EP2833919A1 - Microparticules et nanoparticules constituées de polysaccharides hydrophobisés et d'une alpha-cyclodextrine - Google Patents

Microparticules et nanoparticules constituées de polysaccharides hydrophobisés et d'une alpha-cyclodextrine

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EP2833919A1
EP2833919A1 EP13719892.5A EP13719892A EP2833919A1 EP 2833919 A1 EP2833919 A1 EP 2833919A1 EP 13719892 A EP13719892 A EP 13719892A EP 2833919 A1 EP2833919 A1 EP 2833919A1
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EP
European Patent Office
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groups
polysaccharide
cyclodextrin
sulfate
formula
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP13719892.5A
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German (de)
English (en)
Inventor
Kawthar BOUCHEMAL
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Saclay
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]

Definitions

  • Microparticles and nanoparticles consisting of hydrophobized polysaccharides and alpha-cyclodextrin
  • the invention relates to microparticles and nanoparticles consisting of hydrophobized polysaccharides and alpha-cyclodextrin.
  • the invention also relates to their use as an encapsulation system.
  • particles capable of containing and vectoring or encapsulating an active ingredient are the subject of active research. These particles must be capable of trapping a substance of interest, transporting it in the body to the target cell or tissue, and then releasing it without altering its structure. It is important that these particles are not toxic. But there is a big disadvantage related to their preparation. Indeed, it often requires, during a step at least, the use of an organic solvent and / or the use of surfactants, non-biocompatible, sometimes under very important acid conditions. The removal of the solvent and / or surfactant molecules is often long, incomplete and adds a cost to the production of the particle. The residual traces, toxic, can also contribute to degrade the active substances immobilized in the particles. This is why it is sought to produce these particles in an aqueous medium preferably, from biocompatible and biodegradable polymers.
  • Polysaccharides form a class of polymers very interesting in the field of encapsulation.
  • these polysaccharides are chitosan, chitin, hyaluronic acid and glycosaminoglycans (GAGs).
  • Chitosan is a linear heteropolymer of N-acetyl-D-glucosamine and ⁇ -linked D-glucosamine (1-4) according to the formula:
  • M represents the number of D-glucosamine units
  • ⁇ n represents the number of N-acetyl-D-glucosamine units
  • m in relation to the total number of units is greater than 50%. It has the advantage of being biocompatible and mucoadhesive. Nanoparticles of chitosan have been used as adjuvants for mucosal vaccination in animals (Annales de Médecine Vcierinaire, 2003, 147, 343-350).
  • An adjuvant is a substance that, when administered together with an antigen, increases the immune response to that antigen.
  • the advantage of mucosal vaccination is the introduction of an immune response to the entry gate of microbes. Vaccines administered alone by mucosal route have low bioavailability. They must be co-administered with substances that promote their penetration or with adjuvants.
  • Chitin is a linear heteropolymer of N-acetyl-D-glucosamine and ⁇ -linked D-glucosamine (1-4) according to the formula:
  • M represents the number of D-glucosamine units
  • ⁇ n represents the number of N-acetyl-D-glucosamine units
  • the percentage of m in relation to the total number of units is less than 50%.
  • Chitin is a powerful moisturizing agent, an effective sensor of heavy metals, responsible for a large number of contact allergies. It is used in the treatment of burns because it has healing properties. Chitin is also used to filter wastewater: it forms ionizable chains that make it possible to fix the organic elements. It is also inserted in the industrial food (juice manufacturing), as a technological auxiliary.
  • GAGs glycosaminoglycans
  • HSV herpes simplex virus
  • GAGs and sulfated polysaccharides showed antibacterial activity against: Staphylococcus aureus, Gardnerella vaginalis, Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Yersinia enterocolitica, Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus mutas, Chlamydia trachomatis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. (US 2005/0203055).
  • the heparin coating of abiotic surfaces has reduced Candida albicans adhesion by approximately 50% (Infection and Immunity. 1993, 61 (11), 4560-4568).
  • HIV human immunodeficiency virus
  • HSV human immunodeficiency virus
  • HPV bovine papillomavirus
  • sulfated polysaccharides such as cellulose sulfate, carrageenan, dextran sulfate, dextrin sulfate have shown antimicrobial activity.
  • Hyaluronic acid helps protect the joints by increasing the viscosity of the synovial fluid and making the cartilage more elastic.
  • Hyaluronic acid is the only non-sulfated GAG.
  • Hyaluronic acid is a natural constituent of the dermis that plays an important role in the hydration, tone and elasticity of the skin.
  • Polysaccharides grafted with hydrophobic chains are amphiphilic systems capable of self-associating spontaneously in aqueous medium in the form of heart-crown type micelles capable of accommodating an active ingredient ⁇ Drug Discovery Today, 2012, 17, 623-629). But their solubility in aqueous medium decreases because of the presence of hydrophobic grafted chains.
  • cyclic polysaccharides such as cyclodextrins
  • cyclodextrins causes the formation of particles constituting inclusion systems, soluble in aqueous medium.
  • inclusion systems soluble in aqueous medium.
  • Variable size and structure, ranging from the nanoparticle to the hydrogel, are able to vectorize a substance of interest.
  • Gref et al (US2005 / 004348A1) describe particles obtained by grafting one or more (for example two) cyclic polysaccharides, such as beta-cyclodextrin, onto a biodegradable polymer such as poly ( ⁇ -caprolaetone) and their use. as vectors of active substances.
  • the cyclic polysaccharide is covalently bound to the biodegradable polymer.
  • This same patent describes the formation of nanoparticles by mixing a dextran bearing lauryl chains and a beta-cyclodextrin polymer.
  • Bochot et al (US2006 / 0188464A1, EP1590077B1, International Journal of Pharmaceuticals, 2007, 339, 121) describe, in their publication and their applications, beads whose size varies from 1 to 3 mm, obtained by mixing an oil and a solution of water. alpha-cyclodextrin. They do not use linear polysaccharides described above and, on the other hand, the size of the particles formed is millimetric.
  • One of the aims of the invention is to provide inclusion complexes between a polysaccharide and a cyclodextrin.
  • Another object of the invention is to provide microparticles or nanoparticles formed from the aforementioned inclusion complexes.
  • Another aim is to provide a process for the simple preparation of said particles without necessarily using organic solvents or surfactants.
  • the invention relates to the use of said particles as such, without necessarily adding substance (s) of interest.
  • the invention relates to the use of said particles to encapsulate one or more substance (s) of interest.
  • the invention relates to an inclusion complex formed between:
  • polysaccharide and the cyclodextrin being non-covalently bound.
  • the invention relates to an inclusion complex formed by the interaction between:
  • a polysaccharide comprising hydrophobic groups covalently bonded to said polysaccharide
  • inclusion complex refers to a system that results from the interaction of a "host” molecule that admits within its cavity one or more other "guest” molecules without any covalent linkage. established.
  • polysaccharide refers to a carbohydrate macromolecule formed by the linking of a large number of elemental sugars.
  • the majority of the polysaccharides are hydrophilic, they carry -OH and / or -NH 2 groups , and / or -COOH, and / or -CH 2 -OH, and / or -SO 3 " , or groups derived therefrom. The nature of these groups makes it possible to differentiate them from a structural point of view and from a point of view of the physicochemical and biological properties
  • polysaccharide refers here to a linear or branched polysaccharide.
  • hydrophobic group-containing polysaccharide means that the polysaccharide has been "hydrophobized” by grafting, on -OH and / or -NH 2 groups , and / or -COOH, and / or -CH 2 -OH groups, and / or or -S0 3 " of alkyl chains which, by their nature, are hydrophobic because of their apolar nature.
  • The” polysaccharide having hydrophobic groups "is therefore an amphiphilic polysaccharide.In certain conditions, these polysaccharides are capable of self-association for form heart-crown type micelles in an aqueous medium ⁇ Drug Discovery Today, 2012, 623-629).
  • Cyclodextrin (or cycloamylose) is a cyclic oligosaccharide of ⁇ -D-glucopyranose linked by ⁇ (1-4) linkages. It is a molecule-cage of natural origin that can encapsulate various molecules, including molecules of therapeutic interest. There are different sizes, each having the shape of a "lampshade”. It carries hydrophilic groups (-OH) located outside, the assembly delimiting a relatively hydrophobic cavity. This amphiphilic character allows the cyclodextrin to include in its cavity hydrophobic molecules to form water-soluble inclusion complexes. Its biodegradable nature predisposes it to important applications in the food, cosmetics and pharmaceutical fields. Encapsulation in cyclodextrins makes it possible to protect fragile molecules or to ensure their slow and controlled release.
  • alpha-cyclodextrin instead of a cyclodextrin polymer is an obvious economic and regulatory advantage because this cyclodextrin is commercially available and is recognized as a pharmaceutical excipient accepted by the majority. pharmacopoeia.
  • Polysaccharide and cyclodextrin being non-covalently bound means that the interactions between these two molecules are Van der Waals bonds and / or hydrogen bonds, and / or electrostatic bonds, and / or hydrophobic bonds, and not covalent bonds. These inclusion complexes are thus exclusively formed by non-covalent bonds by simple mixture of alpha-cyclodextrin and polysaccharide grafted with hydrophobic groups. Thus, using the same procedure and varying the type of these non-covalent interactions, one can form particles of varying size and structure.
  • the invention thus relates to an inclusion complex formed by the interaction between at least:
  • a polysaccharide chosen from chitosan, dextran, hyaluronic acid, amylose, amylopectin, pullulan, heparin, chitin, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, chondroitin; sulfate, cellulose sulfate, dextran sulfate, dextrin sulfate, starch, pectin, alginates, carrageenans, fucan, curdlan, xylan, polyguluronic acid, xanthan, arabinan, polymannuronic acid, and derivatives thereof, said polysaccharide having hydrophobic groups selected from alkyl groups, linear or branched, containing from 2 to 1000 carbon atoms, or linear or branched, especially linear alkenyl groups, which may contain at least 1 double bond C C, said hydrophobic groups being covalently bound to said polysaccharide,
  • polysaccharide and the cyclodextrin being non-covalently bound.
  • the polysaccharide is composed of at least 3 saccharide units, its molar mass being in particular between 100 Da to 1000000 kDa, and in particular equal to 20 kDa, 145 kDa or 250 kDa.
  • the polysaccharide is composed of at least 3 saccharide units, its molar mass being in particular between 5 kDa and 100,000 kDa, and in particular equal to 20 kDa, kDa or 250 kDa.
  • the ratio between the concentration of the cyclodextrin and the concentration of the polysaccharide is from 10 -6 to 90,000, in particular from 4 to 15, and in particular equal to 10.
  • the ratio between the concentration of the cyclodextrin and the polysaccharide concentration is from 0.01 to 1500, in particular from 4 to 15, and especially equal to 10.
  • This parameter is very important because it makes it possible to modulate the size of the particles obtained from the aforementioned inclusion complexes by modifying the concentration ratio between the cyclodextrin and the polysaccharide.
  • the average particle size may increase as the ratio of cyclodextrin concentration to polysaccharide concentration decreases.
  • the ratio is less than 0.01, no particles are formed. If the ratio is greater than 20, particles are formed. Beyond a concentration ratio of 1500, and especially for a concentration greater than 50 g / L, alpha-cyclodextrin is no longer soluble in water.
  • the solubility of the polysaccharide is not a limiting factor in the formation of the particles, because they form even if the polysaccharide is used as a suspension in water.
  • a suspension polysaccharide can be used to formulate the nanoparticles and the microparticles has the advantage of obtaining more concentrated particles. Thanks to this new technology, polysaccharides that were difficult to formulate in the form of nanoparticles or microparticles because of their solubility problems in water (especially chitin) thus find a new use.
  • this process is simple, reduces environmental pollution because solvents, surfactants or reagents are not necessarily used. It also decreases energy consumption. It does not necessarily use a heating step if a purification step after their preparation.
  • the polysaccharides retain their antimicrobial properties even after their formulation in the form of nanoparticles and microparticles
  • the invention particularly relates to an inclusion complex in which the polysaccharide is selected from chitosan, dextran, hyaluronic acid, amylose, amylopectin, pullulan, heparin, chitin, cellulose, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate, cellulose sulfate, dextran sulfate, dextrin sulfate, starch, pectin, alginates, carrageenans, fucan, curdlane, xylan, polyguluronic acid, xanthan, arabinan, polymannuronic acid, and their derivatives, and is especially chitosan.
  • the polysaccharide is selected from chitosan, dextran, hyaluronic acid, amylose, amylopectin, pullulan, heparin, chitin, cellulose,
  • They can be neutral (dextran for example), or globally positively charged (chitosan for example) or negatively (heparin, hyaluronic acid, pectin).
  • the polysaccharides have intrinsic properties even without adding active molecules.
  • Chitosan has the advantage of being biocompatible, mucoadhesive and can be used as an adjunct for mucosal vaccination.
  • Chitin has moisturizing and healing properties and has the ability to capture heavy metals and purify wastewater.
  • GAGs and sulfated polysaccharides have activity to prevent, inhibit and / or treat fungal infections, bacterial, viral and / or parasitic on biotic or abiotic surfaces.
  • Hyaluronic acid is known to promote hydration, tone and elasticity of the skin and to protect the joints by increasing the viscosity of the synovial fluid and making the cartilage more elastic.
  • Biofilms are defined as an organized community of cells attached to a biotic or abiotic surface, inserted into an extracellular material. Biofilms are the predominant form of life of microorganisms and constitute a mode of resistance of these to antimicrobial agents. They can colonize biotic surfaces such as the surface of cells, tissues or organs (such as the skin and mucous membranes of the mouth, nose, eye, ear, vagina, rectum and / or the digestive tract) or abiotic surfaces such as plastic, glass, metal or any other material on which microorganisms can develop.
  • the degree of substitution of the polysaccharide by the hydrophobic groups is from 0.001 to 100%, in particular from 0.05 to 50%.
  • the degree of substitution of the polysaccharide by the hydrophobic groups is between 0.1% and 70%, in particular equal to 2%, 13% or 17%. .
  • the degree of substitution reflects the number of hydrophobic groups bound to 100 saccharide units of the polysaccharide chain. It is determined by the experimental conditions of the grafting and can be measured by nuclear magnetic resonance (RM) or by elemental analysis for example.
  • RM nuclear magnetic resonance
  • the hydrophobic groups are not aromatic groups.
  • fatty acids used for the grafting of the hydrophobic chains on the polysaccharide are in particular lauric acid, palmitic acid, oleic acid, stearic acid, linoleic acid, this list being by no means exhaustive and limiting.
  • the hydrophobic groups are covalently attached to the polysaccharide by a nitrogen atom of said polysaccharide.
  • This relates to polysaccharides having amino groups, especially chitosan and heparin.
  • amino groups may undergo an N-acylation reaction by reaction with a fatty acid or a fatty acid derivative such as a fatty acid chloride or a fatty acid anhydride.
  • the hydrophobic groups are covalently attached to the polysaccharide by one or more oxygen atoms of said polysaccharide.
  • the hydrophobic groups are covalently attached to the polysaccharide by one or more oxygen atoms of said polysaccharide, and in particular at the level of the carboxylic function COOH and / or a CH 2 -OH group and / or -SO 3 "of said polysaccharide.
  • -OH groups are numerous on polysaccharides.They react with fatty acids or fatty acid derivatives such as chlorides. acid, the acid anhydrides, to give esters.
  • the hydrophobic group of the fatty acid or its derivative is thus grafted to the polysaccharide by one of its oxygen atoms, in the form of an acyl group: it is an "O-acylation" reaction.
  • the O-acylation reaction leads to the formation of easily ester-degradable ester bonds after in vivo administration.
  • the hydrophobic groups are covalently attached to the polysaccharide by a nitrogen, phosphorus or sulfur atom and by atoms of oxygen of said polysaccharide in the proportions of 0.001 to 100%.
  • the hydrophobic groups are covalently attached to the polysaccharide by a nitrogen, phosphorus or sulfur atom and by atoms of oxygen of said polysaccharide in the proportions of 0.5 to 20%.
  • the polysaccharide contains amino groups and hydroxyl groups, by reaction with fatty acids or fatty acid derivatives such as acid chlorides, acid anhydrides, it can undergo both N-acylation and O-acylation.
  • the amino groups are more reactive than the hydroxyl groups.
  • the cyclodextrin CD has the formula:
  • R, R and R identical or different, in particular identical, are hydrogen atoms, alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms, selected from methyl, ethyl, propyl, isopropyl, amino groups, groups; ammonium -NH 3 , or -S0 4 " -sulphate groups, and are in particular hydrogen atoms or methyl groups, said CD being talpha-cyclodextrin ( ⁇ -CD) in monomer form.”
  • Cyclodextrins "(CD ) are cyclic oligomers of ⁇ -D-glucopyranoses linked by ⁇ (1-4) linkages
  • Three families are mainly used: ⁇ -, ⁇ - and ⁇ -cyclodextrins respectively 6, 7 or 8 glucopyranose subunits.
  • the cyclodextrins are therefore caged molecules capable of accommodating molecules by inclusion, in particular species of hydrophobic nature.
  • the size of the cavity depends on the nature of the cyclodextrin.
  • the inner part of the cavity is hydrophobic, the outer part is hydrophilic.
  • the -OH groups may be substituted, in particular with methyl, hydroxypropyl or sulphobutyl groups. Substitutions can increase the solubility of the cyclodextrin.
  • the cyclodextrin only used in the invention is ⁇ ' ⁇ -cyclodextrin.
  • the advantage of this cyclodextrin is related to its small size which allows it to interact with the hydrophobic chains linked to the polysaccharide.
  • the cyclodextrin is functionalized with a ligand chosen from antibodies, antibody fragments, receptors, lectins, biotin or its derivatives.
  • ligand refers to a molecule capable of covalently binding to CD.
  • the ligand is chosen from protein compounds involved in particular in the recognition and / or neutralization of pathogens (anti-bodies or fragments, receptors, lectins), involved in the metabolism of fatty acids (biotin and derivatives).
  • the cyclodextrin in the inclusion complex of the invention, is charged or uncharged. In yet another aspect, in the inclusion complex of the invention, the cyclodextrin is substituted or unsubstituted.
  • substituted cyclodextrin is meant, for example, an alkyl-substituted cyclodextrin, for example a methylated cyclodextrin, a hydroxyalkyl group, a maltosyl group, a galactosyl group, or any other molecule,
  • the polysaccharide is a chitosan bearing hydrophobic groups
  • ⁇ the cyclodextrin is ⁇ a-CD.
  • Chitosan a linear polysaccharide of natural origin, randomly composed of ⁇ - (1-4) linked D-glucosamine deacylated units to acetylated N-acetyl-D-glucosamine units, is produced by chemical or enzymatic deacetylation of chitin. .
  • Chitosan is biocompatible, biodegradable. It is non-toxic, bio-adhesive because of the interaction between the positive charges in acidic medium (pH ⁇ 6.0-6.5) carried by the amine functions and the negative charges carried by the biological membranes. It also has antibacterial and anti viral activity.
  • Chitosan is soluble in an aqueous solution of acetic acid in low concentration by protonation of the amino groups present.
  • the glucoside chain of chitosan is essentially hydrophilic. But it is possible to graft groups, in particular hydrophobic groups, on the amino and hydroxyl groups.
  • the polysaccharide then becomes amphiphilic and can form micelles, nanoparticles but also hydrogels at higher concentration by self-association in an aqueous medium. It is therefore possible to encapsulate active ingredients in the objects it forms. It can be used to encapsulate active ingredients (paclitaxel, ibuprofen, ).
  • the chitosan carries hydrophobic groups grafted at certain nitrogen atoms and has the formula:
  • M represents the number of units of desacetylated units
  • N represents the number of units of acetylated units
  • DDA degree of deacetylation
  • R 4 represents the hydrophobic group and is chosen from:
  • alkyl group linear or branched, containing from 1 to 20 carbon atoms, in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -C] 3 ⁇ 4,
  • the chitosan carries hydrophobic groups grafted at certain nitrogen atoms and has the formula
  • M represents the number of units of D-glucosamine units
  • N represents the number of units of N-acetyl-D-glucosamine units
  • DDA degree of deacetylation
  • R 4 represents the hydrophobic group and is chosen from:
  • a linear or branched alkyl group containing from 1 to 1000 carbon atoms in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -CH 3 ,
  • the 50% DDA is the limit between chitin and chitosan: when the DDA is less than 50%, it is called chitin, otherwise it is called chitosan.
  • the - (CH 2 ) 14 -CH 3 group comes from palmitic acid
  • - (CH) 16 -CH 3 comes from stearic acid
  • - (CH 2 ) 7 -CH CH-CH 2 - (CH 2 7 -CH 3 is derived from linoleic acid
  • - (CH 2 ) 7 -CH CH- (CH 2 ) 7 -CH 3 is derived from oleic acid.
  • the N-acylated chitosan is obtained from an N-acylation reaction in the presence of a coupling agent, EDCI (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), which reacts with the groups carboxylic acids of the fatty acid (oleic or palmitic for example) to form an intermediate ester capable of binding to the free amino functions of chitosan (Lee, KY, et al., Structural Determination and Interior Polarity of Self-Aggregate Prepared from Deoxycholic Acid-Modified Chitosan in Water., Macromolecules, 1998, 31, 2, 378-383).
  • the following diagram shows the sequence of reactions carried out to obtain an N-acylated chitosan, grafted with chains derived from oleic acid. We proceed in the same way with other fatty acids such as palmitic acid for example.
  • the IR and NMR spectra of the grafted chitosan make it possible to demonstrate the secondary amino function obtained after N-acylation and the presence of the grafted alkyl chains.
  • the chitosan in the inclusion complex, carries hydrophobic groups grafted at oxygen atoms from -OH groups and / or -CH 2 OH groups attached to the ring.
  • chitosan and having the formula:
  • n, m and R have the meanings given above.
  • the chitosan in the inclusion complex, carries hydrophobic groups grafted at oxygen atoms from -OH groups and / or -CH 2 OH groups attached to the ring.
  • chitosan and having the formula:
  • ⁇ R represents
  • n, m and R have the meanings given above, and provided that R
  • the infrared (IR) spectra of the products obtained show a characteristic band of an ester bond at 1700 cm -1 , while the proton MR spectra compared to that of the native chitosan make it possible to establish the presence of the alkyl chains.
  • the chitosan carries hydrophobic groups grafted at certain oxygen atoms and certain nitrogen atoms, and has the formula:
  • n, m and R 4 have the meanings given above.
  • the chitosan carries hydrophobic groups grafted at certain oxygen atoms and certain nitrogen atoms, and has the formula:
  • ⁇ R represents
  • n, m and R 4 have the meanings defined above, and subject to
  • the polysaccharide is a dextran bearing hydrophobic groups, attached by oxygen atoms of said dextran and containing groups of formula
  • p R 4 has the meanings indicated above,
  • ⁇ * represents dextran
  • ⁇ the cyclodextrin is ⁇ a-CD.
  • Dextran is a dextrose polymer.
  • the IR spectrum of O-palmitoyl-dextran shows an absorption band corresponding to the carbonyl ester group.
  • the polysaccharide is hyaluronic acid bearing hydrophobic groups, attached by oxygen atoms of said hyaluronic acid and representing groups of formula
  • Cyclodextrin is a-CD.
  • the polysaccharide is an amylopectin bearing hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said amylopectin and representing groups of formula
  • ⁇ the cyclodextrin is ⁇ a-CD.
  • the polysaccharide is a pullulan bearing hydrophobic groups attached to the oxygen atoms of said pullulan and resenting groups of formula
  • n R 4 has the meanings given above,
  • Cyclodextrin is a-CD.
  • Pullulan consists of maltotriose units.
  • the three units of glucose that make up maltotriose are linked by a saccharide bond of the ⁇ -1,4 type, while the maltotrioses are connected to each other by osidic bonds of the ⁇ -1,6 type. It is grafted, in particular by palmitic acid.
  • the polysaccharide is a heparin carrying hydrophobic groups fixed by nitrogen atoms of said heparin and containing groups of formula
  • 0 * represents heparin
  • the polysaccharide is a heparin bearing hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said heparin, these oxygens possibly originating from the hydroxyl or carboxyl groups of heparin, and representing groups of formula
  • ⁇ and the cyclodextrin is the ct-CD.
  • the polysaccharide is a carrageenan carrying hydrophobic groups fixed by nitrogen atoms of said sulfate carrageenan and containing groups of formula
  • polysaccharide is a carrageenan bearing hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said carrageenan, these oxygens possibly originating from hydroxyl or carboxyl groups of carrageenan, and representing groups of formula
  • ⁇ and the cyclodextrin is ⁇ a-CD.
  • the polysaccharide is a hyaluronic acid bearing hydrophobic groups attached by nitrogen atoms of said hyaluronic acid and representing groups of formula in which
  • the polysaccharide is a hyaluronic acid bearing hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said hyaluronic acid, these oxygens possibly originating from the hydroxyl or carboxyl groups of hyaluronic acid, and representing groups of formula
  • ⁇ * represents hyaluronic acid
  • ⁇ and the cyclodextrin is ⁇ a-CD.
  • the polysaccharide is a glycosaminoglycan bearing hydrophobic groups attached by nitrogen atoms of said glycosaminoglycan and representing groups of formula
  • polysaccharide is a glycosaminoglycan bearing hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said glycosaminoglycan, these oxygens possibly originating from hydroxyl or carboxyl groups of glycosaminoglycan, and representing groups of formula
  • n R 4 has the meanings given above,
  • ⁇ and the cyclodextrin is ⁇ a-CD.
  • the polysaccharide is a carrageenan sulfate bearing hydrophobic groups attached by nitrogen atoms of said carrageenan sulfate and representing groups of formula
  • a * represents carrageenan sulfate
  • polysaccharide is a carrageenan sulfate bearing hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said carrageenan sulfate, these oxygens possibly originating from hydroxyl or carboxyl groups of carrageenan sulfate, and representing groups of formula
  • ⁇ and the cyclodextrin is ⁇ a-CD.
  • the polysaccharide is a dextran sulphate carrying hydrophobic groups attached by nitrogen atoms of said dextran sulphate and containing groups of formula
  • ⁇ R 4 has the meanings indicated above,
  • n * represents the. dextran sulfate
  • polysaccharide is a dextran sulfate bearing hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said dextran sulfate, these oxygens possibly coming from hydroxyl or carboxyl groups of dextran sulfate, and representing groups of formula in which
  • ⁇ and the cyclodextrin is ⁇ a-CD.
  • the polysaccharide is a sulfate cellulose carrying hydrophobic groups attached by nitrogen atoms of said cellulose sulphate and representing groups of formula
  • the polysaccharide is a cellulose sulfate carrying hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said cellulose sulfate, these oxygens possibly originating from hydroxyl or carboxyl groups of cellulose sulfate, and representing groups of formula
  • ⁇ and the cyclodextrin is ⁇ a-CD.
  • the polysaccharide is a heparan sulphate carrying hydrophobic groups attached by nitrogens of nitrate representing groups of formula
  • ⁇ R 4 has the meanings indicated above,
  • the polysaccharide is a heparan sulfate bearing hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said heparan sulfate, these oxygens being able to from the hydroxyl or carboxyl groups of heparan sulfate, and representing groups of formula
  • ⁇ and the cyclodextrin is ⁇ a-CD.
  • the polysaccharide is a keratan sulfate bearing hydrophobic groups fixed by nitrogen atoms of said keratan ulfate and representing groups of formula
  • the polysaccharide is a keratan sulfate bearing hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said keratan sulfate, these oxygens possibly coming from hydroxyl or carboxyl groups of keratan sulfate, and representing groups of formula
  • n * represents keratan sulfate
  • ⁇ and the cyclodextrin is the a-CD.
  • the polysaccharide is a chondroitin sulfate bearing hydrophobic groups attached by nitrogen atoms of said chondroitin sulfate and representing groups of formula in which
  • the polysaccharide is a chondroitin sulfate bearing hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said chondroitin sulfate, these oxygens possibly originating from hydroxyl or carboxyl groups of chondroitin sulfate, and representing groups of formula
  • n R 4 has the meanings given above,
  • n * represents chondroitin sulfate
  • ⁇ and the cyclodextrin is ⁇ -CD.
  • the polysaccharide is a sulfate dextrin carrying hydrophobic groups attached by nitrogen atoms of said sulfate dextrin and containing groups of the formula
  • polysaccharide is a sulfate dextrin carrying hydrophobic groups attached by oxygen atoms of said sulfate dextrin, these oxygens possibly originating from hydroxyl or carboxyl groups of dextrin sulfate, and representing groups of formula
  • the invention also relates to a particle of size ranging from 10 nm to 100,000 nm containing inclusion complexes formed by the interaction between at least
  • a polysaccharide comprising hydrophobic groups covalently bonded to said polysaccharide, optionally functionalized with a ligand chosen from antibodies, antibody fragments, receptors, lectins or biotin or its derivatives,
  • a cyclodextrin in the form of a monomer optionally functionalized with a ligand chosen from antibodies, antibody fragments, receptors, lectins or biotin or its derivatives.
  • the invention also relates to a particle of size ranging from 50 nm to 10,000 nm containing inclusion complexes between:
  • a polysaccharide comprising hydrophobic groups covalently bonded to said polysaccharide, optionally functionalized with a ligand chosen from antibodies, antibody fragments, receptors, lectins or biotin or its derivatives,
  • a cyclodextrin in the form of a monomer optionally functionalized with a ligand chosen from antibodies, antibody fragments, receptors, lectins or biotin or its derivatives.
  • the invention relates to nanometric particles, ranging in size from 10 nm to 1000 nm and micrometric particles of size ranging from
  • the invention relates to nanoscale particles having a size of from 50 nm to 1000 nm and micrometric particles ranging in size from 1000 nm to 10000 nm.
  • the invention relates to a particle of
  • a polysaccharide chosen from chitosan, dextran, hyaluronic acid, amylose, amylopectin, puUulane, heparin, chitin, cellulose derivatives, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate, cellulose sulfate, dextran sulfate, dextrin sulfate, starch, pectin, alginates, carrageenans, fucan, curdlan, xylan, polyguluronic acid, xanthan, arabinane, polymannuronic acid, and derivatives thereof, comprising hydrophobic groups selected from linear or branched alkyl groups or linear or branched alkenyl groups and carrying from 1 to 4 double bonds C C, conjugated or otherwise, said groups hydrophobic agents being covalently bonded to said polysaccharide, optionally functionalized with a ligand chosen
  • a monomeric ⁇ -cyclodextrin optionally functionalized with a ligand selected from antibodies, antibody fragments, receptors, lectins or biotin or its derivatives.
  • the sizes of the particles formed were evaluated by quasi-elastic light scattering (DQEL) on the one hand and by transmission electron microscopy (TEM) on the other hand.
  • DQEL quasi-elastic light scattering
  • TEM transmission electron microscopy
  • Size plays a very important role regarding the amount of encapsulated active ingredient, the applications envisaged, and the route of administration of the active ingredient.
  • the invention also relates to a particle of size ranging from 10 nm to 100000 nm containing inclusion complexes formed by the interaction between at least:
  • a polysaccharide chosen from chitosan, dextran, hyaluronic acid, amylose, amylopectin, pullulan, heparin, chitin, cellulose derivatives, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate, cellulose sulfate, dextran sulfate, dextrin sulfate, starch, pectin, alginates, carrageenans, fucan, curdlan, xylan, polyguluronic acid, xanthan, arabinane, polymannuronic acid, and derivatives thereof, comprising hydrophobic groups selected from alkyl groups, linear or branched, containing from 2 to 1000 carbon atoms, or linear or branched, especially linear alkenyl groups, which may contain at least least 1 C C double bond, said hydrophobic groups being covalently bonded to said polysaccharide,
  • an ⁇ -cyclodextrin in the form of a monomer optionally functionalized with a ligand chosen from antibodies, antibody fragments, receptors, lectins or biotin or its derivatives.
  • the invention also relates to particles of size ranging from 10 nm to 100000 nm containing inclusion complexes formed by the interaction between:
  • a mixture of at least two polysaccharides chosen from chitosan, dextran, hyaluronic acid, amylose, amylopectin, pullulan, heparin, chitin, cellulose derivatives, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate, cellulose sulfate, dextran sulfate, dextrin sulfate, starch, pectin, alginates, carrageenans, fucan, curdlane, xylan, acid polyguluronic acid, xanthan, arabinan, polymannuronic acid, and derivatives thereof, comprising hydrophobic groups chosen from linear or branched alkyl groups containing from 2 to 1000 carbon atoms, or linear or branched alkenyl groups, in particular linear, which may contain at least one C C double bond, said hydrophobic groups being covalently bonded to said polysacc
  • At least one ⁇ -cyclodextrin in the form of a monomer optionally functionalized with a ligand chosen from antibodies, antibody fragments, receptors, lectins or biotin or its derivatives.
  • the invention also relates to an encapsulation system containing one or more previously defined particles, and a substance used for its properties in the pharmaceutical, paramedical, medical device, animal feed, agrochemical, medical, cosmetic and veterinary fields. agri-foodstuffs, pesticides, cosmetic textiles, perfumery, the environment (eg water pollution control) or in the paint, building and / or automobile industry.
  • a medical device is an instrument, apparatus, equipment or software for use in humans or animals for the purposes of: diagnosis, prevention, control, treatment or mitigation of disease , diagnosis, control, treatment, mitigation or compensation of injury or disability, study or replacement or modification of anatomy or physiological process, mastery of conception .
  • the substance has pharmaceutical properties and is chosen from inorganic compounds and organic, synthetic or natural compounds.
  • the encapsulation system previously defined according to the invention can be used to prepare appropriate compositions in the pharmaceutical, medical, paramedical, medical device, animal feed, cosmetic, veterinary, food, pesticide, cosmeto-textile, perfumery, environmental (eg water pollution control) or in the paint, packaging, building and / or automobile industry.
  • the encapsulated substance may possess pharmaceutical properties and be an active ingredient for therapeutic use. It may belong to the following list, the latter being in no way limiting, to the group of compounds with vitamin properties, in particular vitamin A, vitamin E, vitamin C, vitamin K, vitamin B, vitamin D , antitumor agents, in particular paclitaxel, docetaxel, tamoxifen, doxorubicin, painkillers, in particular paracetamol, anti-inflammatories, in particular diclofenac, ibuprofen, ketoprofen, antibiotics, in particular penicillins, tetracyclines and antifungals, in particular ketoconazole, clotrimazole, nystatin, chlorhexidine and its derivatives, antiparasitic agents, in particular albendazole, metronidazole, enzymatic agents, in particular alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, alcohol dehydrogenase, hormonal agents, in particular testosterone, levonorgestrel
  • This substance for therapeutic use can be used in humans and animals.
  • the encapsulated substance may also have cosmetic properties and belong to the group of compounds with anti-inflammatory, anti-aging, anti-ultraviolet (anti-UV), depigmenting, healing, moisturizing, fragrancing, deodorizing, antibacterial, antiperspirant, cleansing, coloring, conservative.
  • anti-UV anti-ultraviolet
  • the substance has food properties and belongs to the group of compounds with vitamin, enzymatic and sweetening properties. It can also be an essential oil, a dye, a preservative, an antioxidant, a probiotic.
  • Some molecules or families of molecules that can be encapsulated are: molsidomine, ketoconazole, gliclazide, diclofenac, levonorgestrel, paclitaxel, docetaxel, tamoxifen, hydrocortisone, pancratistatin, ketoprofen, diazepam, ibuprofen, nifedipine, testosterone, tamoxifen, furosemide, tolbutamide, chloramphenicol, benzodiazepines, naproxen, dexamethasone, diflunisal, anadamide, pilocarpine, daunorubicin, doxorubicin, essential oils, terpenes, terpenoids.
  • a solvent or a mixture of solvents especially: alkyl acetate (ethyl acetate, butyl acetate, methyl acetate), acetone, acetonitrile, acetic acid, methanoic acid, ammonia, acetic anhydride, aniline, anisole, benzene, butanol, butanone, chlorobenzene, chloroform, cyclohexane, cyclopentane, dichloroethane, dichloromethane, diisopropyl ether, dimethylformamide, dimethylsulfoxide, dioxane, water, ethanol, glycol ether, diethyl ether, ethylene glycol, heptane, hexamethylphosphoramide, hexane, methanol, methyl ethyl ketone, nitrobenzene, pentane, percgloroethylene, propano
  • alkyl acetate ethyl acetate,
  • compositions containing the encapsulation system with the active ingredient are therefore the medical, veterinary, cosmetic, cosmeto-textile, the environmental field particularly related to the depollution of water, the field of paints, building or the automobile, perfumery.
  • the invention also relates to the use of previously defined particles.
  • the invention thus relates to the use of said particles as medicaments, especially as adjuvants for vaccination, treatment of burns, and / or for cicatrization.
  • the invention also relates to the use of said particles in the preparation of medicaments having at least one activity for preventing, inhibiting and / or treating fungal, bacterial, viral and / or parasitic infections on biotic or abiotic surfaces.
  • the invention also relates to the use of said particles as veterinary medicaments, especially as adjuvants for vaccination.
  • the invention also relates to the use of particles as a cosmetic agent, especially as an anti-aging agent, depigmenting, healing, moisturizing, perfuming, deodorant, antiperspirant, cleanser, dye, preservative.
  • the invention also relates to the use of particles for the implementation of a method for preparing devices, in particular healing dressings, said devices comprising said particles, and being capable of releasing said particles or one or more substance (s) active (s) of interest contained in said particles.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition containing as active substance the substance encapsulated in the particles, in solid form, or in the form of solution or suspension in a physiological medium, optionally enriched with an excipient such as glucose, sucrose or any other pharmaceutically acceptable excipient, usable for the routes:
  • parenteral oral, cutaneous, subcutaneous, nasal, pulmonary or ocular and, for any mucosal administration, or at a specific site (tumor, light of certain blood vessels),
  • pills tablets
  • soft capsules hard capsules
  • capsules powders, granules, soluble or dispersible tablets, patch, implant, suppositories, solutions, suspension, syrup, pastes, creams, gels, emulsions, sprays, lotions, ointments, shampoos.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition containing as active substance a substance encapsulated in inclusion complexes or in particles defined above, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle, in solid form, or in the form of a solution or suspension. in a physiological medium, usable by the ways:
  • compositions in the pharmaceutical field are tablets, soft capsules, hard capsules (capsules), powders, granules, patches, implants, suppositories, solutions, suspensions, syrups, pastes, creams, gels, emulsions, sprays, lotions and ointments.
  • Advantageous forms in the paramedical field are dressings, catheters, compress, gauze, hydrophilic cotton, physiological saline, spray, etc.
  • Implants in the field of medical devices are implants, prostheses, instrument washer-disinfectors, compresses, dressings (especially healing), sprays, gauzes, hydrophilic cotton, etc.
  • oral forms tablettes, powders, soft capsules, hard capsules (capsules), granules, pastes, solutions, suspensions), injectables (solutions, suspensions) and topical agents, the action of which may be local or systemic (spray, necklaces, ear loops, powders, lotions, ointments, shampoos, patch, emulsions, milk, gel, cream).
  • Advantageous forms in the food field are solutions, emulsions, pastes, gels, powders used alone or included in food preparations; in the field of food supplements: mainly oral forms (powders, tablets, capsules, granules, soft capsules or hard capsules (capsules), pastes, solutions, suspensions, infusions).
  • the invention also relates to a cosmetic composition containing as active substance the substance encapsulated in the particles, and containing cosmetically acceptable excipients, usable in the form of gels, pastes, ointments, lotions, creams, milks, sticks, shampoos, powders, aerosols, patches.
  • the invention also relates to a process for preparing an inclusion complex comprising a mixing step:
  • a polysaccharide comprising hydrophobic groups covalently bound by a nitrogen atom or by one or more oxygen atoms to said polysaccharide
  • the process for preparing the invention of an inclusion complex comprises a mixing step:
  • a polysaccharide comprising hydrophobic groups covalently bound to the polysaccharide by a nitrogen atom of said polysaccharide
  • the method for preparing the invention of an inclusion complex comprises a step of mixing at least:
  • a polysaccharide comprising hydrophobic groups covalently bound to the polysaccharide by a nitrogen atom of said polysaccharide
  • the invention also relates to a method for preparing an inclusion complex as defined above, comprising a mixing step of at least
  • a polysaccharide in the form of a suspension in a solvent especially water comprising hydrophobic groups covalently bound to the polysaccharide by oxygen atoms of said polysaccharide, and
  • polysaccharide having hydrophobic groups of formula:
  • R 4 represents
  • a linear or branched alkyl group containing from 1 to 1000 carbon atoms in particular the groups - (CH 2 ) 4 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -CH 3 ,
  • R, R and R are hydrogen atoms, alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms, selected from methyl, ethyl, propyl, isopropyl, amino -NH 2 groups, ammonium groups - NH 3 , or sulfate groups --SO4 and are especially hydrogen atoms or methyl groups,
  • said CD being alpha-cyclodextrin ( ⁇ -CD) in monomeric form, to obtain an inclusion complex in which said polysaccharide and cyclodextrin are non-covalently bound.
  • the invention also relates to a process for preparing an inclusion complex as defined above, comprising a step of mixing at least:
  • a polysaccharide comprising hydrophobic groups covalently bound to the polysaccharide by oxygen atoms of said polysaccharide
  • ⁇ -cyclodextrin in the form of a monomer suspended in a solvent, in particular water,
  • polysaccharide having hydrophobic groups of formula:
  • a linear or branched alkyl group containing from 1 to 1000 carbon atoms in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -CH 3 ,
  • R, R and R are hydrogen atoms, alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms, selected from methyl, ethyl, propyl, isopropyl, amino -NH 2 groups, ammonium groups - NH 3 + , or sulphate -SO 2 - groups, and are in particular hydrogen atoms or methyl groups,
  • said CD being alpha-cyclodextrin ( ⁇ -CD) in monomeric form
  • the invention also relates to a process for preparing an inclusion complex as defined above, comprising a step of mixing at least:
  • polysaccharide having hydrophobic roups of formula:
  • R 4 represents A linear or branched alkyl group containing from 1 to 1000 carbon atoms, especially the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -CH 3 ,
  • R, R and R are hydrogen atoms, alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms, chosen from methyl, ethyl, propyl, isopropyl, amino -NH 2 groups, ammonium groups - NH 3 + , or sulfate groups -SO 4 2- , and are in particular hydrogen atoms or methyl groups,
  • said CD being alpha-cyclodextrin ( ⁇ -CD) in monomeric form
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a mixing step
  • a polysaccharide comprising hydrophobic groups covalently bound to the polysaccharide by oxygen atoms of said polysaccharide
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a step of mixing at least:
  • a polysaccharide comprising hydrophobic groups covalently bound to the polysaccharide by oxygen atoms of said polysaccharide
  • the invention also relates to a method for preparing an inclusion complex comprising a mixing step:
  • a chitosan comprising hydrophobic groups covalently attached to chitosan by one or more oxygen atoms of said chitosan,
  • M represents the number of units of D-glucosamine units
  • N represents the number of units of N-acetyl-D-glucosamine units
  • the degree of deacetylation representing the percentage of m in relation to the total number of units is greater than 50%
  • R 4 represents a hydrophobic group and is chosen from:
  • R 1 , R 2 and R 3 are hydrogen atoms, alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms, selected from methyl, ethyl, propyl, isopropyl, amino groups -NH 2 , ammonium groups - NH 3 + , or sulfate groups -SO 4 " , and are in particular hydrogen atoms or methyl groups,
  • said CD being alpha-cyclodextrin ( ⁇ -CD) in monomeric form
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a mixing step:
  • a plurality of polysaccharides comprising hydrophobic groups covalently attached to said polysaccharides by a nitrogen atom and / or by one or more oxygen atoms of said polysaccharides, the polysaccharides being chitosan, dextran, hyaluronic acid, amylose, amylopectin, pullulan, heparin, chitin, cellulose derivatives, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate, cellulose sulfate, dextran sulfate, dextrin sulfate starch, pectin, alginates, carrageenans, fucan, curdlan, xylan, polyguluronic acid, xanthan, arabinan, polymannuronic acid, and their derivatives,
  • polysaccharides and the cyclodextrin are non-covalently bound.
  • the use of several polysaccharides may have the advantage of modulating the properties of the particles by modifying the ratio between the polysaccharides. Thus, it is expected that the size, overall charge and target applications of these particles may be modulated.
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a mixing step: A polysaccharide chosen from chitosan, dextran, hyaluronic acid, amylose, amylopectin, puUulane, heparin, chitin, cellulose derivatives, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate, cellulose sulfate, dextran sulfate, dextrin sulfate, starch, pectin, alginates, carrageenans, fucan, curdlane, xylan, polyguluronic acid, xanthan, arabinan, polymannuronic acid, and their derivatives, and is especially chitosan, said polysaccharide comprising hydrophobic groups of formula:
  • ⁇ * represents the polysaccharide
  • ⁇ R 4 represents:
  • alkyl group linear or branched, containing from 1 to 20 carbon atoms, in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 6 -CH 3 ,
  • ⁇ P is an integer equal to 6
  • R, R and R are hydrogen atoms, alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms, selected from methyl, ethyl, propyl, isopropyl, amino -NH 2 groups, ammonium groups - NH 3 , or sulfate groups -SO 4 and are in particular hydrogen atoms or methyl groups,
  • said CD being alpha-cyclodextrin ( ⁇ -CD) in monomeric form
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a mixing step of at least
  • ⁇ * represents the polysaccharide
  • ⁇ R 4 represents:
  • a linear or branched alkyl group containing from 1 to 20 carbon atoms in particular the groups - (CH 2 ) 4 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -CH 3,
  • R, R and R are hydrogen atoms, alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms, selected from methyl, ethyl, propyl, isopropyl, amino -NH 2 groups, ammonium groups - N3 ⁇ 4, or sulfate groups -SO 4 ' , and are in particular hydrogen atoms or methyl groups,
  • said CD being alpha-cyclodextrin ( ⁇ -CD) in monomeric form, to obtain an inclusion complex in which said polysaccharide and cyclodextrin are non-covalently bound.
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a step of mixing the polysaccharide:
  • aqueous solution at a concentration of from 0.01 to 9000 g / l, in particular of from 1 to 600 g / l, and in particular approximately equal to 10 g / l, the aqueous solvent being chosen from pure water, an aqueous solution of pH ranging from 1 to 7 or 7 to 14, in particular from 5 to 7, or a physiological saline solution optionally enriched with glucose or containing any other excipient for pharmaceutical, medical, paramedical, medical devices, food animal, cosmetic, veterinary, agri-food, pesticides, cosmeto-textiles, perfumery, environmental (eg water pollution control) or in the paint, packaging, building and / or automotive industry .
  • environmental eg water pollution control
  • an aqueous medium chosen from pure water, an aqueous solution of pH of from 1 to 7 or 7 to 14, in particular of from 5 to 7, or a saline solution optionally enriched with glucose or containing any other excipient for pharmaceutical, medical, paramedical, medical devices, animal nutrition, cosmetics, veterinary, agri-food, pesticides, cosmeto-textiles, perfumery, environmental (eg water depollution) or in the industry paintings, packaging, building and / or automobile,
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a step of mixing the polysaccharide
  • aqueous solution at a concentration of from 1 to 150 g / l, in particular of from 5 to 50 g / l, and in particular approximately equal to 10 g / l, the aqueous solvent being chosen from pure water, a solution of aqueous pH ranging from 1 to 7 or 7 to 12, in particular from 5 to 7, or a physiological saline solution optionally enriched with glucose or containing any other excipient for pharmaceutical, cosmetic, agri-food or veterinary use,
  • an aqueous medium chosen from pure water, an aqueous solution of pH ranging from 1 to 7 or from 7 to 12, in particular from 5 to 7, or a saline solution optionally enriched with glucose or containing any other excipient for pharmaceutical, cosmetic, agri-food or veterinary use,
  • the step of mixing the polysaccharide in aqueous solution or dispersion is carried out at a concentration of from 0.01 to 9000 g / l, in particular from 1 to 600 g / l. L, and in particular approximately equal to 10 g / l, with a cyclodextrin, especially ⁇ ' ⁇ -CD, at a concentration of from 0.01 to 9000 g / l, in particular of from 1 to 300 g / l, and in particular about 200 g / L.
  • the step of mixing the polysaccharide in aqueous solution or dispersion is carried out at a concentration of from 1 to 150 g / l, in particular from 5 to 50 g / l, and in particular approximately equal to 10 g / l, with a cyclodextrin, ⁇ ' ⁇ -CD, at the concentration of 1 to 150 g / l, in particular of 5 to 50 g / l, and in particular approximately equal to 10 g / L.
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a step of mixing the polysaccharide in dispersion in an aqueous medium
  • the concentration of said polysaccharide being from 0.01 to 9000 g / l of aqueous medium, in particular ranging from 1 to 600 g / l of aqueous medium, and in particular being approximately equal to 1 g / l or approximately equal to 10 g / L of aqueous medium,
  • a cyclodextrin, ⁇ ' ⁇ -CD at a concentration of from 0.01 to 9000 g / l of aqueous medium, in particular of from 0.01 to 300 g / l of aqueous medium, and in particular of approximately 10 g / L aqueous medium.
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a step of mixing the polysaccharide in dispersion in an aqueous medium
  • the mass of said polysaccharide being from 1 to 150 g / l of aqueous medium, in particular being from 1 to 10 g / l of aqueous medium, and in particular being approximately equal to 1 g / l or approximately equal to 10 g / l of aqueous medium,
  • a cyclodextrin, ⁇ -CD at a concentration of from 1 to 150 g / l of aqueous medium, in particular of from 1 to 50 g / l of aqueous medium, and in particular of approximately 10 g / l of aqueous medium.
  • the complexes are also formed when the polysaccharide is used in the form of a suspension.
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a step of mixing the polysaccharide with a cyclodextrin, ⁇ -CD,
  • the mass percentage of said polysaccharide being from 0.01% to 90%, and especially from 0.5% to 50%
  • the weight percentage of the cyclodextrin being from 0.01% to 90%, and especially from 0.5% to 50%
  • the mass percentage of the water or of the aqueous medium being comprised from 10% to 99.99%, and especially from 50% to 99.5%.
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a step of mixing the polysaccharide with a cyclodextrin, ⁇ -CD,
  • the mass percentage of said polysaccharide being from 0.1% to 15%, and in particular from 0.5% to 5%,
  • the weight percentage of the cyclodextrin being from 0.1% to 15%, and especially from 0.5% to 5%,
  • the mass percentage of water or of the aqueous medium being comprised from 70% to 99.9%, and in particular from 90% to 99%.
  • stirring in particular magnetic
  • stirring speed of between 10 and 1000 rpm, in particular at a stirring speed of from 100 to 500 rpm, and in particular at a stirring speed of approximately equal at 200 rpm, at a temperature of 1 to 100 ° C, in particular at a temperature of 10 to 35 ° C, and in particular at a temperature of about 20 ° C,
  • the duration of the stirring being from 6 hours to 15 days, in particular from 24 hours to 96 hours, and in particular approximately equal to 72 hours.
  • stirring in particular magnetic stirring at a speed of between 50 and 1000 revolutions / minute, in particular at a stirring speed of 100 to 500 revolutions / minute, and in particular at a stirring speed of about equal to at 200 rpm, at a temperature of 4 to 60 ° C, in particular at a temperature of 10 to 35 ° C, and especially at a temperature of about 20 ° C,
  • the duration of stirring being from 24 hours to 15 days, in particular from 24 hours to 48 hours, and in particular approximately equal to 36 hours.
  • the process for preparing an inclusion complex also comprises a step for preparing a polysaccharide bearing hydrophobic groups, by reaction of N-acylation
  • R 4 represents: A linear or branched alkyl group containing from 1 to 1000 carbon atoms, in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -CH 3 ,
  • the process for preparing an inclusion complex also comprises a step for preparing a polysaccharide bearing hydrophobic groups, by reaction of N-acylation
  • R 4 represents:
  • a linear or branched alkyl group containing from 1 to 20 carbon atoms in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -CH 3 ,
  • the N-acylation reaction relates in particular to chitosan. It is carried out by the action of an acid chloride (Li, Y.-Y. et al., 2006, J Appl Polym Sci 102, 1968-1973), a carboxylic acid, less reactive than the chloride of acid, in the presence of the coupling agent EDCI, or by the action of acid anhydrides (Lee, KY et al., 1995, Biomaterials 16, 1211-1216, Lee, MY et al, 2005, Int J Biol Macromol, 36, 152-158; Mourya, VK and Inamdar, NN (2008) Fact Sheet Polymer 68 (6), 1013-1051).
  • Another embodiment of the process for preparing an inclusion complex comprises a step for preparing a polysaccharide bearing hydrophobic groups, by reacting O-acylation between said polysaccharide dissolved in methanesulphonate and 1 to 20 equivalents per polysaccharide unit. of fatty acid chloride, the reaction being carried out at ambient temperature,
  • a chitosan comprising hydrophobic groups covalently attached to chitosan by a nitrogen atom and / or by one or more oxygen atoms of said chitosan,
  • a chitosan comprising hydrophobic groups covalently attached to chitosan by a nitrogen atom and / or by one or more oxygen atoms of said chitosan,
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a mixing step between
  • M represents the number of units of desacetylated units
  • N represents the number of units of acetylated units
  • the degree of deacetylation representing the percentage of m in relation to the total number of units is greater than 50%
  • R 4 represents a hydrophobic group and is chosen from:
  • alkyl group linear or branched, containing from 1 to 20 carbon atoms, in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 6 -CH 3j
  • R, R and R are hydrogen atoms, alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms, selected from methyl, ethyl, propyl, isopropyl, amino -NH 2 groups, ammonium groups - N3 ⁇ 4, or sulfate groups -SO 4 " , and are in particular hydrogen atoms or methyl groups,
  • said CD being alpha-cyclodextrin ( ⁇ -CD) in monomeric form, at a concentration of from 1 to 150 g / l of aqueous medium, in particular of from 1 to 50 g of aqueous medium, and in particular of approximately 10 g / l of aqueous medium,
  • aqueous solution at the concentration of from 1 to 150 g / l, in particular being from 1 to 10 g / l, and in particular being approximately equal to 1 or approximately equal to 10 g / l,
  • the aqueous solvent being chosen from pure water, an aqueous solution of pH ranging from 1 to 7 or from 7 to 12, in particular from 5 to 7, or a physiological saline solution optionally enriched with glucose or containing any other excipient to pharmaceutical, cosmetic, agri-food or veterinary use,
  • an aqueous medium chosen from pure water, an aqueous solution of pH ranging from 1 to 7 or 7 to 12, in particular from 5 to 7, or a saline solution optionally enriched with glucose or containing any other excipient for pharmaceutical, cosmetic, agri-food or veterinary use
  • the mass of said polysaccharide being from 1 to 150 g / l of aqueous medium, in particular being from 1 to 10 g / l of aqueous medium, and in particular being equal to 1 g / L or 10 g / L of aqueous medium
  • the mass percentage of said polysaccharide being from 0.1% to 15%, and in particular from 0.5% to 5%,
  • the weight percentage of the cyclodextrin being from 0.1% to 15%, and especially from 0.5% to 5%,
  • the mass percentage of the water or of the aqueous medium being from 70% to 99.9%, and especially from 90% to 99%,
  • said mixture being carried out with stirring, in particular magnetic stirring at a speed of between 50 and 1000 revolutions / minute, in particular at a stirring speed of 100 to 500 revolutions / minute, and in particular at a stirring speed approximately equal to 200 rpm, at a temperature of 4 to 60 ° C, in particular at a temperature of 10 to 35 ° C, and especially at a temperature of about 20 ° C,
  • the duration of the stirring being between 24 hours and 15 days, in particular between 24 hours and 48 hours, and in particular approximately equal to 36 hours,
  • the process for preparing an inclusion complex comprises a mixing step between
  • ⁇ R represents
  • R 4 represents a hydrophobic group and is chosen from:
  • ⁇ is a linear or branched alkyl group containing from 1 to 1000 carbon atoms, in particular the groups - (CH 2 ) 4 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -CH 3;
  • R represents at least one group of formula
  • M represents the number of units of D-glucosamine units
  • N represents the number of units of N-acetyl-D-glucosamine units
  • R, R and R are hydrogen atoms, alkyl groups having 1 to 3 carbon atoms, chosen from methyl, ethyl, propyl, isopropyl, amino -NH 2 groups, ammonium groups - NH 3 + , or sulphate groups -S0 4 2 ⁇ , and are in particular hydrogen atoms or methyl groups,
  • said CD being alpha-cyclodextrin ( ⁇ -CD) in monomeric form
  • aqueous solvent chosen from water pure, an aqueous solution of pH of 1 to 7 or 7 to 14, in particular of 5 to 7, or a saline solution optionally enriched with glucose or containing any other excipient for pharmaceutical, medical, paramedical, medical devices animal feed, cosmetics, veterinary, agri-food, pesticides, cosmeto-textiles, perfumery, environmental (eg water pollution control) or in the paint, packaging, building and / or building industry automobile,
  • an aqueous medium chosen from pure water, an aqueous solution of pH of from 0 to 7 or 7 to 14, in particular of from 5 to 7, or a physiological saline solution optionally enriched with glucose or containing any other excipient for pharmaceutical, medical, paramedical, medical devices, animal nutrition, cosmetics, veterinary, food, pesticides, cosmetic textiles, perfumery, environmental (eg water depollution) or in the industry paintings, packaging, building and / or automobile.
  • the mass of said polysaccharide being from 0.01 to 9000 g / L of aqueous medium, in particular ranging from 1 to 60 g / L of aqueous medium, and in particular being equal to 1 g / L or 10 g / L of medium aqueous,
  • the mass percentage of said polysaccharide being from 0.01% to 90%, and especially from 0.5% to 5%,
  • the weight percentage of the cyclodextrin being from 0.01% to 90%, and especially from 0.5% to 5%,
  • the mass percentage of water or of the aqueous medium being from 10% to 99.99%, and especially from 50% to 99.5%,
  • said mixture being carried out with stirring, in particular magnetic stirring at a stirring speed of between 10 and 1000 rpm, in particular at a stirring speed of 100 to 500 rpm, and especially at a stirring speed about 200 rpm, at a temperature of 1 to 100 ° C, in particular at a temperature of 10 to 35 ° C, and especially at a temperature of about 20 ° C,
  • the duration of the stirring being between 12 hours and 15 days, in particular between 24 hours and 96 hours, and in particular approximately equal to 72 hours,
  • the invention also relates to particles obtained according to the methods described above.
  • the invention also relates to a chitosan bearing hydrophobic groups having for formula II:
  • a linear or branched alkyl group containing from 1 to 20 carbon atoms in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -CH 3 ,
  • M represents the number of units of desacetylated units
  • N represents the number of units of acetylated units
  • the degree of deacetylation representing the percentage of m relative to the total number of units is greater than 50%.
  • the invention also relates to a chitosan bearing hydrophobic groups having for formula II:
  • ⁇ R represents
  • a linear or branched alkyl group containing from 1 to 1000 carbon atoms in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -CH 3 ,
  • R represents at least one group of formula
  • M represents the number of units of D-glucosamine units
  • N represents the number of units of N-acetyl-D-glucosamine units, provided that the degree of deacetylation (DDA) representing the percentage of m relative to the total number of units is greater than 50%.
  • DDA degree of deacetylation
  • the invention also relates to a carrageenan bearing hydrophobic groups having the formula I and / u II:
  • R represents
  • a linear or branched alkyl group containing from 1 to 1000 carbon atoms in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 16 -CH 3 ,
  • R represents at least one group of formula
  • the invention also relates to a heparin carrying hydrophobic groups having the formula:
  • ⁇ R represents
  • R represents
  • a linear or branched alkyl group containing from 1 to 1000 carbon atoms in particular the groups - (CH 2) 4 --CH 3 or - (CH 2 ) 6 --CH 3 ,
  • R represents at least one group of formula
  • the invention also relates to an amylopectin bearing hydrophobic groups having the formula:
  • R represents a hydrogen atom
  • alkyl group linear or branched, containing from 1 to 1000 carbon atoms, in particular the - (CH 2) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 6 -CH 3 groups ,
  • R represents at least one group of formula
  • the invention also relates to a pullulan carrying hydrophobic groups having the formula:
  • R represents
  • R represents at least one group of formula
  • the invention also relates to a dextran bearing hydrophobic groups having the formula:
  • ⁇ R represents
  • alkyl group linear or branched, containing from 1 to 20 carbon atoms, in particular the groups - (CH 2) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 1 -CH 3 ,
  • R represents at least one group of formula
  • the invention also relates to a pectin bearing hydrophobic groups having the formula:
  • ⁇ R represents
  • R represents
  • alkyl group linear or branched, containing from 1 to 20 carbon atoms, in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or - (CH 2 ) 6 -CH 3 ,
  • R represents at least one group of formula
  • the invention also relates to hyaluronic acid bearing hydrophobic groups having the formula:
  • ⁇ R represents
  • R represents
  • a linear or branched alkyl group containing from 1 to 1000 carbon atoms in particular the groups - (CH 2 ) 14 -CH 3 or T (CH 2 ) 16 -CH 3 ,
  • R represents at least one group of formula
  • the invention also relates to a chitin bearing hydrophobic groups having the formula:
  • R represents
  • a linear or branched alkyl group containing from 1 to 1000 carbon atoms in particular the groups - (CH 2 ) 4 -CH 3 or - (CH 2) 16 -CH 3 ,
  • M represents the number of N-glucosamine units
  • ⁇ n represents the number of N-acetyl-glucosamine units
  • the invention also relates to a method for preparing an encapsulation system comprising a step of mixing particles containing inclusion complexes according to the invention,
  • said substance being previously dissolved in an aqueous medium such as water, physiological saline, said medium optionally being enriched with glucose or containing any other excipient for pharmaceutical, medical, paramedical, medical devices, animal feed, cosmetic, veterinary, agro food, pesticides, cosmeto-textiles, perfumery, environmental (water pollution for example) or in the industry of paints, packaging, building and / or automobile.
  • an aqueous medium such as water, physiological saline
  • said medium optionally being enriched with glucose or containing any other excipient for pharmaceutical, medical, paramedical, medical devices, animal feed, cosmetic, veterinary, agro food, pesticides, cosmeto-textiles, perfumery, environmental (water pollution for example) or in the industry of paints, packaging, building and / or automobile.
  • said medium optionally containing a cosolvent selected from ethanol or acetone, or a surfactant selected from polysorbate derivatives, in particular Tween 80 or Tween 40, to obtain particles containing inclusion complexes containing said substance.
  • a cosolvent selected from ethanol or acetone
  • a surfactant selected from polysorbate derivatives, in particular Tween 80 or Tween 40
  • the process for preparing an encapsulation system according to the invention comprises a mixing step:
  • a polysaccharide comprising hydrophobic groups covalently attached to the polysaccharide by a nitrogen atom and by oxygen atoms of said polysaccharide,
  • said polysaccharide being selected from chitosan, dextran, acid, hyaluronic acid, amylose, amylopectin, pullulan, heparin, chitin, cellulose derivatives, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate, cellulose sulfate, dextran sulfate, dextrin sulfate, starch, pectin, alginates, carrageenans, fucan, curdlane, xylan, polyguluronic acid, xanthan, arabinan, polymannuronic acid, and derivatives thereof, and is especially chitosan,
  • the mass percentage of said solvent being from 0 to 50% and in particular approximately equal to 25%
  • the mass percentage of said polysaccharide being from 0.1% to 15%, and in particular from 0.5% to 5%,
  • the weight percentage of the cyclodextrin being from 0.1% to 15%, and especially from 0.5% to 5%,
  • the percentage by weight of the water or of the aqueous medium being from 30% to 99.9%, and especially from 90% to 99%,
  • the step of mixing the process for preparing an encapsulation system comprises a step of dissolving the active ingredient in an aqueous medium, followed by the addition in the medium of the amphiphilic polysaccharide and ⁇ -cyclodextrin.
  • the mixture is placed under magnetic stirring for 3 days. But in a practical way, it is possible to mix all the components at the same time.
  • the particles can then be isolated
  • FIG. 1 represents the characteristic IR spectrum of N-acylated chitosan by oleic acid (1) in comparison with that of native chitosan (2).
  • Figure 2 represents the characteristic IR spectrum of N-acylated chitosan by oleic acid (1) in comparison with that of native chitosan (2).
  • Figure 2 shows the formula of unmodified chitosan and its 1 H-NMR spectrum (300 MHz) in DCl at 1% v / v in D 2 0.
  • the hydrogen atoms are numbered on the formula of the compound, these numbers appearing on the peaks of the NMR spectrum.
  • Figure 3 shows the 1H-NMR spectrum (300 MHz) of chitosan after N-acylation with oleic acid solubilized in DCl at 1% v / v in D 2 0.
  • Figure 4 shows the IR spectrum of O-palmitoyl-cbitosan (1) in comparison with native chitosan (2).
  • Figure 5 shows the proton NMR spectrum in DMSO-d 6 , O-palmitoyl-chitosan.
  • Figure 6 shows the IR spectrum of O-palmitoyl-pullulan (1) compared to that of native pullulan (2).
  • Figure 7 shows the IR spectrum of O-palmitoyl amylopectin (1) compared to that of native amylopectin (2).
  • Figure 8 shows the IR spectrum of O-palmitoyl dextran (1) compared to that of native dextran (2).
  • Figure 8bis shows the IR spectrum of O-palmitoyl-dextran
  • Figure 9 shows the IR spectrum of chitin esterified with palmitic acid (1) in comparison with that of native chitin (2).
  • Figure 9-bis shows the IR spectrum of O-palmitoyl-chitin
  • Figure 10 shows the solid 13 C-NMR spectrum of O-oleoyl-chitin.
  • Figure 11 shows the characteristic IR spectrum of O-palmitoyl heparin (1) compared to native heparin (2).
  • Figure 12 shows the characteristic IR spectrum of O-palmitoyl heparin (1) compared to native heparin (2).
  • Figure 12 shows the characteristic IR spectrum of ⁇ -striatoyl-carrageenan (1) in comparison with native carrageenan (2).
  • Figure 13 shows the characteristic IR spectrum of O-palmitoyl hyaluronic acid (1) in comparison with native hyaluronic acid (2).
  • Figure 14 shows the images obtained by transmission electron microscopy of different particle preparations.
  • FIG. 15 represents the ⁇ , ⁇ and ⁇ cyclodextrins. In the figure, the dimensions are given in Angstroms.
  • FIG. 16 represents the effect of the concentration of O-palmitoyl heparin DS 1% on the D h of the nanoparticles.
  • FIG. 17 represents the effect of the concentration of ⁇ -CD on the D h of the microparticles composed of O-palmitoyl heparin DS2.
  • FIG. 18 represents the observation in MET of particles composed of O-palmitoyl heparin DS2
  • FIG. 19 represents the effect of the concentration of ⁇ -CD on the D h of the microparticles composed of O-palmitoyl-carrageenan DS I.
  • Figure 20 shows the effect of the concentration of O-palmitoyl-carrageenan DSI on the D h of the microparticles.
  • Figure 21 shows the effect of the ⁇ -CD concentration on the D h of O-pallitoyloyl-carrageenan DS2 particles.
  • Figure 22 shows the effect of the concentration of ⁇ -palmitoyl-carrageenan DS3 on the D h of the microparticles formed.
  • Figure 23 shows the effect of the concentration of ⁇ -palmitoyl-carrageenan DS3 on the D h of the microparticles formed.
  • FIG. 23 (1) represents an image obtained by transmission electron microscopy of the preparation ⁇ -cyclodextrin / native chitosan / water (10/1/89)% indicating the absence of formation of nanoparticles or microparticles.
  • Figure 23 (2) shows nanoparticles composed of ⁇ -cyclodextrin / CM6 / water (10/1/89)%.
  • FIG. 24 (1) represents an image obtained by transmission electron microscopy of the nanoparticles at the laboratory scale.
  • FIG. 24 (2) shows an image obtained by transmission electron microscopy of the nanoparticles at the pilot scale.
  • CD cyclodextrin
  • CM modified chitosan
  • Da unit of molar mass in dalton, which corresponds to g L
  • HSV the human herpes simplex virus
  • HPV the human papillomavirus
  • RSV Respiratory syncytial virus
  • IR spectra ATR-FTIR, FT spectrometer TR-4100, JASCO: the principle consists in putting a crystal (diamond) in contact with the sample to be analyzed, before being crossed by the infrared beam.
  • Particle size measurements The particle sizes were evaluated by the hydrodynamic diameter. Measurements of the average hydrodynamic diameters of the nanoparticles and microparticles were carried out with a Nano-ZS90 nanoseries Zetasizer from Malvern Instruments SA (Orsay, France) by quasi-elastic light scattering. The samples were previously diluted by taking 30 ⁇ of suspension of nanoparticles or microparticles and diluting them in 1 ml of MilliQ ® water. Diameters The hydrodynamics of the microparticles were remeasured by a laser granulometer (MasterSizer 2000) from Malvern Instruments SA (Orsay, France).
  • TEM Transmission electron microscopy
  • Castor oil comes from the company Croda, France.
  • the molar mass of the depolymerized chitosan is determined by capillary viscometry.
  • DDA degree of deacetylation
  • the IR spectra of the grafted chitosan obtained were recorded.
  • the two curves of FIG. 1 show a very wide band between 3430 cm -1 and 3440 cm -1 corresponding to the OH groups (FIG. 1).
  • the native chitosan has a low absorption at the level of the vibration of the NH groups around 1578 cm- 1, after N-acylation, it is necessary to note the weak absorption of its derivatives in the bands 3000 cm -1 and 3600 cm -1 and the appearance of two bands 1636 cm -1 and 1657 cm -1 , characteristics of the carbonyl groups and secondary amides respectively and which confirm well the formation of the amide bond .
  • For strips to 2922 cm “, 2853 cm” ⁇ 1457 cm "1 and 1198 cm they correspond to alkyl chains of the fatty acid.
  • the characteristics of the modified chitosan CM1-CM9 are summarized in Table 1 below.
  • the degree of substitution was calculated from the results of the elemental analysis of ⁇ -acylated chitosan and native chitosan.
  • N-acyl chitosan For the characterization of N-acyl chitosan by proton NMR, a solution of polymer at a concentration of 5 g / L is prepared in deuterated water (D 2 0) in the presence of deuterated hydrochloric acid (DCl). This step allows the exchange of labile protons of the hydroxyl groups by deuterium atoms. The labile protons of the hydroxyl groups all resonant at the same frequency, their exchange by deuterium atoms makes it possible to eliminate the residual signal of the light water. In order to reduce the viscosity, the experiments were recorded at a temperature of 85 ° C with an acquisition number and a relaxation time of 5 and 1 seconds respectively.
  • the chitosan (250 kDa, 2 g) is dissolved in 20 mL of methanesulfonic acid at room temperature with continuous magnetic stirring for one hour.
  • the acid chloride (oleic or palmitic) is then introduced into the reaction medium. After 5 hours, the mixture is cooled in an ice bath to stop the reaction, a precipitate is formed. The precipitate is dialyzed for 12 hours and then neutralized with sodium bicarbonate. It is then dialyzed for 48 hours and lyophilized.
  • the IR spectrum (FIG. 4) of O-palmitoyl-chitosan shows a characteristic band of carbonyls of an ester group at 1700 cm -1 and bands at 2916 cm -1 , 2849 cm -1 correspond to the alkyl chains of the acid.
  • Example 5 Table 2, characteristics of modified chitosan CM10-CM12
  • the characteristics of the modified chitosan CM10-CM12 are summarized in Table 2 below.
  • the degree of substitution was calculated from the results of the elemental analysis of O-acylated chitosan and native chitosan.
  • O-palmitoyl-pullulan was prepared according to the reference of Sunamoto et al (Sunamoto J, Sato T, Taguchi T, Hamazaki H, Naturally occuring polysaccharid derivatives which is an artificial cell wall on an artificial liposome, Macromolecules, 1992, 25, 5665-5670).
  • Pullulan (5 g) is dissolved in anhydrous dimethylformamide (55 mL) at 60 ° C.
  • 5 ml of anhydrous pyridine and palmitoyl chloride (5 equivalents per unit of glucose triholoside) are added to the resulting solution.
  • the reaction mixture is stirred at 60 ° C for 2 h and then for 1 h at room temperature.
  • the mixture is poured into ethanol (350 mL).
  • the precipitate obtained is extracted and washed with ethanol and then with diethyl ether.
  • the white solid obtained is dried under vacuum.
  • Amylopectin (5 g) is mixed with anhydrous dimethylformamide. The mixture is stirred at 70 ° C. until the polysaccharide is completely dissolved. Then, anhydrous triethylamine and palmitoyl chloride are added and then heated under stirring for 2 hours. The solution is then diluted in methanol which is responsible for precipitation of O-palmitoyl amylopectin. The white solid obtained is filtered and then dried under vacuum.
  • IR spectrum of O-palmitoyl amylopectin 1739 cm -1 band corresponding to the carbonyl of the ester group (FIG. 7), and in particular 2916 cm- 1 , 2849 cm -1 and 1462 cm- 1 bands corresponding to the alkyl chains fatty acid.
  • Example 7bis Synthesis and Characterization of Amylopectin Derivatives Grafted with Palmitic Acid
  • the (-palnitoyl amylopectin was prepared according to the reference of Sunamoto et al (Sunamoto J, Sato T, Taguchi T, Hamazaki H, Naturally occuring polysaccharid derivatives which is an artificial cell wall on an artificial liposome, Macromolecules, 1992, 25, 5665-5670)
  • the amylopectin (5 g) is mixed with 55 ml of anhydrous dimethylformamide at 60 ° C. with continuous magnetic stirring
  • To the solution obtained are added 5 ml of anhydrous pyridine, 1.2 ml of anhydrous DMF.
  • the amount of palmitoyl chloride was varied depending on the degree of substitution desired.
  • Dextran is suspended in anhydrous dimethylformamide. The mixture is stirred at 70 ° C until complete dissolution of the polysaccharide. Then, the anhydrous triethylamine and palmitoyl chloride are added and then heated with stirring for 2 hours. The solution is then diluted in methanol which causes precipitation of O-palmitoyl dextran. The white solid obtained is filtered and then dried under vacuum.
  • IR spectrum of O-palmitoyl-dextran 1739 cm -1 band corresponding to the carbonyl of the ester group (FIG. 8), and in particular bands at 2914 cm -1 , 2853 cm -1, correspond to the alkyl chains of the fatty acid.
  • Example 8bis Synthesis and Characterization of Dextran Derivatives Grafted with Palmitic Acid
  • O-palmitoyl-dextran was prepared according to the protocol described by Sunamoto et al (Sunamoto J, Sato T, Taguchi T, Hamazaki H, Naturally occuring polysaccharid derivatives which is an artificial cell wall on an artificial liposome, Macromolecules, 1992 , 25, 5665-5670).
  • Dextran (5 g) is mixed with 55 mL of anhydrous dimethylformamide at 60 ° C. 5 ml of anhydrous pyridine and palmitoyl chloride are added to the solution obtained. The reaction mixture is stirred at 60 ° C for 2 hours and then for 1 hour at room temperature. The mixture is poured into 350 mL of ethanol. The precipitate obtained is extracted and washed with ethanol and then with diethyl ether. The white solid obtained is dried under vacuum.
  • Chitin was esterified with oleic acid according to the method described in reference (Yang B.Y., Ding Q, Montgomery R., Preparation and physical properties of chitin fatty acid esters, Carbohydrate Research, 2009, 344 (3) , 336-342).
  • Chitin (7.5 g) previously dried under vacuum at 60 ° C. for 16 hours, is introduced into a mixture of trifluoroacetic acid (75 ml) and palmitic acid or oleic acid (28 g). The mixture is then heated to 70 ° C with continuous stirring for 30 min, then cooled to room temperature.
  • trifluoroacetic acid causes the formation of the acid anhydride which is much more reactive than the carboxylic acid itself. Being strongly electronegative and having a strong acid power, trifluoroacetic acid causes the protonation of the amine functions, thus allowing a preferential esterification on the alcohol functions.
  • O-oleoyl-chitin and O-palmitoyl-chitin Characterization of O-oleoyl-chitin and O-palmitoyl-chitin: Infrared spectroscopy analysis is a fast and efficient method for identifying the chemical groups of esterified chitin compared to the native chitin spectrum.
  • the spectrum shown in FIG. 9 is typical of chitin, the frequency of the carbonyl (CO) regions of the amides between 1600 cm -1 and 1500 cm -1 is of great intensity.
  • the band corresponding to amide I is divided into two peaks at 1654 cm "1 and 1619 cm".
  • the band corresponding to amide II is unique and is 1556 cm -1 .
  • FIG. 9bis With regard to the spectrum obtained from O-palmitoyl-chitin (FIG. 9bis), we observe a greater absorption for the bands at 1649 cm -1 and 1554 cm -1 , which explains the presence of the CO and amide II carbonyl groups. thus demonstrating N-acylation of the free amino functions of chitin.
  • Figure 9bis (1) also shows bands at 2916 cm- 1 and 2849 cm- 1 corresponding to the alkyl chains of the fatty acid.
  • Characterization by I3 C-NMR of the oleic acid-esterified chitin solid is particularly suitable for the characterization of this derivative which is insoluble in water and in the majority of organic solvents.
  • the spectrum shown in FIG. 10 shows the presence of 9 resonance peaks whose values are shown in Table 3 below.
  • Example 10a Synthesis and Characterization of Heparin Grafted with Palmitic Acid DS2
  • the heparin esterified with palmitic acid is purified by dissolving in 10 ml of distilled water and adding NaCl until a NaCl concentration of 10% w / v is reached. Afterwards, 20 ml of methanol are added and the precipitate formed is recovered on a sintered glass filter and then washed with 100 ml of ethanol and then 100 ml of acetone. The solid is dried under vacuum at room temperature.
  • Carrageenan (2 g) is suspended in 10 ml of dichloromethane and 1, 2 or 3 ml of palmitic acid chloride contained in a flask.
  • O-palmitoyl-carrageenans obtained DSI, DS2 and DS3 in relation to the amount of acid chloride reacted.
  • the flask is refluxed under continuous magnetic stirring for 72 h at 30 ° C.
  • the solid is recovered on a sintered glass filter and then washed twice with 100 mL of ethanol.
  • the solid is dried under vacuum at room temperature for 12 hours.
  • Hyaluronic acid (2 g) is mixed with 10 ml of dichloromethane and 2 ml of palmitic acid chloride contained in a flask. The flask is refluxed under continuous magnetic stirring for 5 days at 30 ° C. Afterwards, the solid is recovered on a sintered glass filter and then washed twice with 100 ml of acetone. The solid is dried under vacuum at room temperature for 12 hours.
  • Infrared characterization Figure 13: Characterization by infrared spectroscopy of ⁇ -palmitoyl-hyaluronic acid showed the presence of bands corresponding to the carbonyl groups of the ester function.
  • Example 13 Formation of microparticles and nanoparticles from ⁇ -cyclodextrin and acylated polysaccharides: N-palmitoyl-chitosan and O-oleoyl-chitosan
  • microparticles and nanoparticles were formed from ⁇ -cyclodextrin and polysaccharide grafted with fatty acids.
  • the examples of the polysaccharides used are grouped in the table below.
  • the protocol consists of weighing ⁇ -cyclodextrin and the O- or N-acyl polysaccharide in a small flask. Subsequently, the distilled water is added to the mixture of ⁇ -cyclodextrin and the polysaccharide O- or N-acylated. The mixture is kept under magnetic stirring for 3 days.
  • Table 4 Sizes of particles obtained from N-acylated or O-acylated chitosan An example of an image of particles observed by electron transmission microscopy is shown in FIG. 14.
  • the protocol adopted for encapsulating the hydrophilic active principles is to dissolve the active principle in water at an initial concentration as indicated in Table 5 and then to add the amphiphilic polysaccharide and ⁇ -cyclodextrin.
  • the mixture is kept under magnetic stirring for 3 days. After the 3 days of mixing, the concentration of the active ingredient that has not been encapsulated is determined in the supernatant of the preparation.
  • the supernatant is separated either by simple sedimentation or by centrifugation of the microparticles, or after ultracentrifugation in the case of nanoparticles.
  • Example of encapsulated active molecules Example 15 Preparation and Characterization of Nanoparticles Comprising O-Palmitoyl Heparin DSI
  • the protocol consists of weighing O-palmitoyl heparin DSI and ⁇ -cyclodextrin in a vial. Subsequently, the water is added to the mixture. The whole is mixed for 72 hours at room temperature thanks to a magnetic bar.
  • the O-palmitoyl heparin DSI concentrations of ⁇ -cyclodextrin are shown in Table 6.
  • the results of hydrodynamic diameter measurements are shown in Table 6 and Figure 16.
  • O-palmitoyl heparin DS2 and ⁇ -cyclodextrin were weighed into a vial. Subsequently, the water is added to the mixture. The whole is mixed for 72 hours at room temperature thanks to a magnetic bar.
  • concentrations of ⁇ -cyclodextrin ⁇ -palmitoyl heparin DS 2 are shown in Table 7.
  • the results of hydrodynamic diameter measurements are shown in Table 7 and Figure 17.
  • Table 7 Effect of the variation of the concentration of ⁇ -CD on the hydrodynamic diameter of nanoparticles composed of heparin DS2
  • Figure 18 shows an example of images obtained by electron transmission electron microscopy observations of nanoparticles composed of heparin DS2. These images obtained without contrast agents, show that these nanoparticles self-organized in a well structured manner in the form of a hexagon.
  • the 0-palmitoyl-carrageenan DSI and ⁇ -cyclodextrin are weighed in a bottle. Subsequently, the water is added to the mixture. The whole is mixed for 72 hours at room temperature thanks to a magnetic bar.
  • the O-palmitoyl-carrageenan de ⁇ -cyclodextrin concentrations and the hydrodynamic diameter measurement results are shown in Table 8.
  • LO-palmitoyl-carrageenan DS3 as well as ⁇ -cyclodextrin are weighed into a vial. Subsequently, the water is added to the mixture. The whole is mixed for 72 hours at room temperature.
  • the ⁇ -palmitoyl-carrageenan concentrations of ⁇ -cyclodextrin and the results of hydrodynamic diameter measurements are shown in Table 11. • Variation of the amount of fl-palmitoyl-carrageenan DS3.
  • Table 11 Effect of variation of O-palmitoyl-carrageenan concentration on the hydrodynamic diameter of microparticles composed of carrageenan DS3
  • the microparticles and nanoparticles were formed from ⁇ -cyclodextrin and N-palmitoyl-chitosan CM9.
  • concentrations used are summarized in the table below.
  • the protocol consists of weighing N-palmitoyl-chitosan, ⁇ -cyclodextrin and castor oil previously marked by Sudan III. The addition of Sudan III makes it possible to detect the instability phenomena of the preparations. Subsequently, the water is added to the mixture. The whole is mixed for 72 hours at room temperature.
  • Table 12 Effect of variation of castor oil concentration on the hydrodynamic diameter of microparticles and nanoparticles composed of chitosan CM9
  • the microparticles were formed from ⁇ -cyclodextrin and O-oleoyl-chitin DS 0.68%.
  • concentrations used are grouped in the table below.
  • the protocol consists of weighing O-oleoyl-cliitin, ⁇ -cyclodextrin and castor oil previously marked by Sudan ⁇ .
  • Sudan III makes it possible to detect the instability phenomena of the preparations.
  • the water is added to the mixture. Everything is mixed for 72 hours at room temperature.
  • the preparations observed with the eye did not show phenomena of instability.
  • the results of the size measurements are summarized in the table below.
  • FIG. 23 (1) is an image obtained after observation by electron transmission microscopy which shows the absence of formation of nanoparticles or microparticles in comparison with the images of nanoparticles obtained with O-palmitoyl-chitosan CM6 / ⁇ -cyclodextrin / water (1/10/89)%.
  • Lyophilization is a vacuum drying process at low temperature.
  • the product containing water is previously frozen. Even today freeze-drying remains the method of choice for drying heat-sensitive products.
  • microparticles were prepared from ⁇ -cyclodextrin and N-oleoyl-chitosan, CM4, DS 13.47%.
  • the protocol consists of weighing N-oleoyl-chitosan and ⁇ -cyclodextrin. The concentrations used are shown in Table 14. Thereafter, water is added to the mixture. The whole is mixed for 72 hours at room temperature.
  • Freeze-drying is carried out on 1 ml of preparation containing the microparticles previously frozen at (-20 ° C.) for 12 h, then placed in the freeze-dryer for 24 h. After freeze-drying, the preparations are resuspended in 1 mL of MilliQ ® water, we note that the macroscopic appearance of the samples has not changed. In order to ensure that the lyophilization step did not modify the physicochemical characteristics of the particles, measurements of the hydrodynamic diameter were made after lyophilization and compared with those obtained before lyophilization (Table 14).
  • Scaling up is a necessity to develop this process on an industrial scale.
  • a pilot consisting of a reactor stirred by a mechanical propeller type agitator.
  • the stirring speed is set at 350 rpm.
  • the regulation of the temperature at 25 ° C is ensured by a circulation of fluid (water / ethylene glycol) connected to a thermostat.
  • the batches of 100 ml of microparticles are obtained by successively adding to the reactor (1 g) chitosan of molecular weight 250 kDa N-acylated with 10 equivalents of palmitic acid (CM9, DS 17.01%), 10 g of a-cyclodextrin and MilliQ ® water qs 100 mL.
  • Table 16 Hydrodynamic diameters of microparticles composed of a mixture of O-.
  • Table 17 Hydrodynamic Diameters of the Microparticles Comprising a Mixture of O-Palmitoyl-Chitosan and O-Palmitoyl-Pullulan
  • Table 20 Hydrodynamic Diameters of the Microparticles Comprising a Mixture of O-Palmitoyl-Chitin and O-Palmitoyl-Pullulan
  • Example 26 Antiviral activity of nanoparticles composed of O-palmitoyl heparin Cells. Kidney epithelial cells extracted from an African green monkey (cells
  • Vero (ATCC CCL-81), Hep-2 and (ATCC CCL-23) human epithelial cells and kidney epithelial cells extracted from an African green monkey (MA-104, ATCC CRL-2378.1) are grown in monolayers. in Eagle's Minimum Essential Environment (MEAT) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum and 1% antibiotic-antifungal solution (Zell Shield, Minerva Biolabs GmbH, Berlin, Germany).
  • MEAT Eagle's Minimum Essential Environment
  • the 293TT cell line derived from human kidney embryonic cells transformed with simian virus 40 large T antigen (SV40), is cultured in Dulbecco's Modified Minimal Eagle Medium (DMEM) (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). ) supplemented with 10% fetal bovine serum (FCS; Gibco-BRL), 1% Glutamax-I (Invitrogen, Carlsbad, CA) and 1% non-essential amino acids (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany). 293TT cells allow the expression of a high level of proteins from vectors containing the SV40 origin of replication due to over-replication of the expression vectors (Buck et al, 2004).
  • DMEM Dulbecco's Modified Minimal Eagle Medium
  • FCS fetal bovine serum
  • Glutamax-I Invitrogen, Carlsbad, CA
  • non-essential amino acids Sigma Aldrich, Steinheim, Germany
  • HSV-1 and HSV-2 Clinical isolates of HSV-1 and HSV-2 have been provided by Professor M. Pistello (University of Pisa, Italy). The HSV-1 and HSV-2 strains were propagated and titrated by the Vero cell plate technique.
  • the RSV strain A2 (ATCC VR-1540) was propagated and titrated by the Reed-Muench method on Hep-2 cells described previously (Donalisio et al, 2012).
  • the human rotavirus strain Wa (ATCC VR-2018) was active with 5 ⁇ g / ml with porcine type IX pork trypsin (Sigma, St. Louis, Mo.) for 30 min at 37 ° C and propagated in patients.
  • HPV PsV production Plasmids and 293TT cells used for pseudovirus (PsV) production were provided by John Schiller (National Cancer Institute, Bethesda, MD). The protocol details and plasmid maps of this study can be found at the following link: http://home.ccr.cancer.gov/lco/default.asp. HPV-16 pseudoviruses were produced according to previously described methods (Buck et al, 2005). Briefly, 293TT cells are transfected with plasmids expressing the major and minor capsid proteins of papillomavirus (respectively L1 and L2) and a reporter plasmid expressing secreted alkaline phosphatase (SEAP), pYSEAP.
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • the capsids were matured overnight in a cell lysate, the clarified supernatant was then loaded over a density gradient of 27 to 33 to 39%, Optiprep (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), at room temperature for 4 hours. The material was then centrifuged at 340,000 g for 3.5 hours at 16 ° C in an SW50.1 rotor (Beckman Coulter, Inc., FuUerton, CA) and then collected by puncture at the bottom of the tubes. Fractions are assayed for purity in glycine-10% Tris-Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) gels, titrated on 293TT cells for SEAP detection, and then pooled and frozen at -80 °. C for the desired duration. The L1 protein content of PsV stocks was determined by comparison with standard bovine serum albumin on SDS-polyacrylamide gels stained with Coomassie Blue.
  • SDS Tris-Sodium Dodecyl Sulfate
  • O-palmitoyl-hyaluronic acid and ⁇ -cyclodextrin are weighed in a bottle. Subsequently, the water is added to the mixture. The whole is mixed for 72 hours at room temperature. The concentration of ⁇ -cyclodextrin and the results of measurements of the hydrodynamic diameters are shown in Table 25.
  • the protocol adopted for encapsulating the hydrophobic active principles is to dissolve the active ingredient in an ethanol / water mixture at an initial concentration as indicated in Table 26 and then to add the amphiphilic polysaccharide and ⁇ -cyclodextrin.
  • the mixture is kept under magnetic stirring for 3 days. After the 3 days of mixing, the concentration of the active ingredient that has not been encapsulated is determined in the supernatant of the preparation. The supernatant is separated either by simple sedimentation or by centrifugation of the microparticles, or after ultracentrifugation in the case of nanoparticles.

Abstract

L'invention concerne des microparticules et nanoparticules constituées de polysaccharide hydrophobisé et d'une alpha-cyclodextrine, obtenues par auto-association dans un milieu aqueux, ledit polysaccharide hydrophobisé étant obtenu par greffage de chaînes alkyles provenant d'acides gras, par réaction d'acylation. Ces microparticules et nanoparticules constituent des systèmes utilisés pour l'encapsulation de substances d'intérêt, notamment dans le domaine pharmaceutique, et leur vectorisation à des fins thérapeutiques.

Description

Microparticules et nanoparticules constituées de polysaccharides hydrophobisés et d'une alpha-cyclodextrine
L'invention concerne des microparticules et des nanoparticules constituées de polysaccharides hydrophobisés et d'une alpha-cyclodextrine.
L'invention concerne également leur utilisation comme système d'encapsulation.
Actuellement, les particules capables de contenir et de vectôriser ou d' encapsule un principe actif font l'objet de recherches actives. Ces particules doivent être capables de piéger une substance d'intérêt, de la véhiculer dans l'organisme jusqu'à la cellule ou jusqu'au tissu cible, - puis de la libérer sans qu'il y ait altération de sa structure. Il est important que ces particules ne soient pas toxiques. Mais il existe un gros désavantage lié à leur préparation. En effet, celle-ci nécessite souvent, au cours d'une étape au moins, l'utilisation d'un solvant organique ou/et l'utilisation de tensioactifs, non biocompatibles, parfois dans des conditions d'acidité très importantes. L'élimination des molécules de solvant et/ou de tensioactif est souvent longue, incomplète et ajoute un coût à la production de la particule. Les traces rémanentes, toxiques, peuvent par ailleurs contribuer à dégrader les substances actives immobilisées dans les particules. C'est pourquoi on cherche à produire ces particules en milieu aqueux préférentiellement, à partir de polymères biocompatibles et biodégradables.
Les polysaccharides forment une classe de polymères très intéressante dans le domaine de l'encapsulation. Parmi ces polysaccharides, on retrouve le chitosane, la chitine, l'acide hyaluronique et les glycosaminoglycanes (GAGs).
Le chitosane est un hétéropolymère linéaire de N-acétyle-D-glucosamine et de D-glucosamine liés en β (1-4) selon la formule :
dans laquelle
■ m représente le nombre d'unités D-glucosamine,
■ n représente le nombre d'unités N-acétyl-D-glucosamine,
sous réserve que le pourcentage de m par rapport au nombre total d'unités soit supérieur à 50 %. Il présente l'avantage d'être biocompatible et mucoadhésif. Des nanoparticules de chitosanè ont été utilisées comme adjuvants pour la vaccination par voie muqueuse chez les animaux (Annales de Médecine Vétérinaire, 2003, 147, 343-350). Un adjuvant est une substance qui, lorsqu'elle est administrée en même temps qu'un antigène, augmente la réponse immunitaire à cet antigène. L'avantage de la vaccination par voie muqueuse est l'introduction d'une réponse immune à la porte d'entrée des microbes. Les vaccins administrés seuls par voie muqueuse ont une faible biodisponibilité. Ils doivent être co-administrés avec des substances qui favorisent leur pénétration ou avec des adjuvants.
La chitine est un hétéropolymère linéaire de N-acétyle-D-glucosamine et de D-glucosamine liés en β (1-4) selon la formule :
dans laquelle
■ m représente le nombre d'unités D-glucosamine,
■ n représente le nombre d'unités N-acétyl-D-glucosamine,
sous réserve que le pourcentage de m par rapport au nombre total d'unités soit inférieur à 50 %.
La chitine est un puissant agent hydratant, un capteur efficace de métaux lourds, responsables d'un grand nombre d'allergies de contacts. Elle est utilisée dans le traitement des brûlures car il a des propriétés cicatrisantes. La chitine est également utilisée pour filtrer les eaux usées : elle forme des chaînes ionisables qui permettent de fixer les éléments organiques. Elle est aussi insérée dans l'alimentation industrielle (fabrication de jus), en tant qu'auxiliaire technologique.
L'une des premières étapes dans la colonisation des surfaces biotiques par les microbes implique leur interaction avec les récepteurs situés au niveau des cellules tels que les glycosaminoglycanes (GAGs) notamment l'héparine, l'héparane-sulfate, l'acide hyaluronique, le dermatane sulfate, le kératane sulfate et la chondroïtine sulfate. De nombreux virus, bactéries, champignons et parasites sont capables de se lier aux GAGs contenus à la surface des cellules facilitant ainsi leur attachement initial puis l'entrée cellulaire suivie de l'infection: Des données recueillies à partir de la littérature indiquent que l'effet inhibiteur de l'héparine, l'héparane sulfate, le dermatane sulfate et la chondroïtine sulfate a été démontré sur le virus de l'herpès simplex humain (HSV) {Journal ofbacteriology, 1964, 87(5), 1060-1066, Virology. 1995, 208(2), 531-539, Journal of Virology. 1989, 63(1), 52-58), tandis que la liaison de particules mimant le papillomavirus humain (HPV) aux cellules a été inhibée par l'héparine {The Journal of Biological Chemistry. 1999, 274(9), 5810-5822). De plus, l'héparane sulfate s'est avéré jouer un rôle important dans la prévention des infections par le HPV- 16 {Journal of Virology. 2009, 83 (5), 2067-2074).
Le revêtement d'héparine de surfaces abiotiques a permis de réduire l'adhésion bactérienne de 90 % {Journal ofUrology. 1987, 138, 423-426). Les GAGs et les polysaccharides sulfatés ont montré une activité antibactérienne contre : Staphylococcus aureus, Gardnerella vaginalis, Mycobacterium tuberculosis, Listeria monocytogenes, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Yersinia enterocolitica, Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus mutas, Chlamydia trachomatis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. (US 2005/0203055).
Le revêtement d'héparine de surfaces abiotiques a permis de réduire l'adhésion de Candida albicans d'environ 50 % {Infection and Immunity. 1993, 61(11), 4560-4568).
Le brevet US 2005/0203055 a montré que la cellulose sulfate avait des propriétés :
- antivirales contre le virus d'immunodéficience humaine (VIH), le HSV, l'HPV, le papillomavirus bovin (BPV)
- antiparasitaires contre Trichomonas vaginalis,
- antifongiques contre Aspergillus niger et Candida albicans.
D'autres polysaccharides sulfatés tels que la cellulose sulfate, le carraghénane, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate ont montré une activité antimicrobienne.
L'acide hyaluronique aide à protéger les articulations en augmentant la viscosité du liquide synovial et en rendant le cartilage plus élastique. L'acide hyaluronique c'est le seul GAG non- sulfaté. L'acide hyaluronique est un constituant naturel du derme possédant un rôle important dans l'hydratation, la tonicité et l'élasticité de la peau.
Les polysaccharides greffés par des chaînes hydrophobes sont des systèmes amphiphiles capables de s'auto-associer spontanément en milieu aqueux sous forme de micelles de type cœur-couronne pouvant accueillir un principe actif {Drug Discovery Today, 2012, 17, 623- 629). Mais leur solubilité en milieu aqueux décroît à cause de la présence des chaînes greffées, hydrophobes.
L'utilisation de polysaccharides cycliques, tels que les cyclodextrines, entraîne la formation de particules constituant des systèmes d'inclusion, solubles en milieu aqueux. Ces systèmes, de taille et de structure variables, allant de la nanoparticule à l'hydrogel, sont capables de vectoriser une substance d'intérêt.
Gref et al (US2005/004348A1) décrivent des particules obtenues par greffage d'un ou plusieurs (par exemple deux) polysaccharides cycliques, tel que la béta-cyclodextrine, sur un polymère biodégradable tel que la poly(£-caprolaetone) et leur utilisation en tant que vecteurs de substances actives. Dans ce cas, le polysaccharide cyclique est lié de façon covalente au polymère biodégradable. Ce même brevet décrit la formation de nanoparticules par mélange d'un dextrane portant des chaînes lauryle et d'un polymère de béta-cyclodextrine.
Bochot et al (US2006/0188464A1 ; EP1590077B1 ; International Journal ofPharmaceutics, 2007, 339, 121) décrivent, dans leur publication et leurs demandes, des billes dont la taille varie de 1 à 3 mm, obtenues en mélangeant une huile et une solution d'alpha-cyclodextrine. Ils n'utilisent pas de polysaccharides linéaires décrits ci-dessus et, d'autre part, la taille des particules formées est millimétrique.
L'un des buts de l'invention est de fournir des complexes d'inclusion entre un polysaccharide et une cyclodextrine.
L'un des autres buts de l'invention est de proposer des microparticules ou des nanoparticules formées à partir des susdits complexes d'inclusion.
L'un des autres buts est de fournir un procédé de préparation simple desdites particules sans utiliser obligatoirement des solvants organiques ou des tensioactifs.
En outre, l'invention a pour objet l'utilisation desdites particules en tant que telle, sans obligatoirement rajouter de substance(s) d'intérêt.
L'invention a pour objet l'utilisation desdites particules pour encapsuler une ou plusieurs substance(s) d'intérêt.
L'invention concerne un complexe d'inclusion formé entre :
B un polysaccharide comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente audit polysaccharide,
■ une cyclodextrine (CD) sous forme de monomère,
le polysaccharide et la cyclodextrine étant liés de façon non-covalente.
Selon un autre aspect avantageux, l'invention concerne un complexe d'inclusion formé par l'interaction entre :
■ un polysaccharide comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente audit polysaccharide,
■ et une cyclodextrine (CD) sous forme de monomère,
le polysaccharide et la cyclodextrine étant liés de façon non-covalente. Le terme "complexe d'inclusion" désigne un système qui résulte de l'interaction d'une molécule "hôte" qui admet à l'intérieur de sa cavité une ou plusieurs autres molécules "invitées" sans qu'aucune liaison covalente ne s'établisse.
Le terme « polysaccharide » désigne une macromolécule glucidique formée par l'enchaînement d'un grand nombre de sucres élémentaires. La majorité des polysaccharides sont hydrophiles, ils portent des groupes -OH et/ou -NH2, et/ou -COOH, et/ou -CH2-OH, et/ou -S03 ", ou des groupes dérivés de ces derniers. La nature de ces groupes permet de les différencier d'un point de vue structural et d'un point de vue des propriétés physicochimiques et biologiques. Le terme « polysaccharide » désigne ici un polysaccharide linéaire ou ramifié.
L'expression « polysaccharide comportant des groupes hydrophobes » signifie que le polysaccharide a été "hydrophobisé" par greffage, sur les groupes -OH et/ou -NH2, et/ou - COOH, et/ou -CH2-OH, et/ou -S03 " de chaînes alkyles qui, par nature, sont hydrophobes en raison de leur caractère apolaire. Le « polysaccharide comportant des groupes hydrophobes » est donc un polysaccharide amphiphile. Dans certaines conditions, ces polysaccharides sont capables d'auto-association pour former des micelles de type coeur- couronne en milieu aqueux {Drug Discovery Today, 2012, 623-629).
Une « cyclodextrine » (ou cycloamylose) est un oligosaccharide cyclique de β-D-glucopyranose reliés par des liaisons a(l-4). C'est une molécule-cage d'origine naturelle qui permet d'encapsuler diverses molécules, notamment des molécules d'intérêt thérapeutique. Il en existe de différentes tailles, chacune ayant la forme d'un « abat-jour ». Elle porte des groupes hydrophiles (-OH) localisés à l'extérieur, l'ensemble délimitant une cavité relativement hydrophobe. Ce caractère amphiphile permet à la cyclodextrine d'inclure dans sa cavité des molécules hydrophobes pour former des complexes d'inclusion solubles dans l'eau. Son caractère biodégradable la prédispose à des applications importantes dans les domaines agroalimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques. L'encapsulation dans les cyclodextrines permet en effet de protéger des molécules fragiles ou d'assurer leur libération lente et contrôlée.
Le fait d'utiliser l'alpha-cyclodextrine au lieu d'un polymère de cyclodextrine représente un avantage évident d'un point de vue économique et réglementaire car cette cyclodextrine est disponible dans le commerce et reconnue comme étant un excipient pharmaceutique accepté par la majorité des pharmacopées.
L'expression « Le polysaccharide et la cyclodextrine étant liés de façon non-covalente » signifie que les interactions entre ces deux molécules sont des liaisons de Van der Waals et/ou des liaisons hydrogène, et/ou des liaisons électrostatiques, et/ou des liaisons hydrophobes, et non pas des liaisons covalentes. Ces complexes d'inclusion sont ainsi exclusivement formés par des liaisons non-covalentes par simple mélange d'alpha-cyclodextrine et de polysaccharide greffé par des groupements hydrophobes. Ainsi, en utilisant le même mode opératoire et en faisant varier le type de ces interactions non-covalentes, on peut former des particules de taille et de structure variées.
L'invention concerne ainsi un complexe d'inclusion formé par l'interaction entre au moins :
■ un polysaccharide choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, l'héparane- sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtirie sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés, ledit polysaccharide comportant des groupes hydrophobes choisis parmi les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, contenant de 2 à 1000 atomes de carbone, ou des groupes alcényles linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, pouvant contenir au moins 1 double liaison C=C, lesdits groupes hydrophobes étant liés de façon covalente audit polysaccharide,
■ et une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère,
le polysaccharide et la cyclodextrine étant liés de façon non-covalente.
De façon avantageuse, dans le complexe d'inclusion selon l'invention, le polysaccharide est composé d'au moins 3 unités saccharidiques, sa masse molaire étant en particulier comprise de 100 Da à 1000000 kDa, et notamment égale à 20 kDa, 145 kDa ou 250 kDa.
Selon un autre aspect, dans le complexe d'inclusion selon l'invention, le polysaccharide est composé d'au moins 3 unités saccharidiques, sa masse molaire étant en particulier comprise de 5 kDa à 100000 kDa, et notamment égale à 20 kDa, 145 kDa ou 250 kDa.
De façon avantageuse, le rapport entre la concentration de la cyclodextrine et la concentration du polysaccharide est compris de 10"6 à 90.0 000, en particulier compris de 4 à 15, et notamment égal à 10.
Selon un autre aspect, le rapport entre la concentration de la cyclodextrine et la concentration du polysaccharide est compris de 0,01 à 1500, en particulier compris de 4 à 15, et notamment égal à 10.
Ce paramètre est très important car il permet de moduler la taille des particules obtenues à partir des susdits complexes d'inclusion en modifiant le rapport de concentration entre la cyclodextrine et le polysaccharide. La taille moyenne des particules pourrait augmenter quand le rapport entre la concentration de la cyclodextrine et la concentration du polysaccharide diminue.
Si le rapport est inférieur à 0,01, on ne forme pas de particules. Si le rapport est supérieur à 20, on forme des particules. Au-delà d'un rapport de concentration de 1500, et notamment pour une concentration supérieure à 50 g/L, l'alpha-cyclodextrine n'est plus soluble dans l'eau.
La solubilité du polysaccharide n'est pas un facteur limitant dans la formation des particules, car celles-ci se forment même si le polysaccharide est utilisé sous forme de suspension dans l'eau. Le fait de pouvoir utiliser un polysaccharide sous forme de suspension pour formuler les nanoparticules et les microparticules présente l'avantage d'obtenir des particules plus concentrées. Grâce à cette nouvelle technologie, les polysaccharides qui étaient difficiles à formuler sous forme de nanoparticules ou de microparticules à cause de leurs problèmes de solubilité dans l'eau (notamment la chitine) trouvent ainsi un nouvel usage.
De façon avantageuse ce procédé est simple, réduit la pollution de l'environnement car les solvants, tensioactifs ou réactifs ne sont pas obligatoirement utilisés. Il diminue également la consommation énergétique. Il ne fait pas appel obligatoirement à une étape de chauffage si une étape de purification après leur préparation.
De façon avantageuse les polysaccharides gardent leurs propriétés notamment antimicrobiennes même après leur formulation sous forme de nanoparticules et microparticules
L'invention concerne en particulier un complexe d'inclusion dans lequel le polysaccharide est choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, les dérivés de la cellulose, l'héparane- sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés, et est notamment le chitosane.
Ils peuvent être neutres (dextrane par exemple), ou globalement chargés positivement (chitosane par exemple) ou négativement (héparine, l'acide hyaluronique, la pectine).
Dans un aspect particulier de l'invention, les polysaccharides ont des propriétés intrinsèques même sans rajouter de molécules actives. Le chitosane présente l'avantage d'être biocompatible, mucoadhésif et peut être utilisé comme adjuvant pour la vaccination par voie muqueuse. La chitine présente des propriétés hydratantes et cicatrisantes et a la capacité de capturer les métaux lourds et de purifier les eaux usées. Les GAGs et les polysaccharides sulfatés ont une activité pour prévenir, inhiber et/ou traiter les infections fongiques, bactériennes, virales et/ou parasitaires sur les surfaces biotiques ou abiotiques. L'acide hyaluronique connu pour favoriser l'hydratation, la tonicité et l'élasticité de la peau et à protéger les articulations en augmentant la viscosité du liquide synovial et en rendant le cartilage plus élastique.
Ces polysaccharides présentent la capacité de prévenir et d'inhiber la formation de biofilm. Un biofilm est défini comme une communauté organisée de cellules fixée à une surface biotique ou abiotique, insérée dans un matériau extracellulaire. Les biofilms sont la forme prédominante de vie des micro-organismes et constituent un mode de résistance de celles-ci aux agents antimicrobiens. Ils peuvent coloniser les surfaces biotiques telles que la surface des cellules, des tissus ou organes (comme par exemple la peau et les muqueuses buccale, nasale, oculaire, auriculaire, vaginale, rectale et/ou de l'appareil digestif) ou les surfaces abiotiques telles que le plastique, le verre, le métal ou tout autre matériau sur lequel peuvent se développer des micro-organismes.
Selon un autre mode de réalisation particulier, dans le complexe d'inclusion de l'invention, le degré de substitution du polysaccharide par les groupes hydrophobes est compris de 0,001 à 100 %, notamment compris de 0,05 à 50%.
Selon un autre mode de réalisation particulier, dans le complexe d'inclusion de l'invention, le degré de substitution du polysaccharide par les groupes hydrophobes est compris de 0,1 à 70 %, notamment égal à 2 %, 13 % ou 17 %.
Le degré de substitution reflète le nombre de groupes hydrophobes liés à 100 unités saccharidiques de la chaîne polysaccharidique. Il est déterminé par les conditions expérimentales du greffage et peut être mesuré par résonance magnétique nucléaire (RM ) ou par analyse élémentaire par exemple.
C'est aussi un paramètre permettant de moduler la taille moyenne des particules formées à partir des complexes d'inclusion. Quand le degré de substitution augmente, leur taille moyenne est susceptible de diminuer ou d'augmenter en fonction du polysaccharide utilisé.
Selon un mode de réalisation particulier, dans le complexe d'inclusion de l'invention, les groupes hydrophobes sont des groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, contenant de 2 à 1000 atomes de carbone, ou des groupes alcényles linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, pouvant contenir au moins 1 double liaison C=C.
Selon un autre mode de réalisation 'particulier, dans le complexe d'inclusion de l'invention, les groupes hydrophobes sont des groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, contenant de 2 à 20 atomes de carbone, ou des groupes alcényles linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, contenant 2 à 20 atomes de carbone et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non. Selon un mode de réalisation particulier, les groupes hydrophobes ne sont pas des groupes aromatiques.
Les acides gras utilisés pour le greffage des chaînes hydrophobes sur le polysaccharide sont notamment l'acide laurique, l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide stéarique, l'acide linoléique, cette liste n'étant en aucun cas exhaustive et limitante.
Selon un mode de réalisation particulier, dans le complexe d'inclusion de l'invention, les groupes hydrophobes sont fixés de façon covalente au polysaccharide par un atome d'azote dudit polysaccharide.
Ceci concerne les polysaccharides comportant des groupes amino, en particulier le chitosane et l'héparine.
Ces groupes amino peuvent subir une réaction de N-acylation par réaction avec un acide gras ou un dérivé d'acide gras tel qu'un chlorure d'acide gras ou un anhydride d'acide gras.
Selon un autre mode de réalisation particulier, dans le complexe d'inclusion de l'invention, les groupes hydrophobes sont fixés de façon covalente au polysaccharide par un ou plusieurs atomes d'oxygène dudit polysaccharide.
Selon un autre mode particulier de réalisation particulier, dans le complexe d'Inclusion de l'invention, les groupes hydrophobes sont fixés de façon covalente au polysaccharide par un ou plusieurs atomes d'oxygène dudit polysaccharide, et notamment au niveau de la fonction carboxylique COOH, et/ou d'un groupe CH2-OH et/ou -S03" dudit polysaccharide. Les groupes -OH sont nombreux sur les polysaccharides. Ils réagissent avec les acides gras ou des dérivés d'acides gras tels que les chlorures d'acide, les anhydrides d'acide, pour donner des esters. Le groupe hydrophobe de l'acide gras ou de son dérivé est donc greffé au polysaccharide par un de ses atomes d'oxygène, sous forme d'un groupe acyle : c'est une réaction de "O-acylation".
La réaction de O-acylation conduit à la formation de liaisons ester facilement dégradables par les estérases après administration in vivo.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, dans le complexe d'inclusion de l'invention, les groupes hydrophobes sont fixés de façon covalente au polysaccharide par un atome d'azote, de phosphore ou de soufre et par des atomes d'oxygène dudit polysaccharide dans les proportions de 0,001 à 100 %.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, dans le complexe d'inclusion de l'invention, les groupes hydrophobes sont fixés de façon covalente au polysaccharide par un atome d'azote, de phosphore ou de soufre et par des atomes d'oxygène dudit polysaccharide dans les proportions de 0,5 à 20 %.
Lorsque le polysaccharide contient des groupes amino et des groupes hydroxyles, par réaction avec les acides gras ou des dérivés d'acides gras tels que les chlorures d'acide, les anhydrides d'acide, il peut subir à la fois une N-acylation et une O-acylation. Cependant, les groupes amino sont plus réactifs que les groupes hydroxyles.
Lorsqu'on utilise le méthanesulfonate, la O-acylation du chitosane est majoritaire.
Selon un autre mode de réalisation, dans le complexe d'inclusion de l'invention, la cyclodextrine CD a pour formule :
dans laquelle
• p est un entier égal à 6,
1 2 3
• R , R et R , identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisis parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -N¾, des groupes ammonium -NH3 , ou- des groupes sulfate -S04 ", et sont notamment des atomes d'hydrogène ou des groupes méthyles, ladite CD étant Talpha-cyclodextrine (α-CD) sous forme de monomère. Les "cyclodextrines" (CD) sont des oligomères cycliques de β-D-glucopyranoses reliés par des liaisons a(l-4). Trois familles sont principalement utilisées. Il s'agit des α-, β- et γ- cyclodextrines formées respectivement de 6, 7 ou 8 sous-unités glucopyranose. p=6 correspond à la α-cyclodextrine; p=7 correspond à la β -cyclodextrine et p=8 correspond à la γ -cyclodextrine. Elles sont schématisées ci-après :
Leur géométrie est comparable à un tronc de cône délimitant une cavité en son centre. Elle est décrite dans la figure 15.
Ce sont donc des molécules cages, capables d'accueillir des molécules par d'inclusion, espèces notamment de nature hydrophobe. La taille de la cavité dépend de la nature de la cyclodextrine. La partie interne de la cavité est hydrophobe, la partie externe est hydrophile. Les groupes -OH peuvent être substitués, notamment par des groupes méthyles, hydroxypropyles ou sulfobutyles. Les substitutions peuvent augmenter la solubilité de la cyclodextrine.
La cyclodextrine uniquement utilisée dans l'invention est Ι'α-cyclodextrine. L'avantage de cette cyclodextrine est lié à sa petite taille qui lui permet d' interagir avec les chaînes hydrophobes liées au polysaccharide.
Selon un mode de réalisation particulier dans le complexe d'inclusion de l'invention, la cyclodextrine est fonctionnalisée par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines, de la biotine ou ses dérivés.
Le terme "ligand" désigne une molécule capable de se lier de façon covalente à la CD.
Le ligand est choisi parmi des composés protéiniques intervenant notamment dans la reconnaissance et/ou la neutralisation d'agents pathogènes (anti-corps ou fragments, récepteurs, lectines), intervenant dans le métabolisme des acides gras (biotine et dérivés).
Selon un autre aspect particulier, dans le complexe d'inclusion de l'invention, la cyclodextrine est chargée ou non-chargée. Selon encore un autre aspect, dans le complexe d'inclusion de l'invention, la cyclodextrine est substituée ou non-substituée.
Par « cyclodextrine substituée », on entend par exemple une cyclodextrine substituée par un groupe alkyle, par exemple une cyclodextrine méthylée, par un groupe hydroxyalkyle, par un groupe maltosyl, par un groupe galactosyl, ou par toutes autres molécules,
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, dans le complexe d'inclusion :
■ le polysaccharide est un chitosane portant des groupes hydrophobes,
■ la cyclodextrine est Γ a-CD.
Le chitosane, polysaccharide linéaire d'origine naturelle, composé aléatoirement d'unités désacétylées D-glucosamines liées en β-(1-4) à des unités acétylées N-acétyle-D- glucosamines, est produit par désacétylation chimique ou enzymatique de la chitine. Le chitosane est biocompatible, biodégradable. Il est non-toxique, bio-adhésif en raison de l'interaction entre les charges positives en milieu acide (pH< 6,0-6,5) portées par les fonctions aminés et les charges négatives portées par les membranes biologiques. Il présente aussi une activité antibactérienne et anti virale.
Le chitosane est soluble dans une solution aqueuse d'acide acétique en faible concentration par protonation des groupes amino présents. La chaîne glucosidique du chitosane est essentiellement hydrophile. Mais il est possible de greffer des groupements, en particulier hydrophobes, sur les groupes amino et hydroxyles. Le polysaccharide devient alors amphiphile et peut former des micelles, des nanoparticules mais aussi des hydrogels à plus grande concentration par auto-association en milieu aqueux. Il est donc possible d'encapsuler des principes actifs dans les objets qu'il forme. Il peut être utilisé pour encapsuler des principes actifs (paclitaxel, ibuprofène,...).
Selon un autre mode de réalisation, dans le complexe d'inclusion de l'invention, le chitosane porte des groupes hydrophobes greffés au niveau de certains atomes d'azote et a pour formule :
dans laquelle
« m représente le nombre de motifs d'unités désacétylées, ■ n représente le nombre de motifs d'unités acétylées,
sous réserve que le degré de désacétylation (DDA) représentant le pourcentage de m par rapport au nombre total d'unités soit supérieur à 50 %,
■ R4 représente le groupe hydrophobe et est choisi parmi :
n un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 20 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)i4-CH3 ou -(CH2)16-C]¾,
° un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 20 atomes de carbone et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non, notamment les groupes - (CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3.
Selon un autre mode de réalisation, dans le complexe d'inclusion de l'invention, le chitosane porte des groupes hydrophobes greffés au niveau de certains atomes d'azote et a pour formule
dans laquelle
■ m représente le nombre de motifs d'unités D-glucosamine,
■ n représente le nombre de motifs d'unités N-acétyle-D-glucosamine,
sous réserve que le degré de désacétylation (DDA) représentant le pourcentage de m par rapport au nombre total d'unités soit supérieur à 50 %,
■ R4 représente le groupe hydrophobe et est choisi parmi :
° un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
n un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et contenant au moins un double liaison C=C, notamment les groupes -(C¾)7- CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3.
Le- DDA de 50 % désigne la limite entre la chitine et le chitosane : lorsque le DDA est inférieur à 50 %, on parle de chitine, sinon on parle de chitosane.
Le groupe -(CH2)14-CH3 provient de l'acide palmitique, -(CH )16-CH3 provient de l'acide stéarique, -(CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 provient de l'acide linoléique, -(CH2)7-CH=CH- (CH2)7-CH3 provient de l'acide oléique. Le chitosane N-acylé est obtenu à partir d'une réaction de type N-acylation en présence d'un agent de couplage, l'EDCI (l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide), qui réagit avec les groupements carboxyliques de l'acide gras (oléique ou palmitique par exemple) pour former un ester intermédiaire capable de se lier aux fonctions amino libres du chitosane (Lee, K. Y., et al., Structural Détermination and Interior Polarity of Self-Aggre gâtes Prepared from Deoxycholic Acid-Modified Chitosan in Water., Macromolecules, 1998, 31 , 2, 378-383). Le schéma ci-après représente la suite de réactions réalisée pour obtenir un chitosane N-acylé, greffé par des chaînes provenant de l'acide oléique. On procède de la même façon avec les autres acides gras tels que l'acide palmitique par exemple.
Schéma : N-acylation du chitosane par l'acide oléique en présence de l'EDCI.
Les spectres IR et RMN des chitosanes greffés permettent de mettre en évidence la fonction aminé secondaire obtenue après N-acylation et la présence des chaînes alkyles greffées.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, dans le complexe d'inclusion, le chitosane porte des groupes hydrophobes greffés au niveau d'atomes d'oxygène provenant des groupes -OH et/ou des groupes -CH2OH fixés au cycle du chitosane, et ayant pour formule :
dans laquelle n, m et R ont les significations désignées ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, dans le complexe d'inclusion, le chitosane porte des groupes hydrophobes greffés au niveau d'atomes d'oxygène provenant des groupes -OH et/ou des groupes -CH2OH fixés au cycle du chitosane, et ayant pour formule :
dans laquelle
■ R représente
un atome d'hydrogène, ou
un groupe de formule
dans laquelle n, m et R ont les significations désignées ci-dessus, et sous réserve que R
représente au moins un groupe de formule
Dans "Biomacromolecules 2002, 5, 1 126-1128", Sashiwa et al. décrivent la réaction « one-pot » d'O-acylation du chitosane. Le méthylsulfonate, MeS03H, permet de protéger le - N¾ de la N-acylation pour donner majoritairement des composés greffés au niveau des atomes d'oxygène du chitosane, et plus particulièrement au niveau de la fonction -OH primaire du chitosane (-CH2OH).
Les spectres infrarouge (IR) des produits obtenus montrent une bande caractéristique d'une liaison ester à 1700 cm"1. D'autre part, les spectres RM du proton comparés à celui du chitosane natif permettent d'établir la présence des chaînes alkyles.
Selon un autre mode de réalisation particulier, dans le complexe d'inclusion de l'invention, le chitosane porte des groupes hydrophobes greffés au niveau de certains atomes d'oxygène et de certains atomes d'azote, et a pour formule :
dans laquelle
dans laquelle n, m et R4 ont les significations désignées ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation particulier, dans le complexe d'inclusion de l'invention, le chitosane porte des groupes hydrophobes greffés au niveau de certains atomes d'oxygène et de certains atomes d'azote, et a pour formule :
dans laquelle
■ R représente
un atome d'hydrogène, ou • un groupe de formule
dans laquelle n, m et R4 ont les significations dési nées ci-dessus, et sous réserve
représente au moins un groupe de formule
Selon encore un autre mode de réalisation, dans le complexe d'inclusion
■ le polysaccharide est un dextrane portant des groupes hydrophobes, fixés par des atomes d'oxygène dudit dextrane et re résentant des groupes de formule
dans laquelle
p R4 a les significations désignées ci -dessus,
α * représente le dextrane,
■ la cyclodextrine est Γ a-CD.
Le dextrane est un polymère de dextrose.
Le spectre IR de l'O-palmitoyle-dextrane montre une bande d'absorption correspondant au carbonyle du groupe ester.
Selon un autre mode de réalisation, dans le complexe d'inclusion
■ le polysaccharide est l'acide hyaluronique portant des groupes hydrophobes, fixés par des atomes d'oxygène dudit acide hyaluronique et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente l'acide hyaluronique,
■ la cyclodextrine est a-CD.
Selon encore un autre mode de réalisation, dans le complexe d'inclusion de l'invention
■ le polysaccharide est une amylopectine portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène de ladite amylopectine et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente l'acide hyaluronique,
■ la cyclodextrine est Γ a-CD.
Par comparaison des spectres IR de l'O-palmitoyle-amylopectine et de l'amylopectine native, on établit la présence du carbonyle du groupe ester chez le produit obtenu.
Selon un autre mode de réalisation, dans le complexe d'inclusion de l'invention
■ le polysaccharide est un pullulane portant des groupes hydrophobes fixés des atomes d'oxygène dudit pullulane et re résentant des groupes de formule
dans laquelle
n R4 a les significations désignées ci-dessus,
α * représente le pullulane,
■ la cyclodextrine est a-CD.
Le pullulane est constitué d'unités de maltotriose. Les trois unités de glucose qui composent le maltotriose sont reliées par une liaison osidique du type a-1,4, tandis que les maltotrioses sont connectés entre eux par des liaisons osidiques du type a- 1,6. Il est greffé, notamment par l'acide palmitique.
Par comparaison des spectres IR de l'O-palmitoyle-pullulane et du pullulane natif, on établit la présence du carbonyle du groupe ester chez le produit obtenu.
Selon un autre mode de réalisation, dans le complexe d'inclusion de l'invention
■ le polysaccharide est une héparine portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote de ladite héparine et re résentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
0 * représente l'héparine, ■ ou bien le polysaccharide est une héparine portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène de ladite héparine, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de l'héparine, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente l'héparine,
■ et la cyclodextrine est l' ct-CD.
Selon un autre aspect avantageux, dans le complexe d'inclusion de l'invention ■ le polysaccharide est un carraghénane portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote dudit carraghénane sulfate et re résentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente le carraghénane,
■ ou bien le polysaccharide est un carraghénane portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène dudit carraghénane, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de carraghénane, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
D * représente le carraghénane,
■ et la cyclodextrine est Γ a-CD.
Selon un autre aspect avantageux, dans le complexe d'inclusion de l'invention
■ le polysaccharide est un acide hyaluronique portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote dudit acide hyaluronique et représentant des groupes de formule dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente l'acide hyaluronique,
■ ou bien le polysaccharide est un acide hyaluronique portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène dudit acide hyaluronique, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de l'acide hyaluronique, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
α * représente l'acide hyaluronique,
■ et la cyclodextrine est Γ a-CD.
Selon un autre aspect avantageux, dans le complexe d'inclusion de l'invention
■ le polysaccharide est un glycosaminoglycane portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote dudit glycosaminoglycane et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente le glycosaminoglycane,
■ ou bien le polysaccharide est un glycosaminoglycane portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène dudit glycosaminoglycane, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de glycosaminoglycane, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
n R4 a les significations désignées ci-dessus,
0 * représente glycosaminoglycane,
■ et la cyclodextrine est Γ a-CD.
Selon un autre aspect avantageux, dans le complexe d'inclusion de l'invention ■ le polysaccharide est un carraghénane sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote dudit carraghénane sulfate et représentant des groupes de formule
dans laquelle
D R4 a les significations désignées ci-dessus,
a * représente le carraghénane sulfate,
■ ou bien le polysaccharide est un carraghénane sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène dudit carraghénane sulfate, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de carraghénane sulfate, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente le carraghénane sulfate,
■ et la cyclodextrine est Γ a-CD.
Selon un autre aspect avantageux, dans le complexe d'inclusion de l'invention
■ le polysaccharide est un dextrane sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote dudit dextrane sulfate et re résentant des groupes de formule
dans laquelle
α R4 a les significations désignées ci-dessus,
n * représente le. dextrane sulfate,
■ ou bien le polysaccharide est un dextrane sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène dudit dextrane sulfate, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de dextrane sulfate, et représentant des groupes de formule dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente le dextrane sulfate,
■ et la cyclodextrine est Γ a-CD.
Selon un autre aspect avantageux, dans le complexe d'inclusion de l'invention
■ le polysaccharide est une cellulose sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote de ladite cellulose sul ate et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente la cellulose sulfate,
■ ou bien le polysaccharide est une cellulose sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène de ladite cellulose sulfate, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de cellulose sulfate, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente la cellulose sulfate,
■ et la cyclodextrine est Γ a-CD.
Selon un autre aspect avantageux, dans le complexe d'inclusion de l'invention
■ le polysaccharide est une héparane sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote de ladit représentant des groupes de formule
dans laquelle
α R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente la héparane sulfate,
■ ou bien le polysaccharide est une héparane sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène de ladite héparane sulfate, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de l'héparane sulfate, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
D R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente l'héparane sulfate,
■ et la cyclodextrine est Γ a-CD.
Selon un autre aspect avantageux, dans le complexe d'inclusion de l'invention
■ le polysaccharide est une kératane sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote de ladite kératane ulfate et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente la kératane sulfate,
■ ou bien le polysaccharide est une kératane sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène de ladite kératane sulfate, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de kératane sulfate, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
D R4 a les significations désignées ci-dessus,
n * représente la kératane sulfate,
■ et la cyclodextrine est l' a-CD.
Selon un autre aspect avantageux, dans le complexe d'inclusion de l'invention
■ le polysaccharide est un chondroïtine sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote dudit chondroïtine sulfate et représentant des groupes de formule dans laquelle
D R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente le chond « roïtine sulfate,
■ ou bien le polysaccharide est un chondroïtine sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène dudit chondroïtine sulfate, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de chondroïtine sulfate, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
n R4 a les significations désignées ci-dessus,
n * représente le chondroïtine sulfate,
■ et la cyclodextrine est Γ -CD.
Selon un autre aspect avantageux, dans le complexe d'inclusion de l'invention
■ le polysaccharide est un dextrine sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote dudit dextrine sulfate et re résentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente le dextrine sulfate,
■ ou bien le polysaccharide est un dextrine sulfate portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène dudit dextrine sulfate, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de dextrine sulfate, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
0 * représente le dextrine sulfate,
■ et la cyclodextrine est Γ a-CD. Selon un mode avantageux, l'invention concerne aussi une particule de taille comprise de 10 nm à 100 000 nm contenant des complexes d'inclusion formé par l'interaction entre au moins
■ un polysaccharide comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente audit polysaccharide, éventuellement fonctionnalisé par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés,
■ une cyclodextrine sous forme de monomère, éventuellement fonctionnalisée par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés.
L'invention concerne aussi une particule de taille comprise de 50 nm à 10000 nm contenant des complexes d'inclusion entre :
■ un polysaccharide comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente audit polysaccharide, éventuellement fonctionnalisé par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés,
■ et une cyclodextrine sous forme de monomère, éventuellement fonctionnalisée par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés.
Selon un mode avantageux, l'invention concerne des particules nanométriques, de taille comprise de 10 nm à 1000 nm et des particules micrométriques de taille comprise de
1000 nm à 100000 nm.
L'invention concerne des particules nanométriques, de taille comprise de 50 nm à 1000 nm et des particules micrométriques de taille comprise de 1000 nm à 10000 nm.
Selon un aspect avantageux, l'invention concerne une particule de taille comprise de
10 nm à 100000 nm contenant des complexes d'inclusion selon l'invention formé par interaction entre au moins :
■ un polysaccharide choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le puUulane, l'héparine, la chitine, les dérivés de la cellulose, l'héparane-sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés, comportant des groupes hydrophobes choisis parmi les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés ou des groupes alcényles linéaires ou ramifiés et portant de 1 à 4 double liaisons Ç=C, conjuguées ou non, lesdits groupes hydrophobes étant liés de façon covalente audit polysaccharide, éventuellement fonctionnalisé par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés,
■ et une a-cyclodextrine sous forme de monomère, éventuellement fonctionnalisée par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés.
Les tailles des particules formées ont été évaluées par diffusion quasi-élastique de la lumière (DQEL) d'une part et par microscopie électronique à transmission (MET) d'autre part.
La taille joue un rôle très important concernant la quantité de principe actif encapsulé, les applications envisagées, et la voie d'administration du principe actif.
L'invention concerne aussi une particule de taille comprise de 10 nm à 100000 nm contenant des complexes d'inclusion formé par l'interaction entre au moins :
■ un polysaccharide choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, les dérivés de la cellulose, l'héparane-sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés, comportant des groupes hydrophobes choisis parmi les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, contenant de 2 à 1000 atomes de carbone, ou des groupes alcényles linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, pouvant contenir au moins 1 double liaison C=C, lesdits groupes hydrophobes étant liés de façon covalente audit polysaccharide, éventuellement fonctionnalisé par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés,
■ et une α-cyclodextrine sous forme de monomère, éventuellement fonctionnalisée par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention concerne également des particules de taille comprise de 10 nm à 100000 nm contenant des complexes d'inclusion formé par l'interaction entre :
■ un mélange d'au moins deux polysaccharides choisis parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, les dérivés de la cellulose, l'héparane-sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés, comportant des groupes hydrophobes choisis parmi les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, contenant de 2 à 1000 atomes de carbone, ou des groupes alcényles linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, pouvant contenir au moins 1 double liaison C=C , lesdits groupes hydrophobes étant liés de façon covalente audit polysaccharide, éventuellement fonctionnalisé par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés,
■ et d'au moins une α-cyclodextrine sous forme de monomère, éventuellement fonctionnalisée par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés.
L'invention concerne aussi un système d'encapsulation contenant une ou plusieurs particules précédemment définie(s), et une substance utilisée pour ses propriétés dans les domaines pharmaceutique, paramédical, des dispositifs médicaux, alimentation animale, agrochimie, médical, cosmétique, vétérinaire, agro-alimentaire, des pesticides, des cosméto- textiles, de la parfumerie, environnemental (dépollution des eaux par exemple) ou dans l'industrie des peintures, du bâtiment et/ou de l'automobile.
Un dispositif médical est un instrument, appareil, équipement ou encore un logiciel destiné à être utilisé chez l'homme ou chez l'animal à des fins : de diagnostic, de prévention, de contrôle, de traitement ou d'atténuation d'une maladie, de diagnostic, de contrôle, de traitement, d'atténuation ou de compensation d'une blessure ou d'un handicap, d'étude ou de remplacement ou modification de l'anatomie ou d'un processus physiologique, de maîtrise de la conception.
Selon un aspect avantageux, la substance a des propriétés pharmaceutiques et est choisie parmi les composés inorganiques et les composés organiques, synthétiques ou naturels.
Le système d'encapsulation précédemment défini selon l'invention peut être utilisé pour préparer des compositions appropriées dans les domaines pharmaceutique, médical, paramédical, dispositifs médicaux, alimentation animale, cosmétique, vétérinaire, agroalimentaire, des pesticides, des cosméto-textiles, de la parfumerie, environnemental (dépollution des eaux par exemple) ou dans l'industrie des peintures, des emballages, du bâtiment et/ou de l'automobile.
La substance encapsulée peut posséder des propriétés pharmaceutiques et être un principe actif à usage thérapeutique. Elle peut appartenir à la liste suivante, cette dernière n'étant en aucun cas limitante, au groupe des composés à propriétés vitaminiques, notamment la vitamine A, la vitamine E, la vitamine C, les vitamines K, les vitamines B, la vitamine D, anti-tumorales, notamment le paclitaxel, le docétaxel, le tamoxifène, la doxorubicine, antidouleurs, notamment le paracétamol, anti-inflammatoires, notamment le diclofénac, l'ibuprofène, le kétoprofène, antibiotiques, notamment les pénicillines, les tétracyclines, antifongiques, notamment le kétoconazole, le clotrimazole, la nystatine, la chlorhexidine et ses dérivés, antiparasitaires, notamment l'albendazole, le métronidazole, enzymatiques, notamment la phosphatase alcaline, l'acetylcholinesterase, l'alcool déshydrogénase, hormonales, notamment la testostérone, le lévonorgestrel, anxiolytiques, notamment les benzodiazépines, antidiabétiques, notamment le glicàzide, anti-hypertenseurs, notamment la nifédipine, ou vaccinales, antiviraux, notamment ΑΖΤ, analgésiques ou des combinaisons d'analgésiques, notamment le paracétamol antiépileptiques notamment les barbituriques et dérivés, anesthésiques locaux et généraux, notamment l'Atropine, mais également les hypnotiques, sédatifs, antipsychotiques, neuroleptiques, antidépresseurs, anxiolytiques, notamment antagonistes, agent bloquant neuronal, anticholinergiques, cholinomimétiques, antimuscariniques, muscariniques, notamment, antiadrénergiques, antiarythmiques, antiarthritiques, antiasthmatiques, anticonvulsif, antihistaminiques, anti-nausée, antinéoplasiques, antipyrétiques, antipruriginaux, antispasmesdiurétiques, vasodilateurs, stimulants du système nerveux central, notamment préparations contre la toux et le rhume, décongestionnant, stimulants de la croissance osseuse, inhibiteurs de la résorption osseuse, immunosuppresseurs, relaxant musculaire, psychostimulants, sédatifs, tranquillisants, protéines, peptides ou leurs fragments, lesdites protéines, peptides ou fragments étant naturels, recombinants ou produits par voie chimique, acides nucléiques (ribonucléotides ou désoxyribonucléotides), notamment les molécules simples et double brin, les construits de gène, les vecteurs d'expression, molécules anti-sens et autres du même genre.
Cette substance à usage thérapeutique peut être utilisée chez l'homme et chez l'animal.
La substance encapsulée peut aussi posséder des propriétés cosmétiques et appartenir au groupe des composés à propriétés anti-inflammatoires, anti-âge, anti-ultraviolets (anti-UV), dépigmentantes, cicatrisantes, hydratantes, parfumantes, désodorisantes, antibactériennes, anti-transpirants, nettoyantes, colorantes, conservatrices.
Dans un système d'encapsulation particulier, la substance possède des propriétés alimentaires et appartient au groupe des composés à propriétés vitaminiques, enzymatiques, édulcorantes. Elle peut aussi être une huile essentielle, un colorant, un conservateur, un anti-oxydant, un probiotique.
Quelques molécules ou familles de molécules pouvant être encapsulées sont : la molsidomine, le kétoconazole, le gliclazide, le diclofénac, le lévonorgestrel, le paclitaxel, le docétaxel, le tamoxifène, l'hydrocortisone, pancratistatin, le kétoprofène, le diazépam, l'ibuprofène , nifédipine, la testostérone, le tamoxifène, le furosémide, le tolbutamide, le chloramphénicol, les benzodiazépines, le naproxène, la dexaméthasone, le diflunisal, l'anadamide, la pilocarpine, la daunorubicine, la doxorubicine , les huiles essentielles, les terpènes, les terpénoïdes.
Pour améliorer la solubilité des molécules d'intérêt, on peut prévoir d'utiliser un ou solvant ou un mélange de solvants, notamment: acétate d'alkyle (acétate d'éthyle, acétate de butyle, acétate de méthyle), acétone, acétonitrile, acide acétique, acide méthanoïque, ammoniac, anhydride acétique, aniline, anisole, benzène, butanol, butanone, chlorobenzène, chloroforme, cyclohexane, cyclopentane, dichloroéthane, dichlorométhane, éther diisopropylique, diméthylformamide, diméthylsulfoxide, dioxane, eau, éthanol, éther de glycol, éther diéthylique, éthylène glycol, heptane, hexarnéthylphosphoramide, hexane, méthanol, méthyle éthyle cétone, nitrobenzène, pentane, percgloroéthylène, propanol, propoxypropane, pyridine, sulfure de carbone, tétrachloroéthane, tétrahydrofurane, toluène, trichloroéthane, trichloroéthylène, trèméthylpentane, xylène.
Les domaines d'utilisation des compositions contenant le système d'encapsulation avec le principe actif sont donc le domaine médical, vétérinaire, cosmétique, les cosméto-textiles, le domaine environnemental notamment lié à la dépollution des eaux, le domaine des peintures, du bâtiment ou de l'automobile, la parfumerie.
L'invention concerne également l'utilisation des particules précédemment définies. L'invention concerne ainsi l'utilisation desdites particules comme médicaments, notamment comme adjuvants pour la vaccination, le traitement des brûlures, et/ou pour la cicatrisation. L'invention concerne aussi l'utilisation desdites particules dans la préparation de médicaments ayant au moins une activité pour prévenir, inhiber et/ou traiter les infections fongiques, bactériennes, virales et/ou parasitaires sur les surfaces biotiques ou abiotiques. L'invention concerne aussi l'utilisation desdites particules comme médicaments vétérinaires, notamment comme adjuvants pour la vaccination.
L'invention concerne aussi l'utilisation des particules comme agent cosmétique, notamment comme agent anti-âge, dépigmentant, cicatrisant, hydratant, parfumant, désodorisant, anti- transpirant, nettoyant, colorant, conservateur.
L'invention concerne aussi l'utilisation des particules pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de dispositifs, notamment pansements cicatrisants, lesdits dispositifs comportant lesdites particules, et étant , susceptible de libérer lesdites particules ou une ou plusieurs substance(s) active(s) d'intérêt contenue(s) dans lesdites particules.
L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique contenant à titre de substance active la substance encapsulée dans les particules, sous forme solide, ou sous forme de solution ou de suspension dans un milieu physiologique, éventuellement enrichi avec un excipient tel que le glucose, le saccharose ou tout autre excipient pharmaceutiquement acceptable, utilisable pour les voies :
parentêrale, orale, cutanée, sous-cutanée, nasale, pulmonaire ou oculaire et, pour toute administration au niveau d'une muqueuse, ou au niveau d'un site précis (tumeur, lumière de certains vaisseaux sanguins),
sous forme de pilules (comprimés), capsules molles, capsules dures (gélules), poudres, granules, comprimés solubles ou dispersibles, patch, implant, suppositoires, solutions, suspension, sirop, pâtes, crèmes, gels, émulsions, sprays, lotions, pommades, shampoings.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique contenant à titre de substance active une substance encapsulée dans des complexes d'inclusion ou dans des particules définis précédemment, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, sous forme solide, ou sous forme de solution ou de suspension dans un milieu physiologique, utilisable par les voies :
parentêrale, orale, cutanée, sous-cutanée, nasale, pulmonaire ou oculaire et, pour toute administration au niveau d'une muqueuse, notamment sous forme de pilules (comprimés), capsules molles, capsules dures (gélules), poudres, granules, comprimés solubles ou dispersibles, patch, implant, suppositoires, solutions, suspension, sirop, pâtes, crèmes, gels, émulsions, sprays, lotions, ou pommades.
Les formes avantageuses dans le domaine pharmaceutique sont les comprimés, les capsules molles, les capsules dures (les gélules), les poudres, les granules, les patchs, les implants, les suppositoires, les solutions, les suspensions, les sirops, les pâtes, les crèmes, les gels, les émulsions, les sprays, les lotions et les pommades.
Les formes avantageuses dans le domaine paramédical sont les pansements, les cathéters, la compresse, la gaze, le coton hydrophile, le sérum physiologique, le spray...
Les formes avantageuses dans le domaine des dispositifs médicaux sont les implants, les prothèses, les laveurs-désinfëcteurs d'instruments, les compresses, les pansements (notamment cicatrisants), les sprays, les gazes, le coton hydrophile ...
Les formes avantageuses dans le domaine vétérinaire sont les formes orales (comprimés, poudres, capsules molles, capsules dures (gélules), granules, pâtes, solutions, suspensions), injectables (solutions, suspensions) et topiques dont l'action peut être locale ou systémique (spray, colliers, boucles auriculaires, poudres, lotions, pommades, shampooings, patch, émulsions, lait, gel, crème).
Les formes avantageuses dans le domaine alimentaire sont les solutions, les émulsions, les pâtes, les gels, les poudres utilisées seules ou inclues dans des préparations alimentaires; dans le domaine des compléments alimentaires : les formes orales principalement (poudres, comprimés, gélules, granules, capsules molles ou capsules dures (gélules), pâtes, solutions, suspensions, infusions).
L'invention concerne aussi une composition cosmétique contenant à titre de substance active la substance encapsulée dans les particules, et contenant des excipients cosmétiquement acceptables, utilisable sous forme de gels, pâtes, pommades, lotions, crèmes, laits, sticks, shampoings, poudres, aérosols, patchs.
L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comportant une étape de mélange :
■ d'un polysaccharide comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente par un atome d'azote ou par un ou plusieurs atomes d'oxygène audit polysaccharide,
■ et d'une cyclodextrine (CD) sous forme de monomère,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation de l'invention d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange :
■ d'un polysaccharide comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente au polysaccharide par un atome d'azote dudit polysaccharide,
■ et d'une cyclodextrine (CD) sous forme de monomère,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation de l'invention d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange d'au moins :
■ un polysaccharide comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente au polysaccharide par un atome d'azote dudit polysaccharide, et
■ une cyclodextrine (CD) sous forme de monomère,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'un complexe d'inclusion tel que défini ci-dessus, comportant une étape de mélange d'au moins
■ un polysaccharide sous forme de suspension dans un solvant, notamment l'eau comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente au polysaccharide par des atomes d'oxygène dudit polysaccharide, et
■ une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère, pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente,
et notamment comportant une étape de mélange :
■ d'un polysaccharide choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, l'héparane- sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés,
ledit polysaccharide comportant des grou es hydrophobes de formule :
dans laquelle
* représente le polysaccharide,
R4 représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)i4-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes -(CH2)7- CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3,
■ et d'une α-cyclodextrine (CD) ayant pour formule :
dans laquelle
• p est égal à 6,
• R , R et R , identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisis parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH2, des groupes ammonium - NH3 , ou des groupes sulfate -SO4 et sont notamment des atomes d'hydrogène ou des groupes méthyles,
ladite CD étant l'alpha-cyclodextrine (α-CD) sous forme de monomère, pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Dans un autre aspect, l'invention concerne également un procédé de préparation d'un complexe d'inclusion tel que défini ci-dessus, comportant une étape de mélange d'au moins:
■ un polysaccharide comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente au polysaccharide par des atomes d'oxygène dudit polysaccharide, et
■ une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère en suspension dans un solvant, notamment l'eau,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente,
et notamment comportant une étape de mélange :
■ d'un polysaccharide choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, l'héparane- sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés,
ledit polysaccharide comportant des grou es hydrophobes de formule :
dans laquelle
- * représente le polysaccharide,
- R4 représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
« un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes -(CH2)7- CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3, et
■ d'une a-cyclodextrine (CD) ayant pour formule :
dans laquelle
• p est égal à 6,
1 2 3 * *
• R , R et R , identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisis parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH2, des groupes ammonium - NH3 +, ou dés groupes sulfate -S0 2", et sont notamment des atomes d'hydrogène ou des groupes méthyles,
ladite CD étant l'alpha-cyclodextrine (α-CD) sous forme de monomère,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Dans encore un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne également un procédé de préparation d'un complexe d'inclusion tel que défini ci-dessus, comportant une étape de mélange d'au moins:
■ un polysaccharide sous forme de suspension dans un solvant, notamment l'eau comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente au polysaccharide par des atomes d'oxygène dudit polysaccharide,
H et une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère, de préférence en suspension dans un solvant, notamment l'eau,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente,
et notamment comportant une étape de mélange:
■ d'un polysaccharide choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, l'héparane- sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés,
ledit polysaccharide comportant des roupes hydrophobes de formule :
dans laquelle
- ·* représente le polysaccharide,
- R4 représente • un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)i4-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes -(CH2) - CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3, et
■ d'une α-cyclodextrine (CD) ayant pour formule :
dans laquelle
• p est égal à 6,
1 2 3
· R , R et R , identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisis parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH2, des groupes ammonium - NH3 +, ou des groupes sulfate -S04 2", et sont notamment des atomes d'hydrogène ou des groupes méthyles,
ladite CD étant l'alpha-cyclodextrine (α-CD) sous forme de monomère,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange
■ d'un polysaccharide comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente au polysaccharide par des atomes d'oxygène dudit polysaccharide,
■ et d'une cyclodextrine (CD) sous forme de monomère,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Selon un autre aspect avantageux de réalisation, le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange d'au moins :
■ un polysaccharide comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente au polysaccharide par des atomes d'oxygène dudit polysaccharide,
■ et une cyclodextrine (CD) sous forme de monomère,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente. L'invention concerne également un procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comportant une étape de mélange :
■ d'un chitosane comportant des groupes hydrophobes fixés de façon covalente au chitosane par un ou plusieurs atomes d'oxygène dudit chitosane,
■ et d'une α-cyclodextrine (CD),
et notamment comportant une étape de mélange entre un chitosane de formule I :
ou un chitosane de formu
dans lesquelles
■ m représente le nombre de motifs d'unités D-glucosamine,
■ n représente le nombre de motifs d'unités N-acétyle-D-glucosamine,
sous réserve que le degré de désacétylation représentant le pourcentage de m par rapport au nombre total d'unités soit supérieur à 50 %,
■ R4 représente un groupe hydrophobe et est choisi parmi :
α un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)i4-CH3 ou -(CH2)16-CH3;
° un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non, notamment les groupes - (CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3,
► et une ct-cyclodextrine (CD) de formule :
dans laquelle
• p est égal à 6,
• R1, R2 et R3, identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisis parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH2, des groupes ammonium - NH3 +, ou des groupes sulfate -S04 ", et sont notamment des atomes d'hydrogène ou des groupes méthyles,
ladite CD étant l'alpha-cyclodextrine (α-CD) sous forme de monomère,
à la concentration comprise de 0,01 à 9000 g/L de milieu aqueux, en particulier comprise de 1 à 300 g/L de milieu aqueux, et notamment égale à environ 200 g/L de milieu aqueux, pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel le chitosane de formule I et la cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Selon un mode particulier de réalisation, le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange :
■ de plusieurs polysaccharides comportant des groupes hydrophobes fixés de façon covalente aux susdits polysaccharides par un atome d'azote ou/et par un ou plusieurs atomes d'oxygène desdits polysaccharides, les polysaccharides étant le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, les dérivés de la cellulose, Phéparane-sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés,
■ une cyclodextrine (CD),
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel les polysaccharides et la cyclodextrine sont liés de façon non-covalente. L'utilisation de plusieurs polysaccharides peut présenter l'avantage de moduler les propriétés des particules en modifiant le rapport entre les polysaccharides. Ainsi, il est attendu que la taille, la charge globale et les applications visées de ces particules peuvent être modulées.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange : ■ d'un polysaccharide choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le puUulane, l'héparine, la chitine, les dérivés de la cellulose, l'héparane-sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés, et est notamment le chitosane, ledit polysaccharide comportant des groupes hydrophobes de formule :
dans laquelle
■ * représente le polysaccharide,
■ R4 représente :
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 20 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)i6-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 20 atomes de carbone et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non, notamment les groupes -(CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3, et
■ d'une cyclodextrine (CD) ayant pour formule :
dans laquelle
· p est un entier égal à 6,
• R , R et R , identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisis parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH2, des groupes ammonium - NH3 , ou des groupes sulfate -S04 et sont notamment des atomes d'hydrogène ou des groupes méthyles,
ladite CD étant l'alpha-cyclodextrine (α-CD) sous forme de monomère,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange d'au moins
■ un polysaccharide choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le puUulane, l'héparine, la chitine, les dérivés de la cellulose, l'héparane-sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés, et est notamment le chitosane, ledit polysaccharide comportant des roupes hydrophobes de formule :
dans laquelle
■ * représente le polysaccharide,
■ R4 représente :
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 20 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)i4-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 20 atomes de carbone et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non, notamment les groupes -(CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3,
'une cyclodextrine (CD) ayant pour formule :
dans laquelle
• p est un entier égal à 6,
• R , R et R , identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisis parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH2, des groupes ammonium - N¾ , ou des groupes sulfate -SO4 ', et sont notamment des atomes d'hydrogène ou des groupes méthyles,
ladite CD étant l'alpha-cyclodextrine (α-CD) sous forme de monomère, pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Selon un aspect particulier, le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange du polysaccharide:
■ en solution aqueuse à la concentration comprise de 0,01 à 9000 g/L, en particulier comprise de 1 à 600 g/L, et notamment environ égale à 10 g/L, le solvant aqueux étant choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 1 à 7 ou de 7 à 14, notamment compris de 5 à 7, ou une solution de sérum physiologique éventuellement enrichie de glucose ou contenant tout autre excipient à usage pharmaceutique, médical, paramédical, dispositifs médicaux, alimentation animale, cosmétique, vétérinaire, agro-alimentaire, des pesticides, des cosméto-textiles, de la parfumerie, environnemental (dépollution des eaux par exemple) ou dans l'industrie des peintures, des emballages, du bâtiment et/ou de l'automobile.
■ ou en dispersion dans un milieu aqueux choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 1 à 7 ou de 7 à 14, notamment compris de 5 à 7, ou une solution de sérum physiologique éventuellement enrichie de glucose ou contenant tout autre excipient à usage pharmaceutique, médical, paramédical, dispositifs médicaux, alimentation animale, cosmétique, vétérinaire, agro-alimentaire, des pesticides, des cosméto-textiles, de la parfumerie, environnemental (dépollution des eaux par exemple) ou dans l'industrie des peintures, des emballages, du bâtiment et/ou de l'automobile,
avec une cyclodextrine, Γα-CD.
Le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange du polysaccharide
■ en solution aqueuse à la concentration comprise de 1 à 150 g/L, en particulier comprise de 5 à 50 g/L, et notamment environ égale à 10 g/L, le solvant aqueux étant choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 1 à 7 ou de 7 à 12, notamment compris de 5 à 7, ou une solution de sérum physiologique éventuellement enrichie de glucose ou contenant tout autre excipient à usage pharmaceutique, cosmétique, agro-alimentaire ou vétérinaire,
■ ou en dispersion dans un milieu aqueux choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 1 à 7 ou de 7 à 12, notamment compris de 5 à 7, ou une solution de sérum physiologique éventuellement enrichie de glucose ou contenant tout autre excipient à usage pharmaceutique, cosmétique, agro-alimentaire ou vétérinaire,
avec une cyclodextrine, Γα-CD. Dans le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion, l'étape de mélange du polysacchande en solution ou dispersion aqueuse se fait à une concentration comprise de 0,01 à 9000 g/L, en particulier comprise de 1 à 600 g/L, et notamment environ égale à 10 g/L, avec une cyclodextrine, notamment Ι'α-CD, à la concentration comprise de 0,01 à 9000 g/L, en particulier comprise de 1 à 300 g/L, et notamment environ égale à 200 g/L.
Dans le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion, l'étape de mélange du polysacchande en solution ou dispersion aqueuse se fait à une concentration comprise de 1 à 150 g/L, en particulier comprise dé 5 à 50 g/L, et notamment environ égale à 10 g/L, avec une cyclodextrine, Ι'α-CD, à la concentration comprise de 1 à 150 g/L, en particulier comprise de 5 à 50 g/L, et notamment environ égale à 10 g/L.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange du polysacchande en dispersion dans un milieu aqueux,
la concentration dudit polysacchande étant comprise de 0,01 à 9000 g/L de milieu aqueux, en particulier étant comprise de 1 à 600 g/L de milieu aqueux, et notamment étant environ égale à 1 g/L ou environ égale à 10 g/L de milieu aqueux,
avec une cyclodextrine, Ι'α-CD, à la concentration comprise de 0,01 à 9000 g/L de milieu aqueux, en particulier comprise de 0,01 à 300 g/L de milieu aqueux, et notamment égale à environ 10 g/L de milieu aqueux.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange du polysacchande en dispersion dans un milieu aqueux,
la masse dudit polysacchande étant comprise de 1 à 150 g/L de milieu aqueux, en particulier étant comprise de 1 à 10 g/L de milieu aqueux, et notamment étant environ égale à 1 g/L ou environ égale à 10 g/L de milieu aqueux,
avec une cyclodextrine, Γα-CD, à la concentration comprise de 1 à 150 g/L de milieu aqueux, en particulier comprise de 1 à 50 g/L de milieu aqueux, et notamment égale à environ 10 g/L de milieu aqueux.
Les complexes se forment aussi lorsque le polysacchande est utilisé sous forme d'une suspension.
Le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange du polysaccharide avec une cyclodextrine, Γα-CD,
• le pourcentage massique dudit polysaccharide étant compris de 0,01 % à 90 %, et notamment de 0,5 % à 50 %, • le pourcentage massique de la cyclodextrine étant compris de 0,01 % à 90 %, et notamment de 0,5 % à 50 %,
• le pourcentage massique de l'eau ou du milieu aqueux étant compris de 10 % à 99,99 %, et notamment de 50 % à 99,5 %.
Le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange du polysaccharide avec une cyclodextrine, Γα-CD,
• le pourcentage massique dudit polysaccharide étant compris de 0,1 % à 15 %, et notamment de 0,5 % à 5 %,
• le pourcentage massique de la cyclodextrine étant compris de 0,1 % à 15 %, et notamment de 0,5 % à 5 %,
• le pourcentage massique de l'eau ou du milieu aqueux étant compris de 70 % à 99,9 %, et notamment de 90 % à 99 %.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de préparation d'un complexe d'inclusion, l'étape de mélange du polysaccharide avec une cyclodextrine, l'a-CD,
est effectuée sous agitation, notamment magnétique, à une vitesse d'agitation comprise de 10 à 1000 tours/minute, en particulier à une vitesse d'agitation comprise de 100 à 500 tours/minute, et notamment à une vitesse d'agitation environ égale à 200 tours/minutes, à une température comprise de 1 à 100 °C, en particulier à une température comprise de 10 à 35 °C, et notamment à une température environ égale à 20 °C,
la durée de l'agitation étant comprise de 6 heures à 15 jours, en particulier comprise de 24 heures à 96 heures, et notamment environ égale à 72 heures.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de préparation d'un complexe d'inclusion, l'étape de mélange du polysaccharide avec une cyclodextrine, l'a-CD,
est effectuée sous agitation, notamment magnétique, à une vitesse d'agitation comprise de 50 à 1000 tours/minute, en particulier à une vitesse d'agitation comprise de 100 à 500 tours/minute, et notamment à une vitesse d'agitation environ égale à 200 tours/minutes, à une température comprise de 4 à 60 °C, en particulier à une température comprise de 10 à 35 °C, et notamment à une température environ égale à 20 °C,
la durée de l'agitation étant comprise de 24 heures à 15 jours, en particulier comprise de 24 heures à 48 heures, et notamment environ égale à 36 heures.
Le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte aussi une étape de préparation d'un polysaccharide portant des groupes hydrophobes, par réaction de N-acylation
■ entre le polysaccharide et un chlorure d'acide de formule R4-C(0)C1,
dans laquelle
R4 représente : • un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes - (CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3,
■ ou entre le polysaccharide et un acide gras de formule R4-C02H, dans laquelle R4 a les significations désignées ci-dessus,
en présence d'un agent de couplage tel que le chlorure de N-(3-dimethylaminopropyle)-N- éthylcarbodiimide (EDCI) à température ambiante pendant 24 heures,
« ou bien entre le polysaccharide et un anhydride cyclique d'acide de formule R4-CO-0-CO- R4, dans laquelle R4 a les significations désignées ci-dessus,
pour donner un polysaccharide portant des groupes hydrophobes fixés de façon covalente au polysaccharide par un atome d'azote dudit polysaccharide.
Le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte aussi une étape de préparation d'un polysaccharide portant des groupes hydrophobes, par réaction de N-acylation
■ entre le polysaccharide et un chlorure d'acide de formule R -C(0)C1,
dans laquelle
R4 représente : '
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 20 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 20 atomes de carbone et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non, notamment les groupes -(CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(C¾)7- CH=CH-(CH2)7-CH3,
■ ou entre le polysaccharide et un acide gras de formule R4-C02H, dans laquelle R4 a les significations désignées ci-dessus,
en présence d'un agent de couplage tel que le chlorure de N-(3-dimethylaminopropyle)-/V- éthylcarbodiimide (EDCI) à température ambiante pendant 24 heures,
■ ou bien entre le polysaccharide et un anhydride cyclique d'acide de formule R4-CO-0-CO- R4, dans laquelle R4 a les significations désignées ci-dessus,
pour donner un polysaccharide portant des groupes hydrophobes fixés de façon covalente au polysaccharide par un atome d'azote dudit polysaccharide.
La réaction de N-acylation concerne en particulier le chitosane. Elle est réalisée par action d'un chlorure d'acide (Li, Y- Y. et al, 2006, J Appl. Polym. Sci. 102, 1968-1973), d'un acide carboxylique, moins réactif que le chlorure d'acide, en présence de l'agent de couplage EDCI, ou par action d'anhydrides d'acides (Lee, K.Y. et al., 1995, Biomaterials 16, 1211 - 1216 ; Lee, M. Y. et al, 2005, Int. J. Biol. Macromol, 36, 152-158 ; Mourya, V.K and Inamdar, N.N. (2008). React. Funct. Polym. 68 (6), 1013-1051).
Un autre mode du procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de préparation d'un polysaccharide portant des groupes hydrophobes, par réaction de O- acylation entre ledit polysaccharide dissous dans du méthanesulfonate et 1 à 20 équivalents par unité de polysaccharide, de chlorure d'acide gras, la réaction étant effectuée à température ambiante,
lesdits polysaccharide et chlorure d'acide étant désignés précédemment,
pour donner un polysaccharide portant des groupes hydrophobes fixés de façon covalente au polysaccharide par un ou plusieurs atomes d'oxygène dudit polysaccharide.
Un autre mode du procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange d'au moins :
■ un chitosane comportant des groupes hydrophobes fixés de façon covalente au chitosane par un atome d'azote ou/et par un ou plusieurs atomes d'oxygène dudit chitosane,
■ et une cyclodextrine (CD),
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel le chitosane et la cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Un autre mode du procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange d'au moins :
■ un chitosane comportant des groupes hydrophobes fixés de façon covalente au chitosane par un atome d'azote ou/et par un ou plusieurs atomes d'oxygène dudit chitosane,
■ et une cyclodextrine (CD),
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel le chitosane et la cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange entre
► un chitosane de formule :
ou un chitosane de formule :
dans lesquelles
■ m représente le nombre de motifs d'unités désacétylées,
■ n représente le nombre de motifs d'unités acétylées,
sous réserve que le degré de désacétylation représentant le pourcentage de m par rapport au nombre total d'unités soit supérieur à 50 %,
■ R4 représente un groupe hydrophobe et est choisi parmi :
° un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 20 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)i6-CH3j
D un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 20 atomes de carbone et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non, notamment les groupes - (CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3,
► et une cyclodextrine (CD) de formule :
dans laquelle
• p est un entier égal à 6,
1 2 3
• R , R et R , identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisis parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH2, des groupes ammonium - N¾ , ou des groupes sulfate -S04 ", et sont notamment des atomes d'hydrogène ou des groupes méthyles,
ladite CD étant l'alpha-cyclodextrine (α-CD) sous forme de monomère, à la concentration comprise de 1 à 150 g/L de milieu aqueux, en particulier comprise de 1 à 50 g L de milieu aqueux, et notamment égale à environ 10 g/L de milieu aqueux,
lesdits chitosanes de formule I ou II étant
• en solution aqueuse à la concentration comprise de 1 à 150 g/L, en particulier étant comprise de 1 à 10 g/L, et notamment étant environ égale à 1 ou environ égale à 10 g/L,
le solvant aqueux étant choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 1 à 7 ou de 7 à 12, notamment compris de 5 à 7, ou une solution de sérum physiologique éventuellement enrichie de glucose ou contenant tout autre excipient à usage pharmaceutique, cosmétique, agro-alimentaire ou vétérinaire,
• ou en dispersion dans un milieu aqueux choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 1 à 7 ou de 7 à 12, notamment compris de 5 à 7, ou une solution de sérum physiologique éventuellement enrichie de glucose ou contenant tout autre excipient à usage pharmaceutique, cosmétique, agro-alimentaire ou vétérinaire, la masse dudit polysaccharide étant comprise de 1 à 150 g/L de milieu aqueux, en particulier étant comprise de 1 à 10 g/L de milieu aqueux, et notamment étant égale à 1 g/L ou 10 g/L de milieu aqueux,
• le pourcentage massique dudit polysaccharide étant compris de 0,1 % à 15 %, et notamment de 0,5 % à 5 %,
· le pourcentage massique de la cyclodextrine étant compris de 0,1 % à 15 %, et notamment de 0,5 % à 5 %,
• le pourcentage massique de l'eau ou du milieu aqueux étant compris de 70 % à 99,9 %, et notamment de 90% à 99%,
ledit mélange étant effectué sous agitation, notamment magnétique, à une vitesse d'agitation comprise de 50 à 1000 tours/minute, en particulier à une vitesse d'agitation comprise de 100 à 500 tours/minute, et notamment à une vitesse d'agitation environ égale à 200 tours/minutes, à une température comprise de 4 à 60 °C, en particulier à une température comprise de 10 à 35 °C, et notamment à une température environ égale à 20 °C,
la durée de l'agitation étant comprise de 24 heures à 15 jours, en particulier comprise de 24 heures à 48 heures, et notamment environ égale à 36 heures,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel le chitosane de formule I ou II et la cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un complexe d'inclusion comporte une étape de mélange entre
►un chitosane de formule :
dans laquelle
■ R représente
• un atome d'hydrogène, ou
• un groupe de formule dans laquelle
■ R4 représente un groupe hydrophobe et est choisi parmi :
α un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)i4-CH3 ou -(CH2)16-CH3;
α un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes -(CH2)7-CH=CH- CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3,
sous réserve que R représente au moins un groupe de formule
■ m représente le nombre de motifs d'unités D-glucosamine,
■ n représente le nombre de motifs d'unités N-acétyle-D-glucosamine,
sous réserve que le pourcentage de m par rapport au nombre total d'unités soit supérieur à 50 %, ► et une cyclodextrine (CD) de formule :
dans laquelle
• p est un entier égal à 6,
· R , R et R , identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisis parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH2, des groupes ammonium - NH3 +, ou des groupes sulfate -S04 2~, et sont notamment des atomes d'hydrogène ou des groupes méthyles,
ladite CD étant l'alpha-cyclodextrine (α-CD) sous forme de monomère,
à la concentration comprise de 0,01 à 9000 g/L de milieu aqueux, en particulier comprise de 1 à 300 g/L de milieu aqueux, et notamment égale à environ 200 g/L de milieu aqueux, lesdits chitosanes de formule I ou II étant
• en solution aqueuse à la concentration comprise de 0,01 à 9000 g/L, en particulier étant comprise de 1 à 300 g/L, et notamment étant environ égale à 200 g/L, le solvant aqueux étant choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 1 à 7 ou de 7 à 14, notamment compris de 5 à 7, ou une solution de sérum physiologique éventuellement enrichie de glucose ou contenant tout autre excipient à usage pharmaceutique, médical, paramédical, dispositifs médicaux, alimentation animale, cosmétique, vétérinaire, agro-alimentaire, des pesticides, des cosméto-textiles, de la parfumerie, environnemental (dépollution des eaux par exemple) ou dans l'industrie des peintures, des emballages, du bâtiment et/ou de l'automobile,
• ou en dispersion dans un milieu aqueux choisi parmi l'eau pure, une solution aqueuse de pH compris de 0 à 7 ou de 7 à 14, notamment compris de 5 à 7, ou une solution de sérum physiologique éventuellement enrichie de glucose ou contenant tout autre excipient à usage pharmaceutique, médical, paramédical, dispositifs médicaux, alimentation animale, cosmétique, vétérinaire, agro-alimentaire, des pesticides, des cosméto- textiles, de la parfumerie, environnemental (dépollution des eaux par exemple) ou dans l'industrie des peintures, des emballages, du bâtiment et/ou de l'automobile. la masse dudit polysaccharide étant comprise de 0,01 à 9000 g/L de milieu aqueux, en particulier étant comprise de 1 à 60 g/L de milieu aqueux, et notamment étant égale à 1 g/L ou 10 g/L de milieu aqueux,
• le pourcentage massique dudit polysaccharide étant compris de 0,01 % à 90 %, et notamment de 0,5 % à 5 %,
• le pourcentage massique de la cyclodextrine étant compris de 0,01 % à 90 %, et notamment de 0,5 % à 5 %,
• le pourcentage massique de l'eau ou du milieu aqueux étant compris de 10 % à 99,99 %, et notamment de 50% à 99,5%,
ledit mélange étant effectué sous agitation, notamment magnétique, à une vitesse d'agitation comprise de 10 à 1000 tours/minute, en particulier à une vitesse d'agitation comprise de 100 à 500 tours/minute, et notamment à une vitesse d'agitation environ égale à 200 tours/minutes, à une température comprise de 1 à 100 °C, en particulier à une température comprise de 10 à 35 °C, et notamment à une température environ égale à 20 °C,
la durée de l'agitation étant comprise de 12 heures à 15 jours, en particulier comprise de 24 heures à 96 heures, et notamment environ égale à 72 heures,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel le chitosane de formule I ou II et la cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
Dans un autre aspect, l'invention concerne aussi des particules obtenue selon les procédés décrits ci-dessus.
L'invention concerne également un chitosane portant des groupes hydrophobes ayant pour formule II :
dans laquelle
■ R4 représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 20 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 20 atomes de carbone et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non, notamment les groupes -(CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7- CH=CH-(CH2)7-CH3,
■ m représente le nombre de motifs d'unités désacétylées,
■ n représente le nombre de motifs d'unités acétylées,
sous réserve que le degré de désacétylation représentant le pourcentage de m par rapport au nombre total d'unités soit supérieur à 50 %.
L'invention concerne également un chitosane portant des groupes hydrophobes ayant pour formule II :
dans laquelle
■ R représente
un atome d'hydrogène, ou
un groupe de formule
dans laquelle
■ R4 représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes - (CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH- CH2)7-CH3,
sous réserve que R représente au moins un groupe de formule
■ m représente le nombre de motifs d'unités D-glucosamine,
■ n représente le nombre de motifs d'unités N-acétyle-D-glucosamine, sous réserve que le degré de désacétylation (DDA) représentant le pourcentage de m par rapport au nombre total d'unités soit supérieur à 50 %.
L'invention concerne également un carraghénane portant des groupes hydrophobes ayant pour formule I et/ u II :
II
R représente
un atome d'hydrogène, ou
un groupe de formule
*
dans laquelle
■ R4 représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes - (CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7- =CH-(CH2)7-CH3,
sous réserve que R représente au moins un groupe de formule
L'invention concerne aussi une héparine portant des groupes hydrophobes ayant pour formule :
dans laquelle
■ R représente
• un atome d'hydrogène, ou
• un groupe de formule
R représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)i4-CH3 ou -(CH2)i6-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins une double liaison C=C, notamment les groupes - (CH2)7-CH-CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-C =CH-(CH2)7-CH3,
sous réserve que R représente au moins un groupe de formule
L'invention concerne aussi une amylopectine portant des groupes hydrophobes ayant pour formule :
R représente un atome d'hydrogène, ou
un groupe de formule
dans laquelle
■ R4 représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)i6-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes - (CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH- CH2)7-CH3,
sous réserve que R représente au moins un groupe de formule
L'invention concerne aussi un pullulane portant des groupes hydrophobes ayant pour formule :
R représente
un atome d'hydrogène,
un groupe de formule
dans laquelle
■ R4 représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(C¾)14-CH3 ou -(CH2)16-CH3, • un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes - (CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-C =CH-(CH2)7-CH3,
sous réserve que R représente au moins un groupe de formule
L'invention concerne aussi un dextrane portant des groupes hydrophobes ayant formule :
dans laquelle
■ R représente
un atome d'hydrogène, ou
un groupe de formule
dans laquelle
■ R4 représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 20 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)1 -CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 20 atomes de carbone et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non, notamment les groupes -(CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7- CH=CH-(CH2)7-CH3,
sous réserve que R représente au moins un groupe de formule
L'invention concerne aussi une pectine portant des groupes hydrophobes ayant pour formule :
dans laquelle
■ R représente
un atome d'hydrogène,
un groupe de formule
R représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 20 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)i6-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 20 atomes de carbone et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non, les groupes -(CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3.
sous réserve que R représente au moins un groupe de formule
L'invention concerne aussi l'acide hyaluronique portant des groupes hydrophobes ayant pour formule :
dans laquelle
■ R représente
un atome d'hydrogène, ou
un groupe de formule
R représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou T(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes - (CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3,
sous réserve que R représente au moins un groupe de formule
L'invention concerne également une chitine portant des groupes hydrophobes ayant pour formule :
R réprésente
un atome d'hydrogène, ou
un groupe de formule
dans laquelle
■ R4 représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)i4-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes - (CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3, sous réserve que R représente au moins un groupe de formule O
■ m représente le nombre d'unités N-glucosarnine,
■ n représente le nombre d'unités N-acétyle-glucosamine,
sous réserve que le pourcentage d'unités n par rapport au nombre total d'unités soit supérieur à 50 %.
Dans un mode de réalisation préféré, le groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 20 atomes de carbone et le groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 20 atomes de carbone et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non, sont choisis parmi les acides gras.
L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un système d'encapsulation comportant une étape de mélange de particules contenant des complexes d'inclusion selon l'invention,
avec une substance utilisée pour ses propriétés dans les domaines pharmaceutique, médical, paramédical, dispositifs médicaux, alimentation animale, cosmétique, vétérinaire, agro- alimentaire, des pesticides, des cosméto-textiles, de la parfumerie, environnemental (dépollution des eaux par exemple) ou dans l'industrie des peintures, des emballages, du bâtiment et/ou de l'automobile.
ladite substance étant préalablement dissoute dans un milieux aqueux tel que l'eau, le sérum physiologique, ledit milieu étant éventuellement enrichi de glucose ou contenant tout autre excipient à usage pharmaceutique, médical, paramédical, dispositifs médicaux, alimentation animale, cosmétique, vétérinaire, agro-alimentaire, des pesticides, des cosméto-textiles, de la parfumerie, environnemental (dépollution des eaux par exemple) ou dans l'industrie des peintures, des emballages, du bâtiment et/ou de l'automobile.
ledit milieu contenant éventuellement un co-solvant choisi parmi l'éthanol ou l'acétone, ou un tensio-actif choisi parmi les dérivés de polysorbates, notamment le Tween 80 ou le Tween 40, pour obtenir des particules contenant des complexes d'inclusion contenant ladite substance.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de préparation d'un système d'encapsulation selon l'invention comporte une étape de mélange :
• d'un polysaccharide comportant des groupes hydrophobes fixés de façon covalente au polysaccharide par un atome d'azote et par des atomes d'oxygène dudit polysaccharide,
ledit polysaccharide étant choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide, hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, les dérivés de la cellulose, l'héparâne-sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés, et est notamment le chitosane,
• d'une cyclodextrine désignée ci-dessus,
• d'une substance utilisée pour ses propriétés dans les domaines pharmaceutique, médical, paramédical, dispositifs médicaux, alimentation animale, cosmétique, vétérinaire, agro-alimentaire, des pesticides, des cosméto-textiles, de la parfumerie, environnemental (dépollution des eaux par exemple) ou dans l'industrie des peintures, des emballages, du bâtiment et/ou de l'automobile.
• le pourcentage massique dudit solvant étant compris de 0 à 50 % et notamment environ égal à 25 %,
• le pourcentage massique dudit polysaccharide étant compris de 0,1 % à 15 %, et notamment de 0,5 % à.5 %,
• le pourcentage massique de la cyclodextrine étant compris de 0,1 % à 15 %, et notamment de 0,5 % à 5 %,
• le pourcentage massique de l'eau ou du milieu aqueux étant compris de 30 % à 99,9 %, et notamment de 90 % à 99 %,
pour obtenir un complexe d'inclusion contenant ladite substance.
L'étape de mélange du procédé de préparation d'un système d'encapsulation comporte une étape de dissolution du principe actif en milieu aqueux, suivie de l'addition dans le milieu du polysaccharide amphiphile et de α-cyclodextrine. Le mélange est placé sous agitation magnétique pendant 3 jours. Mais de façon pratique, il est possible de mélanger tous les composants en même temps.
Les particules peuvent alors être isolées
- soit par sédimentation, soit par centrifugation s'il s'agit de microparticules (diamètre hydrodynamique supérieur au micromètre),
- soit par ultracentrifugation ou par des méthodes de séparations membranaires telles que l'ultrafiltration et la microfiltration, s'il s'agit de nanoparticules (diamètre hydrodynamique inférieur au micromètre).
DESCRIPTION DES FIGURES ;
Figure 1
La figure 1 représente le spectre IR caractéristique du chitosane N-acylé par l'acide oléique (1) en comparaison avec celui du chitosane natif (2). Figure 2
La figure 2 représente la formule du chitosane non-modifié et son spectre 1H-RMN (300 MHz) dans le DCl à 1 % v/v dans le D20. Les atomes d'hydrogène sont numérotés sur la formule du composé, ces numéros apparaissant sur les pics du spectre de RMN.
Figure 3
La figure 3 représente le spectre 1H-RMN (300 MHz) du chitosane après N-acylation par l'acide oléique solubilisé dans le DCl à 1 % v/v dans le D20.
Figure 4
La figure 4 représente le spectre IR du O-palmitoyle-cbitosane (1) en comparaison avec le chitosane natif (2).
Figure 5
La figure 5 représente le spectre RMN du proton dans le DMSO-d6, du O-palmitoyle- chitosàne.
Figure 6
La figure 6 représente le spectre IR du O-palmitoyle-pullulane (1) en comparaison avec celui du pullulane natif (2).
Figure 7
La figure 7 représente le spectre IR du O-palmitoyle-amylopectine (1) en comparaison avec celui de l'amylopectine native (2).
Figure 8
La figure 8 représente le spectre IR du O-palmitoyle-dextrane (1) en comparaison avec celui du dextrane natif (2).
Figure 8bis
La figure 8bis représente le spectre IR du O-palmitoyle-dextraneFigure 9 La figure 9 représente le spectre IR de la chitine estérifiée par l'acide palmitique (1) en comparaison avec celui de la chitine native (2).
Figure 9-bis
La figure 9-bis représente le spectre IR de la O-palmitoyl-chitine
Figure 10
La figure 10 représente le spectre 13C-RMN à l'état solide de l'O-oléoyle-chitine.
Figure 11
La figure 11 représente le spectre IR caractéristique de l'O-palmitoyle-héparine (1) en comparaison avec l'héparine native (2). Figure 12
La figure 12 représente le spectre IR caractéristique de Ο-parmitoyle-carraghénane (1) en comparaison avec le carraghénane natif (2).
Figure 13
La figure 13 représente le spectre IR caractéristique de l'O-palmitoyle-acide hyaluronique (1) en comparaison avec l'acide hyaluronique natif (2).
Figure 14
La figure 14 représente les images obtenues en microscopie électronique à transmission de différentes préparations de particules.
Figure 15
La figure 15 représente les α, β et γ cyclodextrines. Dans la figure, les dimensions sont indiquées en Angstrôms.
Figure 16
La figure 16 représente l'effet de la concentration de l'O-palmitoyle-héparine DS 1 % sur le Dh des nanoparticules.
Figure 17
La figure 17 représente l'effet de la concentration de Γα-CD sur le Dh des microparticules composées d'O-palmitoyle-héparine DS2.
Figure 18
La figure 18 représente l'observation en MET des particules composées d'O-palmitoyle- héparine DS2
Figure 19
La figure 19 représente l'effet de la concentration de α-CD sur le Dh des microparticules composées d'O-palmitoyle-carraghénane DS I.
Figure 20
La figure 20 représente l'effet de la concentration de l'O-palmitoyle-carragliénane DSI sur le Dh des microparticules.
Figure 21
La figure 21 représente l'effet de la concentration de Γα-CD sur le Dh des particules d'O- palrnitoyle-carraghénane DS2.
Figure 22
La figure 22 représente l'effet de la concentration de Ο-palmitoyle-carraghénane DS3 sur le Dh des microparticules formées. Figure 23
La figure 23 (1) représente une image obtenue en microscopie électronique à transmission de la préparation α-cyclodextrine/chitosane natif/eau (10/1/89) % indiquant l'absence de formation de nanoparticules ou microparticules.
La figure 23 (2) montre des nanoparticules composées de a-cyclodextrine/CM6/eau (10/1/89) %.
Figure 24
La figure 24 (1) représente une image obtenue en microscopie électronique à transmission des nanoparticules à l'échelle laboratoire.
La figure 24 (2) représente une image obtenue en microscopie électronique à transmission des nanoparticules à l'échelle pilote.
EXEMPLES
Signification des abréviations utilisées :
CD : cyclodextrine
CDC13 : chloroforme deutéré
CM : chitosane modifié
D20 : eau deutérée
Da : unité de masse molaire en dalton, qui correspond au g L
DC1 : acide chlorhydrique deutéré
DDA : degré de désacétylation
Dh : diamètre hydrodynamique
DMF : diméthylformarnide
DMSO-d6 : diméthylsulfoxyde deutéré
DS : degré de substitution
EDCI : l-éthyl-3-(3-dimémylarninopropyl) carbodiimide
HSV : le virus de l'herpès simplex humain
HPV : le papillomavirus humain
IR : infrarouge
kDa : kilodalton
kHz : kilohertz
MET : microscopie électronique à transmission
Mm : masse molaire
MHz : Mégahertz NaN02 : Nitrite de sodium
QSP : quantité suffisante pour
RMN : résonance magnétique nucléaire
RPM : rotation par minute
RSV : Le virus respiratoire syncytial
δ : déplacement du proton, exprimé en ppm
Mm : masse molaire
AP : acide palmitique
AO : acide oléique
Caractéristiques/types des appareils d'analyse utilisés :
1H-RMN (Bruker ARX, 300 MHz ou 500 MHz) : Tous les composés de chitosane N- ou O- acylés obtenus ont été analysés par RMN du proton. Selon la solubilité des polysaccharides acylés, plusieurs solvants peuvent être utilisés tels que l'eau deutérée (D20) avec 1 % v/v de DC1, le chloroforme deutéré (CDC13), le diméthylsulfoxyde deutéré (DMSO-d6). Les spectres sont réalisés à température ambiante. Si le polysaccharide acylé est faiblement soluble ou si la viscosité est élevée, on chauffe les échantillons jusqu'à 85°C et on travaille avec un champ électromagnétique de 500 MHz.
Caractérisation par 13C-RMN du solide : Les spectres ont été réalisés sur un spectromètre AVANCE II BRUKER, on a eu recours aux techniques spécialisées de RMN du solide, notamment la rotation à l'angle magique (MAS) et le transfert de polarisation de 1H à l3C (CP) pour éviter les inconvénients liés aux temps de relaxation parfois très longs à l'état solide.
On a opéré à G>L = 500 MHz (!H) et 125,77 MHz (13C); le temps de contact était fixé à 1,5 ms. Ces échantillons étaient tournés à l'angle magique à une fréquence de 10 kHz, nous avons utilisé un rotor de 4 mm.
Les spectres IR (ATR-FTIR, spectromètre FT TR-4100, JASCO): le principe consiste à mettre en contact un cristal (diamant) avec l'échantillon à analyser, avant d'être traversé par le faisceau infrarouge.
Mesures de taille des particules : Les tailles des particules ont été évaluées par le diamètre hydrodynamique. Les mesures des diamètres hydrodynamiques moyens des nanoparticules et microparticules ont été réalisées avec un Zetasizer nanoséries Nano-ZS90 de la société Malvern instruments SA (Orsay, France) par diffusion quasi-élastique de la lumière. Les échantillons ont été préalablement dilués en prélevant 30 μΕ de suspension de nanoparticules ou microparticules et en les diluant dans 1 mL d'eau MilliQ®. Les diamètres hydrodynamiques des microparticules ont été remesurés par un granulomètre laser (MasterSizer 2000) de la société Malvern instruments SA (Orsay, France).
La microscopie électronique par transmission (MET) a été utilisée pour observer les microparticules et nanoparticules à l'aide d'un microscope Jeol 1400 60 kV et d'une caméra. Lyophilisation des polysaccharides greffés par des groupements hydrophobes : Certains dérivés de polysaccharides synthétisés ont été lyophilisés en utilisant un lyophilisateur Alpha 1-2 (A vantée, France) pendant 48 heures après avoir congelé les solutions pendant au moins 12 heures.
Détails sur les produits utilisés : Les principes actifs, vitamine B6, paracétamol, kétoprophène, indométacine, caféine ont été obtenus chez la société INRESA, Bartenheim, France. Le Parsol 1789 provient de la société DSM Nutritional Products, Allemagne.
Tous les solvants : le diméfhylformamide anhydre, le dichlorométhane, l'éther diéthylique, l'éthanol, le méthanol, l'ammoniaque, l'acide acétique glacial (98 % (m/m)) proviennent de VWR, France.
Le chitosane (de viscosité moyenne, de masse molaire Mm=250 kDa), le pullulane, l'amylopectine, le dextrane le -carraghénane, l'héparine, l'acide hyaluronique, le chlorure de N-(3-dimethylaminopropyle)-N-éthylcarbodiimide (EDCI), l'acide palmitique (99 % (m/m)), l'acide oléique (> 98 % (m m)), le bicarbonate de sodium, l'hydroxyde de sodium, le chlorure de sodium, le nitrite de sodium (NaN02), l'acide méthanesulfonique, le chlorure de palmitoyle, le chlorure d'oléoyle, l'eau deutérée, l'acide chlorhydrique deutéré (DCl), le chloroforme deutéré (CDC13); le diméthylesulfoxyde deutéré (DMSO-d6), la pyridine anhydre, la triéthylamine, le Soudan III, l'hydroxypropyl- -cyclodextrine (ΗΡ-β-CD) ont été fournis par Sigma-Aldrich Chemical Co, Saint quentin Fallavier, France. L'huile de ricin provient de la société Croda, France. L'a-cyclodxtrine (a-CD), la méthyle-P-cyclodextrine (Με-β-CD) Rameb®, degré de substitution -1.8, Mm=1320 g/mol, a été acheté chez Cyclolab (Budapest, Hongrie).
Les autres chitosanes (20 et 145 kDa) ont été obtenus après dépolymérisation du chitosane commercial Mm=250 kDa selon la technique développée par Huang et al (Pharmaceutical Research, 2004, 21(2), 344): 2 g de chitosane commercial sont solubilisés toute une nuit dans 100 mL d'acide acétique (6 % v/v), cette solution de chitosane est ensuite dépolymérisée par réaction chimique pendant 1 h avec 10 mL de NaN02 (85 mg/mL). Le chitosane dépolymérisé est ensuite précipité par augmentation du pH jusqu'à 9 à l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium (4 mol/L) et récupéré par filtration (filtre en verre fritté n°4, sous vide). Il est ensuite solubilisé dans 20 mL d'acide acétique (0,1 mol/L) et dialysé (membrane de dialyse Spectra/Por, MWCO 3500, lot 3228543, Spectrum laboratories Inc®) contre 1 L d'eau distillée deux fois pendant lh30 puis toute une nuit puis lyophilisé.
La masse molaire du chitosane dépolymérisé est déterminée par viscosimétrie capillaire. Le temps d'écoulement (f) dans un microrube μ-Ubbelohde (type 53710 1, n° 1016187, R=0,01022 mm2/s2, Schott Gerâte) de solutions de chitosane dans un mélange acide acétique 0,1 mol/L et NaCl 0,2 mol/L à différentes concentrations (c = 0,25/0,50/1,00/1,50/2,00 g L) est mesuré à 20 °C (bain CT1450 Schott Gerâte et système de refroidissement CK100 Schott Gerâte) à l'aide d'un viscosimètre AVS400 (Schott Gerâte). Pour chaque concentration, le temps d'équilibration est de 5 min et cinq mesures successives sont réalisées. A partir des résultats obtenus la viscosité intrinsèque [η] est déduite en prenant l'ordonnée à l'origine de la droite— = f( C ) avec t0 le temps d'écoulement du mélange d'acide acétique 0,1 mol/L et de NaCl 0,2 mol/L. La masse molaire est ensuite calculée en utilisant l'équation de Mark- Houwink-Sakurada η = ΚΜ^ , avec K=l ,81.10"6 et α=0,93.
Synthèse des polysaccharides portant des groupes hydrophobes
Exemple 1 : Synthèse et caractérisation du chitosane N-acylé
Le protocole consiste à dissoudre 1 g de chitosane (Mm=20, 145, 250 kDa), dont le degré de désacétylation (DDA) est égal à 85 %, dans une solution aqueuse d'acide acétique à 1 % v/v (100 mL) diluée avec du méthanol (75 mL). L'acide oléique ou palmitique est dissous dans 10 mL de méthanol et ajouté à la solution de chitosane. Un nombre de mole d'EDCI égal à celui de l'acide gras, est ajouté goutte à goutte au mélange acide gras et chitosane sous agitation magnétique continue. Après 24 heures de réaction, le produit est précipité dans un mélange méthanol/ammoniaque 7/3 v/v. Le précipité est filtré sur un filtre en verre fritté et lavé successivement avec l'eau, le méthanol puis l'éther diéthylique. Enfin, le produit est séché sous vide pendant 48 heures.
Lors de cette réaction plusieurs paramètres ont été modifiés. Ainsi, il est possible d'obtenir plusieurs types de chitosanes N-acylés en fonction du type d'acide gras greffé, du taux de greffage (degré de substitution) et de la masse molaire du chitosane.
Les spectres IR des chitosanes greffés obtenus ont été enregistrés. Les deux courbes de la figure 1 font apparaître une bande très large entre 3430 cm"1 et 3440 cm"1 correspondant aux groupements OH (Figure 1). Le chitosane natif présente une faible absorption au niveau de la vibration des groupements NH vers 1578 cm"1. Après N-acylation, il faut noter la faible absorption de ses dérivés aux bandes 3000 cm"1 et 3600 cm"1 et l'apparition de deux bandes 1636 cm"1 et 1657 cm"1, caractéristiques des groupements carbonyles et amides secondaires respectivement et qui confirment bien la formation de la liaison amide. Quant aux bandes à 2922 cm" , 2853 cm' "\ 1457 cm"1 et 1 198 cm" , elles correspondent aux chaînes alkyles de l'acide gras.
La comparaison des spectres RM du proton (Figures 2 et 3) montre un signal supplémentaire par rapport au spectre du chitosane non modifié à δ=1,017 ppm. Il correspond au signal du groupe méthyle du bout de la chaîne d'acide gras. Exemple 2 : Caractéristiques des chitosanes modifiés CM1-CM9
Les caractéristiques des chitosanes modifiés CM1-CM9 sont regroupées dans le tableau 1 ci-dessous. Le degré de substitution a été calculé à partir des résultats de l'analyse élémentaire du chitosane jV-acylé et du chitosane natif.
Tableau 1 : Caractéristiques des chitosanes N-acylés
Exemple 3 : Préparation des échantillons de chitosanes modifiés, CM1-CM9. Caractérisation par RMN du proton
Pour la caractérisation du chitosane N-acylé par RMN du proton, une solution de polymère à une concentration égale à 5 g/L est préparée dans de l'eau deutérée (D20) en présence d'acide chlorhydrique deutéré (DCl). Cette étape permet l'échange des protons labiles des groupements hydroxyles par des atomes de deutérium. Les protons labiles des groupements hydroxyles résonnant tous à la même fréquence, leur échange par des atomes de deutérium permet d'éliminer le signal résiduel de l'eau légère. Afin de diminuer la viscosité, les expériences ont été enregistrées à une température de 85 °C avec un nombre d'acquisition et un délai de relaxation de 5 et 1 secondes respectivement.
1H-RMN (300 MHz) chitosane non-modifié : la correspondance de chaque déplacement de protons est indiqué sur la figure 2.
1H-RMN (300 MHz) chitosane modifié : un pic supplémentaire par rapport au spectre du chitosane non modifié apparaît pour un déplacement chimique égal à δ8=1,017 ppm (Figure 3). Il correspond au signal de la chaîne d'acide gras.
Exemple 4 : Synthèse et caractérisation du chitosane 0-acylé
Le chitosane (250 kDa, 2 g) est dissous dans 20 mL d'acide méthanesulfonique, à température ambiante sous agitation magnétique continue, pendant une heure. Le chlorure d'acide (oléique ou palmitique) est alors introduit dans le milieu réactionnel. Au bout de 5 heures, le mélange est refroidi dans un bain de glace pour arrêter la réaction, un précipité se forme. Le précipité est dialysé pendant 12 heures, puis neutralisé à l'aide du bicarbonate de sodium. Il est ensuite dialysé pendant 48 heures et lyophilisé.
Le spectre IR (Figure 4) du O-palmitoyle-chitosane montre une bande caractéristique des carbonyles d'un groupe ester à 1700 cm"1 et des bandes à 2916 cm"1, 2849 cm"1 correspondent aux chaînes alkyles de l'acide gras. Le spectre en RMN du proton (Figure 5) comparé au spectre du chitosane natif (Figure 2), montre l'apparition de nouveaux pics dont ceux caractéristiques du groupement CH3 du bout de chaîne à 0,88 ppm et du proton des groupements méthylène CH2 à proximité de la fonction CO a 2,8 ppm.
Exemple 5 : Tableau 2, caractéristiques des chitosanes modifiés CM10-CM12
Les caractéristiques des chitosanes modifiés CM10-CM12 sont regroupés dans le tableau 2 ci-dessous. Le degré de substitution a été calculé à partir des résultats de l'analyse élémentaire du chitosane O-acylé et du chitosane natif.
Tableau 2 : Caractéristiques des chitosanes O-acylés Exemple 6 : Synthèse et caractérisation du pullulane greffé par l'acide palmitique
L'O-palmitoyle-pullulane a été préparé selon la référence de Sunamoto et al (Sunamoto J, Sato T, Taguchi T, Hamazaki H, Naturally occuring polysaccharid derivatives which behave as an artificial cell wall on an artificial liposome, Macromolecules, 1992, 25, 5665-5670). Le pullulane (5g) est dissous dans le diméthylformamide anhydre (55 mL) à 60 °C. A la solution obtenue sont ajoutés 5 mL de pyridine anhydre et le chlorure de palmitoyle (5 équivalents par unité de triholoside de glucose). Le mélange réactionnel est mis sous agitation à 60 °C pendant 2 h puis pendant 1 h à température ambiante. Le mélange est versé dans de l'éthanol (350 mL). Le précipité obtenu est extrait et lavé avec l'éthanol puis avec l'éther diéthylique. Le solide blanc obtenu est séché sous vide.
Spectre IR de ΓΟ-palmitoyle-pullulane : bande à 1739 cm"1 correspondant au carbonyle du groupe ester (Figure 6) et des bandes à 2916 cm" , 2849 cm' "', 1467 cm"1 et 1197 cm , correspondent aux chaînes alkyles de l'acide gras. Exemple 7 : Synthèse et caractérisation de dérivés d'amylopectine greffée par l'acide palmitique
L'amylopectine (5 g) est mélangée avec le diméthylformamide anhydre. Le mélange est mis sous agitation s 70 °C jusqu'à la dissolution complète du polysaccharide. Ensuite, la triéthylamine anhydre et le chlorure de palmitoyle sont ajoutés puis chauffés sous agitatio pendant 2 h. La solution est ensuite diluée dans du méthanol ce qui est à l'origine d'une précipitation du O-palmitoyle-amylopectine. Le solide blanc obtenu est filtré puis séché sous vide.
Spectre IR de l'O-palmitoyle-amylopectine : bande à 1739 cm"1 correspondant au carbonyle du groupe ester (Figure 7) et notamment des bandes à 2916 cm"1, 2849 cm'1, 1462 cm"1 correspondent aux chaînes alkyles de l'acide gras.
Exemple 7bis : Synthèse et caractérisation de dérivés d'amylopectine greffée par l'acide palmitique
L'( -palrnitoyle-amylopectine a été préparée selon la référence de Sunamoto et al (Sunamoto J, Sato T, Taguchi T, Hamazaki H, Naturally occuring polysaccharid derivatives which behave as an artificial cell wall on an artificial liposome, Macromolecules, 1992, 25, 5665-5670). L'amylopectine (5 g) est mélangée avec 55 mL de diméthylformamide anhydre à 60 °C sous agitation magnétique continue. A la solution obtenue sont ajoutés 5 mL de pyridine anhydre, 1,2 mL de DMF anhydre contenant le chlorure de palmitoyle. La quantité de chlorure de palmitoyle a été variée en fonction du degré de substitution souhaité. Le mélange réactionnel est mis sous agitation à 60 °C pendant 2 h puis pendant 1 h à température ambiante. Le mélange est versé dans 350 mL d'éthanol. Le solide blanc obtenu est séché sous vide. Exemple 8 : Synthèse et caractérisation de dérivés de dextrane greffés par l'acide palmitique
Le dextrane est mis en suspension dans le diméthylformamide anhydre. Le mélange est mis sous agitation à 70 °C jusqu'à la dissolution complète du polysaccharide. Ensuite, la triéthy lamine anhydre et du chlorure de palmitoyle sont ajoutés puis chauffés sous agitation pendant 2 h. La solution est ensuite diluée dans du méthanol ce qui est à l'origine d'une précipitation du O-palmitoyle-dextrane. Le solide blanc obtenu est filtré puis séché sous vide. Spectre IR de O-palmitoyle-dextrane : bande à 1739 cm"1 correspondant au carbonyle du groupe ester (Figure 8) et notamment des bandes à 2914 cm"1, 2853 cm"1 correspondent aux chaînes alkyles de l'acide gras.
Exemple 8bis : Synthèse et caractérisation de dérivés de dextrane greffés par l'acide palmitique
L' O-palmitoyle-dextrane a été préparé selon le protocole décrit par Sunamoto et al (Sunamoto J, Sato T, Taguchi T, Hamazaki H, Naturally occuring polysaccharid derivatives which behave as an artificial cell wall on an artificial liposome, Macromolecules, 1992, 25, 5665-5670). Le dextrane (5 g) est mélangé avec 55 mL de diméthylformamide anhydre à 60 °C. A la solution obtenue sont ajoutés 5 mL de pyridine anhydre et le chlorure de palmitoyle. Le mélange réactionnel est mis sous agitation à 60 °C pendant 2 heures puis pendant 1 heure à température ambiante. Le mélange est versé dans 350 mL d'éthanol. Le précipité obtenu est extrait et lavé avec l'éthanol puis avec l'éther diéthylique. Le solide blanc obtenu est séché sous vide.
Spectre IR de O-palmitoyle-dextrane (Figure 8bis) : bandes à 2914 cm"1 et à 2848 cm"1 correspondant aux chaînes alkyles de l'acide gras. Exemple 9 : Synthèse et caractérisation de l'O-oléoyle-chitine et de l'O-palmitoyle- chitine
Synthèse : La chitine a été estérifiée par l'acide oléique selon la méthode décrite dans la référence (Yang B. Y, Ding Q, Montgomery R, Préparation and physical properties of chitin fatty acids esters, Carbohydrate Research, 2009, 344 (3), 336-342). La chitine (7,5 g) préalablement séchée sous vide à 60 °C pendant 16 heures, est introduite dans un mélange d'acide trifluoroacétique (75 mL) et d'acide palmitique ou l'acide oléique (28 g). Le mélange est alors chauffé à 70 °C sous agitation continue pendant 30 min, puis refroidi à température ambiante. Par la suite, 300 mL d'éthanol absolu froid (-20 °C) sont ajoutés, et le mélange est concentré à l'évaporateur rotatif à une température de 20 °C sous vide. Le produit obtenu est dispersé dans l'éthanol absolu et chauffé à 80 °C. Après décantation et élimination du surnageant, le produit final est séché et dissout dans 30 mL de DMF puis centrifugé à 3600 g. L'estérification de la chitine par l'acide palmitique ou l'acide oléique s'effectue en présence de l'acide trilfuoroacétique, connu pour être un promoteur d'estérification pour d'autres polysaccharides, notamment l'amidon cité dans la référence (Yang B. Y, Montgomery R, Acylation of Starch using Trifluoroacetic Anhydride Promoter, Starch - Stàrke, 2006, 58 (10), 520-526). En effet l'acide trifuloroacétique entraine la formation de l'anhydride d'acide qui est beaucoup plus réactif que l'acide carboxylique lui-même. Etant fortement électronégatif et ayant un pouvoir acide puissant, l'acide trifluoroacétique entraîne la protonation des fonctions aminés, permettant ainsi une estérifïcatiôn préférentielle sur les fonctions alcools.
Caractérisation de l'0-oléoyle-chitine et de l'O-palmitoyle-chitine : L'analyse en spectroscopie infrarouge est une méthode rapide et efficace pour identifier les groupements chimiques de la chitine estérifïée par comparaison avec le spectre de la chitine native. Le spectre représenté sur la figure 9, est typique de la chitine, la fréquence des régions carbonyles (CO) des amides entre 1600 cm"1 et 1500 cm"1 est de grande intensité. La bande correspondant à l'amide I est divisée en deux pics à 1654 cm"1 et 1619 cm" . La bande correspondant à l'amide II est unique et est à 1556 cm"1.
En ce qui concerne le spectre obtenu du O-palmitoyl-chitine (Figure 9bis), nous observons une absorption plus importante pour les bande à 1649 cm"1 et 1554 cm"1, ce qui explique la présence des groupements carbonyles CO et amide II, démontrant ainsi une N-acylation des fonctions aminés libres de la chitine. La figure 9bis (1) montre également des bandes à 2916 cm"1 et à 2849 cm"1 correspondant aux chaînes alkyles de l'acide gras.
Caractérisation par I3C-RMN du solide de la chitine estérifïée par l'acide oléique est particulièrement adaptée à la caractérisation de ce dérivé insoluble dans l'eau et dans la majorité des solvants organiques. Le spectre présenté à la figure 10 montre la présence de 9 pics de résonance dont les valeurs sont reportées sur le tableau 3 ci-dessous.
Fonction Déplacement (ppm)
=CH-, -CH2- , - CH3 14,29, 22,93, 29,81
C2 55,35
C6 60,96
C3-C5 73,87
C4 83,85 Cl 104,03
C=0 amide et ester 173,79
Tableau 3 : Déplacements obtenues en RMN du carbone solide de l'O-oléoyl-chitine exprimés en ppm et les fonctions correspondantes
Exemple 10 : Synthèse de l'héparine greffée par l'acide palmitique DSI
Introduire 1 g d'héparine dans 11 mL de DMF anhydre. Chauffer progressivement à 60 °C sous agitation magnétique. Ajouter 5 mL de pyridine anhydre puis 2,5 g de chlorure de palmitoyle dans 6 mL de DMF .anhydre. Laisser le mélange sous agitation magnétique pendant 2 h à 60 °C puis l h à température ambiante. Verser le mélange dans 100 mL d'éthanol froid afin d'obtenir un précipité. Extraire et laver le précipité avec lOO mL d'éthanol puis 100 mL d'éther diéthylique.
Exemple lObis : Synthèse et caractérisation de l'héparine greffée par l'acide palmitique DS2
Synthèse : L'héparine (2 g) est dissoute dans 10 mL de dichlorométhane et 2 mL de chlorure d'acide palmitique contenus dans un ballon. Le ballon est mis sous reflux sous agitation magnétique continue pendant 72 h à température ambiante. Après, 20 mL d'une solution d'acétate de sodium dans le méthanol est rajoutée au mélange réactionnel. Le précipité formé est récupéré sur un filtre en verre fritté de porosité N° 4 puis lavé avec 100 mL de méthanol puis lOO mL d'acétone. Le solide est séché sous vide à température ambiante. L'héparine estérifiée par l'acide palmitique est purifiée par dissolution dans 10 mL d'eau distillée et addition de NaCl jusqu'à atteindre une concentration en NaCl de 10 % m/v. Après, 20 mL de méthanol sont rajoutés et le précipité formé est récupéré sur un filtre en verre fritté puis lave avec 100 mL d'éthanol puis 100 mL d'acétone. Le solide est séché sous vide à température ambiante.
Caractérisation de l'O-palmitoyle-héparine : L'analyse en spectroscopie infrarouge (Figure 11) a montré la présence de bandes à 1620 et 1724 cm"1 qui correspondent aux groupes carbonyle de la fonction ester. Les bandes à 1135 et 1187 cm"1 correspondent aux groupes C- O de la fonction ester. Le spectre de l'O-palmitoyle-héparine a également montré des bandes à 2849 et 2916 cm"1 correspondant aux groupements alkyles de l'acide palmitique.
Exemple 11 : Synthèse et caractérisation de carraghénane greffé par l'acide palmitique
Synthèse : Le carraghénane (2 g) est mis en suspension dans 10 mL de dichlorométhane et 1, 2 ou 3 mL de chlorure d'acide palmitique contenus dans un ballon. Nous appelons les O-palmitoyle-carraghénanes obtenues DSI, DS2 et DS3 en relation avec la quantité de chlorure d'acide mise en réaction. Le ballon est mis sous reflux sous agitation magnétique continue pendant 72 h à 30 °C. Après, le solide est récupéré sur un filtre en verre fritté puis lavé deux fois avec 100,mL d'éthanol. Le solide est séché sous vide à température ambiante pendant 12 h.
Caractérisation infra-rouge (Figure 12) : La caractérisation par spectroscopie infrarouge de rO-palmitoyle-carraghénane a montré la présence de bandes à 1699 cm"1 et 1739 cm"1 qui correspondent aux groupes carbonyle de la fonction ester. Les bandes à 1047 cm"1 et 1207 cm"1 correspondent aux groupes C-0 de la fonction ester. Le spectre de l'O-palmitoyle- carraghénane a également montré des bandes à 2848 cm"1 et 2916 cm"1 correspondant aux groupements alkyle de l'acide palmitique.
Exemple 12 : Synthèse et caractérisation de l'acide hyaluronique greffé par l'acide palmitique
L'Acide hyaluronique (2 g) est mélangé avec 10 mL de dichlorométhane et 2 mL de chlorure d'acide palmitique contenus dans un ballon. Le ballon est mis sous reflux sous agitation magnétique continue pendant 5 jours à 30 °C. Après, le solide est récupéré sur un filtre en verre fritté puis lavé deux fois avec 100 mL d'acétone. Le solide est séché sous vide à température ambiante pendant 12 h. Caractérisation infra-rouge (Figure 13) : La caractérisation par spectroscopie infrarouge de ΓΟ-palmitoyle-acide hyaluronique a montré la présence de bandes correspondants aux groupes carbonyle de la fonction ester. Les bandes à 1048 et 1207 cm"1 correspondent aux groupes C-0 de la fonction ester. Le spectre de Γ O-palmitoyle-acide hyaluronique a également montré des bandes à 2848 et 2915 cm"1 correspondant aux groupements alkyle de l'acide palmitique.
Exemple 13 : Formation de micropàrticules et de nanoparticules à partir d'a- cyclodextrine et de polysaccharides acylés : N-palmitoyle-chitosane et 0-oléoyle- chitosane
Les microparticules et nanoparticules ont été formées à partir d'a-cyclodextrine et de polysaccharide greffé par des acides gras. Les exemples des polysaccharides utilisés sont groupés dans le tableau ci -dessous. Le protocole consiste à peser Ι'α-cyclodextrine ainsi que le polysaccharide O- ou N-acylé dans un petit flacon. Par la suite, l'eau distillée est rajoutée au mélange d'a-cyclodextrine ainsi que le polysaccharide O- ou N-acylé. Le mélange est maintenu sous agitation magnétique pendant 3 jours. polysaccharide Masse Acide DS Pourcentage Pourcentage Pourcentage Taille des molaire gras (%) massique de massique massique particules polysaccharid d'a- d'eau (nm)*
(kDa) e amphiphile cyclodextrine
chitosane N- 250 AP 13,1 1 10 89 7320 ± acylé 2 1823 chitosane 0- 250 AO 4,64 1 10 89 2090 ± acylé 367
* Diamètre hydrodynamique exprimé en volume.
Tableau 4 : Tailles des particules obtenues à partir du chitosane N-acylé ou O-acylé Un exemple d'image de particules observées en microscopie à transmission électronique est représenté dans la Figure 14.
■5
Exemple 14 : Encapsulation de principes actifs solubles dans l'eau
Le protocole adopté pour encapsuler les principes actifs hydrophiles est de dissoudre le principe actif dans l'eau à une concentration initiale telle qu'indiquée dans le tableau 5 puis de rajouter le polysaccharide amphiphile et Γα-cyclodextrine. Le mélange est maintenu sous0 agitation magnétique pendant 3 jours. Après les 3 jours de mélange, la concentration du principe actif qui n'a pas été encapsulée est déterminée dans le surnageant de la préparation. Le surnageant est séparé soit par simple sédimentation ou par centrifugation des microparticules, soit après ultracentrifugation dans le cas des nanoparticules.
Tableau 5 : Exemple de molécules actives encapsulées. Exemple 15 : Préparation et caractérisation de nanoparticules composées d'O- palmitoyle-héparine DSI
Le protocole consiste à peser l'O-palmitoyle-héparine DSI et α-cyclodextrine dans un flacon. Par la suite, l'eau est rajoutée au mélange. Le tout est mélangé pendant 72 h à température ambiante grâce à un barreau magnétique. Les concentrations de l'O-palmitoyle- héparine DSI de Γα-cyclodextrine sont indiquées sur le tableau 6. Les résultats des mesures des diamètres hydrodynamiques sont indiqués sur le tableau 6 et la Figure 16.
Tableau 6 : Effet de la variation de la concentration d'O-palmitoyle-héparine sur le diamètre hydrodynamique des nanoparticules composées d'héparine DS2
Exemple 16 : Préparation et caractérisation de nanoparticules composées d'O- palmitoyle-héparine DS2
L'O-palmitoyle-héparine DS2 et Γα-cyclodextrine ont été pesés dans un flacon. Par la suite, l'eau est rajoutée au mélange. Le tout est mélangé pendant 72 h à température ambiante grâce à un barreau magnétique. Les concentrations de rO-palmitoyle-héparine DS2 de α- cyclodextrine sont indiquées sur le tableau 7. Les résultats des mesures des diamètres hydrodynamiques sont indiqués sur le tableau 7 et la Figure 17.
Tableau 7 : Effet de la variation de la concentration d'a-CD sur le diamètre hydrodynamique des nanoparticules composées d'héparine DS2 La Figure 18 montre un exemple d'images obtenues par observations en microscopie à transmission électronique des nanoparticules composées d'héparine DS2. Ces images obtenues sans agents de contraste, montrent que ces nanoparticules s'auto-organisaient d'une manière bien structurée sous la forme d'un hexagone.
Exemple 17 : Préparation et caractérisation de microparticules d'0-palmitoyle- carraghénane DSI
L'0-palmitoyle-carraghénane DSI ainsi que Γα-cyclodextrine sont pesés dans un flacon. Par la suite, l'eau est rajoutée au mélange. Le tout est mélangé pendant 72 h à température ambiante grâce à un barreau magnétique. Les concentrations de l'O-palmitoyle- carraghénane de Γα-cyclodextrine et les résultats des mesures des diamètres hydrodynamiques sont indiqués sur le tableau 8.
• Variation de la quantité d'a-cyclodextrine (Figure 19)
Effet de la variation de la concentration d'a-CD sur le diamètre hydrodynamique des microparticules composées de carraghénane DSI
• Variation de la quantité dO-palmitoyle-carraghénane DSI (Figure 20)
Nom Concentration Concentration Rapport de Dh (nm)
d'a-CD (g/L) d'0-palmitoyle- concentration a- carraghénane CD/0- DSI (g/L) palmitoyle- carraghénane
DSI
Carr5 100 2.5 40 1089 ± 272
Carr6 100 5 20 1277 ± 218 Carr7 100 10 10 1196 ± 242
Carr8 100 20 5 1384 ± 225
Carr9 100 30 3,3 1658 ± 403
Tableau 9 : Effet de la variation de la concentration d'O-palmitoy e-carraghénane sur le diamètre hydrodynamique des microparticules composées de carraghénane DSI Exemple 18 : Préparation et caractérisation de microparticules et nanoparticules d'O- palmitoyle-carraghénane DS2
LO-palmitoyle-carraghénane DS2 ainsi que Γα-cyclodextrine sont pesés dans un flacon. Par la suite, l'eau est rajoutée au mélange. Le tout est mélangé pendant 72 h à température ambiante grâce à un barreau magnétique. Les concentrations de l'O-palmitoyle- carraghénane de Γα-cyclodextrine et les résultats des mesures des diamètres hydrodynamiques sont indiqués sur le tableau 10.
• Variation de la quantité d'a-cyclodextrine (Figure 21)
Tableau 10 : Effet de la variation de la concentration d'a-CD sur le diamètre hydrodynamique des microparticules et nanoparticules composées de carraghénane DS2 Exemple 19 : Préparation et caractérisation de microparticules d'O-palmitoyle- carraghénane DS3
LO-palmitoyle-carraghénane DS3 ainsi que Γα-cyclodextrine sont pesés dans un flacon. Par la suite, l'eau est rajoutée au mélange. Le tout est mélangé pendant 72 h à température ambiante. Les concentrations de ΓΟ-palmitoyle-carraghénane de l'a- cyclodextrine et les résultats des mesures des diamètres hydrodynamiques sont indiqués sur le tableau 11. • Variation de la quantité d'fl-palmitoyle-carraghénane DS3.
Tableau 11 : Effet de la variation de la concentration d'O-palmitoyle-carraghénane sur le diamètre hydrodynamique des microparticules composées de carraghénane DS3
Exemple 20 : Fabrication de microparticules et de nanoparticules composées de N- palmitoyle-chitosane en présence d'huile de ricin
Les microparticules et nanoparticules ont été formées à partir d'a-cyclodextrine et de N-palmitoyle-chitosane CM9. Les concentrations utilisées sont regroupées dans le tableau ci- dessous. Le protocole consiste à peser le N-palmitoyle-chitosane, Ρα-cyclodextrine et l'huile de ricin préalablement marquée par le Soudan III. L'ajout de Soudan III permet de détecter les phénomènes d'instabilité des préparations. Par la suite, l'eau est rajoutée au mélange. Le tout est mélangé pendant 72 h à température ambiante.
Les préparations observées à l'oeil n'ont pas montré de phénomènes d'instabilité. Les résultats des mesures de taille sont regroupés dans le tableau ci-dessous.
Tableau 12 : Effet de la variation de la concentration d'huile de ricin sur le diamètre hydrodynamique des microparticules et nanoparticules composées de chitosane CM9
Exemple 21 : Fabrication de microparticules composées d'O-oléoyle-chitine en présence d'huile de ricin
Les microparticules ont été formées à partir d'a-cyclodextrine et d'O-oléoyle-chitine DS 0,68%. Les concentrations utilisées sont groupées dans le tableau ci-dessous. Le protocole consiste à peser l'O-oléoyle-cliitine, α-cyclodextrine et l'huile de ricin préalablement marquée par le Soudan ΠΙ. L'ajout de Soudan III permet de détecter les phénomènes d'instabilité des préparations. Par la suite, l'eau est rajoutée au mélange. Le tout est mélangé pendant 72 h à température ambiante. Les préparations observées à l'œil n'ont pas montré de phénomènes d'instabilité. Les résultats des mesures de taille sont regroupés dans le tableau ci- dessous.
Tableau 13 : Effet de la variation de la concentration d'huile de ricin et de la concentration d'O-oléoyle-chitine sur le diamètre hydrodynamique des microparticules
Exemple 22 : Absence de formation de particules en utilisant le chitosane natif, non- greffé par l'acide palmitique
L'a-cyclodextrine (100 mg) et le chitosane natif (10 mg) ont été pesés dans un vial. Par la suite, l'eau est rajoutée au mélange de façon à atteindre un volume total de 1 mL. Le tout est mélangé grâce à un barreau magnétique pendant 72 h à température ambiante. La figure 23 (1) est une image obtenue après observations en microscopie à transmission électronique qui montre l'absence de formation de nanoparticules ou de microparticules en comparaison avec les images des nanoparticules obtenues avec l'O-palmitoyle-chitosane CM6/a-cyclodextrine/eau (1/10/89) %.
Exemple 23 : Séchage des particules par lyophilisation
La lyophilisation est un procédé de séchage sous vide et à basse température. Le produit contenant de l'eau est préalablement congelé. Encore aujourd'hui la lyophilisation reste la méthode de choix pour sécher des produits thermosensibles.
Les microparticules ont été préparées à partir d'a-cyclodextrine et du N-oléoyle-chitosane, CM4, DS 13,47 %. Le protocole consiste à peser le N-oléoyle-chitosane et l'a-cyclodextrine. Les concentrations utilisées sont indiquées dans le tableau 14. Par la suite, l'eau est rajoutée au mélange. Le tout est mélangé pendant 72 h à température ambiante.
" La lyophilisation est réalisée sur 1 mL de préparation contenant les microparticules préalablement congelés à (-20 °C) pendant 12. h, puis placés dans le lyophilisateur pendant 24 h. Après avoir été lyophilisés, les préparations sont remises en suspension dans 1 mL d'eau MilliQ®, nous notons que l'aspect macroscopique des échantillons n'a pas changé. Afin de s'assurer que l'étape de lyophilisation n'a pas modifié les caractéristiques physico-chimiques des particules, des mesures du diamètre hydrodynamique ont été effectuées après lyophilisation et comparées avec ceux obtenus avant lyophilisation (Tableau 14).
Tableau 14 : Mesure des diamètres hydrodynamiques des particules (de chitosane CM4
kDa N-acylé avec PAO et un DS 13,47 %) avant et après lyophilisation Exemple 24 : Transposition d'échelle de la fabrication des particules (Scale-up)
Le passage à l'échelle pilote est une nécessité pour pouvoir développer ce procédé à l'échelle industrielle. Nous avons conçu un pilote composé d'un réacteur agité par un agitateur mécanique de type hélice. La vitesse d'agitation est fixée à 350 rpm. La régulation de la température à 25 °C est assurée par une circulation de fluide (eau/éthylène glycol) reliée à un thermostat.
Les lots de 100 mL de microparticules sont obtenus en ajoutant successivement dans le réacteur (1 g) de chitosane de masse molaire 250 kDa N-acylé avec 10 équivalents d'acide palmitique (CM9, DS 17,01%), 10 g d'a-cyclodextrine et l'eau MilliQ® qsp 100 mL.
Les résultats obtenus à l'échelle pilote sont regroupés dans le tableau 15 et comparés à ceux obtenus à l'échelle laboratoire.
obtenues à l'échelle pilote en comparaison avec celles obtenues à l'échelle laboratoire
Aucune modification significative du D¾ n'a été reportée. Les images MET ont montré que mes microparticules conservaient leurs structures hexagonales. Exemple 25 : Fabrication de microparticules avec un mélange de deux polysaccharides
Tableau 16 : Diamètres hydrodynamiques des microparticules composées d'un mélange d'O-.
palmitoyle-chitosane et d'O-palmitoyle-dextrane
Tableau 17 : Diamètres hydrodynamiques des microparticules composées d'un mélange d'O- palmitoyle-chitosane et d'O-palmitoyle-pullulane
Tableau 18 : Diamètres hydrodynamiques des microparticules composées d'un mélange d'O- palmitoyle-chitine et d'O-palmitoyle-dextrane
Tableau 20 : Diamètres hydrodynamique des microparticules composées d'un mélange d'O- palmitoyle-chitine et d'O-palmitoyle-pullulane
Exemple 26 : Activité antivirale des nanoparticules composées dO-palmitoyle héparine Cellules. Des cellules épithéliales de rein extraites d'un singe vert africain (cellules
Vero, (ATCC CCL-81), des cellules épithéliales humaines Hep-2 et (ATCC CCL-23) et des cellules épithéliales de rein extraites d'un singe vert africain (MA-104, ATCC CRL-2378.1) sont cultivées en monocouches dans un milieu minimum essentiel de Eagle (MEAT) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur et 1% de solution antibiotique-antifongique (Zell Shield, Minerva Biolabs GmbH, Berlin, Germany). La lignée cellulaire 293TT, dérivées des cellules embryonnaires humaines de rein transformées avec l'antigène grand T du virus simien 40 (SV40), est cultivée dans un milieu minimum essentiel de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal (FCS; Gibco- BRL), Glutamax-I 1% (Invitrogen, Carlsbad, CA) et 1% d'acides aminés non essentiels (Sigma Aldrich, Steinheim, Germany). Les cellules 293TT permettent l'expression d'un taux élevé de protéines à partir de vecteurs contenant l'origine de réplication du SV40 en raison de la sur- réplication des vecteurs d'expression (Buck et al, 2004).
Virus. Des isolats cliniques de HSV-1 and HSV-2 ont été fournis par le Professeur M. Pistello, (University of Pisa, Italy). Les souches HSV-1 and HSV-2 ont été propagées et titrées par la technique en plaque sur cellules Vero. La souche A2 RSV (ATCC VR-1540) a été propagée et titrée par la méthode Reed-Muench sur cellules Hep-2 décrite précédemment (Donalisio et al, 2012). La souche de rotavirus humain Wa(ATCC VR-2018) a été active avec 5μg/ml avec de la trypsine pancréatique de porc de type IX(Sigma, St. Louis, Mo.) pendant 30 min à 37 °C et propagées dans des cellules MA104 en utilisant le milieu MEM contenant 0.5 μg de trypsine par mL comme décrit précédemment (Coulson et al, 1986). Les stocks de virus ont été maintenus congelés (-80°C).
HPV PsV production. Les plasmides et cellules 293TT utilisés pour la production de pseudovirus (PsV) ont été fournis par John Schiller (National Cancer Institute, Bethesda, MD). Le détail des protocoles et les cartes des plasmides de cette étude peuvent être consultés sur le lien suivant : http://home.ccr.cancer.gov/lco/default.asp. Des pseudovirus HPV- 16 ont été produits selon des méthodes précédemment décrites (Buck et al, 2005). De façon succincte, les cellules 293TT sont transfectées avec des plasmides exprimant les protéines de capsides majeures et mineures de papillomavirus (respectivement Ll et L2) et d'un plasmide rapporteur exprimant la phosphatase alcaline sécrétée (SEAP), pYSEAP. Les capsides ont été maturées pendant la nuit dans un lysat cellulaire, le surnageant clarifié a ensuite été chargé au-dessus d'un gradient de densité de 27 à 33 à 39%, Optiprep (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO), à température ambiante pendant 4h. Le matériel a ensuite été centrifugé à 340 000 g pendant 3h30 à 16 °C dans un rotor SW50.1(Beckman Coulter, Inc., FuUerton, CA) et ensuite collecté par ponction au fond des tubes. Les fractions sont analysées pour la pureté dans des gels de glycine-Tris- 10% de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), titrées sur des cellules 293TT pour tester l'infectiosité par détection à la SEAP, et ensuite groupé et congelé à -80°C pendant la durée souhaitée. La teneur en protéine Ll des stocks de PsV a été déterminée en comparaison avec l'albumine de sérum bovin standard sur des gels de polyacrylamide-SDS colorés au Bleu de Coomassie.
Exemple 27 : Absence de formation de particules en utilisant les dérivés de β- cyclodextrine et le O-palmitoyle-chitosane (CM12)
Tableau 22 : Absence de formation de particules par mélange d'O-palmitoyle-chitosane
(CM12) avec ΓΗΡ-β-CD ou la Με-β-CD Exemple 28 : Absence de formation de particules en utilisant les dérivés de β- cyclodextrine et le 0-oléoyle-chitine
Tableau 23 : Absence de formation de x
le O-oléoyle-chitine
Exemple 29 : Absence de formation de particules en utilisant les dérivés de p- cyclodextrine et le 0-palmitoyle-pullulane
Tableau 24 : Absence de formation de particules en utilisant les dérivés de β-cyclodextrine et le O-palmitoyle-pullulane Exemple 30 : Préparation et caractérisation de microparticules d'0-palmitoyle-acide hyaluronique
L'O-palmitoyle-acide hyaluronique ainsi que Γα-cyclodextrine sont pesés dans un flacon. Par la suite, l'eau est rajoutée au mélange. Le tout est mélangé pendant 72 h à température ambiante. La concentration de α-cyclodextrine et les résultats des mesures des diamètres hydrodynamiques sont indiqués sur le tableau 25.
composées ( -palmitoyle-acide hyaluronique Exemple 31 : Encapsulation de principes actifs en présence d'un solvant
Le protocole adopté pour encapsuler les principes actifs hydrophobes est de dissoudre le principe actif dans un mélange éthanol/eau à une concentration initiale telle qu'indiquée dans le tableau 26 puis de rajouter le polysaccharide amphiphile et α-cyclodextrine. Le mélange est maintenu sous agitation magnétique pendant 3 jours. Après les 3 jours de mélange, la concentration du principe actif qui n'a pas été encapsulée est déterminée dans le surnageant de la préparation. Le surnageant est séparé soit par simple sédimentation ou par centrifugation des microparticules, soit après ultracentrifugation dans le cas des nanoparticules.
Tableau 26 : Exemple de molécules actives encapsulées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Complexe d'inclusion selon la revendication 1 formé par l'interaction entre au moins
■ un polysaccharide choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, l'héparane- sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés, ledit polysaccharide comportant des groupes hydrophobes choisis parmi les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés, contenant de 2 à 1000 atomes de carbone, ou des groupes alcényles linéaires ou ramifiés, notamment linéaires, pouvant contenir au moins 1 double liaison C=C, lesdits groupes hydrophobes étant liés de façon coval ente audit polysaccharide,
■ et une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère,
le polysaccharide et la cyclodextrine étant liés de façon non-covalente.
2. Complexe d'inclusion selon la revendication 1 dans lequel le polysaccharide est composé d'au moins 3 unités saccharidiques, sa masse molaire étant en particulier comprise de 100 Da à 1000000 kDa, et notamment égale à 20 kDa, 145 kDa ou 250 kDa,
et notamment dans lequel le degré de substitution du polysaccharide par les groupes hydrophobes est compris de 0,001 à 100%, notamment compris de 0,05 et 50%.
3. Complexe d'inclusion selon la revendication 1 ou 2 dans lequel le rapport entre la concentration de la cyclodextrine en g/L et celle du polysaccharide est compris de 10"6 à 900 000 en particulier compris de 4 à 15, et notamment égal à 10.
4. Complexe d'inclusion selon la revendication 1 à 3 dans lequel :
* le polysaccharide est un chitosane portant des groupes hydrophobes au niveau d'atomes d'oxygène provenant des groupes -OH et/ou des groupes -CH2OH fixés au cycle du chitosane, et ayant pour formule
dans laquelle
■ R représente
• un atome d'hydrogène, ou
• un groupe de
dans laquelle
■ R4 représente le groupe hydrophobe et est choisi parmi :
° un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)1 -CH3 ou -(CH2)16-CH3,
° un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et contenant au moins un double liaison C=C, notamment les groupes -(C¾)7- CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou - CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3.sous réserve que R représente au
moins un groupe de formule
m m représente le nombre de motifs d'unités D-glucosamine,
■ n représente le nombre de motifs d'unités N-acétyle-D-glucosamine,
sous réserve que le degré de désacétylation (DDA) représentant le pourcentage de m par rapport au nombre total d'unités soit supérieur à 50 %,
* et Γα- cyclodextrine CD
dans laquelle
• p est égal à 6, 1 2 3
• R , R et R , identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisis parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH2, des groupes ammonium -NH3 +, ou des groupes sulfate -SO42", et sont notamment des atomes d'hydrogène ou des groupes méthyles,
ladite CD étant l'alpha-cyclodextrine (α-CD) sous forme de monomère,
et notamment dans lequel la cyclodextrine est fonctionnalisée par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines, de la biotine ou ses dérivés.
5. Complexe d'inclusion selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel
■ le polysacchande est un dextrane portant des groupes hydrophobes, fixés par des atomes d'oxygène dudit dextrane et re résentant des groupes de formule
dans laquelle
D R4 a les significations désignées dans la revendication 4,
D * représente le dextrane,
■ la cyclodextrine est l' a-CD,
ou dans lequel le polysaccharide est l'acide hyaluronique portant des groupes hydrophobes, fixés par des atomes d'oxygène dudit acide hyaluronique et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées dans la revendication 4,
n * représente l'acide hyaluronique,
■ la cyclodextrine est l' a-CD,
ou dans lequel le polysaccharide est une amylopectine portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène de ladite am lopectine et représentant des groupes de formule
dans laquelle n R4 a les significations désignées dans la revendication 4,
° * représente une amylopectine,
■ la cyclodextrine est Γ a-CD,
ou dans lequel le polysaccharide est un pullulane portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène dudit pullulane et représentant des groupes de formule
* O-^^R4
O
dans laquelle
° R4 a les significations désignées dans la revendication 5,
° * représente le pullulane,
■ la cyclodextrine est Γ a-CD,
ou dans lequel le polysaccharide est une héparine portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote de ladite héparine et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées dans la revendication 4,
° * représente l'héparine,
ou dans lequel le polysaccharide est une héparine portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène de ladite héparine, ces oxygènes pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de l'héparine, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
D R4 a les significations désignées dans la revendication 4,
α * représente l'héparine,
■ et la cyclodextrine est Γ a-CD,
ou dans lequel le polysaccharide est un carraghénane portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'azote dudit c sentant des groupes de formule dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
° * représente le carraghénane,
. ■ ou bien le polysaccharide est un carraghénane portant des groupes hydrophobes fixés par des atomes d'oxygène dudit carraghénane, ces oxygènes, pouvant provenir des groupements hydroxyles ou carboxyles de carraghénane, et représentant des groupes de formule
dans laquelle
° R4 a les significations désignées ci-dessus,
D * représente le carraghénane,
■ et la cyclodextrine est Γ a-CD.
6. Particule de taille comprise de 1 nm à 100000 nm contenant des complexes d'inclusion selon les revendications 1 à 5 par interaction entre au moins
■ un polysaccharide choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, les dérivés de la cellulose, l'héparane-sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyguluronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés, comportant des groupes hydrophobes choisis parmi les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés ou des groupes alcényles linéaires ou ramifiés et portant de 1 à 4 double liaisons C=C, conjuguées ou non, lesdits groupes hydrophobes étant liés de façon covalente audit polysaccharide, éventuellement fonctionnalisé par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés,
■ une α-cyclodextrine sous forme de monomère, éventuellement fonctionnalisée par un ligand choisi parmi des anti-corps, des fragments d'anti-corps, des récepteurs, des lectines ou de la biotine ou ses dérivés.
7. Système d'encapsulation contenant une ou plusieurs particules selon la revendication 6, et une substance utilisée pour ses propriétés dans les domaines pharmaceutique, médical, paramédical, des dispositifs médicaux, cosmétique, vétérinaire, agro-alimentaire, alimentation animale, agrochimie, des pesticides, des cosméto-textiles, de la parfumerie, environnemental, notamment la dépollution des eaux, dans l'industrie des peintures, du bâtiment et/ou de l'automobile.
8. Composition pharmaceutique contenant à titre de substance active une substance encapsulée dans des complexes d'inclusion selon l'une des revendications 1 à 5 ou dans des particules selon la revendication 6, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, sous forme solide, ou sous forme de solution ou de suspension dans un milieu physiologique, utilisable par les voies :
parentérale, orale, cutanée, sous-cutanée, nasale, pulmonaire ou oculaire et, pour toute administration au niveau d'une muqueuse,
notamment sous forme de pilules (comprimés), capsules molles, capsules dures (gélules), poudres, granules, comprimés solubles ou dispersibles, patch, implant, suppositoires, solutions, suspension, sirop, pâtes, crèmes, gels, émulsions, sprays, lotions, ou pommades.
9. Procédé de préparation d'un complexe d'inclusion selon les revendications 1 à 5, comportant une étape de mélange d'au moins :
■ un polysaccharide sous forme de suspension dans un solvant, notamment l'eau comportant des groupes hydrophobes liés de façon covalente au polysaccharide par des atomes d'oxygène dudit polysaccharide,
■ et d'une α-cyclodextrine (CD) sous forme de monomère, de préférence en suspension dans un solvant, notamment l'eau,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lésdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente,
et notamment comportant une étape de mélange
■ d'un polysaccharide choisi parmi le chitosane, le dextrane, l'acide hyaluronique, l'amylose, l'amylopectine, le pullulane, l'héparine, la chitine, l'héparane- sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine sulfate, la cellulose sulfate, le dextrane sulfate, la dextrine sulfate, l'amidon, la pectine, les alginates, les carraghénanes, le fucane, le curdlane, le xylane, l'acide polyglucuronique, le xanthane, l'arabinane, l'acide polymannuronique, et leurs dérivés,
ledit polysaccharide comportant des groupes hydrophobes de formule O
dans laquelle
- * représente le polysaccharide,
- R4 représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes -(CH2)7- CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-CH3,
■ d'une α-cyclodextrine (CD) ayant pour formule
dans laquelle
• p est égal à 6,
• R1, R2 et R3, identiques ou différents, notamment identiques, sont des atomes d'hydrogène, des groupes alkyles comportant 1 à 3 atomes de carbone, choisis parmi méthyles, éthyles, propyles, isopropyles, des groupes amino -NH2, des groupes ammonium - NH3 +, ou des groupes sulfate -S04 2", et sont notamment des atomes d'hydrogène ou des groupes méthyles,
ladite CD étant l'alpha-cyclodextrine (α-CD) sous forme de monomère,
pour obtenir un complexe d'inclusion dans lequel lesdits polysaccharide et cyclodextrine sont liés de façon non-covalente.
10. Polysaccharide choisi parmi
II
* un pullulane portant des groupes hydrophobes ayant pour formule
* un acide hyaluronique portant des groupes hydrophobes ayant pour formule
* une chitine portant des groupes hydrophobes ayant pour formule
dans laquelle
■ R représente
un atome d'hydrogène,
un groupe de formule
dans laquelle
■ R4 représente
• un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, contenant de 1 à 1000 atomes de carbone, notamment les groupes -(CH2)14-CH3 ou -(CH2)16-CH3,
• un groupe alcényle linéaire ou ramifié, contenant 2 à 1000 atomes de carbone et portant au moins 1 double liaison C=C, notamment les groupes - (CH2)7-CH=CH-CH2-(CH2)7-CH3 ou -(CH2)7-CH=CH- CH2)7-CH3,
sous réserve que R représente au moins un groupe de formule
■ m représente le nombre d'unités N-glucosamine,
■ n représente le nombre d'unités N-acétyle-glucosamine,
sous réserve que le pourcentage d'unités n par rapport au nombre total d'unités soit supérieur à 50 %,
11. Particules selon la revendication 6, comprenant un complexe d'inclusion selon les revendications 1 à 5 pour leur utilisation comme médicaments, notamment comme adjuvants pour la vaccination, le traitement des brûlures, et/ou pour la cicatrisation.
12. Particules selon la revendication 6, comprenant un complexe d'inclusion selon les revendications 1 à 5, pour leur utilisation dans la préparation de médicaments ayant au moins une activité pour prévenir, inhiber et/ou traiter les infections fongiques, bactériennes, virales et/ou parasitaires sur les surfaces biotiques ou abiotiques.
13. . Particules selon la revendication 6, comprenant un complexe d'inclusion selon les revendications 1 à 5 pour leur utilisation comme médicaments vétérinaires, notamment comme adjuvants pour la vaccination.
14. Utilisation des particules selon la revendication 6, comprenant un complexe d'inclusion selon les revendications 1 à 5 comme agent cosmétique, notamment comme agent anti-âge, dépigmentant, cicatrisant, hydratant, parfumant, désodorisant, anti -transpirant, nettoyant, colorant, conservateur.
15. Utilisation des particules selon la revendication 6 comprenant un complexe d'inclusion selon l'une des revendications 1 à 5 pour la mise en œuvre d'un procédé de préparation de dispositifs, notamment pansements cicatrisants, lesdits dispositifs comportant lesdites particules, et étant susceptible de libérer lesdites particules ou une ou plusieurs substance(s) active(s) d'intérêt contenue(s) dans lesdites particules.
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