI, et le mélange a été conservé à 4°C pendant 12 h. La même méthode de purification que celle décrite pour l'exemple 4 a été est utilisée.
Exemple 6 : Propriétés rhéologiques d'hydrogels de polysaccharides en fonction de la température
On a mesuré le module élastique G' et le module visqueux G" de différents hydrogels de polysaccharides en fonction de la température, à une concentration de 40 g/1 dans le milieu de culture RPMI. Des résultats sont montrés sur les figures 7 et 8.
Pour le HA non modifié (figure 7), ces mesures montrent que le système ne présente aucune transition thermosensible (pas de gélification) et on observe simplement une diminution des modules en fonction de la température, phénomène classique pour les polymères.
Pour le HA modifié en utilisant le procédé selon l'invention (BIBB-Jeffamine ® M-2005 avec un taux de greffage de 2%) ces mesures montrent (figure 8) que le système ne présente aucune transition thermosensible (pas de gélification), et on observe simplement une diminution des modules en fonction de la température.
Exemple 7 : Transition sol-gel réversible dans un hydrogel pour culture cellulaire
On a préparé un hydrogel de HA greffé par une polyétheramine de type Jeffamine® modifiée selon l'invention avec un milieu de culture connu sous le signe RPMI (Roswell Park Mémorial Institute Médium). On obtient à 20°C un liquide clair et translucide, qui est gel à 37°C, mais reste clair et translucide. La solidification du liquide est réversible. Exemple 8 : Transition sol-gel réversible d'un hydrogel pour culture cellulaire
On a préparé un hydrogel de HA greffé par une polyétheramine de type Jeffamine ® 2005 modifiée selon l'invention par un acide halide (BIBB-Jeffamine ® M-2005 avec un taux de greffage de 10%) dans un milieu de type DMEM (en anglais : « DulbeccoA/ogt modified Eagle's Minimal Essential Médium ») tamponné par l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1 - pipérazine éthane sulfonique (HEPES) ; ce milieu de culture cellulaire est connu sous le sigle HDMEM ou hDMEM.
On a enregistré un thermogramme différentiel à balayage (technique appelée en anglais « Differential Scanning Calorimetry, DSC) à une vitesse de 2°C.min"1. Cette technique mesure les variations de l'enthalpie en fonction de la température. Le thermogramme enregistré est montré sur la figure 9, courbe A. A titre de comparaison on enregistre le même thermogramme pour la Jeffamine ® modifiée par un acide halide (courbe B) et pour la Jeffamine ® M2005 (courbe C).
On observe un phénomène endothermique lors d'une montée de température entre 10°C et 40°C ; il s'agit probablement de la formation d'associations hydrophobes.
On note que les pics ne se situent pas à la même température. La comparaison des températures des pics montre que la modification de la polyétheramine par un acide halide diminue sa température de transition (formation d'associations hydrophobes) d'environ 29°C à environ 18°C. Elle montre également qu'après le greffage de cette polyétheramine modifiée sur un polysaccharide de type HA la température de transition du système est plus proche de celle de la polyétheramine modifiée que de celle de la polyétheramine non modifiée.
Le comportement est réversible avec un phénomène exothermique lors de la phase de refroidissement de 40°C à 10°C (non représenté sur le graphique).
Exemple 9 : Greffage de polyéthermonoamines modifiées sur des polysaccharides divers
En suivant les approches décrites dans les exemples précédents on a préparé les polysaccharides modifiés suivants :
(i) avec la polyéthermonoamine de base correspondant à Z = CH3, x = 6, y = 29 (dans le commerce sous la marque Jeffamine ® M2005) modifiée par la réaction avec le bromure de α-bromoisobutyryl : • Polysaccharide = acide hyaluronique (HA) avec un taux de greffage compris entre 2% et 21 % (molaire).
• Polysaccharide = alginate avec un taux de greffage de 1 %
• Polysaccharide = pullulane avec un taux de greffage de 4%
· Polysaccharide = xanthane avec un taux de greffage de 2%
(ii) avec la polyéthermonoamine de base correspondant à Z = CH3, x = 6, y = 29 (dans le commerce sous la marque Jeffamine ® M2005) modifiée par la réaction avec le chlorure de 6-bromohexanoyl :
· Polysaccharide = acide hyaluronique (HA) avec un taux de greffage compris entre 2% et 10% (molaire)
• Polysaccharide = alginate avec un taux de greffage de 5%
• Polysaccharide = diéthylaminoéthylpullulane (DEAE-pullulane) avec un taux de greffage de 10%
(iii) avec la polyéthermonoamine de base correspondant à Z = CH3, x = 1 , y = 9 (dans le commerce sous la marque Jeffamine ® M600) modifiée par la réaction avec le chlorure de 6-bromohexanoyl :
• Polysaccharide = acide hyaluronique (HA) avec un taux de greffage de 1 % (molaire)
(iv) avec la polyéthermonoamine de base correspondant à Z = H (pour EO) ou CH3 (pour PO), x = 6, y = 35 (dans le commerce sous la marque Jeffamine ® M2070) modifiée par la réaction avec le bromure de α-bromoisobutyryl :
· Polysaccharide = acide hyaluronique (HA) avec un taux de greffage de 18% (molaire).
Les meilleurs résultats en vue de l'utilisation comme hydrogel présentant des propriétés rhéologique thermosensibles avec une transition autour de la température corporelle normale (environ 37°) ont été atteints avec le HA greffé à raison de 3 à 10% molaires avec la polyéthermonoamine de base correspondant à Z = H (pour EO) ou CH3 (pour PO), x = 6, y = 35 (dans le commerce sous la marque Jeffamine ® M2070) modifiée par la réaction avec le chlorure de 6-bromohexanoyl.

Claims

REVENDICATIONS
Procédé de modification des polysaccharides, dans lequel :
(a) on fait réagir un polysaccharide avec une polyétheramine modifiée de type (X-R- C(0)NH)bR'
(où R' représente un polyéther et b = 1 , 2 ou 3 et X représente un halogène, de préférence Cl ou Br, R représente un reste alkyle, possiblement substitué, ou un reste aromatique, possiblement substitué),
en présence d'une base, de préférence en présence d'eau et d'isopropanol,
(b) on purifie le produit obtenu en présence de NaCI, au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée à un pH compris entre 9 et 13 (et de préférence entre 10 et 12) ;
(c) on purifie le produit issu de l'étape (b), au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée après neutralisation à un pH compris entre 6 et 8 (de préférence entre 6,5 et 7,5), éventuellement après lyophilisation et lavage du produit lyophilisé (de préférence à l'éthanol).
Procédé selon la revendication 1 ; dans lequel R représente un reste alkyle, possiblement substitué (de préférence un reste en Ci , C2 , C3, C4 , C5, C6, C7, C8, C9, C10 C11 ou C12), ou un reste aromatique (de préférence un reste phényle), possiblement substitué.
Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel ledit polyéther R' présente la structure suivante :
Figure imgf000028_0001
z
où Z est un atome hydrogène (dans le cas de l'oxyde d'éthylène) ou un méthyl (dans le cas de l'oxyde de propylène), et où, de manière préférée, x=1 à 3, Z=CH3 et y = 7 à 1 1 (avec x=1 et y=9 préféré) ; x=17 à 21 , Z=CH3 et y = 2 à 5 (avec x=19 et y = 3 préféré); x=5 à 8, Z=CH3 et y = 25 à 32 (avec x=6 et y=29 préféré),
• ladite polyétheramine ayant de préférence une masse molaire comprise entre environ 300 et environ 3000, et encore plus préférentiellement entre environ 500 et environ 2500, et/ou
• ladite polyétheramine présentant un rapport molaire de [oxyde de propylène] / [oxyde d'éthylène] compris entre 10/1 et 1/10. Procédé selon la revendication 3, dans lequel on active d'abord au moins une fonction carboxylique -COOH du polysaccharide 7>s à l'aide d'une aminé quaternaire, puis on ajoute ladite polyétheramine modifiée.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel au moins une étape de purification, et de préférence toutes les étapes de purification après neutralisation, est effectuée à une température inférieure à 20°C, de préférence comprise entre 0°C et 15°C, et encore plus préférentiellement entre 2°C et 8°C.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le produit issu de l'étape (c) est lyophilisé, lavé à l'éthanol et séché.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel ledit polysaccharide est sélectionné dans le groupe formé par les polysaccharides neutres (et notamment par le pullulane et le dextrane), les polysaccharides anioniques naturels (et notamment : alginate, acide hyaluronique, gomme xanthane, gomme d'agar agar, pectines, héparine), les polysaccharides anioniques de synthèse (et notamment : carboxyméthylcellulose, carboxyméthylpullunane), les polysaccharides cationiques naturels (et notamment le chitosane), les polysaccharides cationiques de synthèse (et notamment : diéthylaminoéthylcellulose, diéthylamoniéthyldextrane), les polysaccharides amphiphiles, les polysaccharides zwitterioniques naturels ou obtenus par modification chimique (et notamment le carboxyméthylchitosane), ou par des mélanges de ces polysaccharides,
et est de manière préférée sélectionné dans le groupe formé par le pullulan, le xanthane, l'alginate et l'acide hyaluronique.
Polysaccharide modifié susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
Hydrogel formé par au moins un polysaccharide selon la revendication 8 et un liquide aqueux, ledit liquide aqueux comprenant possiblement du sérum et/ou un milieu de culture de cellules.
10. Hydrogel selon la revendication 9, caractérisé en qu'il présente des propriétés rhéologies thermosensibles avec une température de transition comprise entre 33 et 39°C ou avec une température de transition comprise entre 4 et 20°C.
1 1 . Utilisation d'un hydrogel selon la revendication 9 ou 10 dans un milieu pour la culture cellulaire ou dans un milieu pour le transport de cellules.
12. Utilisation d'un hydrogel selon la revendication 9 ou 10 pour la préparation d'une composition destinée à être utilisé en tant que pansement cutanée, agent d'embolisation, agent de viscosupplémentation, agent de comblement, agent limitant l'adhésion post chirurgicale, ou agent de régénération tissulaire.
13. Procédé de préparation d'une polyétheramine modifiée de type (X-R-C(0)NH)bR' par réaction d'une polyétheramine (H2N)bR' avec un halogénure d'un acyle halogéné X- R-C(0)X, dans lequel :
(a) on approvisionne une polyétheramine (H2N)bR' (où R' représente un polyéther et b = 1 , 2 ou 3) et un halogénure d'acyle halogéné X-R-C(0)X (où X représente un halogène, de préférence Cl ou Br, R représente un reste alkyle, possiblement substitué, ou un reste aromatique, possiblement substitué),
(b) on mélange les deux réactifs en présence d'une base, de préférence E¾N et/ou NaOH, et laisse réagir le mélange, de préférence à une température inférieure à 35°C, de préférence inférieure à 20°C, et encore plus préférentiellement entre 0°C et 10°C, de préférence en l'absence de solvant (et de préférence en l'absence de DMF et THF).
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel on effectue à l'issue de l'étape (b) un lavage du milieu réactionnel à l'eau acidifiée.
15. Procédé selon la revendication 13 ou 14, dans lequel on conserve ladite polyétheramine modifiée en présence d'un alcool (de préférence isopropanol).
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, dans lequel ladite polyétheramine (H2N)bR' est une polyéthermonoamine présentant la structure suivante :
Figure imgf000030_0001
Z
où Z est un atome hydrogène, un reste méthyle ou un reste éthyle, et x et y sont des nombres entiers.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, dans lequel ladite polyétheramine présente une masse molaire comprise entre environ 300 et environ 3000, et encore plus préférentiellement entre environ 500 et environ 2500, et/ou ladite polyétheramine présente un rapport molaire de [oxyde de propylène] / [oxyde d'éthylène] compris entre 10/1 et 1/10.
18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel, x=1 à 7, Z=CH3 et y = 5 à 15 (avec x=1 à 3 et y=7 à 1 1 préféré), ou x=15 à 25, Z=CH3 et y = 1 à 9 (avec x = 17 à 21 et y = 2 à 5 préféré), ou x = 3 à 1 1 , Z=CH3 et y = 21 à 35 (avec x = 5 à 8 et y = 25 à 32 préféré).
19. Polyétheramine modifiée de type (X-R-C(0)NH)bR' susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 18. 20. Utilisation d'une polyétheramine modifiée selon la revendication 19 pour modifier un polysaccharide.
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