CA2954455A1 - Procede de modification de polysaccharides par greffage de polyetheramines, polysaccharides ainsi modifies et preparations les comportant et presentant des proprietes rheologiquesthermosensibles - Google Patents

Procede de modification de polysaccharides par greffage de polyetheramines, polysaccharides ainsi modifies et preparations les comportant et presentant des proprietes rheologiquesthermosensibles Download PDF

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Abstract

Procédé de modification des polysaccharides, dans lequel : (a) on fait réagir un polysaccharide avec une polyétheramine modifiée de type (X-R-C(O)NH)bR' (où R' représente un polyéther et b = 1, 2 ou 3 et X représente un halogène, de préférence Cl ou Br, R représente un reste alkyle, possiblement substitué, ou un reste aromatique, possiblement substitué), en présence d'une base, de préférence en présence d'eau et d'isopropanol, (b) on purifie le produit obtenu en présence de NaCI, au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée à un pH compris entre 9 et 13 (et de préférence entre 10 et 12); (c) on purifie le produit issu de l'étape (b), au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée après neutralisation à un pH compris entre 6 et 8 (de préférence entre 6,5 et 7,5), éventuellement après lyophilisation et lavage du produit lyophilisé (de préférence à l'éthanol).

Description

Procédé de modification de polysaccharides par greffage de polyétheramines, polysaccharides ainsi modifiés et préparations les comportant et présentant des propriétés rhéologiques thermosensibles Domaine technique de l'invention L'invention concerne la chimie organique, plus particulièrement la chimie des polysaccharides. Elle concerne plus précisément la modification de polysaccharides naturels ou synthétiques par greffage de polyétheramines. Elle concerne également l'utilisation de ces polysaccharides modifiés sous la forme d'un hydrogel comme milieu de culture de cellules. Ces préparations d'hydrogels peuvent présenter des propriétés rhéologiques thermosensibles, qui sont intéressantes pour leur utilisation intra-corporelle en médecine humaine et vétérinaire, pour la culture cellulaire et le transport d'échantillons biologiques (cellules, expiants, biopsies...).
Etat de la technique Un des polysaccharides les plus répandus dans le corps animal et humain est l'acide hyaluronique. Il peut être fabriqué à l'échelle industrielle par fermentation à l'aide de microorganismes (notamment Streptococcus equi). Ce produit d'origine biologique est un polysaccharide biocompatible et biodégradable, qui peut former des hydrogels.
Pour ces raisons des utilisations intracorporelles ont été recherchées pour ce produit, notamment en orthopédie. Ainsi, l'utilisation intracorporelle d'hydrogels d'acide hyaluronique (HA) pour le traitement de cartilages usés ou abîmés est bien connue ; le procédé
le plus connu est la viscosupplémentation (i.e. l'ajout de HA au liquide synovial, ou le remplacement total du liquide synovial par le HA). L'utilisation intracorporelle en dermatologie a également été envisagée.
Il est apparu l'idée de modifier chimiquement le HA. Cela permet de générer des hydrogels présentant des propriétés nouvelles et particulières. Cela est décrit en détail dans la publication Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis of derivatives fora broad range of biomecical applications par C.E. Schanté et al., parue dans la revue Carbohydrate Polymers, vol. 85, p. 469-489 (2011), dans la thèse de doctorat de Zied Souguir ( Fonctionnalisation de polysaccharides et étude de leurs propriétés 'pH dépendantes' ), Université de Rouen, 2006, et dans la thèse de doctorat de Kristoffer Bergman Hyaluronan Derivatives and Injectable Gels for Tissue Engineering , Upsala 2008.
Cependant, une telle modification chimique ne doit pas induire une toxicité, directe ou indirecte (i.e. par le biais des produits de décomposition au cours de la métabolisation de l'HA modifié), et ne doit pas nuire à la biodégradabilité du produit.
2 De nombreux brevets traitent de la modification chimique de HA et de l'utilisation de HA
modifié pour le traitement de pathologies des articulations. A titre d'exemple, EP
1 095 064 (Fidia) décrit un certain nombre de dérivés de HA. EP 2 457 574 Al (Fidia Andvanced Biopolymes) décrit la préparation de biomatériaux à partir de dérives des HA
qui sont des amides, et des essais de leur utilisation dans la viscosupplémentation. WO
2004/022603 (LG Life Sciences) décrit des polymères de HA réticulés avec des polymères à base de glycol, alors que KR 1007 37954 B1 (Korea University) décrit un dérivé acrylé de HA; ces deux documents envisagent l'utilisation intracorporelle des produits obtenus.
Le greffage de l'acide hyaluronique par de polyétheramines de type Jeffamine et par des poly(N-isopropylacrylamides) (PNIPAM) est connu de l'article Single step synthesis and characterization of thermoresponsive hyaluronan hydrogels par M. D'Este et al., paru dans la revue Carbohydrate Polymers 90 (2012), p. 1378-1385.
Certains de ces hydrogels de HA modifiés (fonctionnalisés) montrent des propriétés rhéologiques thermosensibles. Des applications intracorporelles pour la libération contrôlée de principes actifs ont été envisagées pour ces produits, voir par exemple les publications suivantes : Mee Ryang Kim et Tae Gwan Park, Temperature-responsive and degradable hyaluronic acid / Pluronic acid hydrogels for con trolled release of human growth hormone ,Journal of Controlled Release, vol. 80, p. 69-77 (2002) ;
T.R. Hoare et D.S.Kohane, Hydrogels in drug delivety : Progress and challenges", Polymer, vol. 49 (2008), p. 1993-2007; C.C.Chen et al., Transdermal delivery of selegiline from alginate-Pluronic composite thermogels , International J of Pharmaceutics, vol. 415 (2010), p.
119-128; S. Van Vlierberghe et al., Biopolymer-Based Hydrogels As Scaffolds for Tissue Engineering Applications : A Review , Biomacromolecules, 2011, 12, p. 1387-1408.
Il apparaît que le choix des molécules greffées sur le polysaccharide est critique pour les caractéristiques physico-chimiques du produit. Plus particulièrement, la demande de brevet EP 1 659 143 (Teijin) décrit des hydrogels thermosensibles d'acide hyaluronique et d'une polyétheramine secondaire à base d'oxyde de propylène (Jeffamine XTJ-507).
L'application visée est la régénération du cartilage. Selon l'enseignement de ce document, la zone de transition de viscosité s'étale sur une plage de température d'une largeur d'environ 15 C, ce qui est trop large pour une application en médecine.
Plusieurs publications suggèrent que le choix de la polyétheramine peut avoir une influence sur les propriétés physico-chimiques du produit. A titre d'exemple, l'article de G.
Mocanu et al., Multi-responsive carboxymethyl polysaccharide crosslinked hydrogels
3 containing Jeffamine side-chains paru dans Carbohydrate Polymers, vol. 89, p. 578-585 (2012) montre, pour un hydrogel contenant un polysaccharide autre que HA, une différence notable des propriétés thermosensibles entre les Jeffamines M-600 et M-2005 (deux produits qui se distinguent par leur rapport Oxyde de propylène /
Oxyde d'éthylène et leurs masse molaires). La publication Single step synthesis and characterization of thermoresponsive hyaluronan hydrogels par M. d'Este et al.
(Carbohydrate Polymers, vol. 90, p. 1378-1385 (2012)) montre pour un hydrogel de type HA ¨ Jeffamine que la Jeffamine M2005 ne conduit pas à une thermosensibilité
significative, alors que la thermosensibilité de l'hydrogel avec la Jeffamine M600 est perceptible mais assez faible.
On connaît également des hydrogels thermosensibles de chitosane modifié par acétylation ou désacétylation, voir US 2009/0004276 (Mor Research Applications Ltd). On sait par ailleurs que la modification de certains polysaccharides permet de préparer des hydrogels dont certaines propriétés dépendent du pH, voir la thèse citée de Zied Souguir et la publication de G. Mocanu et al., New anionic crosslinked multi-responsive pullulan hydrogels , parue dans Carbohydrate Polymers, vol. 87, p. 1440-1446 (2012).
Cependant, dans tous ces cas, la variation des propriétés de l'hydrogel en fonction de l'environnement biologique dans lequel il se trouve dans le cas d'une utilisation intra-corporelle, et notamment la variation de ses propriétés en fonction de la température, est assez faible et assez difficile à contrôler lors de la synthèse du produit.
Il existe clairement un besoin pour une nouvelle approche permettant de préparer une gamme plus large de polysaccharides modifiés, biocompatibles, non toxiques, susceptibles d'être utilisés de manière intra-corporelle, et notamment utilisables pour le transport et/ou la libération contrôlée de principes actifs et/ou de cellules, qui présentent des propriétés thermosensibles montrant une variation plus large et qui sont plus faciles à
contrôler lors de leur synthèse.
Objets de l'invention Selon l'invention le problème est résolu par une nouvelle voie de synthèse de polysaccharides modifiés par greffage de polyétheramines. La demanderesse s'est rendu compte que les polyétheramines disponibles ne permettaient pas de résoudre le problème, et qu'il fallait d'abord développer de nouvelles molécules de polyétheramines susceptibles d'être greffées sur un polysaccharide. Cela lui a permis ensuite de préparer de nouveaux polysaccharides modifiés par greffage desdites polyétheramines, ainsi que de nouvelles préparations à base de polysaccharides ainsi modifiés qui présentent des propriétés rhéologiques thermosensibles particulièrement intéressantes.
4 Ainsi un premier objet de l'invention est un procédé de modification des polysaccharides, dans lequel :
(a) on fait réagir un polysaccharide avec une polyétheramine modifiée de type (X-R-C(0)NH)bR' (où R' représente un polyéther et b = 1, 2 ou 3 et X représente un halogène, de préférence Cl ou Br, R représente un reste alkyle, possiblement substitué, ou un reste aromatique, possiblement substitué), en présence d'une base, de préférence en présence d'eau et d'isopropanol, (b) on purifie le produit obtenu en présence de NaCI, au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée à un pH

compris entre 9 et 13 (et de préférence entre 10 et 12);
(c) on purifie le produit issu de l'étape (b), au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée après neutralisation à un pH compris entre 6 et 8 (de préférence entre 6,5 et 7,5), éventuellement après lyophilisation et lavage du produit lyophilisé (de préférence à l'éthanol).
R représente avantageusement un reste alkyle, possiblement substitué (par exemple un reste en C1 , C2 , C3, C4 , C5, C6, C7, Cg, C9, C10 C11 OU C12), ou un reste aromatique (par exemple un reste phényle), possiblement substitué.
Dans un mode de réalisation ladite polyétheramine modifiée est une polyéthermonoamine dans laquelle le reste R' présente la structure suivante :
s=
x \
Y
où Z est un atome hydrogène (dans le cas de l'oxyde d'éthylène) ou un méthyle (dans le cas de l'oxyde de propylène), et où, de manière préférée, x=1 à 3, Z=CH3 et y = 7 à 11 (avec x=1 et y=9 préféré) ; x=17 à 21, Z=CH3 et y = 2 à 5 (avec x=19 et y = 3 préféré);
x=5 à 8, Z=CH3 et y = 25 à 32 (avec x=6 et y=29 préféré).
De manière avantageuse leadite polyétheramine R' présente une masse molaire comprise entre environ 300 et environ 3000, et encore plus préférentiellement entre environ 500 et environ 2500, et/ou ladite polyétheramine présentant un rapport molaire de [oxyde de propylène] /[oxyde d'éthylène] compris entre 10/1 et 1/10.
Dans un mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention on active d'abord au moins une fonction carboxylique Fs-COOH du polysaccharide Fg à l'aide d'une amine quaternaire, puis on ajoute ladite polyétheramine modifiée.

Pour permettre l'utilisation du polysaccharide modifié dans des utilisations pharmaceutique ou intracorporelles, le procédé selon l'invention peut comporter au moins une étape de purification, et de préférence toutes les étapes de purification après neutralisation, est effectuée à une température inférieure à 20 C, de préférence comprise
5 entre 0 C et 15 C, et encore plus préférentiellement entre 2 C et 8 C.
Dans le procédé de modification des polysaccharides selon l'invention, le produit issu de l'étape (c) peut être est lyophilisé, lavé à l'éthanol et séché.
Avantageusement, en vue de son utilisation dans un hydrogel, ledit polysaccharide est sélectionné dans le groupe formé par les polysaccharides neutres (et notamment par le pullulane et le dextrane), les polysaccharides anioniques naturels (et notamment :
alginate, acide hyaluronique, gomme xanthane, gomme d'agar agar, pectines, héparine), les polysaccharides anioniques de synthèse (et notamment :
carboxyméthylcellulose, carboxyméthylpullunane), les polysaccharides cationiques naturels (et notamment le chitosane), les polysaccharides cationiques de synthèse (et notamment :
diéthylaminoéthylcellulose, diéthylamoniéthyldextrane), les polysaccharides amphiphiles, les polysaccharides zwitterioniques naturels ou obtenus par modification chimique (et notamment le carboxyméthylchitosane), ou par des mélanges de ces polysaccharides. On préfère particulièrement le pullulan, le xanthane, l'alginate et l'acide hyaluronique.
Un autre objet de l'invention est un polysaccharide modifié susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.
Encore un autre objet de l'invention est un hydrogel formé par au moins un polysaccharide modifié selon l'invention et un liquide aqueux. Ledit liquide aqueux peut comprendre du sérum et/ou un milieu de culture de cellules.
Dans un mode de réalisation, l'hydrogel selon l'invention présente avantageusement des propriétés rhéologies thermosensibles avec une température de transition comprise entre 33 et 39 C. Dans un autre mode de réalisation il présente des propriétés rhéologies thermosensibles avec une température de transition comprise entre 4 et 20 C.
Encore un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un hydrogel selon l'invention dans un milieu pour la culture cellulaire ou dans un milieu pour le transport de cellules.
Encore un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un hydrogel selon l'invention pour la préparation d'une composition destinée à être utilisé en tant que pansement cutanée,
6 agent d'embolisation, agent de viscosupplémentation, agent de comblement, agent limitant l'adhésion post chirurgicale, ou agent de régénération tissulaire.
Lesdits polyétheramines modifiées de type (X-R-C(0)NH)bR' qui sont utilisées dans le procédé de modification de polysaccharides selon l'invention n'existent pas dans l'état de la technique, et peuvent être préparées par un nouveau procédé de préparation d'une polyétheramine modifiée de type (X-R-C(0)NH)bR' par réaction d'une polyétheramine (H2N)bR' avec un halogénure d'un acyle halogéné X-R-C(0)X, dans lequel :
(a) on approvisionne une polyétheramine (H2N)bR' (où R' représente un polyéther et b = 1, 2 ou 3) et un halogénure d'acyle halogéné X-R-C(0)X (où X représente un halogène, de préférence Cl ou Br, R représente un reste alkyle, possiblement substitué, ou un reste aromatique, possiblement substitué), (b) on mélange les deux réactifs en présence d'une base, de préférence Et3N
et/ou NaOH, et laisse le mélange réagir à une température inférieure à 35 C, de préférence inférieure à 25 C, encore plus préférentiellement inférieure à 20 et de manière optimale entre 0 C et 10 C, de préférence en l'absence de solvant (et de préférence en l'absence de DMF et THF).
La réaction se déroule selon le schéma suivant :
X-R-C(0)X + (H2N)b-R' ---> (X-R-C(0)NH)bR' où b est égal à 1, 2 u 3, où X représente un halogène (de préférence Cl ou Br) ; R
représente un reste alkyle, possible substitué (par exemple un reste en C6), ou un reste aromatique (par exemple un reste phényle), possible substitué (mais la fonctionnalisation du reste aromatique n'est pas préférée) ; et R' représente un polyéther, de préférence de type PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y. La polyétheramine peut être une polyéthermonoamine (avec b = 1), ou une polyétherdiamine (avec b = 2), ou une polyéthertriamine (avec b=3).
On utilise de préférence des amines primaires.
La réaction se déroule en présence d'une base, de préférence Et3N et/ou NaOH
qui capte le HX résultant de la réaction.
La réaction est effectuée avantageusement et à une température inférieure à 20 C, de préférence comprise entre 0 C et 10 C.
A l'issue de l'étape (b) on peut effectuer un lavage du milieu réactionnel à
l'eau acidifiée.
La polyétheramine modifiée obtenue par ce procédé peut être conservée en présence d'un alcool (de préférence isopropanol).
7 D'une manière générale, pour la fabrication des polysaccharides modifiées par greffage de polyétheramines on préfère les polyéthermonoamines H2N-R', et en particulier celles qui présentent la structure suivante :
e .ex= , /
Z.1 où Z1 est un atome hydrogène (dans le cas de l'oxyde d'éthylène) ou un méthyle (dans le cas de l'oxyde de propylène), ou encore un éthyle ou propyle, et x et y indiquent la longueur des chaînes, sachant que pour une molécule donnée, x et y sont des nombres entiers, mais sur un produit donné tel qu'il sera utilisé (qui peut comporter des molécules dont la longueur peut ne pas être identique) x et y représentent des valeurs moyennes.
Dans un mode de réalisation la masse molaire des polyétheramines utilisables peut varier entre environ 300 et environ 3000, et on préfère une plage comprise entre 500 et 2500.
Le rapport molaire de PO/E0 peut varier dans des limites assez larges, par exemple entre 10/1 et 1/10.
Mais on peut également utiliser des polyétherdiamines, et en particulier celles qui présentent la structure suivante :

0 /x É É
ou la structure suivante :
H2N,õ
\y-s ro¨yf Ne42 x É É
où Z1, x et y ont la signification indiquée ci-dessus, et z représente, comme x et y, et comme cela est expliqué ci-dessus, la longueur de la chaîne.
8 On peut également utiliser des polyéthertriamines, et en particulier celles qui présentent la structure suivante :
CH
y-SH2 e H2Nsis, 4,NH2 X f z2 où Z1, x et y ont la signification indiquée ci-dessus, et z représente, comme x et y, et comme cela est expliqué ci-dessus, la longueur de la chaîne. Z2 est hydrogène ou un alkyle en C1 à C4, de préférence méthyle ou éthyle. Le nombre n peut compris entre 0 et 12, et est de préférence 0, 1 ou 2.
Ladite polyétheramine présente avantageusement une masse molaire comprise entre environ 300 et environ 3000, et encore plus préférentiellement entre environ 500 et environ 2500. Dans le cas ou ladite polyétheramine est un mélange d'oxyde de propylène et d'oxyde de éthylène, ladite polyétheramine présente avantageusement un rapport molaire de [oxyde de propylène] /[oxyde d'éthylène] compris entre 10/1 et 1/10.
Dans un mode de réalisation avantageux, et en particulier pour les polyéthermonoamines, on choisit x=1 à 7, Z=CH3 et y = 5 à 15 (avec x=1 à 3 et y=7 à 11 préféré).
Dans un autre mode de réalisation avantageux on choisit x=15 à 25, Z=CH3 et y = 1 à 9 (avec x = 17 à
21 et y = 2 à 5 préféré). Dans encore un autre mode de réalisation avantageux on choisit x = 3 à 11, Z=CH3 et y = 21 à 35 (avec x = 5 à 8 et y = 25 à 32 préféré). Ces modes de réalisation avantageux sont établis en vue de l'utilisation des polyétheramines modifiées qui résultent du procédé selon l'invention.
Ce nouveau procédé de synthèse de polyétheramines modifiées tel que décrit ci-dessus représente un autre objet de la présente invention.
Un autre objet de l'invention sont des polyétheramines modifiées de type (X-R-C(0)NH)bR' (avec b = 1, 2 ou 3) susceptibles d'être obtenues par le procédé
selon l'invention. Ces polyétheramines modifiées sont des produits intermédiaires de synthèse intéressants pour la préparation de polysaccharides modifiés, et notamment tel que décrit ci-dessus.
9 Ainsi, un dernier objet de l'invention est l'utilisation d'une polyétheramine modifiée selon l'invention pour modifier un polysaccharide.
Description des figures Les figures 1 à 6, 8 et 9 illustrent différents aspects de l'invention, la figure 7 concerne l'état de la technique.
Les figures 1 et 2 se rapportent à un essai de modification d'une polyétheramine de type Jeffamine M2005 par réaction avec un halogénure d'un acyle halogéné. L'axe vertical représente l'intensité normalisée.
La figure 1 montre le Spectre 1H RMN (dans CDCI3) de la polyétheramine modifiée.
La figure 2 montre les spectres infrarouge (FT-IR) : la courbe (a) correspond à la polyétheramine de départ, la courbe (b) à la polyétheramine modifiée.
Les figures 3 à 5 se rapportent à un essai de greffage d'un polysaccharide (en l'occurrence l'acide hyaluronique) avec une polyétheramine de type Jeffamine qui a été préalablement modifiée par réaction avec un halogénure d'un acyle halogéné (et qui est le même que celui des figures 1 et 2).
La figure 3 montre le spectre 1H RMN (dans D20) d'un acide hyaluronique (HA) greffé par la polyétheramine modifiée.
Les figures 4 et 5 montrent la variation des modules de conservation (module élastique) G' (.) et de perte (module visqueux) G"(Y ) du HA greffé en fonction de la température :
la concentration de HA greffé est de 40g11 dans le milieu de culture RPMI
(figure 4) ou de 20 g/I (figure 5). On note la transition sol ¨ gel réversible pour une température inférieure à 37 C (environ 29 C pour la figure 4, environ 34 C pour le figure 5).
Les figures 6 à 9 se rapportent à des essais décrits en grand détail dans la section Exemples .
La figure 6 montre l'absorbance UV en fonction de la température pour un polysaccharide (en l'occurrence HA) greffé par une polyétheramine de type Jeffamine M2005 qui avait été préalablement modifiée par l'action du 2-Bromo-2-méthylpropionylbromure (réaction de Williamson). La figure représente une mesure effectuée sur le mélange réactionnel.
Les figures 7 et 8 comparent la variation des modules de conservation (module élastique) G' (courbe A) et de perte (module visqueux) G" (courbe B) en fonction de la température pour l'acide hyaluronique non greffé (figure 7) et pour l'acide hyaluronique greffé (taux de greffage : 2% molaires) par une polyétheramine de type Jeffamine M2005 qui avait été préalablement modifiée par l'action du 2-Bromo-2-méthylpropionylbromure (réaction d'estérification) (figure 8). Dans les deux cas, la concentration de HA (greffé ou non) était de 40 g/I dans le milieu de culture RPMI.
La figure 9 montre des courbes DSC (calorimétrie différentielle par balayage, en anglais Differential Scanning Calorimetry ) pour un échantillon d'hydrogel de HA
greffé par une 5 polyétheramine de type Jeffamine M2005 qui avait été préalablement modifiée par l'action du 2-Bromo-2-méthylpropionylbromure (réaction d'estérification) ; ces hydrogels ont été formés avec un milieu de culture cellulaire de type RPMI.
Courbe A: Hydrogel de HA greffé par une Jeffamine modifiée.
Courbe B : Jeffamine modifiée (à titre de comparaison).
10 Courbe C : Jeffamine M2005 (à titre de comparaison).
Description détaillée de l'invention Les polysaccharides modifiés selon l'invention qui donnent les meilleurs résultant étant modifiés par greffage de dérivés de polyétheramines qui ne sont pas disponibles dans le commerce, on décrit ici d'abord une méthode générale (section A) pour obtenir des polyétheramines modifiées qui sont susceptibles d'être greffés sur des polysaccharides, puis on décrit deux méthodes (sections B et C) de greffage par estérification du polysaccharide permettant d'obtenir des polysaccharides à propriétés rhéologiques thermosensibles. Ces deux méthodes donnent sensiblement les mêmes produits. Et enfin on décrit (section D) l'utilisation de ces produits.
A) Modification de polyétheramine par réaction avec un halogénure d'un acyle halogéné
Cette réaction se déroule selon le schéma suivant :
X-R-C(0)X + (H2N)b-R' ---> (X-R-C(0)NH)bR' où b est égal à 1, 2 ou 3, où X représente un halogène (de préférence Cl ou Br) ; R
représente un reste alkyle, possiblement substitué (par exemple un reste en C1 , C2, C3, C4 , C5, C6, C7, Cg, Cg, C10 C11 OU C12), ou un reste aromatique (par exemple un reste phényle), possiblement substitué (mais la fonctionnalisation du reste aromatique n'est pas préférée) ; et R' représente un polyéther, de préférence de type PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y. La polyétheramine peut être une polyéthermonoamine (avec b = 1), ou une polyétherdiamine (avec b = 2), ou une polyéthertriamine (avec b=3). On utilise de préférence des amines primaires.
La réaction se déroule en présence d'une base, de préférence Et3N et/ou NaOH, qui capte le HX résultant de la réaction. La température est inférieure à 35 C, de préférence inférieure à 25 C, et encore plus préférentiellement inférieure à 20 C, et de manière optimale comprise entre 0 C et 10 C ; une température d'environ 4 C convient.
11 De manière préférée la réaction de la polyétheramine H2N-R' avec l'halogénure d'un acyle halogéné X-R-C(0)X s'effectue sans solvant. Après la réaction, le mélange est purifié par simple lavage à l'eau acide : ce lavage enlève l'amine non réagie et l'acide HX (ou son sel) qui résulte de la réaction.
Le schéma suivant montre un mode de réalisation avantageux de cette réaction utilisant une polyéthermonoamine :
0 Et3N ou NaOH 0 X¨R
+ H2N ¨R' ___________________________________________ - X¨R
./( X

X: Halogène (Cl, Br,...) R: alkyle, aromatique,...
R': PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y On peut également utiliser une polyétherdiamine :
0 Et3N ou NaOH 0 X¨R + H2N ¨W-NH2 _____________________ X¨R __ =/( H
X 4 C N¨W¨N
H R¨X
X: Halogène (Cl, Br,...) 0 R: alkyle, aromatique,...
R": PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y On peut également utiliser une polyéthertriamine :
C) 0 NH Et3N ou NaOH 0 7 R¨X

X¨R + H2N ¨R¨NH2 _____________________ X¨R ___ =/( NH
X 4 C N¨R"H
H N
X: Halogène (Cl, Br,...) R¨X

R: alkyle, aromatique,...
R: PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y PPO signifie ici polypropylène oxyde et PEO signifie polyéthylène oxyde, et le (PEO)x-co-(PPO)y est un copolymère entre PO (propylène oxyde) et EO (éthylène oxyde). Le sigle Et3N signifie triéthylamine.
12 Comme polyétheramine H2N-R' ou R"(NH2)2 ou R¨(NH2)3 on peut utiliser notamment des produits disponibles sous la marque Jeffamine , et en particulier les produits Jeffamine M600, Jeffamine M2005, Jeffamine M2070, Jeffamine D2000...). Tous ces produits sont des liquides, et la réaction peut se dérouler sans solvant ; en règle générale le produit X-R-C(0)NHR' obtenu présente une viscosité plus grande que la polyétheramine H2N-R' de départ. La même remarque s'applique aux polyétherdiamines et polyéthertriamines.
L'absence de solvant (tel que: DMF, THF) pour la réaction a plusieurs avantages : ces solvants sont coûteux, et ils sont toxiques et doivent ensuite être éliminés du produit car il faut éviter de contaminer le produit avec des molécules qui risquent de gêner pour son usage final (qui peut être un usage en culture cellulaire ou même un usage intracorporel).
Le produit peut être conservé dans l'isopropanol (sous la forme de solution), ce solvant étant choisi en fonction de l'usage ultérieur du produit. Le produit peut être caractérisé par spectroscopies RMN et Infrarouge pour démontrer son identité et sa pureté.
Ce procédé selon l'invention présente de nombreux avantages. Il donne accès à
un large spectre de polyétheramines modifiées, avec une bonne pureté. Il peut être effectué sans solvants organiques (tels que le DMF, THF) qui pourraient être susceptibles, même à
l'état de traces, de gêner l'utilisation des polyétheramines selon l'invention pour la préparation de polysaccharides modifiés destinés à une utilisation pharmaceutique ou intracorporel le.
Nous décrivons maintenant l'utilisation des polyétheramines modifiées selon l'invention afin de démontrer l'application industrielle de cette nouvelle classe de composés comme intermédiaires de synthèse, et en particulier dans le but d'obtenir des polysaccharides modifiés présentant des propriétés physiques, physico-chimques et chimiques variées et intéressantes pour une utilisation en pharmacie, biologie cellulaire ou médecine.
B) Modification de polysaccharides par la réaction de Williamson Cette méthode vise à greffer la polyétheramine modifiée, susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, et obtenue notamment par l'exemple selon l'étape 1 décrite ci-dessus, sur un polysaccharide pour obtenir notamment des polysaccharides à
propriétés rhéologiques thermosensibles. Une méthode alternative est présentée ci-dessous (méthode C).
13 La réaction comprend le greffage d'une polyétheramine modifiée de type (X-R-C(0)NH)bR' (par exemple une polyéthermonoamine modifiée de type X-R-C(0)NHR', ou une polyétherdiamine modifiée de type (X-R-C(0)NH)2R', ou encore une polyéthertriamine modifiée de type (X-R-C(0)NH)3R') sur un groupement ¨OH d'un polysaccharide (Fs -OH), ce qui conduit à un polysaccharide modifié de type (Fs -0-R-C(0)NH)bR', (dans le cas d'une polyéthermonoamine modifiée le polysaccharide modifié
peut être de type Fs -0-R-C(0)NHR', dans le cas d'une polyétherdiamine modifiée le polysaccharide modifié peut être de type (Fs -0-R-C(0)NH)2R', et dans le cas d'une polyéthertriamine modifiée le polysaccharide modifié peut être de type (Fs -0-R-C(0)NH)3R'), dans lequel l'atome d'oxygène qui constitue le point de greffage entre le polysaccharide et le greffon provient du groupement OH du polysaccharide.
Dans ce schéma réactionnel les symboles X, R et R' ont la même signification que celle décrite en relation avec la méthode A ci-dessus.
La réaction se déroule de préférence dans un mélange d'eau et d'isopropanol, en employant directement le produit de la méthode A décrite ci-dessus.
Le schéma suivant montre un mode de réalisation avantageux de cette réaction:
Polysaccharide OH + X R Polysaccharide 0 H20/Isopropanol ,0 H R
NaOH
X: Halogène (Cl, Br,...) 70 C H
R: alkyle, aromatique,...
PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y Les analyses physicochimiques réalisés dans un milieu de culture cellulaire (RPMI) par des mesures rhéologiques, des modules de conservation (G') et modules de perte (G") en fonction de la température pour deux concentrations (40 et 20 g/1) montrent la transition sol gel réversible pour des températures inferieurs à 37 C.
C) Modification de polysaccharides par estérification Cette méthode vise à greffer la polyétheramine modifiée, susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, obtenue par exemple selon l'étape 1 décrite ci-dessus, sur un polysaccharide pour obtenir notamment des polysaccharides à propriétés rhéologiques thermosensibles. Il s'agit d'une alternative à la méthode B présentée ci-dessus.
14 La réaction comprend l'activation de la fonction carboxylique Fs-COOH d'un polysaccharide Fs à l'aide d'un amine quaternaire, et de préférence du tetrabutylamine (TBA), conduisant à une fonction Fs-000- , suivi du greffage d'une polyétheramine modifié de type (X-R-C(0)NH)bR' sur ledit groupement ¨000- du polysaccharide, ce qui conduit à un polysaccharide modifié de type (S-000-R-C(0)NH)b R', dans lequel l'atome d'oxygène qui constitue le point de greffage entre le polysaccharide et le greffon provient du groupement COOH du polysaccharide.
Dans ce schéma réactionnel les symboles X, R et R' ont la même signification que celle décrite en relation avec la méthode A ci-dessus.
La réaction se déroule de préférence dans un mélange d'eau et d'isopropanole, en employant directement le produit de la méthode A décrite ci-dessus. On préfère une température au-dessus de 25 C, de préférence comprise entre 40 C et 95 C, et encore plus préférentiellement entre 55 C et 90 C, une température d'environ 70 C
convient bien.
Le schéma suivant montre un mode de réalisation avantageux de cette réaction:
OH- rN\._ Polysaccharide ________ +Polysaccharide _______________________ * r--' X: Halogène (Cl, Br,...) R: alkyle, aromatique,...
H20/Isopropanol x¨R _______________________________________________ /(0 R': PEO, PPO ou (PEO)x-co-(PPO)y N¨R' H

Polysaccharide _____________ 0 R __ =/K
N¨R' H
Remarques communes aux méthodes B et C:
a) Purification Le produit de la réaction issu de la méthode B ou C doit être purifié s'il est destiné à un usage intracorporel. Cette purification se fait avantageusement en présence de NaCI et en au moins deux étapes qui se distinguent par leur pH.

Une première étape de purification est effectuée à un pH compris entre 9 et 13 (de préférence entre 10 et 12, et encore plus préférentiellement environ 11), de préférence au moins en partie (et possiblement dans sa totalité) par une méthode de séparation 5 membranaire telle que la diafiltration. C'est à ce pH que les molécules de polyétheramine non réagies (i.e. qui n'ont pas été greffés sur le polysaccharide) sont éliminées, probablement par neutralisation des fonctions ammonium quaternaires de la polyétheramine et élimination des liaisons ioniques entre l'ammonium de la polyétheramine et le carboxylate du polysaccharide ; la polyétheramine non réagie 10 présente en général une toxicité cellulaire qui gêne pour l'utilisation ultérieure de l'hydrogel en culture cellulaire, et qui serait en tous cas inacceptable pour l'utilisation intracorporelle de l'hydrogel.
Une deuxième étape de purification est effectuée après neutralisation, de préférence à un
15 pH d'environ 7, qui est en règle générale le pH auquel l'hydrogel sera utilisé
ultérieurement, que ce soit en culture cellulaire ou pour des applications intracorporelles.
Cette deuxième étape de purification peut également être faite, partiellement ou en totalité, par une méthode de séparation membranaire telle que la diafiltration, ou par une autre technique appropriée. Cette deuxième étape à pH neutre peut être faite après lyophilisation (la poudre étant ensuite lavée à l'éthanol pour enlever des restes de polyétheramines libres et d'autres sous-produits).
La séparation membranaire peut être effectuée de manière connue, par exemple avec des membranes présentant une valeur de MWCO ( molecular weight cut-off ) d'environ 10 kDa à 30 kDa, par exemple entre 12 kDa à 14 kDa en mode boudin. La dialyse peut être faite contre de l'eau et/ou contre un mélange d'eau et d'éthanol (par exemple avec le rapport volume : eau 2/3, éthanol 1/3). On observe une baisse du pH au cours de la dialyse.
Selon un aspect très avantageux de l'invention au moins une étape de purification (et préférentiellement au moins toutes les étapes de purification avant la neutralisation, et encore plus préférentiellement aussi au moins une (et de préférence toutes) les étapes de purification après neutralisation) est (sont) effectuée(s) à une température inférieure à
20 C, de préférence comprise entre 0 C et 15 C, et encore plus préférentiellement entre 2 C et 8 C, notamment à une température d'environ 4 C.
En effet, la demanderesse a observé qu'à la température ambiante le mélange réactionnel est trouble et tend à former des agrégats à température ambiante qui gênent
16 la purification ; or, l'obtention d'un produit pur est nécessaire pour toute utilisation intracorporelle de l'hydrogel. En revanche, le produit selon l'invention, purifié à basse température comme indiqué ci-dessus, est translucide après gélification, contrairement à
de nombreux hydrogels de polysaccharide de l'état de la technique.
La demanderesse tend à penser (sans vouloir être enfermée par cette théorie) que la polyétheramine non modifiée (libre) participe à la formation desdits agrégats dans lesquels il pourrait se trouver emprisonné, puisque les agrégats disparaissent après une purification suffisante de l'hydrogel.
La demanderesse a trouvé qu'en dehors de la toxicité de la polyétheramine résiduelle (non-réagie, libre), il existe une autre raison pour purifier au mieux le polysaccharide modifié par greffage d'une polyétheramine : la présence de polyétheramine libre dans les hydrogels qui montrent une variation de la viscosité en fonction de la température conduit à un gradient de la viscosité plus faible et étalé sur une plage de température plus large comparé à un hydrogel purifié.
Le produit purifié est congelé (par exemple à -20 C) et lyophilisé, puis lavé
à l'éthanol (par exemple deux fois) et séché (de préférence à 40 C sous vide).
Le produit final se présente sous la forme d'une poudre sèche. Il peut être transformé en hydrogel en le dispersant dans une quantité voulue d'un milieu aqueux. Ledit milieu aqueux peut être un milieu de culture cellulaire. A titre d'exemple on peut utiliser les milieux de culture connus sous le sigle RPMI (Roswell Park Memorial lnstitute). Le milieu aqueux peut comprendre des additifs, tels que des facteurs de croissance et/ou des principes pharmaceutiquement actifs (tels que des antibiotiques), et du sérum.
b) Polysaccharides utilisables Dans le cadre de la présente invention, différents types de polysaccharides peuvent être utilisés pour être modifiés par greffage selon la méthode B ou selon la méthode C. Ces polysaccharides peuvent appartenir aux groupes des polysaccharides neutres (par exemple pullulane, dextrane), des polysaccharides anioniques naturels (par exemple :
alginate, acide hyaluronique, gomme xanthane, gomme d'agar agar, pectines, héparine), des polysaccharides anioniques de synthèse (par exemple carboxyméthylcellulose, carboxyméthylpullunane), des polysaccharides cationiques naturels (notamment le chitosane), des polysaccharides cationiques de synthèse (par exemple diéthylaminoéthylcellulose, diéthylamoniéthyldextrane), des polysaccharides amphiphiles, des polysaccharides zwitterioniques naturels ou obtenus par modification chimique (par exemple carboxyméthylchitosane).
17 Les polysaccharides de type pullulan, xanthane, alginate, acide hyaluronique (ce dernier étant abrégé HA) sont les polysaccharides particulièrement préférés pour préparer des polysaccharides greffés à propriétés rhéologiques thermosensibles. Des tests en culture cellulaire à différentes concentrations montrent la non-toxicité de ces produits ainsi que la prolifération des cellules dans ces systèmes.
Par ailleurs, ces polysaccharides sont biocompatibles et biodégradables.
A titre d'exemple, on peut utiliser l'acide hyaluronique (HA), qui présente une biocompatibilité bien connue. On peut utiliser un HA d'origine bactérienne (Streptococcus equi) qui est dans le commerce avec une masse molaire en nombre qui varie typiquement de 103 à plus de 106 g/mol (déterminée par chromatographie d'exclusion stérique, diffusion de la lumière multi-angle et réfractométrie).
c) Taux de greffage Le procédé selon l'invention permet d'obtenir des taux de greffage élevés, qui peuvent atteindre 20% molaires. La demanderesse ne connaît aucun procédé connu qui permet d'obtenir des taux de greffage si élevés. Pour l'utilisation des produits comme polysaccharides à propriétés rhéologiques thermosensibles on préfère un taux de greffage compris entre 5% et 20% molaire, de préférence entre 5% et 15%, et encore plus préférentiellement entre 10% et 15%. En effet, dans certains systèmes greffés, au-delà de 15 à 20% l'effet de thermosensibilité des propriétés rhéologiques tend à
diminuer.
d) Choix des polyétheramines Les polyéthermamines préférées dans le cadre de la présente invention (et la présente section Choix des polyétheramines concerne les méthodes A, B et C) sont des copolymères de type polyéthers composés d'oxyde de propylène (PO) et d'oxyde d'éthylène (EO). La présence de ces oxydes de propylène rend la macromolécule hydrophobe et thermosensible, entraînant en solution aqueuse une précipitation en fonction de la température. La température de cette transition dépend entre autres de la quantité relative PO/EO.
Les polyétheramines utilisées dans la présente invention sont de préférence des amines primaires.
18 D'une manière générale (et en particulier pour les méthodes B et C) on préfère les polyéthermonoamines, et en particulier celles qui présentent la structure suivante :
/
H= ¶O' \.^.(1 X
OU Z1 est un atome hydrogène (dans le cas de l'oxyde d'éthylène) ou un méthyl (dans le cas de l'oxyde de propylène) et x et y indiquent la longueur des chaînes, sachant que pour une molécule donnée, x et y sont des nombres entiers, mais sur un produit donné tel qu'il sera utilisé (qui peut comporter des molécules dont la longueur peut ne pas être identique) x et y représentent des valeurs moyennes.
La masse molaire des polyétheramines utilisables peut varier entre environ 300 et environ 3000, et on préfère une plage comprise entre 500 et 2500. Le rapport molaire de PO/E0 peut varier dans des limites assez larges, par exemple entre 10/1 et 1/10.
A titre d'exemple, on peut utiliser les polyéthermonoamines suivantes :
x=1 à 3, Z1=CH3 et y = 7 à 11 (avec x=1 et y=9 préféré) ; x=17 à 21, Z1=CH3 et y = 2 à 5 (avec x=19 et y = 3 préféré); x=5 à 8, Z1=CH3 et y = 25 à 32 (avec x=6 et y=29 préféré).
Mais on peut également utiliser des polyétherdiamines, et en particulier celles qui présentent la structure suivante :
ii2N4 z1 z1 ou la structure suivante :
z1 z1 z1 o Y
où Z1, x et y ont la signification indiquée ci-dessus, et z représente, comme x et y, et comme cela est expliqué ci-dessus, la longueur de la chaîne.
19 On peut également utiliser des polyéthertriamines, et en particulier celles qui présentent la structure suivante :

r( ., ,....õ, , H2N,,,e tr CY7 ... .e., où Z1, x et y ont la signification indiquée ci-dessus, et z représente, comme x et y, et comme cela est expliqué ci-dessus, la longueur de la chaîne. Z2 est hydrogène ou un alkyle en C1 à C4, de préférence méthyle ou éthyle. Le nombre n peut compris entre 0 et 12, et est de préférence 0, 1 ou 2.
On peut utiliser par exemple les polyéthermonoamines commercialisées sous la marque Jeffamine (série M), ou les polyétherdiamines commercialisées sous la marque Jeffamine (série D, ED), ou encore les polyéthertriamines commercialisése sous la marque Jeffamine (série T), par la société Huntsman.
D) Utilisation d'hydrogels de polysaccharides modifiés par greffage selon l'invention Les hydrogels de polysaccharides modifiés par greffage selon l'invention peuvent être utilisés en biologie et médecine, de manière extracorporelle ou de manière intracorporelle.
Ces hydrogels peuvent être préparés avec de l'eau ou avec des liquides aqueux, tels que : les solutions aqueux tamponnées, le sérum physiologique, les milieux de culture cellulaire usuels ou spécifiques.
Ces utilisations en biologie et en médecine sont rendues possibles grâce à la possibilité
de purifier les polysaccharides modifiés selon l'invention de manière très efficace, afin d'éliminer tout résidu toxique. Certaines utilisations, notamment intra-corporelles, sont également rendues possibles grâce à la rhéologie des polysaccharides modifiés selon l'invention (orthopédie, cosmétologie (par exemple comblement de rides, dermatologie).
Les utilisations extracorporelles comprennent l'utilisation en tant que milieu de culture de cellules, notamment animales ou humaines, ou l'utilisation dans une composition de milieu de culture de cellules, notamment animales et humaines. Ces hydrogels peuvent être notamment aussi utilisés dans des systèmes microfluidiques. Elles comprennent également l'utilisation comme milieu (ou dans une composition de milieu) de stockage et/ou de transport de cellules, de biopsies ou d'expiants, notamment de cellules animales ou humaines. Les hydrogels selon l'invention présentent un réseau tridimensionnel qui accueille les cellules à cultiver dans des conditions propices à leur croissance et multiplication.
5 Les utilisations intracorporelles comprennent l'utilisation comme pansement cutanée, agent d'embolisation, agent de viscosupplémentation, agent de comblement, agent limitant l'adhésion post chirurgicale, comme agent de régénération tissulaire, ou dans la composition de tels agents.
10 Ces applications permettent en particulier de tirer profit des propriétés thermosensibles de l'hydrogel selon l'invention.
Nous décrivons ici une utilisation typique d'un hydrogel de polysaccharide modifié avec propriétés rhéologiques thermosensibles selon l'invention. Pour son utilisation comme 15 milieu de culture cellulaire tridimensionnelle, on solubilisé l'hydrogel dans le milieu de culture des cellules, et on dépose les cellules dans le gel thermosensible à
température ambiante. Lors de l'augmentation en température (passage à 37 C, température de l'incubateur) du système, les cellules seront séquestrées à l'intérieur de l'hydrogel. Une des caractéristiques importantes du thermosensible est sa transparence optique lorsque
20 le système est sous forme de gel, permettant une analyse microscopique.
Les cellules pourront alors se développer en suspension à l'intérieur du système et proliférer dans ce système. Lors d'une nouvelle transition à température ambiante les cellules pourront être récupérées et analysées.
L'hydrogel à propriétés rhéologiques thermosensibles est utilisable aussi pour transporter les cellules (souches, primaires et lignées) ou les prélèvements (tels que des biopsies) à
une température d'environ 37 C. En effet, ces échantillons précieux subissent lors du transport des chocs dû aux secousses et arrivent souvent altérées. L'hydrogel à
propriétés rhéologiques thermosensibles permet alors de limiter l'impact de ces secousses dû à la manutention des envois en séquestrant les cellules ou prélèvements (tels que les biopsies) à l'intérieur de l'hydrogel. Une fois l'échantillon réceptionné par son destinataire, il suffira d'une transition à température ambiante pour liquéfier le milieu et récupérer ainsi facilement les cellules ou prélèvements qu'il contient.
L'hydrogel à propriétés rhéologiques thermosensibles peut également être utilisé en médecine régénérative, par exemple lors de la régénération d'un cartilage.
Actuellement, une des principales techniques utilisées pour la régénération du cartilage est la micro fracture. Le praticien effectue sur un patient atteint d'une lésion de grade III ou IV un
21 poinçonnement de l'os sous-jacent du cartilage. Ces poinçonnements entraînent un épanchement sanguin contenant des cellules souches. Ces cellules souches ont la capacité de régénérer le cartilage. Cependant, un problème de cette technique est que les cellules ne restent pas toujours sur le site lésé et se dispersent.
L'injection d'un hydrogel à propriétés rhéologiques thermosensibles chargés de sang comportant des cellules souches (ou d'un autre milieu biologique, enrichi en cellules souches ou contenant des cellules souches) lors de la microfracture permettrait de localiser les cellules sur le site de la lésion et de favoriser la régénération du cartilage.
E) Avantages de l'invention L'utilisation de polyétheramines modifiées selon l'invention comme greffon permet d'obtenir des polysaccharides greffés avec de nouvelles caractéristiques physico-chimiques, et en particulier avec une viscosité qui dépend de la température.
En effet, l'utilisation de polyétheramines selon l'invention permet d'obtenir des taux de greffage plus élevés.
La purification des hydrogels à basse température permet d'obtenir des hydrogels plus purs, non toxiques, sans polyétheramine libre. L'absence de polyétheramine libre accentue aussi la variation de la viscosité en fonction de la température et rétrécit l'intervalle de température dans lequel se produit la transition de viscosité.
Les hydrogels selon l'invention peuvent présenter des propriétés rhéologiques thermosensibles, passant d'un état liquide à un état à plus forte viscosité
dans lequel ils constituent une nanostructure tridimensionnelle ; dans cet état ils peuvent accueillir des cellules. Ils sont optiquement transparents et permettent ainsi l'observation optique desdites cellules.
Exemples Les exemples qui suivent sont donnés à titre d'illustration uniquement, pour permettre à
l'homme du métier d'exécuter l'invention. Ils ne limitent pas la portée de l'invention.
I. Exemples portant sur la synthèse de dérivés de polyétheramines Exemple 1 : Modification d'une polyéthermonoamine avec x=6, Z=CH3 et y=29 par le chlorure de chloroacetyle en présence de triéthylamine (TEA) On a introduit dans un réacteur d'un volume de 250 ml 100 gr (50 mmol) de polyéthermonoamine (x=6, Z=CH3 et y=29, produit disponible sous la marque Jeffamine M2005, masse moléculaire environ 2000 g/mol) et 6,7 ml (50 mmol) de triéthylamine
22 (TEA). Le mélange a été placé dans un bain de glace à 4 C, et on a ajouté, en goutte à
goutte et sous forte agitation magnétique, 3,96 ml (50 mmol) de chlorure de chloroacetyle.
Le mélange réactionnel a été maintenu pendant 2 heures. Après 2 heures on a ajouté
100m1 de 2-propanol. Ensuite le mélange a été transvasé dans une ampoule à
décanter, et on a ajouté 200 ml d'eau à pH acide (pH = 3). Après la séparation de phase, on a récupéré la phase organique contenant la Jeffamine M2005 modifiée.
Exemple 2 : Modification d'une polyéthermonoamine avec x=6, Z=CH3 et y=29 par le chlorure chloroacetyle en présence de soude (NaOH) On a introduit dans un réacteur d'un volume de 250 ml 100 gr (50 mmol) de polyéthermonoamine (x=6, Z=CH3 et y=29, produit disponible sous la marque Jeffamine M2005) et 2 ml d'une solution de soude à 50 mmol de NaOH. Le mélange a été
placé
dans un bain de glace à 4 C, et on a ajouté, en goutte à goutte et sous forte agitation magnétique, 3,96 ml (50 mmol) de chlorure chloroacetyle. Le mélange réactionnel a été
maintenu pendant 2 heures. Après 2 heures ont a ajouté 100m1 de 2-propanol.
Ensuite le mélange a été transvasé dans une ampoule à décanter, et on a ajouté 200 ml d'eau à
pH acide (pH = 3). Après la séparation de phase, on a récupéré la phase organique contenant la Jeffamine M2005 modifiée.
Exemple 3 : Modification d'une polyéthermonoamine avec x=1, Z=CH3 et y=9 par le 2-Bromo-2-methylpropionyl bromure (B1BB) en présence de triéthylamine (TEA) On a introduit dans un réacteur d'un volume de 250 ml 100 gr (166 mmol) de polyéthermonoamine (x=1, Z=CH3 et y=9, produit disponible sous la marque Jeffamine M600 ou XTJ-505, masse moléculaire environ 600 g/mol) et 22,5 ml (166 mmol) de triéthylamine (TEA). Le mélange a été placé dans un bain de glace à 4 C, et on a ajouté, en goutte à goutte et sous forte agitation magnétique, 20,5 ml (166 mmol) de chlorure de chloroethyle. Le mélange a été maintenu pendant 2 heures. Après 2 heures on a ajouté
100m1 de 2-propanol au mélange réactionnel. Ensuite le mélange a été transvasé
dans une ampoule à décanter, et on ajouté 200 ml d'eau à pH acide (pH = 3). Après la séparation de phase, on a récupéré la phase organique contenant la Jeffamine modifiée.
Exemple complémentaire :
Selon l'une des procédures décrites ci-dessus, on a réalisé les polyéthermonoamines modifiées suivantes :
23 Polyethermonoamine de base :
(a) Z = CH3, x = 6, y = 29 (dans le commerce sous la marque Jeffamine M2005) (b) Z = CH3, x = 1, y = 9 (dans le commerce sous la marque Jeffamine M600) (c) Z = H (pour EO) ou CH3 (pour PO), x = 6, y = 35 (Jeffamine M2070) Chacune de ces trois polyéthermonoamines a été modifiée par la réaction avec :

(ai, bl , cl ) : le chlorure de chlorylacetyl (a2, b2, c2) : le bromure de a-bromoisobutyryl (ci, c2, c3) : le chlorure de 6-bromohexanoyl.
On a par ailleurs vérifie que ces synthèses peuvent être effectués avec des polyétherdiamines et polyéthertriamines.
II Exemples portant sur la modification de polysaccharides par les dérivés de polyétheramine Exemple 4: Greffage de Jeffamine M2005 modifiée par le 2-Bromo-2-methylpropionyl bromure sur l'acide hyaluronique (HA) par la réaction de Williamson.
Dans un réacteur on a solubilisé 1 g (2,5 mmol) de HA dans 100 ml d'eau sous agitation mécanique. La solution a été chauffée à 70 C. Ensuite on a dissout 0,8 g de NaOH (0,2 mol) dans 5 ml d'eau, et cette solution de soude a été ajoutée au milieu avec 0,5 g d'iodure de sodium. Après 15 minutes on a ajouté 11 ml de la solution de Jeffamine M2005 modifiée dans de l'isopropanol. Le mélange réactionnel a été chauffé à

pendant 4 h, ensuite on a ajouté 2 g de NaCl et ajusté le pH à une valeur de 11 par addition de HCI (1M). Le mélangea été conservé à 4 C pendant 12 h.
La purification a été obtenue par diafiltration à 4 C. Les mesures de l'absorbance en fonction de la température par UV du mélange réactionnel (figure 6) montrent une augmentation de l'absorbance, ce qui indique la présence d'une phase trouble dû à la formation d'agrégats. Cette observation implique qu'il n'est pas possible de purifier le mélange à température ambiante.
Pour purifier les mélanges réactionnels de manière efficace le système de diafiltration a été placé à 4 C. La purification a été réalisée en 3 étapes. On a commencé la diafiltration à pH = 11 en passant 3 fois le volume de la solution initiale. Ensuite on a neutralisé la solution à pH = 7 et on a passé 4 fois le volume de la solution. Après contrôle de la
24 conductivité on a arrêté la diafiltration. L'échantillon a été congelé et ensuite lyophilisé. Le lyophilisat a été lavé avec de l'éthanol absolu et enfin séché sous vide.
Exemple 5: Greffage de Jeffamine M2005 modifiée par le 2-Bromo-2-methylpropionyl bromure sur l'acide hyaluronique (HA) par la réaction d'estérification.
Dans un réacteur on solubilise 1g (2,5 mmol) de HA dans 100 ml d'eau sous agitation mécanique. Ensuite le pH de la solution est ajusté à 2 par addition de HCI
(1M). Le mélange est dialysé contre l'eau pure pendant 24 heures. Après dialyse la solution est neutralisée à pH=7 par l'addition de tetrabutylammonium hydroxide (TBAOH).
Pour la réaction de greffage, la solution du HA neutralisée a été chauffée à 70 C.
Ensuite on a jouté 11 ml de la solution de Jeffamine M2005 modifiée dans de l'isopropanol. Le mélange réactionnel a été est chauffé à 70 C pendant 12 h. Ensuite on a ajouté
2 g de NaCI, et le mélange a été conservé à 4 C pendant 12 h. La même méthode de purification que celle décrite pour l'exemple 4 a été est utilisée.
Exemple 6 : Propriétés rhéologiques d'hydrogels de polysaccharides en fonction de la température On a mesuré le module élastique G' et le module visqueux G" de différents hydrogels de polysaccharides en fonction de la température, à une concentration de 40 g/I
dans le milieu de culture RPMI. Des résultats sont montrés sur les figures 7 et 8.
Pour le HA non modifié (figure 7), ces mesures montrent que le système ne présente aucune transition thermosensible (pas de gélification) et on observe simplement une diminution des modules en fonction de la température, phénomène classique pour les polymères.
Pour le HA modifié en utilisant le procédé selon l'invention (BIBB-Jeffamine avec un taux de greffage de 2%) ces mesures montrent (figure 8) que le système ne présente aucune transition thermosensible (pas de gélification), et on observe simplement une diminution des modules en fonction de la température.
Exemple 7 : Transition sol-gel réversible dans un hydrogel pour culture cellulaire On a préparé un hydrogel de HA greffé par une polyétheramine de type Jeffamine modifiée selon l'invention avec un milieu de culture connu sous le signe RPMI
(Roswell Park Memorial lnstitute Medium). On obtient à 20 C un liquide clair et translucide, qui est gel à 37 C, mais reste clair et translucide. La solidification du liquide est réversible.

Exemple 8 : Transition sol-gel réversible d'un hydrogel pour culture cellulaire On a préparé un hydrogel de HA greffé par une polyétheramine de type Jeffamine 5 2005 modifiée selon l'invention par un acide halide (BIBB-Jeffamine M-2005 avec un taux de greffage de 10%) dans un milieu de type DMEM (en anglais :
Dulbecco/Vogt modified Eagle's Minimal Essential Medium ) tamponné par l'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique (HEPES) ; ce milieu de culture cellulaire est connu sous le sigle HDMEM ou hDMEM.
On a enregistré un thermogramme différentiel à balayage (technique appelée en anglais Differential Scanning Calorimetry, DSC) à une vitesse de 2 C.min-1. Cette technique mesure les variations de l'enthalpie en fonction de la température. Le thermogramme enregistré est montré sur la figure 9, courbe A. A titre de comparaison on enregistre le même thermogramme pour la Jeffamine modifiée par un acide halide (courbe B) et pour la Jeffamine M2005 (courbe C).
On observe un phénomène endothermique lors d'une montée de température entre et 40 C ; il s'agit probablement de la formation d'associations hydrophobes.
On note que les pics ne se situent pas à la même température. La comparaison des températures des pics montre que la modification de la polyétheramine par un acide halide diminue sa température de transition (formation d'associations hydrophobes) d'environ 29 C à environ 18 C. Elle montre également qu'après le greffage de cette polyétheramine modifiée sur un polysaccharide de type HA la température de transition du système est plus proche de celle de la polyétheramine modifiée que de celle de la polyétheramine non modifiée.
Le comportement est réversible avec un phénomène exothermique lors de la phase de refroidissement de 40 C à 10 C (non représenté sur le graphique).
Exemple 9 : Greffage de polyéthermonoamines modifiées sur des polysaccharides divers En suivant les approches décrites dans les exemples précédents on a préparé
les polysaccharides modifiés suivants :
(i) avec la polyéthermonoamine de base correspondant à Z = CH3, x = 6, y = 29 (dans le commerce sous la marque Jeffamine M2005) modifiée par la réaction avec le bromure de a-bromoisobutyryl :

= Polysaccharide = acide hyaluronique (HA) avec un taux de greffage compris entre 2% et 21% (molaire).
= Polysaccharide = alginate avec un taux de greffage de 1%
= Polysaccharide = pullulane avec un taux de greffage de 4%
= Polysaccharide = xanthane avec un taux de greffage de 2%
(ii) avec la polyéthermonoamine de base correspondant à Z = CH3, x = 6, y = 29 (dans le commerce sous la marque Jeffamine M2005) modifiée par la réaction avec le chlorure de 6-bromohexanoyl :
= Polysaccharide = acide hyaluronique (HA) avec un taux de greffage compris entre 2% et 10% (molaire) = Polysaccharide = alginate avec un taux de greffage de 5%
= Polysaccharide = diéthylaminoéthylpullulane (DEAE-pullulane) avec un taux de greffage de 10%
(iii) avec la polyéthermonoamine de base correspondant à Z = CH3, x = 1, y = 9 (dans le commerce sous la marque Jeffamine M600) modifiée par la réaction avec le chlorure de 6-bromohexanoyl :
= Polysaccharide = acide hyaluronique (HA) avec un taux de greffage de 1%
(molaire) (iv) avec la polyéthermonoamine de base correspondant à Z = H (pour E0) ou CH3 (pour PO), x = 6, y = 35 (dans le commerce sous la marque Jeffamine M2070) modifiée par la réaction avec le bromure de a-bromoisobutyryl :
= Polysaccharide = acide hyaluronique (HA) avec un taux de greffage de 18%
(molaire).
Les meilleurs résultats en vue de l'utilisation comme hydrogel présentant des propriétés rhéologique thermosensibles avec une transition autour de la température corporelle normale (environ 37 ) ont été atteints avec le HA greffé à raison de 3 à 10%
molaires avec la polyéthermonoamine de base correspondant à Z = H (pour E0) ou CH3 (pour PO), x = 6, y = 35 (dans le commerce sous la marque Jeffamine M2070) modifiée par la réaction avec le chlorure de 6-bromohexanoyl.

Claims (20)

REVENDICATIONS
1. Procédé de modification des polysaccharides, dans lequel :
(a) on fait réagir un polysaccharide avec une polyétheramine modifiée de type (X-R-C(O)NH)b R' (où R' représente un polyéther et b = 1, 2 ou 3 et X représente un halogène, de préférence Cl ou Br, R représente un reste alkyle, possiblement substitué, ou un reste aromatique, possiblement substitué), en présence d'une base, de préférence en présence d'eau et d'isopropanol, (b) on purifie le produit obtenu en présence de NaCI, au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée à un pH

compris entre 9 et 13 (et de préférence entre 10 et 12) ;
(c) on purifie le produit issu de l'étape (b), au moins en partie, par une méthode de séparation membranaire, ladite purification étant effectuée après neutralisation à un pH compris entre 6 et 8 (de préférence entre 6,5 et 7,5), éventuellement après lyophilisation et lavage du produit lyophilisé (de préférence à l'éthanol).
2. Procédé selon la revendication 1; dans lequel R représente un reste alkyle, possiblement substitué (de préférence un reste en C1 , C2 , C3, C4 , C5, C6, C7, C8, C9, C10 C11 ou C12), ou un reste aromatique (de préférence un reste phényle), possiblement substitué.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel ledit polyéther R' présente la structure suivante :
ou Z est un atome hydrogène (dans le cas de l'oxyde d'éthylène) ou un méthyl (dans le cas de l'oxyde de propylène), et où, de manière préférée, x=1 à 3, Z=CH3 et y = 7 à
11 (avec x=1 et y=9 préféré) ; x=17 à 21, Z=CH3 et y = 2 à 5 (avec x=19 et y =

préféré); x=5 à 8, Z=CH3 et y = 25 à 32 (avec x=6 et y=29 préféré), .cndot. ladite polyétheramine ayant de préférence une masse molaire comprise entre environ 300 et environ 3000, et encore plus préférentiellement entre environ 500 et environ 2500, et/ou .cndot. ladite polyétheramine présentant un rapport molaire de [oxyde de propylène] /
[oxyde d'éthylène] compris entre 10/1 et 1/10.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel on active d'abord au moins une fonction carboxylique PS-COOH du polysaccharide PS à l'aide d'une amine quaternaire, puis on ajoute ladite polyétheramine modifiée.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel au moins une étape de purification, et de préférence toutes les étapes de purification après neutralisation, est effectuée à une température inférieure à 20°C, de préférence comprise entre 0°C et 15°C, et encore plus préférentiellement entre 2°C et 8°C.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le produit issu de l'étape (c) est lyophilisé, lavé à l'éthanol et séché.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel ledit polysaccharide est sélectionné dans le groupe formé par les polysaccharides neutres (et notamment par le pullulane et le dextrane), les polysaccharides anioniques naturels (et notamment : alginate, acide hyaluronique, gomme xanthane, gomme d'agar agar, pectines, héparine), les polysaccharides anioniques de synthèse (et notamment : carboxyméthylcellulose, carboxyméthylpullunane), les polysaccharides cationiques naturels (et notamment le chitosane), les polysaccharides cationiques de synthèse (et notamment : diéthylaminoéthylcellulose, diéthylamoniéthyldextrane), les polysaccharides amphiphiles, les polysaccharides zwitterioniques naturels ou obtenus par modification chimique (et notamment le carboxyméthylchitosane), ou par des mélanges de ces polysaccharides, et est de manière préférée sélectionné dans le groupe formé par le pullulan, le xanthane, l'alginate et l'acide hyaluronique.
8. Polysaccharide modifié susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
9. Hydrogel formé par au moins un polysaccharide selon la revendication 8 et un liquide aqueux, ledit liquide aqueux comprenant possiblement du sérum et/ou un milieu de culture de cellules.
10. Hydrogel selon la revendication 9, caractérisé en qu'il présente des propriétés rhéologies thermosensibles avec une température de transition comprise entre 33 et 39°C ou avec une température de transition comprise entre 4 et 20°C.
11. Utilisation d'un hydrogel selon la revendication 9 ou 10 dans un milieu pour la culture cellulaire ou dans un milieu pour le transport de cellules.
12. Utilisation d'un hydrogel selon la revendication 9 ou 10 pour la préparation d'une composition destinée à être utilisé en tant que pansement cutanée, agent d'embolisation, agent de viscosupplémentation, agent de comblement, agent limitant l'adhésion post chirurgicale, ou agent de régénération tissulaire.
13. Procédé de préparation d'une polyétheramine modifiée de type (X-R-C(O)NH)b R' par réaction d'une polyétheramine (H2N)b R' avec un halogénure d'un acyle halogéné
X-R-C(O)X, dans lequel :
(a) on approvisionne une polyétheramine (H2N)b R' (où R' représente un polyéther et b = 1, 2 ou 3) et un halogénure d'acyle halogéné X-R-C(O)X (où X représente un halogène, de préférence Cl ou Br, R représente un reste alkyle, possiblement substitué, ou un reste aromatique, possiblement substitué), (b) on mélange les deux réactifs en présence d'une base, de préférence Et3N
et/ou NaOH, et laisse réagir le mélange, de préférence à une température inférieure à
35°C, de préférence inférieure à 20°C, et encore plus préférentiellement entre 0°C
et 10°C, de préférence en l'absence de solvant (et de préférence en l'absence de DMF et THF).
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel on effectue à l'issue de l'étape (b) un lavage du milieu réactionnel à l'eau acidifiée.
15. Procédé selon la revendication 13 ou 14, dans lequel on conserve ladite polyétheramine modifiée en présence d'un alcool (de préférence isopropanol).
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, dans lequel ladite polyétheramine (H2N)b R' est une polyéthermonoamine présentant la structure suivante :
où Z est un atome hydrogène, un reste méthyle ou un reste éthyle, et x et y sont des nombres entiers.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, dans lequel ladite polyétheramine présente une masse molaire comprise entre environ 300 et environ 3000, et encore plus préférentiellement entre environ 500 et environ 2500, et/ou ladite polyétheramine présente un rapport molaire de [oxyde de propylène] /
[oxyde d'éthylène] compris entre 10/1 et 1/10.
18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel, x=1 à 7, Z=CH3 et y = 5 à
15 (avec x=1 à 3 et y=7 à 11 préféré), ou x=15 à 25, Z=CH3 et y = 1 à 9 (avec x = 17 à
21 et y =
2 à 5 préféré), ou x = 3 à 11, Z=CH3 et y = 21 à 35 (avec x = 5 à 8 et y = 25 à 32 préféré).
19. Polyétheramine modifiée de type (X-R-C(O)NH)b R' susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 13 à 18.
20. Utilisation d'une polyétheramine modifiée selon la revendication 19 pour modifier un polysaccharide.
CA2954455A 2014-07-11 2015-07-08 Procede de modification de polysaccharides par greffage de polyetheramines, polysaccharides ainsi modifies et preparations les comportant et presentant des proprietes rheologiquesthermosensibles Abandoned CA2954455A1 (fr)

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