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Description
本発明の好ましい態様を本明細書で示し記載してきたが、かかる態様が例示目的のみで提供されることは、当業者には明らかとなるであろう。多数の変形、変化、及び置換が、今や本発明から逸脱することなく当業者には思い浮かぶであろう。本明細書に記載の本発明の態様に対する様々な代替手段を、本発明の実施に用い得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、及びこれらの特許請求の範囲内の方法及び構造、ならびにそれらの均等物が、これによって網羅されることが意図される。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
デジタルアッセイを行うための方法であって、
複数の多分散液滴であって、前記液滴の少なくともいくつかが試料を含む、液滴を産出することと、
前記試料を増幅することと、
前記試料を検出可能な薬剤で標識することと、
液滴のための画像スタックを取得することと、
前記画像スタックから前記液滴の体積を決定することと、
前記画像スタックから前記液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定することと、
前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む、前記方法。
（項目２）
前記画像スタックを取得することが、光学撮像を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記検出可能な薬剤を検出することが、光学撮像を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記光学撮像が、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記画像スタックが、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記画像スタックが、液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記方法が、前記複数の液滴に対して同時に行われる、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記複数の多分散液滴が、１群列の多分散液滴を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記群列の多分散液滴が、マルチウェルプレート中に配置される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記液滴の体積が、ラインスキャン法、シンプルバウンダリ法、リバースウォーターシェッド法、円検出法、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法、またはこれらの組み合わせによって、前記画像スタックから決定される、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定される、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記複数の多分散液滴が、第１の流体及び第２の流体を含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することを含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
第２の流体と非混和である第１の流体及び前記第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することと、
前記エマルションを前記第２の流体と非混和である第３の流体中で撹拌し、それにより二重エマルションを形成することと、を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記撹拌することが、振とう、ボルテックス、超音波処理、磁石による混合、押出、フローフォーカス、またはこれらの組み合わせから選択される、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６）
前記撹拌することが、エマルションを形成するのに十分である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記押出が、前記流体のピペッティングを含み、前記ピペッティングが、エマルションを産出するのに十分である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記撹拌することが、マイクロ流体デバイス中で起きる、項目１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記撹拌することが、ボルテックスを含む、項目１３または１４に記載の方法。
（項目２０）
前記エマルションが、水相及び非水相を含む、項目１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含む、項目１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含み、前記第３の流体が水を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
前記複数の多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記複数のエマルションが、３つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記第１の流体が水性である、項目１２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の流体が前記試料を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第２の流体が油である、項目１２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記第２の流体が油であり、前記第２の流体が前記第１の流体及び前記第３の流体と非混和である、項目１４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記第１の流体が、前記第３の流体とは異なる、項目１４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記第３の流体が油であり、前記第３の流体が前記第１の流体及び前記第２の流体と非混和である、項目１４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記複数の多分散液滴が、流体界面修飾要素を更に含む、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される、項目３１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記非混和性流体のうちの１つ以上をゲルまたは固体に変換することを更に含む、項目１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記非混和性流体が、前記試料を増幅する前、前記試料を増幅する間、または前記試料を増幅した後に、ゲルまたは固体に変換される、項目３４に記載の方法
（項目３６）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーである、項目１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記試料を増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記試料を増幅することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、項目１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
液滴径の分布が、液滴中央径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記液滴径の分布が、液滴平均径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記多分散液滴における体積が、２倍超で、１０倍超で、１００倍超で、１０００倍超で、１００００倍超で、１０００００倍超で、１００００００倍超で、約２倍超で、約１０倍超で、約１００倍超で、約１０００倍超で、約１００００倍超で、約１０００００倍超で、または１００００００倍超で、変化する、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記多分散液滴が、１００ナノリットル（ｎＬ）〜１フェムトリットル（ｆＬ）、１０ｎＬ〜１０ｆＬ、１ｎＬ〜１００ｆＬ、１００ｎＬ〜１ｐＬ、１０ｎＬ〜１０ｐＬ、または１ｎＬ〜１ｐＬ、約５００ｐＬ〜約５０ｆＬ、約１００ｐＬ〜約１００ｆＬの体積分布を有する、項目１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記多分散液滴の平均体積が、前記試料の増幅中に、５０％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満変化する、項目１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記試料を増幅することが、第１の増幅サイクルを含み、前記多分散液滴の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、前記第１の増幅サイクル後に融合する、項目１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記第１の流体の屈折率が、前記第２の流体の屈折率と、２００％未満、１００％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満異なる、項目１２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
デジタルアッセイを行うための方法であって、
少なくともいくつかが試料を含む複数の多分散液滴を産出することと、
前記試料を増幅することと、
前記試料を検出可能な薬剤で標識することと、
前記複数の多分散液滴を、フローサイトメトリーチャネルを通して流すことと、
前記液滴の体積を、前記液滴が前記フローサイトメトリーチャネルを通して流れるときに決定することと、
前記液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定することと、
前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む、前記方法。
（項目４９）
前記試料の前記濃度を決定することが、前記液滴からの散乱光を検出することを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
デジタルアッセイを行うための組成物であって、
第１の流体と、
第２の流体であって、前記第１の流体及び前記第２の流体が、互いに非混和であり、撹拌時にエマルションを形成することができる、第２の流体と、
界面活性剤と、
増幅試薬と、を含む、前記組成物。
（項目５１）
試料を更に含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５２）
前記試料がヌクレオチドである、項目５１に記載の組成物。
（項目５３）
検出可能な薬剤を更に含み、前記検出可能な薬剤が、試料を標識することができる、項目５０〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５４）
前記試料が、検出可能な薬剤で標識される、項目５１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５５）
核酸試料に結合することができる検出可能な薬剤を更に含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５６）
前記増幅試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）試薬、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）試薬、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）試薬、またはこれらの組み合わせから選択される、項目５０〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５７）
前記増幅試薬がＰＣＲ試薬である、項目５０に記載の組成物。
（項目５８）
前記ＰＣＲ試薬が、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、プローブ、またはこれらの組み合わせから選択される、項目５７に記載の組成物。
（項目５９）
第３の流体を更に含み、前記第３の流体が前記第２の流体と非混和である、項目５０〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６０）
前記組成物が、二重エマルションを形成することができる、項目５９に記載の組成物。
（項目６１）
前記第１の流体が水性である、項目５０〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６２）
前記第１の流体が前記増幅試薬を含む、項目５０〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６３）
前記第２の流体が油である、項目５０〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６４）
前記第２の流体が油であり、前記第２の流体が前記第１の流体及び前記第３の流体と非混和である、項目５９〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６５）
前記第１の流体が、前記第３の流体とは異なる、項目５９〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６６）
前記第３の流体が油であり、前記第３の流体が前記第１の流体及び前記第２の流体と非混和である、項目５９〜６５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６７）
流体界面修飾要素を更に含む、項目５０〜６６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６８）
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤を含む、項目６７に記載の組成物。
（項目６９）
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される、項目６７〜６８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７０）
前記非混和性流体のうちの１つ以上をゲルまたは固体に変換することができる固化剤またはゲル化剤を更に含む、項目５０〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７１）
項目５０〜７０のいずれか一項に記載の組成物を含む、デジタルアッセイを行うためのキット。
（項目７２）
少なくとも１つの液滴の体積を決定するためのシステムであって、
前記少なくとも１つの液滴を保持するように構成された容器と、
前記容器中の前記少なくとも１つの液滴の画像を取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、前記コンピューティングデバイスが、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、（ｉ）前記撮像ソースに、前記少なくとも１つの液滴の画像スタックを取得させ、（ｉｉ）前記プロセッサに、前記試料中の前記少なくとも１つの液滴の体積を前記取得された画像スタックに基づいて決定させる１組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備えるシステム。
（項目７３）
前記少なくとも１つの液滴が、複数の液滴を含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７４）
前記複数の液滴が、多分散性である、項目７３に記載のシステム。
（項目７５）
前記容器が、マルチウェルプレートを含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７６）
前記撮像ソースが、光学撮像ソースを含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７７）
前記光学撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせを行うように構成される、項目７６に記載のシステム。
（項目７８）
前記液滴に対する前記画像スタックが、前記少なくとも１つの液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７９）
前記画像スタックが、前記少なくとも１つの液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含む、項目７８に記載のシステム。
（項目８０）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、（ｉ）前記画像スタックの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、（ｉｉ）前記少なくとも１つの画素セットを、前記少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも１つの画素セットから特定することと、（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記少なくとも１つの液滴の体積を決定させる、項目７２に記載のシステム。
（項目８１）
前記少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、単一の全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目８０に記載のシステム。
（項目８２）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるきに、前記プロセッサに、前記取得した画像スタックに基づいて、複数の液滴の複数の体積を決定させる、項目７２に記載のシステム。
（項目８３）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるきに、更に、前記プロセッサに、前記複数の液滴の少なくともいくつかにおける検出可能な薬剤の有無を決定させる、項目８２に記載のシステム。
（項目８４）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、更に、前記プロセッサに、前記複数の液滴中の試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記複数の液滴の決定された複数の体積に基づいて、決定させる、項目８３に記載のシステム。
（項目８５）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目８４に記載のシステム。
（項目８６）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目８３に記載のシステム。
（項目８７）
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーを含む、項目８３に記載のシステム。
（項目８８）
前記少なくとも１つの液滴が、ヌクレオチドを含む試料を含む、項目７２に記載のシステム。
（項目８９）
前記少なくとも１つの液滴中の前記試料が増幅されている、項目８８に記載のシステム。
（項目９０）
前記少なくとも１つの液滴中の前記試料が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことによって増幅される、項目８９に記載のシステム。
（項目９１）
前記試料が、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅によって増幅される、項目９０に記載のシステム。
（項目９２）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記検出可能な薬剤の濃度を、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定されるようにする、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
液滴の体積を決定するための方法であって、
前記液滴の画像スタックを取得することと、
前記画像スタックの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、
前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、
少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも１つの画素セットから特定することと、
前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、を含む、前記方法。
（項目９４）
前記少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記液滴の前記画像スタックを取得することが、前記液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を取得することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９６）
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像が、前記液滴について別々の焦点深度から撮られる、項目９４に記載の方法。
（項目９７）
前記特定された少なくとも１つの液滴の体積を決定することが、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９８）
前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定することが、
（ｉ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、前記複数の画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の最大径を測定すること、
（ｉｉ）曲線を前記特定された少なくとも１つの液滴の境界に適合させ、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記適合させた曲線に基づいて補間すること、
（ｉｉｉ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径から決定すること、または
（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径、及び前記複数の画像間の画像深度の差異から決定すること、のうちの少なくとも１つを含む、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
複数の液滴の体積を決定することを更に含む、項目９３に記載の方法。
（項目１００）
前記複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無を、前記画像スタックから決定することを更に含む、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記複数の液滴中の試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記決定された複数の液滴の体積に基づいて、決定することを更に含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記複数の液滴中の前記試料を増幅することを更に含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０４）
前記試料を増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記試料を増幅することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０６）
前記検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定される、項目１００に記載の方法。
（項目１０７）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目１００に記載の方法。
（項目１０８）
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーを含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０９）
前記画像スタックを取得することが、光学撮像を含む、項目９３に記載の方法。
（項目１１０）
前記光学撮像が、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記少なくとも１つの液滴の前記画像スタックを取得することが、複数の多分散液滴に対する前記画像スタックを取得することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１１２）
前記複数の多分散液滴が、第１の流体及び第２の流体を含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することを更に含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１１１に記載の方法。
（項目１１４）
前記画像スタックを取得することが、前記形成されたエマルションを撮像することを含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１６）
前記第２の流体と非混和である第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することと、
前記エマルションを前記第２の流体と非混和である第３の流体中で撹拌し、、それにより二重エマルションを形成することと、を更に含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１１７）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含み、前記第３の流体が水を含む、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記撹拌することが、振とう、ボルテックス、超音波処理、磁石による混合、押出、フローフォーカス、またはこれらの組み合わせから選択される、項目１１３または１１６に記載の方法。
（項目１１９）
前記撹拌することが、エマルションを形成するのに十分である、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記押出が、前記流体のピペッティングを含み、前記ピペッティングが、エマルションを産出するのに十分である、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記撹拌することが、マイクロ流体デバイス中で起きる、項目１１６〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
前記エマルションが、水相及び非水相を含む、項目１１３または１１６に記載の方法。
（項目１２３）
前記多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目１１３または１１６に記載の方法。
（項目１２４）
前記多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１２５）
前記複数のエマルションが、３つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製される、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
前記３つ以上の非混和性流体が、第１の流体、第２の流体、及び第３の流体を含む、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記第１の流体が水性である、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記第２の流体が油である、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
前記第２の流体が前記第１の流体及び前記第３の流体と非混和である、項目１２７に記載の方法。
（項目１３０）
前記非混和性の第１、第２、または第３の流体のうちの少なくとも１つを、ゲルまたは固体に変換することを更に含む、項目１２７に記載の方法。
（項目１３１）
前記第１の流体が、前記第３の流体とは異なる、項目１２６に記載の方法。
（項目１３２）
前記第３の流体が油であり、前記第３の流体が前記第１の流体及び前記第２の流体と非混和である、項目１２６に記載の方法。
（項目１３３）
前記非混和性の第３の流体を固体またはゲルに変換することを更に含む、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
前記第１の流体が、検出のための試料を含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１３５）
前記第１の流体の屈折率が、前記第２の流体の屈折率と、２００％未満、１００％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満異なる、項目１２６に記載の方法。
（項目１３６）
前記複数の多分散液滴が、流体界面修飾要素を更に含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１３７）
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤を含む、項目１３６に記載の方法。
（項目１３８）
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、項目１３６に記載の方法。
（項目１３９）
液滴径の分布が、液滴中央径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４０）
液滴径の分布が、液滴平均径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４１）
前記多分散液滴における体積が、２倍超で、１０倍超で、１００倍超で、１０００倍超で、１００００倍超で、１０００００倍超で、１００００００倍超で、約２倍超で、約１０倍超で、約１００倍超で、約１０００倍超で、約１００００倍超で、約１０００００倍超で、または１００００００倍超で、変化する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４２）
前記多分散液滴が、１００ナノリットル（ｎＬ）〜１フェムトリットル（ｆＬ）、１０ｎＬ〜１０ｆＬ、１ｎＬ〜１００ｆＬ、１００ｎＬ〜１ｐＬ、１０ｎＬ〜１０ｐＬ、または１ｎＬ〜１ｐＬ、約５００ｐＬ〜約５０ｆＬ、約１００ｐＬ〜約１００ｆＬの体積分布を有する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４３）
試料を前記複数の多分散液滴における検出のために増幅することを更に含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１４４）
前記多分散液滴の平均体積が、前記試料の増幅中に、５０％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満変化する、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記試料を増幅することが、第１の増幅サイクルを含み、前記多分散液滴の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、前記第１の増幅サイクル後に融合する、項目１４３に記載の方法。
（項目１４６）
前記画像スタックの前記個々の画像中の前記少なくとも１つの画素セットを特定することが、前記個々の画像内で複数のスキャンを取得することと、閾値レベルを設定することと、前記閾値レベル外の前記複数のスキャン中のエリアを前記画素セットとして特定することと、を含む、項目９３に記載の方法。
（項目１４７）
前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、前記少なくとも１つの画素セットのアスペクト比を決定することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１４８）
前記少なくとも１つの画素セットが、前記少なくとも１つの画素セットの前記アスペクト比が閾値以下であるときに、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定される、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
前記閾値が、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２である、項目１４８に記載の方法。
（項目１５０）
前記閾値が、前記試料の少なくとも一部を含まない液滴を除外するのに十分である、項目１４８に記載の方法。
（項目１５１）
前記画素セットを少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、リバースウォーターシェッド法を行うことを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１５２）
前記リバースウォーターシェッド法を行うことが、
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて、マップを生成することと、
前記マップ中の１つ以上の画素セットを特定することと、
個々の画素セットを目的領域として特定することと、
前記目的領域の境界を少なくとも１つの最良適合の円と適合させることと、を含む、項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
前記少なくとも１つの最良適合の円を少なくとも１つの液滴として特定することを更に含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５４）
前記画像スタックの前記個々の画像を、前記マップを生成する前に平滑化することを更に含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５５）
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて生成された前記マップが、位相マップを含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５６）
前記１つ以上の画素セットを特定することが、個々の画素が、前記個々の画素の前記画素強度及び１つ以上の閾値に基づいて、背景画素を含むか、または液滴画素を含むかを決定することを含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５７）
前記個々の画素セットが必要最低限のエリアを上回るエリアを有するときに、前記個々の画素セットが目的領域として特定される、項目１５２に記載の方法。
（項目１５８）
前記個々の画素セットが複数の目的領域を含むか否かを決定することと、前記複数の目的領域を単一の目的領域へと組み合わせることと、を更に含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５９）
前記画素セットを少なくとも１つの液滴の少なくとも一部として特定することが、円検出法を行うことを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１６０）
前記円検出法を行うことが、
閾値外の前記画像スタックの前記個々の画像の１つ以上のエリアを特定することと、
複数の円を前記特定された１つ以上のエリア上に重ね合わせることと、
前記重ね合わせた複数の円のうちの１つ以上の円を、前記１つ以上の円が少なくとも１つの所定の基準を満たさないときに拒否することと、
１つ以上の残りの円を、少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することと、を含む、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
前記少なくとも１つの画素セットを少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行うことを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１６２）
前記リバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行うことが、
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて、マップを生成することと、
前記生成されたマップ中の１つ以上の画素セットを特定することと、
個々の画素を目的領域として特定することと、
複数の円を前記目的領域上に重ね合わせることと、
前記重ね合わせた複数の円のうちの１つ以上の円を、前記１つ以上の円が少なくとも１つの所定の基準を満たさないときに拒否することと、
１つ以上の残りの円を、少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することと、を含む、項目１６１に記載の方法。
（項目１６３）
前記画像スタックの前記個々の画像を、前記マップを生成する前に平滑化することを更に含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて生成された前記マップが、位相マップを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６５）
前記１つ以上の画素セットを特定することが、個々の画素を、前記個々の画素の前記画素強度及び１つ以上の閾値に基づいて、背景画素または液滴画素として特定することを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６６）
前記個々の画素セットが必要最低限のエリアを上回るエリアを有する場合に、前記個々の画素セットが目的領域を含むことが決定される、項目１６２に記載の方法。
（項目１６７）
前記少なくとも１つの所定の基準が、（ｉ）前記目的領域の外部境界画素の最大部分を含む１つ以上の円を選択すること、（ｉｉ）前記目的領域のエリアの最大部分を含む１つ以上の円を選択すること、（ｉｉｉ）前記目的領域とは異なる画素グループからの画素を含む１つ以上の円を拒否すること、（ｉｖ）実質的な複数のグループ外の画素を含む１つ以上の円を拒否すること、または（ｖ）円の円周の実質的な一部が前記画素グループの内部にある、１つ以上の円を判別すること、のうちの１つ以上を含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６８）
前記１つ以上の円を拒否することが、前記複数の対で重なり合った円を検査することを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６９）
前記検査した円が、第１の円及び第２の円を含み、前記第１の円または第２の円のうちの１つを、票に基づいて拒否することを更に含む、項目１６８に記載の方法。
（項目１７０）
前記票が、ユーザによって定義される、項目１６９に記載の方法。
（項目１７１）
前記１つ以上の残りの円を少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することが、前記１つ以上の残りの円を少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に割り当てることを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１７２）
前記１つ以上の円が、（ｉ）前記目的領域を、少なくとも１つの液滴に対する最良の適合度統計を持つ円を有する前記少なくとも１つの液滴に割り当てること、または（ｉｉ）前記目的領域を、エリアにおける前記１つ以上の円との最大の重複を有する前記少なくとも１つの液滴に割り当てること、のうちの１つ以上に基づいて、前記少なくとも１つの液滴に割り当てられる、項目１７１に記載の方法。
（項目１７３）
前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することが、前記１つ以上の特定された円の１つ以上の直径を前記特定された少なくとも１つの個々の液滴に対応するものとして決定することを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１７４）
デジタルアッセイを行うためのシステムであって、
複数の多分散液滴を保持するように構成された容器であって、前記液滴の少なくともいくつかが、検出可能な薬剤で標識された試料を含む、容器と、
前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の画像スタックを取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、
（ｉ）前記撮像ソースに、前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の前記画像スタックを取得させ、
（ｉｉ）前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴の体積を前記取得した画像スタックに基づいて決定させ、
（ｉｉｉ）前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定させ、
（ｉｖ）前記プロセッサに、前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記複数の多分散液滴の体積に基づいて決定させる１組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備える、システム。
（項目１７５）
前記容器が、マルチウェルプレートを含む、項目１７４に記載のシステム。
（項目１７６）
前記撮像ソースが、光学撮像ソースを含む、項目１７４に記載のシステム。
（項目１７７）
前記光学撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を行うように構成される、項目１７６に記載のシステム。
（項目１７８）
前記取得された画像スタックが、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目１７４に記載のシステム。
（項目１７９）
前記画像スタックが、前記単一の液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含む、項目１７８に記載のシステム。
（項目１８０）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、（ｉ）前記画像スタックの少なくとも１つの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、（ｉｉ）前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて特定することと、（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記複数の多分散液滴の体積を決定させる、項目１７４に記載のシステム。
（項目１８１）
少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目１８０に記載のシステム。
（項目１８２）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目１７５に記載のシステム。
（項目１８３）
前記試料が増幅されている、項目１７５に記載のシステム。
（項目１８４）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目１７５に記載のシステム。
（項目１８５）
前記複数の多分散液滴が、第１の流体及び第２の流体を含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１７４に記載のシステム。
（項目１８６）
前記光学撮像が補償光学によって行われる、項目１〜４７または１０９〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８７）
前記光学撮像ソースが補償光学撮像ソースである、項目７６〜７７または１７６〜１７７のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１８８）
液滴の体積を、前記液滴が試料を含む場合にのみ測定することを含む、項目１〜４９、９２〜１７３、または１８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８９）
前記試料を含まないと決定されたあらゆる液滴を測定から除外することを含む、項目１８８に記載の方法。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する。
（項目１）
デジタルアッセイを行うための方法であって、
複数の多分散液滴であって、前記液滴の少なくともいくつかが試料を含む、液滴を産出することと、
前記試料を増幅することと、
前記試料を検出可能な薬剤で標識することと、
液滴のための画像スタックを取得することと、
前記画像スタックから前記液滴の体積を決定することと、
前記画像スタックから前記液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定することと、
前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む、前記方法。
（項目２）
前記画像スタックを取得することが、光学撮像を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記検出可能な薬剤を検出することが、光学撮像を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記光学撮像が、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記画像スタックが、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記画像スタックが、液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記方法が、前記複数の液滴に対して同時に行われる、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記複数の多分散液滴が、１群列の多分散液滴を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記群列の多分散液滴が、マルチウェルプレート中に配置される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記液滴の体積が、ラインスキャン法、シンプルバウンダリ法、リバースウォーターシェッド法、円検出法、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法、またはこれらの組み合わせによって、前記画像スタックから決定される、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定される、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記複数の多分散液滴が、第１の流体及び第２の流体を含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することを含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
第２の流体と非混和である第１の流体及び前記第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することと、
前記エマルションを前記第２の流体と非混和である第３の流体中で撹拌し、それにより二重エマルションを形成することと、を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記撹拌することが、振とう、ボルテックス、超音波処理、磁石による混合、押出、フローフォーカス、またはこれらの組み合わせから選択される、項目１３または１４に記載の方法。
（項目１６）
前記撹拌することが、エマルションを形成するのに十分である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記押出が、前記流体のピペッティングを含み、前記ピペッティングが、エマルションを産出するのに十分である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記撹拌することが、マイクロ流体デバイス中で起きる、項目１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記撹拌することが、ボルテックスを含む、項目１３または１４に記載の方法。
（項目２０）
前記エマルションが、水相及び非水相を含む、項目１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含む、項目１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含み、前記第３の流体が水を含む、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
前記複数の多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記複数のエマルションが、３つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記第１の流体が水性である、項目１２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の流体が前記試料を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第２の流体が油である、項目１２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記第２の流体が油であり、前記第２の流体が前記第１の流体及び前記第３の流体と非混和である、項目１４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記第１の流体が、前記第３の流体とは異なる、項目１４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記第３の流体が油であり、前記第３の流体が前記第１の流体及び前記第２の流体と非混和である、項目１４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記複数の多分散液滴が、流体界面修飾要素を更に含む、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される、項目３１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記非混和性流体のうちの１つ以上をゲルまたは固体に変換することを更に含む、項目１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記非混和性流体が、前記試料を増幅する前、前記試料を増幅する間、または前記試料を増幅した後に、ゲルまたは固体に変換される、項目３４に記載の方法
（項目３６）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーである、項目１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記試料を増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記試料を増幅することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、項目１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
液滴径の分布が、液滴中央径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記液滴径の分布が、液滴平均径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記多分散液滴における体積が、２倍超で、１０倍超で、１００倍超で、１０００倍超で、１００００倍超で、１０００００倍超で、１００００００倍超で、約２倍超で、約１０倍超で、約１００倍超で、約１０００倍超で、約１００００倍超で、約１０００００倍超で、または１００００００倍超で、変化する、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記多分散液滴が、１００ナノリットル（ｎＬ）〜１フェムトリットル（ｆＬ）、１０ｎＬ〜１０ｆＬ、１ｎＬ〜１００ｆＬ、１００ｎＬ〜１ｐＬ、１０ｎＬ〜１０ｐＬ、または１ｎＬ〜１ｐＬ、約５００ｐＬ〜約５０ｆＬ、約１００ｐＬ〜約１００ｆＬの体積分布を有する、項目１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記多分散液滴の平均体積が、前記試料の増幅中に、５０％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満変化する、項目１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記試料を増幅することが、第１の増幅サイクルを含み、前記多分散液滴の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、前記第１の増幅サイクル後に融合する、項目１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記第１の流体の屈折率が、前記第２の流体の屈折率と、２００％未満、１００％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満異なる、項目１２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
デジタルアッセイを行うための方法であって、
少なくともいくつかが試料を含む複数の多分散液滴を産出することと、
前記試料を増幅することと、
前記試料を検出可能な薬剤で標識することと、
前記複数の多分散液滴を、フローサイトメトリーチャネルを通して流すことと、
前記液滴の体積を、前記液滴が前記フローサイトメトリーチャネルを通して流れるときに決定することと、
前記液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定することと、
前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無に基づいて決定することと、を含む、前記方法。
（項目４９）
前記試料の前記濃度を決定することが、前記液滴からの散乱光を検出することを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
デジタルアッセイを行うための組成物であって、
第１の流体と、
第２の流体であって、前記第１の流体及び前記第２の流体が、互いに非混和であり、撹拌時にエマルションを形成することができる、第２の流体と、
界面活性剤と、
増幅試薬と、を含む、前記組成物。
（項目５１）
試料を更に含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５２）
前記試料がヌクレオチドである、項目５１に記載の組成物。
（項目５３）
検出可能な薬剤を更に含み、前記検出可能な薬剤が、試料を標識することができる、項目５０〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５４）
前記試料が、検出可能な薬剤で標識される、項目５１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５５）
核酸試料に結合することができる検出可能な薬剤を更に含む、項目５０に記載の組成物。
（項目５６）
前記増幅試薬が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試薬、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）試薬、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）試薬、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）試薬、またはこれらの組み合わせから選択される、項目５０〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５７）
前記増幅試薬がＰＣＲ試薬である、項目５０に記載の組成物。
（項目５８）
前記ＰＣＲ試薬が、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、プローブ、またはこれらの組み合わせから選択される、項目５７に記載の組成物。
（項目５９）
第３の流体を更に含み、前記第３の流体が前記第２の流体と非混和である、項目５０〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６０）
前記組成物が、二重エマルションを形成することができる、項目５９に記載の組成物。
（項目６１）
前記第１の流体が水性である、項目５０〜６０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６２）
前記第１の流体が前記増幅試薬を含む、項目５０〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６３）
前記第２の流体が油である、項目５０〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６４）
前記第２の流体が油であり、前記第２の流体が前記第１の流体及び前記第３の流体と非混和である、項目５９〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６５）
前記第１の流体が、前記第３の流体とは異なる、項目５９〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６６）
前記第３の流体が油であり、前記第３の流体が前記第１の流体及び前記第２の流体と非混和である、項目５９〜６５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６７）
流体界面修飾要素を更に含む、項目５０〜６６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６８）
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤を含む、項目６７に記載の組成物。
（項目６９）
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される、項目６７〜６８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７０）
前記非混和性流体のうちの１つ以上をゲルまたは固体に変換することができる固化剤またはゲル化剤を更に含む、項目５０〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７１）
項目５０〜７０のいずれか一項に記載の組成物を含む、デジタルアッセイを行うためのキット。
（項目７２）
少なくとも１つの液滴の体積を決定するためのシステムであって、
前記少なくとも１つの液滴を保持するように構成された容器と、
前記容器中の前記少なくとも１つの液滴の画像を取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、前記コンピューティングデバイスが、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、（ｉ）前記撮像ソースに、前記少なくとも１つの液滴の画像スタックを取得させ、（ｉｉ）前記プロセッサに、前記試料中の前記少なくとも１つの液滴の体積を前記取得された画像スタックに基づいて決定させる１組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備えるシステム。
（項目７３）
前記少なくとも１つの液滴が、複数の液滴を含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７４）
前記複数の液滴が、多分散性である、項目７３に記載のシステム。
（項目７５）
前記容器が、マルチウェルプレートを含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７６）
前記撮像ソースが、光学撮像ソースを含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７７）
前記光学撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせを行うように構成される、項目７６に記載のシステム。
（項目７８）
前記液滴に対する前記画像スタックが、前記少なくとも１つの液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目７２に記載のシステム。
（項目７９）
前記画像スタックが、前記少なくとも１つの液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含む、項目７８に記載のシステム。
（項目８０）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、（ｉ）前記画像スタックの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、（ｉｉ）前記少なくとも１つの画素セットを、前記少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも１つの画素セットから特定することと、（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記少なくとも１つの液滴の体積を決定させる、項目７２に記載のシステム。
（項目８１）
前記少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、単一の全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目８０に記載のシステム。
（項目８２）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるきに、前記プロセッサに、前記取得した画像スタックに基づいて、複数の液滴の複数の体積を決定させる、項目７２に記載のシステム。
（項目８３）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるきに、更に、前記プロセッサに、前記複数の液滴の少なくともいくつかにおける検出可能な薬剤の有無を決定させる、項目８２に記載のシステム。
（項目８４）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、更に、前記プロセッサに、前記複数の液滴中の試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記複数の液滴の決定された複数の体積に基づいて、決定させる、項目８３に記載のシステム。
（項目８５）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目８４に記載のシステム。
（項目８６）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目８３に記載のシステム。
（項目８７）
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーを含む、項目８３に記載のシステム。
（項目８８）
前記少なくとも１つの液滴が、ヌクレオチドを含む試料を含む、項目７２に記載のシステム。
（項目８９）
前記少なくとも１つの液滴中の前記試料が増幅されている、項目８８に記載のシステム。
（項目９０）
前記少なくとも１つの液滴中の前記試料が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことによって増幅される、項目８９に記載のシステム。
（項目９１）
前記試料が、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅によって増幅される、項目９０に記載のシステム。
（項目９２）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記検出可能な薬剤の濃度を、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定されるようにする、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
液滴の体積を決定するための方法であって、
前記液滴の画像スタックを取得することと、
前記画像スタックの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、
前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、
少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも１つの画素セットから特定することと、
前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、を含む、前記方法。
（項目９４）
前記少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記液滴の前記画像スタックを取得することが、前記液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を取得することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９６）
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像が、前記液滴について別々の焦点深度から撮られる、項目９４に記載の方法。
（項目９７）
前記特定された少なくとも１つの液滴の体積を決定することが、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目９８）
前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定することが、
（ｉ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、前記複数の画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の最大径を測定すること、
（ｉｉ）曲線を前記特定された少なくとも１つの液滴の境界に適合させ、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記適合させた曲線に基づいて補間すること、
（ｉｉｉ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径から決定すること、または
（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径、及び前記複数の画像間の画像深度の差異から決定すること、のうちの少なくとも１つを含む、項目９７に記載の方法。
（項目９９）
複数の液滴の体積を決定することを更に含む、項目９３に記載の方法。
（項目１００）
前記複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無を、前記画像スタックから決定することを更に含む、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記複数の液滴中の試料の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記決定された複数の液滴の体積に基づいて、決定することを更に含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記複数の液滴中の前記試料を増幅することを更に含む、項目１０１に記載の方法。
（項目１０４）
前記試料を増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記試料を増幅することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、項目１０３に記載の方法。
（項目１０６）
前記検出可能な薬剤の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定される、項目１００に記載の方法。
（項目１０７）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目１００に記載の方法。
（項目１０８）
前記検出可能な薬剤が、フルオレセイン、フルオレセインの誘導体、ローダミン、ローダミンの誘導体、または半導体ポリマーを含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０９）
前記画像スタックを取得することが、光学撮像を含む、項目９３に記載の方法。
（項目１１０）
前記光学撮像が、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記少なくとも１つの液滴の前記画像スタックを取得することが、複数の多分散液滴に対する前記画像スタックを取得することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１１２）
前記複数の多分散液滴が、第１の流体及び第２の流体を含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することを更に含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１１１に記載の方法。
（項目１１４）
前記画像スタックを取得することが、前記形成されたエマルションを撮像することを含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含む、項目１１３に記載の方法。
（項目１１６）
前記第２の流体と非混和である第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することと、
前記エマルションを前記第２の流体と非混和である第３の流体中で撹拌し、、それにより二重エマルションを形成することと、を更に含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１１７）
前記第１の流体が水を含み、前記第２の流体が油を含み、前記第３の流体が水を含む、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記撹拌することが、振とう、ボルテックス、超音波処理、磁石による混合、押出、フローフォーカス、またはこれらの組み合わせから選択される、項目１１３または１１６に記載の方法。
（項目１１９）
前記撹拌することが、エマルションを形成するのに十分である、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記押出が、前記流体のピペッティングを含み、前記ピペッティングが、エマルションを産出するのに十分である、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記撹拌することが、マイクロ流体デバイス中で起きる、項目１１６〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
前記エマルションが、水相及び非水相を含む、項目１１３または１１６に記載の方法。
（項目１２３）
前記多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目１１３または１１６に記載の方法。
（項目１２４）
前記多分散液滴が、複数のエマルションを含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１２５）
前記複数のエマルションが、３つ以上の非混和性流体を組み合わせることによって調製される、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
前記３つ以上の非混和性流体が、第１の流体、第２の流体、及び第３の流体を含む、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記第１の流体が水性である、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記第２の流体が油である、項目１２７に記載の方法。
（項目１２９）
前記第２の流体が前記第１の流体及び前記第３の流体と非混和である、項目１２７に記載の方法。
（項目１３０）
前記非混和性の第１、第２、または第３の流体のうちの少なくとも１つを、ゲルまたは固体に変換することを更に含む、項目１２７に記載の方法。
（項目１３１）
前記第１の流体が、前記第３の流体とは異なる、項目１２６に記載の方法。
（項目１３２）
前記第３の流体が油であり、前記第３の流体が前記第１の流体及び前記第２の流体と非混和である、項目１２６に記載の方法。
（項目１３３）
前記非混和性の第３の流体を固体またはゲルに変換することを更に含む、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
前記第１の流体が、検出のための試料を含む、項目１２６に記載の方法。
（項目１３５）
前記第１の流体の屈折率が、前記第２の流体の屈折率と、２００％未満、１００％未満、６０％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満異なる、項目１２６に記載の方法。
（項目１３６）
前記複数の多分散液滴が、流体界面修飾要素を更に含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１３７）
前記流体界面修飾要素が、界面活性剤を含む、項目１３６に記載の方法。
（項目１３８）
前記流体界面修飾要素が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む、項目１３６に記載の方法。
（項目１３９）
液滴径の分布が、液滴中央径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４０）
液滴径の分布が、液滴平均径の１０００％超、５００％超、１００％超、５０％超、３０％超、２０％超、１５％超、１０％超、９％超、８％超、７％超、６％超、または５％超の標準偏差を有する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４１）
前記多分散液滴における体積が、２倍超で、１０倍超で、１００倍超で、１０００倍超で、１００００倍超で、１０００００倍超で、１００００００倍超で、約２倍超で、約１０倍超で、約１００倍超で、約１０００倍超で、約１００００倍超で、約１０００００倍超で、または１００００００倍超で、変化する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４２）
前記多分散液滴が、１００ナノリットル（ｎＬ）〜１フェムトリットル（ｆＬ）、１０ｎＬ〜１０ｆＬ、１ｎＬ〜１００ｆＬ、１００ｎＬ〜１ｐＬ、１０ｎＬ〜１０ｐＬ、または１ｎＬ〜１ｐＬ、約５００ｐＬ〜約５０ｆＬ、約１００ｐＬ〜約１００ｆＬの体積分布を有する、項目１１１に記載の方法。
（項目１４３）
試料を前記複数の多分散液滴における検出のために増幅することを更に含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１４４）
前記多分散液滴の平均体積が、前記試料の増幅中に、５０％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満変化する、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記試料を増幅することが、第１の増幅サイクルを含み、前記多分散液滴の５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、前記第１の増幅サイクル後に融合する、項目１４３に記載の方法。
（項目１４６）
前記画像スタックの前記個々の画像中の前記少なくとも１つの画素セットを特定することが、前記個々の画像内で複数のスキャンを取得することと、閾値レベルを設定することと、前記閾値レベル外の前記複数のスキャン中のエリアを前記画素セットとして特定することと、を含む、項目９３に記載の方法。
（項目１４７）
前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、前記少なくとも１つの画素セットのアスペクト比を決定することを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１４８）
前記少なくとも１つの画素セットが、前記少なくとも１つの画素セットの前記アスペクト比が閾値以下であるときに、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定される、項目１４７に記載の方法。
（項目１４９）
前記閾値が、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２である、項目１４８に記載の方法。
（項目１５０）
前記閾値が、前記試料の少なくとも一部を含まない液滴を除外するのに十分である、項目１４８に記載の方法。
（項目１５１）
前記画素セットを少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、リバースウォーターシェッド法を行うことを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１５２）
前記リバースウォーターシェッド法を行うことが、
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて、マップを生成することと、
前記マップ中の１つ以上の画素セットを特定することと、
個々の画素セットを目的領域として特定することと、
前記目的領域の境界を少なくとも１つの最良適合の円と適合させることと、を含む、項目１５１に記載の方法。
（項目１５３）
前記少なくとも１つの最良適合の円を少なくとも１つの液滴として特定することを更に含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５４）
前記画像スタックの前記個々の画像を、前記マップを生成する前に平滑化することを更に含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５５）
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて生成された前記マップが、位相マップを含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５６）
前記１つ以上の画素セットを特定することが、個々の画素が、前記個々の画素の前記画素強度及び１つ以上の閾値に基づいて、背景画素を含むか、または液滴画素を含むかを決定することを含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５７）
前記個々の画素セットが必要最低限のエリアを上回るエリアを有するときに、前記個々の画素セットが目的領域として特定される、項目１５２に記載の方法。
（項目１５８）
前記個々の画素セットが複数の目的領域を含むか否かを決定することと、前記複数の目的領域を単一の目的領域へと組み合わせることと、を更に含む、項目１５２に記載の方法。
（項目１５９）
前記画素セットを少なくとも１つの液滴の少なくとも一部として特定することが、円検出法を行うことを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１６０）
前記円検出法を行うことが、
閾値外の前記画像スタックの前記個々の画像の１つ以上のエリアを特定することと、
複数の円を前記特定された１つ以上のエリア上に重ね合わせることと、
前記重ね合わせた複数の円のうちの１つ以上の円を、前記１つ以上の円が少なくとも１つの所定の基準を満たさないときに拒否することと、
１つ以上の残りの円を、少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することと、を含む、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
前記少なくとも１つの画素セットを少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行うことを含む、項目９３に記載の方法。
（項目１６２）
前記リバースウォーターシェッド及び円検出複合法を行うことが、
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて、マップを生成することと、
前記生成されたマップ中の１つ以上の画素セットを特定することと、
個々の画素を目的領域として特定することと、
複数の円を前記目的領域上に重ね合わせることと、
前記重ね合わせた複数の円のうちの１つ以上の円を、前記１つ以上の円が少なくとも１つの所定の基準を満たさないときに拒否することと、
１つ以上の残りの円を、少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することと、を含む、項目１６１に記載の方法。
（項目１６３）
前記画像スタックの前記個々の画像を、前記マップを生成する前に平滑化することを更に含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて生成された前記マップが、位相マップを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６５）
前記１つ以上の画素セットを特定することが、個々の画素を、前記個々の画素の前記画素強度及び１つ以上の閾値に基づいて、背景画素または液滴画素として特定することを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６６）
前記個々の画素セットが必要最低限のエリアを上回るエリアを有する場合に、前記個々の画素セットが目的領域を含むことが決定される、項目１６２に記載の方法。
（項目１６７）
前記少なくとも１つの所定の基準が、（ｉ）前記目的領域の外部境界画素の最大部分を含む１つ以上の円を選択すること、（ｉｉ）前記目的領域のエリアの最大部分を含む１つ以上の円を選択すること、（ｉｉｉ）前記目的領域とは異なる画素グループからの画素を含む１つ以上の円を拒否すること、（ｉｖ）実質的な複数のグループ外の画素を含む１つ以上の円を拒否すること、または（ｖ）円の円周の実質的な一部が前記画素グループの内部にある、１つ以上の円を判別すること、のうちの１つ以上を含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６８）
前記１つ以上の円を拒否することが、前記複数の対で重なり合った円を検査することを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６９）
前記検査した円が、第１の円及び第２の円を含み、前記第１の円または第２の円のうちの１つを、票に基づいて拒否することを更に含む、項目１６８に記載の方法。
（項目１７０）
前記票が、ユーザによって定義される、項目１６９に記載の方法。
（項目１７１）
前記１つ以上の残りの円を少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することが、前記１つ以上の残りの円を少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に割り当てることを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１７２）
前記１つ以上の円が、（ｉ）前記目的領域を、少なくとも１つの液滴に対する最良の適合度統計を持つ円を有する前記少なくとも１つの液滴に割り当てること、または（ｉｉ）前記目的領域を、エリアにおける前記１つ以上の円との最大の重複を有する前記少なくとも１つの液滴に割り当てること、のうちの１つ以上に基づいて、前記少なくとも１つの液滴に割り当てられる、項目１７１に記載の方法。
（項目１７３）
前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することが、前記１つ以上の特定された円の１つ以上の直径を前記特定された少なくとも１つの個々の液滴に対応するものとして決定することを含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１７４）
デジタルアッセイを行うためのシステムであって、
複数の多分散液滴を保持するように構成された容器であって、前記液滴の少なくともいくつかが、検出可能な薬剤で標識された試料を含む、容器と、
前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の画像スタックを取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、
（ｉ）前記撮像ソースに、前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の前記画像スタックを取得させ、
（ｉｉ）前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴の体積を前記取得した画像スタックに基づいて決定させ、
（ｉｉｉ）前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定させ、
（ｉｖ）前記プロセッサに、前記複数の液滴中の前記試料の濃度を、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記複数の多分散液滴の体積に基づいて決定させる１組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備える、システム。
（項目１７５）
前記容器が、マルチウェルプレートを含む、項目１７４に記載のシステム。
（項目１７６）
前記撮像ソースが、光学撮像ソースを含む、項目１７４に記載のシステム。
（項目１７７）
前記光学撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を行うように構成される、項目１７６に記載のシステム。
（項目１７８）
前記取得された画像スタックが、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、項目１７４に記載のシステム。
（項目１７９）
前記画像スタックが、前記単一の液滴について別々の焦点深度から撮られた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００枚の画像を含む、項目１７８に記載のシステム。
（項目１８０）
前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、（ｉ）前記画像スタックの少なくとも１つの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、（ｉｉ）前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて特定することと、（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記複数の多分散液滴の体積を決定させる、項目１７４に記載のシステム。
（項目１８１）
少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、項目１８０に記載のシステム。
（項目１８２）
前記試料がヌクレオチドを含む、項目１７５に記載のシステム。
（項目１８３）
前記試料が増幅されている、項目１７５に記載のシステム。
（項目１８４）
前記検出可能な薬剤が、蛍光性または発光性である、項目１７５に記載のシステム。
（項目１８５）
前記複数の多分散液滴が、第１の流体及び第２の流体を含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、項目１７４に記載のシステム。
（項目１８６）
前記光学撮像が補償光学によって行われる、項目１〜４７または１０９〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８７）
前記光学撮像ソースが補償光学撮像ソースである、項目７６〜７７または１７６〜１７７のいずれか一項に記載のシステム。
（項目１８８）
液滴の体積を、前記液滴が試料を含む場合にのみ測定することを含む、項目１〜４９、９２〜１７３、または１８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８９）
前記試料を含まないと決定されたあらゆる液滴を測定から除外することを含む、項目１８８に記載の方法。
Claims (48)
- デジタルアッセイを行うための方法であって、
複数の多分散液滴であって、前記液滴の少なくともいくつかが標的分子を含む、液滴を産出することと、
前記標的分子を増幅して増幅産物を産出することと、
前記増幅産物を検出可能な薬剤と関連させることと、
液滴についての画像スタックを取得することと、
前記画像スタックから前記液滴の体積を決定することと、
前記液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定することと、
前記複数の液滴中の前記標的分子の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤及び前記増幅産物の有無に基づいて決定することと、を含む、方法。 - 前記画像スタックを取得すること及び前記検出可能な薬剤の有無を決定することのうちの少なくとも１つが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる光学撮像を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記画像スタックが、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記複数の液滴に対して同時に行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液滴の体積が、ラインスキャン法、シンプルバウンダリ法、リバースウォーターシェッド法、円検出法、リバースウォーターシェッド及び円検出複合法、またはこれらの組み合わせによって、前記画像スタックから決定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的分子の濃度が、少なくとも３桁のダイナミックレンジに渡って、または少なくとも６桁のダイナミックレンジに渡って決定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の多分散液滴が、第１の流体及び第２の流体を含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の多分散液滴が、界面活性剤、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせから選択される流体界面修飾要素を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非混和性流体のうちの１つ以上をゲルまたは固体に変換することを更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、前記非混和性流体が、増幅して増幅産物を産出する前、増幅して増幅産物を産出する間、または増幅して増幅産物を産出した後に、ゲルまたは固体に変換される、方法。
- 増幅して増幅産物を産出することが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅して増幅産物を産出することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多分散液滴における体積が、２倍超で、１０倍超で、または１００倍超で変化する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多分散液滴が、１００ナノリットル（ｎＬ）〜１フェムトリットル（ｆＬ）、１０ｎＬ〜１０ｆＬ、１ｎＬ〜１００ｆＬ、１００ｎＬ〜１ｐＬ、１０ｎＬ〜１０ｐＬ、１ｎＬ〜１ｐＬ、５００ｐＬ〜５０ｆＬ、または１００ｐＬ〜１００ｆＬの体積分布を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的分子が試料中に存在する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
- 標的分子を含む少なくとも１つの液滴の体積を決定するためのシステムであって、
前記少なくとも１つの液滴を保持するように構成された容器と、
前記容器中の前記少なくとも１つの液滴の画像を取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、前記コンピューティングデバイスが、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、（ｉ）前記撮像ソースに、前記少なくとも１つの液滴の画像スタックを取得させ、（ｉｉ）前記プロセッサに、前記少なくとも１つの液滴の体積を前記取得された画像スタックに基づいて決定させる１組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備えるシステム。 - 前記撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせを行うように構成される光学撮像ソースを含む、請求項１５に記載のシステム。
- 前記液滴に対する前記画像スタックが、前記少なくとも１つの液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、請求項１５〜１６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、（ｉ）前記画像スタックの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、（ｉｉ）前記少なくとも１つの画素セットを、前記少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することであって、前記少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、単一の全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、ことと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも１つの画素セットから特定することと、（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記少なくとも１つの液滴の体積を決定させる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるきに、前記プロセッサに、前記取得した画像スタックに基づいて、複数の液滴の複数の体積を決定させる、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的分子がヌクレオチドを含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記標的分子が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことによって増幅され、増幅産物が産出されている、請求項２０に記載のシステム。
- 増幅して増幅産物を産出することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載のシステム。
- デジタルアッセイを行うためのシステムであって、
複数の多分散液滴を保持するように構成された容器であって、前記液滴の少なくともいくつかが、増幅されて増幅産物を産出することができる標的分子を含み、前記液滴の少なくともいくつかが、検出可能な薬剤及び前記増幅産物を含む、容器と、
前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の画像スタックを取得するように構成された撮像ソースと、
前記撮像ソースを操作するように構成されたコンピューティングデバイスであって、プロセッサ及び非一時的有形コンピュータ可読記憶媒体を含み、前記記憶媒体が、前記プロセッサによって実行されるときに、
（ｉ）前記撮像ソースに、前記容器中に保持された前記複数の多分散液滴の前記画像スタックを取得させ、
（ｉｉ）前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴の体積を前記取得した画像スタックに基づいて決定させ、
（ｉｉｉ）前記プロセッサに、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤の有無を決定させ、
（ｉｖ）前記プロセッサに、前記複数の液滴中の前記標的分子の濃度を、前記複数の多分散液滴中の前記検出可能な薬剤及び前記増幅産物の有無、及び前記複数の多分散液滴の体積に基づいて決定させる１組の命令を記憶する、コンピューティングデバイスと、を備える、システム。 - 前記撮像ソースが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせのうちの１つ以上を行うように構成される光学撮像ソースを含む、請求項２３に記載のシステム。
- 前記取得された画像スタックが、単一の液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を含む、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記１組の命令が、前記プロセッサによって実行されるときに、前記プロセッサに、（ｉ）前記画像スタックの少なくとも１つの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、（ｉｉ）前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することであって、少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、ことと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて特定することと、（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、によって、前記複数の多分散液滴の体積を決定させる、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記光学撮像が補償光学によって行われる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光学撮像ソースが補償光学撮像ソースである、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記液滴が前記標的分子を含む場合にのみ液滴の体積を測定することを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
- 液滴の体積を決定するための方法であって、
前記液滴の画像スタックを取得することと、
前記画像スタックの個々の画像における少なくとも１つの画素セットを特定することと、
前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することであって、前記少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部が、単一の液滴の部分、複数の液滴の部分、全液滴、複数の全液滴、またはこれらの組み合わせを含む、ことと、
少なくとも１つの個々の液滴を、前記対応に基づいて、前記少なくとも１つの画素セットから特定することと、
前記特定された少なくとも１つの個々の液滴の体積を、前記少なくとも１つの画素セットに基づいて決定することと、を含む、前記方法。 - 前記液滴の前記画像スタックを取得することが、前記液滴を通した別々の焦点深度から撮られた複数の画像を取得することを含む、請求項３０に記載の方法。
- 前記特定された少なくとも１つの液滴の体積を決定することが、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定することを含み、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定することが、
（ｉ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、前記複数の画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の最大径を測定すること、
（ｉｉ）曲線を前記特定された少なくとも１つの液滴の境界に適合させ、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記適合させた曲線に基づいて補間すること、
（ｉｉｉ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径から決定すること、または
（ｉｖ）前記特定された少なくとも１つの液滴を前記画像スタックの複数の画像間で相関させ、各画像における前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を決定し、前記特定された少なくとも１つの液滴の直径を、前記画像スタックの前記複数の画像におけるその直径、及び前記複数の画像間の画像深度の差異から決定すること、のうちの少なくとも１つを含む、請求項３０〜３１のいずれか一項に記載の方法。 - 複数の液滴の体積を決定することを更に含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の液滴中の検出可能な薬剤の有無を決定することを更に含む、請求項３３に記載の方法。
- 前記複数の液滴中の標的分子の濃度を、前記複数の液滴中の前記検出可能な薬剤の有無、及び前記決定された複数の液滴の体積に基づいて、決定することを更に含む、請求項３４に記載の方法。
- 前記複数の液滴中の前記標的分子を増幅して増幅産物を産出することを更に含む、請求項３５に記載の方法であって、増幅して前記増幅産物を産出することが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、またはこれらの組み合わせを行うことを含む、方法。
- 増幅して前記増幅産物を産出することが、ヌクレオチドの等温増幅、またはヌクレオチドの可変温度増幅を含む、請求項３６に記載の方法。
- 前記画像スタックを取得することが、共焦点顕微鏡法、ライン共焦点顕微鏡法、デコンボリューション顕微鏡法、スピニングディスク顕微鏡法、多光子顕微鏡法、平面照明顕微鏡法、ベッセルビーム顕微鏡法、微分干渉顕微鏡法、位相差顕微鏡法、落射蛍光顕微法、明視野撮像法、暗視野撮像法、斜照法、またはこれらの組み合わせによって行われる光学撮像を含む、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの液滴の前記画像スタックを取得することが、複数の多分散液滴に対する前記画像スタックを取得することを含む、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
- 第１の流体及び第２の流体を含む溶液を撹拌することによって多分散液滴のエマルションを形成することを更に含み、前記第１の流体が、前記第２の流体と非混和である、請求項３９に記載の方法。
- 前記複数の多分散液滴が、界面活性剤、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子、ポリマー、沈殿剤、微粒子、疎水性部分と親水性部分とを持つ分子、またはこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを含む流体界面修飾要素を更に含む、請求項３９〜４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多分散液滴における体積が、２倍超で、１０倍超で、または１００倍超で変化する、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多分散液滴が、１００ナノリットル（ｎＬ）〜１フェムトリットル（ｆＬ）、１０ｎＬ〜１０ｆＬ、１ｎＬ〜１００ｆＬ、１００ｎＬ〜１ｐＬ、１０ｎＬ〜１０ｐＬ、１ｎＬ〜１ｐＬ、５００ｐＬ〜５０ｆＬ、または１００ｐＬ〜１００ｆＬの体積分布を有する、請求項３９〜４２に記載の方法。
- 前記複数の多分散液滴において標的分子を増幅して増幅産物を産出することを更に含む、請求項３９〜４０に記載の方法。
- 前記画像スタックの前記個々の画像中の前記少なくとも１つの画素セットを特定することが、前記個々の画像内で複数のスキャンを取得することと、閾値レベルを設定することと、前記閾値レベル外の前記複数のスキャン中のエリアを前記画素セットとして特定することと、を含む、請求項３０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの画素セットを、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、前記少なくとも１つの画素セットのアスペクト比を決定することを含む、請求項３０〜４５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの画素セットが、前記少なくとも１つの画素セットの前記アスペクト比が閾値以下であるときに、少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定される、請求項４６に記載の方法。
- 前記画素セットを少なくとも１つの液滴の少なくとも一部に対応するものとして特定することが、リバースウォーターシェッド法を行うこと、円検出法を行うこと、またはこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを含み、
前記リバースウォーターシェッド法を行うことが、
前記画像スタックの前記個々の画像の画素強度に基づいて、マップを生成することと、
前記マップ中の１つ以上の画素セットを特定することと、
個々の画素セットを目的領域として特定することと、
前記目的領域の境界を少なくとも１つの最良適合の円と適合させることと、を含み；そして、
前記円検出法を行うことが、
閾値外の前記画像スタックの前記個々の画像の１つ以上のエリアを特定することと、
複数の円を前記特定された１つ以上のエリア上に重ね合わせることと、
前記重ね合わせた複数の円のうちの１つ以上の円を、前記１つ以上の円が少なくとも１つの所定の基準を満たさないときに拒否することと、
１つ以上の残りの円を、少なくとも１つの液滴の前記少なくとも一部に対応するものとして特定することと、を含む、請求項３０〜４７のいずれか一項に記載の方法。
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