JP2017520271A - 15種類の男性生殖関連タンパク質またはその組み合わせの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
(a).AK6タンパク質あるいはほかの男性生殖関連遺伝子またはタンパク質に対する特異的抗体、および/または
(b).特異的にAK6あるいはほかの男性生殖関連遺伝子またはタンパク質のmRNAまたはcDNAを増幅させる特異的プライマー
を含む。
もう一つの好適な例において、前記のAK6遺伝子のGenbankのアクセッション番号はNM_016283.4である。
もう一つの好適な例において、前記の検出は、男性個体の精漿または精液サンプルにおける精子局在タンパク質に対して定性および/または定量の検出を行うものである。
もう一つの好適な例において、前記抗老化組成物は、薬物組成物、美容製品組成物、または健康食品組成物を含む。
(a) AK6タンパク質、および表1から選ばれる任意の一つまたは複数のタンパク質、あるいは
(b) 表1から選ばれる任意の二つまたは複数のタンパク質
を含むタンパク質の集合を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の遺伝子は、当該遺伝子の全長配列あるいはその断片、cDNAまたはmRNAを含む。
(i)対象のサンプル由来の本発明の第四に係るタンパク質の集合または本発明の第五に係る遺伝子の集合の発現量および/または活性を検出する工程と、
(ii)(i)における測定結果に基づいて前記の対象が男性不妊症を罹患しているかどうか検出または診断する工程とを含み、
ここで、検出対象由来のサンプルにおけるAK6遺伝子またはタンパク質の発現量E1および/または活性と正常者の発現量および/または活性E2との比E1/E2≧2である場合、および/または検出対象由来のサンプルにおける表1における番号1〜14から選ばれる1種類または複数種類の遺伝子またはタンパク質の発現量および/または活性Eaと正常者の発現量および/または活性Ebとの比Ea/Eb≦0.5である場合、前記の検出対象が不妊症を罹患する確率が正常者よりも高いことを示すことが記載されている方法を提供する。
(a1)AK6阻害剤、
(b1)表1から選ばれる任意の一つまたは複数のタンパク質またはその遺伝子あるいはその促進剤、
(a1)と(b1)の組み合わせ
から選ばれる1種類または複数種類の物質を受精能獲得液と接触させることによって、男性受精成功率の向上および/または不妊症の治療を果たす方法を提供する。
(i)対象のサンプル由来の本発明の第四に係るタンパク質の集合または本発明の第五に係る遺伝子の集合の発現量および/または活性を検出する工程と、
(ii)(i)における測定結果に基づいて前記の対象の年齢範囲、または精細胞の老化状況、または精子および細胞の品質を判断する工程と
を含む方法を提供する。
ここで用いられるように、用語の「本発明のタンパク質」、「男性生殖関連タンパク質」、「本発明の精子局在タンパク質」、「精子局在タンパク質」および「年齢関連の精子局在タンパク質」とは、雄性哺乳動物(特にヒト)の睾丸および/または副睾丸で発現される、年齢関連の、精子に局在するタンパク質を指し、入れ替えて使うことができる。その関連の分子生物学的材料は、突然変異タンパク質、タンパク質の任意の断片、遺伝子およびその任意のDNA断片、突然変異遺伝子、mRNA、干渉RNA、抗体などを含むが、これらに限定されない。代表的な精子局在タンパク質は、表1に示された14種類の下方調節タンパク質および1種類の上方調節タンパク質(AK6)を含む。
本発明は、男性不妊の診断または治療に有用なタンパク質の集合であって、少なくともAK6、およびほかの男性不妊に関連するタンパク質、特に精子局在タンパク質を含むタンパク質の集合を提供する。通常、ここに記載される「ほかの男性不妊に関連するタンパク質」とは、既存技術で発見された男性不妊と関連性が存在するタンパク質を指す。好ましくは、本発明のタンパク質の集合は、AK6および表1における1種類または複数種類の精子局在タンパク質を含む。その中で、AK6タンパク質は、本発明で新しく発見された、男性不妊と密接に関連し、かつ青年と高齢者で差次的発現があるタンパク質である。
(b) 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14個の表1から任意に選ばれるタンパク質を含む。
本発明は、不妊症を診断または予測/検出する目的遺伝子の集合を提供するが、本発明の遺伝子の集合における各遺伝子の既知のmiRNAで前記の遺伝子の集合の発現量を測定することができる。
AK6の遺伝子調節関連miRNAのうち、miR-370、miR-544a、miR-27a、miR-27b、miR-128、miR-20a、miR-20b、miR-106b、miR-106a、miR-17、miR-200b、miR-200cは精子減少無力症群では発現が低下し、miR-93、miR-429は精子無力症群では発現が低下し、miR-519dは高齢者、精子無力症、精子減少無力症患者においていずれも顕著な低下を示す。AK6遺伝子調節関連miRNAの配列は以下の通りである。
本発明において、本発明の15種類の精子局在タンパク質およびその関連分子生物学的材料を定性または定量的に検出する方法を提供するが、ヒト精子局在タンパク質の検出、遺伝子突然変異の検出、遺伝子転写のmRNAの検出、調節関連miRNAの検出、突然変異タンパク質の検出、タンパク質活性の検出を含むが、これらに限定されない。検出に供される生物試料は、精子、精液、尿液、血液、前立腺液を含むが、これらに限定されない。
ヒト精液検査と手技 WHOラボマニュアル第5版の規定によると、前進運動(PR)精子が占める比率が32%未満の場合、精子無力症とする。本発明に記載される精子無力症とは、精液ルーチンのほかの各項目(たとえば奇形率、精子密度、白血球数、精液量など)が基本的に正常の青年の精子無力症である。
本発明に記載される精子減少無力症とは、精液における前進運動精子が占める比率が<32%、精子濃度が15×106/mlまたは単回射精が39×106の人を指す。
本発明のヒト精子局在タンパク質の定性または定量の検出に使用できる方法は特に限定されず、本分野の任意の蛍光強度または蛍光値を検出することができる装置、ソフトウェアまたは方法でもよい。
また、本発明は、精子局在タンパク質の検出に用いられるタンパク質チップを提供する。このようなチップは、定性または定量的にサンプルにおける精子局在タンパク質の含有量を検出することができる。これらの検出結果は、補助的に例えば精子の品質、精子の機能レベルおよび/または精子の品質低下の原因の判断に用いることができる。
精子の生成、成熟および老化は主に睾丸・副睾丸で分泌されて精子に結合するタンパク質分子の量に表れ、増加、減少または欠失のいずれも精子の成熟障害または機能異常を引き起こし、そして男性不妊につながる。本発明に基づき、精子局在タンパク質の検出方法および検出手段は、年齢関連の15種類の精子局在タンパク質の含有量の検出に使用し、そして精子の品質を判断し、男性不妊を診断することができる。
正常者にとって、抗体ブロッキングまたはsiRNA干渉などの方法によって、この14種類の発現下方調節の精子局在タンパク質の発現または活性を低下させることは、避妊に有用である。
(a)精子の品質および健康状態の評価:精子または精漿における本発明のタンパク質の含有量を測定することによって、精子の健康状態および品質を評価する。14種類の発現下方調節タンパク質の含有量が低下または欠失し、1種類の発現上方調節タンパク質(たとえばAK6タンパク質)の含有量が向上すると、精子の健康状態が良くなく、精子の品質のレベルが低く、精子に不完全の現象があることを示す。逆の場合、健康状態が良く、精子の品質が高いことを示す。
(b)男性不妊症の診断:精子または精漿における本発明のタンパク質の含有量を測定することによって、男性不妊症を診断する。14種類の発現下方調節タンパク質の含有量が低下または欠失し、1種類の発現上方調節タンパク質の含有量が向上すると、不妊の可能性があることを示す。
(c)環境汚染の評価:精子における本発明のタンパク質の含有量を検査することによって、生殖健康の予防検出または環境汚染の評価を行う。異なるところで生活する人は、タンパク質の含有量が低いと、生活の環境が良くないことを示す。多くの人に対する統計学的分析は、環境問題の判断に有用である。
(d)人類の健康管理:本発明のタンパク質の人類サンプル(たとえば血、尿、精漿、組織など)における含有量を測定し、正常の範囲を超えると、健康に問題がある可能性が現れ、さらなる検査または診断が必要であることを示す。
(e)年齢査定:たとえば、法医学の分野において、本発明のタンパク質含有量の測定によって、年齢の査定または測定の補助ができる。
(f)保健、治療の応用:本発明のタンパク質を補充することによって、当該タンパク質の機能に関連する疾患を治療することができ、精子の活力の増強、男性不妊症の治療に有用である。たとえば、坐剤とし、体外で女性生殖道に使用され、あるいは注射剤とし、男性に使用される(局部注射、皮下注射など)。
(g)避妊:抗本発明のタンパク質の抗体を使用し、製剤(たとえば坐剤)とし、避妊に使用することができる。
(h)薬物標的および選別:本発明のタンパク質は薬物標的とし、避妊薬物または男性不妊症の治療薬の選別に使用することができる。
(i)治療効果の評価指標:本発明のタンパク質の含有量の変化は、男性不妊症の治療手段の治療効果を評価する補助指標として使用することができる。
(j)毒性試験:動物の精子または精漿における当該タンパク質の含有量の変化を測定することによって、医薬品、化学品、化粧品などの生殖に対する影響を評価する。
以上の応用の完成は、この15種類のタンパク質の人類試料における含有量の変化の測定によって実現することができる以外、また遺伝子の突然変異、転写レベル、アミノ酸の変化、ヌクレオチドまたはアミノ酸の増加・欠失、調節関連miRNAレベル、抗体などを検出することによって実現することができる。
(a)速く有効に年齢と関連する精子局在タンパク質の含有量の検出結果を得ることができる。
(b)本発明のタンパク質の関連分子生物学的材料およびその検出方法は、男性不妊症に対する診断、治療、予防に関する医療技術の推進および診断薬、治療薬、予防薬または避妊薬の開発に有用である。
(c)本発明のタンパク質は、さらに、ヒトまたはほかの哺乳動物の年齢の判断、または細胞老化の評価および精子と細胞の品質の評価、または抗老化製品の開発に使用することができる。
遺伝子のクローニング、原核発現およびタンパク質精製
上記15種類の遺伝子のタンパク質製品は以下のような方法で得ることができる。遺伝子配列によって、成熟コーディング領域を増幅するための一対の特異的プライマーを合成する。通常の方法で調製されたヒト副睾丸cDNAライブラリーを鋳型とし、PCRで目的の遺伝子を直接増幅し、さらに市販のベクターのpGM-T vector(上海貝博生物公司から購入)にクローンして配列決定で正確と確認する。配列決定で確認した遺伝子を制限酵素切断部位で発現ベクターのpET32b(+)(上海貝博生物公司から購入)にクローンし、融合タグの読み枠と一致させる。組換え発現ベクターで大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、IPTGによって発現を誘導し、超音波で菌体を破砕させ、ベクターにおけるHis-Tagタグによって、「二段階ネッケル親和性クロマトグラフィー」で組換えタンパク質を分離して精製する。
異なる年齢の正常者の精液試料(30、40、50、60、65、70±2歳)をそれぞれ30例ずつ採取し、いずれも生殖系疾患の記録がなかった。精液が完全に液化した後、それぞれ1mlの精液を15mlの無菌円錐底試験管に入れ、その後それぞれ8mlになるまでPBSを入れ、軽く吹いて均一に混合した後、500gを15min遠心した。上清を捨てた後、さらにPBSで2回洗浄し(500g、10 min)、上清を捨て、収集された精子沈殿を3%(w/v)BSA含有PBSで精子濃度が1×106個/mlになるように調整した後、それぞれ0.1%ゼラチンで被覆された切片に塗布し、室温で自然乾燥し、-20℃でメタノールで10min固定し、乾燥後PBSで5 minずつ3回洗浄した後、目的タンパク質に対する第一抗体(3%BSA含有PBSで1:50で希釈した)を滴下し、室温で1hインキュベートした。PBSで5 minずつ3回洗浄した。FITC標識の第二抗体(3% BSA含有PBSで1:100で希釈した)を入れ、室温で1hインキュベートした。PBSで5 minずつ3回洗浄した。PIで再染色し、蒸留水で10 minずつ2回洗浄した。緩衝してグリセリンで封じ、それぞれMeta 510共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss、Germany)にセットしてタンパク質の局在位置および定量の分析を行った。
精製された15個の組換えタンパク質はBradford(Bradford 1976)法で定量・同定した後、凍結乾燥して保存した。図3は、15種類の精子局在タンパク質のうちの1種類、すなわちHSPA5遺伝子の相応のタンパク質(GRP78タンパク質とも呼ぶ)の発現精製SDS-PAGE電気泳動結果を示す。
同定によって、精製して得られた組換えタンパク質は本発明のタンパク質であることが確認された。
青年精子無力症の試料を102例収集し、CTSB、HSPA5、ALDH4A1、AK6といった4種類のタンパク質の精子無力症の精子における局在率および含有量の定量分析を行った。具体的な方法は実施例1と同様で、結果を図4に示す。
4.1 モノクローナル抗体の製造
本発明のタンパク質のモノクローナル抗体は通常のタンパク質のモノクローナル抗体の製造方法で得ることができるが、好ましくは本実施例で以下のような方法で得られた。精製された各本発明の組み換えタンパク質でそれぞれBALB/Cマウスを免疫させ、各マウスに1日目に50μgの組み換えタンパク質および等量の完全フロインドアジュバント(CFA)を注射した。その後、15、30および45日目にそれぞれ25μgの組み換えタンパク質および等量の不完全フロインドアジュバント(IFA)を注射して免疫を強化した。最後の免疫から3〜4日後、脾臓細胞を分離してSp2骨髄腫細胞株と混合し、さらにPEGを入れて細胞を互いに融合させ、融合した細胞を適当に希釈し、培養プレートに置いて培養し、通常は0.8個細胞/穴まで希釈し、穴の底の20%を覆うように細胞を培養した時点で、培養の上清液を吸い取ってELISAで抗体の含有量を測定した。陽性細胞株を選んでマウスの腹腔に接種し、腹水を収集し、ブドウ球菌のプロテインAで親和性クロマトグラフィーのカラムを調製し、その中の抗体を集中させた後、溶離し、モノクローナル抗体を回収した。
精子を収集してPBSで洗浄した後、1%ゼラチンで覆われたスライドガラスに塗布し、自然に乾燥させ、さらにメタノールで10分間固定した。精子を含むスライドガラスを3%BSAで室温で1時間ブロックした後、4.1で製造された各種のタンパク質のモノクローナル抗体(1:200)を添加し、4℃で一晩置いた。PBST(0.1%のTween-20を含むPBS)で3回洗浄し、相応のFITC-標識ヒツジ抗マウスIgGである第二抗体(1:200)を入れた。スライドガラスをPBSTで3回洗浄した後、80%グリセリンで封じた。Olympus BX-52顕微鏡で結果を観察した。結果を表1に示す。各タンパク質はそれぞれ成熟精子の尾部、頸部や先体などの部位に局在する。
以下の方法でタンパク質チップNo.1〜3を製造した。
a スライドガラスチップNo.1
(1) 高速スポッターで複数穴の板における各タンパク質サンプル(抗本発明のタンパク質の抗体)を直接高密度で化学処理した、表面に活性アルデヒド基があるスライドガラスにスポットし、各アレイに15個のサンプル点(それぞれ表1における番号1〜15の15種類のタンパク質に相応する)があり、各サンプル点は直径0.4mmであった。
(2) 室温で一晩または37℃で1時間インキュベートし、タンパク質のアミノ基をスライドガラスにおけるアルデヒド基と縮合反応させ、サンプルを固定化した。
(3) スライドガラスにおけるタンパク質と結合しなかった活性アルデヒド基を還元させ、されに充分に洗浄して室温で乾燥した。
(4) 乾燥後、遮光材料で密封して包装し、4℃の環境で保存した。
(1) 高速スポッターで複数穴の板における各タンパク質サンプル(抗本発明のタンパク質の抗体)をPDVF膜にスポットし、各アレイに15個のサンプル点(上記と同様)があり、各サンプル点は直径0.4mmであった。
(2) 緩衝液で膜を2〜3回、毎回3〜6分間洗浄した。
(3) 5%のウシ胎児血清または脱脂粉乳で室温で1〜2時間ブロックした。
(4) さらに緩衝液で膜を2〜3回、毎回3〜6分間洗浄した。
(5) 乾燥後、遮光材料で密封して包装し、4℃の環境で保存した。
(1) 被験タンパク質に対応する抗体対を製造したが、一方は捕捉抗体で、もう一方は検出抗体であった。
(2) 捕捉抗体を磁気ビーズにカップリングし、1種類の捕捉抗体が1種類の番号の磁気ビーズに相応した。
(3) 検出抗体に対して蛍光標識を行った。
(4) 異なる被験タンパク質の間で交差反応が発生することを防止するように、捕捉抗体と検出抗体を最適化した。
5.1 配合
1.β-CDに適量のエタノールを入れてペースト状に均一に撹拌し、HSPA5蛋白質を45分間研磨・包接し、使用に備えた。
2.36型半合成リポラーゼを加熱溶解した後、38℃に維持し、主剤の包接物、ツイン80を入れ、均一に混合して保温した。
3.均一に混合した保温物を膜に充填し、冷却して成形した。
体外受精に使用される精子における15種類の上記タンパク質の含有量を検出することによって、含有量が比較的に低いタンパク質を確認し、実施例2で得られた当該精子局在タンパク質または複数種類のタンパク質の組成物を体外受精能獲得液に置き換えした後、精子と卵子の受精過程をタンパク質を含有する受精能獲得液で完成させた。男性不妊障害、精子無力症患者に対し、タンパク質を入れて30min後、精子の活力が向上し、前進運動精子の数が増加し、そして体外受精の成功率が向上した。
30±5歳の正常青年、精子無力症患者、精子減少無力症患者、70±2歳の高齢者の精液の試料を10例ずつ収集し、PBSで3回洗浄し、顕微鏡でカウントし、遠心して得られた精子をTrizol法で精子RNAを抽出した。精子RNAの試料をCD52、CDH1遺伝子で選別した後、リアルタイムPCRを行った。
TargetScan (http://www.targetscan.org/) およびmiRanda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)の二つのソフトを併用して同時にAK6転写を調節するmiRNA分子を予測した。TargetScanで53個のmiRNAが、miRandaで17個のmiRNAが予測され、そのうち、15個のmiRNAが二つのデータベースで重複した。この15個のmiRNAの精子における含有量を定量検出した。方法は、正常者が提供した精子、精子無力症患者が提供した精子、高齢者が提供した精子(70±2歳)、精子減少無力症患者が提供した精子を10例ずつ選択し、全RNAを抽出した。各miRNA逆転写反応に、miRNA特異的なステムループプライマー、1 ng-1 μg 全RNAおよびReverTra Ace逆転写酵素(Toyobo)を使用した。PCRの場合、miRNA特異的なフォワードプライマーおよび共通のリバースプライマー(URP)を使用し、装置はQIAGEN’s Roter-Gene Qであった。20 μLの反応系において、1 μLのcDNA鋳型を含み、PCR反応条件は95℃5分間、95℃10秒、60℃ 45秒、計40サイクルであった。PCRに使用される酵素はPlatinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDGで、Life Technologies社から購入された(製品番号:11733-038)。U6 snRNAを参照遺伝子とした。2-△△Ct方法で試料におけるmiRNA含有量の差を計算した。すべての実験を3回繰り返した。結果は図7に示す。
GPX5転写調節関連miRNAの予測およびその精子における定量検出方法は実施例11と同様である。計9個のGPX5転写調節関連miRNAが予測され、その正常青年、高齢者(70±2歳)、精子無力症患者、精子減少無力症患者の精子における定量検出結果は図8に示す。
現在、臨床ではすでにいくつかの精漿タンパクが補助的に不妊症の診断および治療に用いられ、複数のマーカーを合わせて検出すると、スクリーニングができ、診断の陽性率が向上する。通常の免疫学的な検出方法は、放射免疫測定(RIA)、酵素結合免疫測定(ELISA)、化学発光免疫測定(CLIA)などを含み、それぞれ利点があるが、これらの技術は共通の制限があり、即ち、毎回1種の不妊症タンパクマーカーしか検出できない。これは臨床上の同時に複数の不妊症マーカーの検出の要求に応えられず、遺伝子チップおよびタンパク質チップは同一の標本における複数の異なる目的の遺伝子またはタンパク質を同時に分析することができ、また同時に複数の標本を検出することもできるため、効率が大幅に向上し、感度と精度が高く、信号雑音比が良く、微量の標本で済み、操作が簡単で、再現性が優れる。
Claims (10)
- (i)男性不妊を検出する試薬またはキットの製造、および/または(ii)避妊用薬物組成物の製造のために使用されることを特徴とするアデニル酸キナーゼ6(adenylate kinase 6、AK6)の遺伝子またはタンパク質、あるいはそのほかの男性生殖関連遺伝子またはタンパク質との組み合わせの使用。
- (i)男性不妊を検出する試薬またはキットの製造、および/または(ii)精子を提供する対象の年齢を判断する試薬またはキットの製造、および/または(iii)ヒトまたはほかの哺乳動物の年齢の判断、または精子の老化の評価および精子の品質の評価に用いられる試薬またはキットの製造のために使用されることを特徴とする男性生殖関連遺伝子またはタンパク質またはその調節性miRNAまたはこれらの組み合わせの使用。
- AK6阻害剤またはそのほかの男性生殖関連タンパク質促進剤または阻害剤との組み合わせの使用であって、(a)男性不妊を治療する薬物組成物の製造、および/または(b)抗老化組成物の製造のために使用され、前記のほかの男性生殖関連タンパク質は、一つまたは複数の表1に示されたタンパク質を含むことを特徴とする使用。
- 男性生殖および/または男性精子の受精成功率に影響するタンパク質の集合であって、
(a) AK6タンパク質、および表1から選ばれる任意の一つまたは複数のタンパク質、あるいは
(b) 表1から選ばれる任意の二つまたは複数のタンパク質
を含むことを特徴とするタンパク質の集合。 - 男性生殖および/または男性精子の受精成功率に影響する遺伝子の集合であって、前記遺伝子の集合における遺伝子はそれぞれ請求項4に記載のタンパク質の集合におけるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子の集合。
- 男性不妊を検出するためのキットであって、請求項4に記載のタンパク質の集合または請求項5に記載の遺伝子の集合を検出する検出試薬を含む容器と、前記キットが男性不妊を検出するためのものであることを明記するラベルまたは説明書とを含むことを特徴とするキット。
- 睾丸または副睾丸によって発現され精子結合タンパク質るを検出するためのチップであって、
固相担体と、前記固相担体に位置する、それぞれ前記の男性生殖関連タンパク質の捕捉試薬が固定化された、請求項4に記載のタンパク質の集合を検出するための検出点を含むチップ。 - 前記の捕捉試薬は、請求項3に記載のタンパク質の集合におけるタンパク質と特異的に結合するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項7に記載のチップ。
- 男性受精成功率を向上させる薬物組成物であって、(a)AK6阻害剤と、任意に(b)表1から選ばれる一つまたは複数のタンパク質または遺伝子あるいはその促進剤と、(c)薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする組成物。
- (a1)AK6遺伝子またはタンパク質またはその促進剤と、任意に(b1)表1から選ばれる一つまたは複数のタンパク質または遺伝子の拮抗剤と、(c1)薬学的に許容される担体とを含むことを特徴とする避妊薬物組成物。
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