JP2017519045A - 酵素的方法による均一抗体薬物コンジュゲート - Google Patents

酵素的方法による均一抗体薬物コンジュゲート Download PDF

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Abstract

本出願は、一態様において、コンジュゲート部分にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドが、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含むＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、ならびに当該コンジュゲート部分が、当該アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされている、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供する。また、野生型または改変トランスグルタミナーゼを使用することによって、そのようなＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを作製する方法も提供する。さらに、特にそのような反応を行うために設計された改変トランスグルタミナーゼを提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年６月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／０１１，５３４号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
抗体ベースの治療法は、様々な障害、例えば癌および免疫疾患など、を標的とする療法において重要な役割を果たしている。近年、標的部位への薬物の効果的な送達のために、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が広く研究されている。例えば、リジン側鎖アミンまたはシステインスルフヒドリル基のどちらかによって薬物を抗体にコンジュゲートするために、化学修飾が広く用いられている。しかしながら、これらのコンジュゲーション方法は、多くの場合、抗体に対する薬物の異なるモル比、非特異的コンジュゲーション部位、ならびに異なる効率、安全性、薬物動態を有するコンジュゲートの異種混合物を生じた。非特許文献１を参照されたい。定義された化学量論での特異的薬物コンジュゲーションのために抗体の特異的部位において改変された反応性システイン残基も作製されている。非特許文献２を参照されたい。しかしながら、そのようなシステイン改変抗体および抗体薬物コンジュゲートの発現およびコンジュゲーションは、長く複雑な反応手順を必要とする。例えば、非特許文献３を参照されたい。システイン改変抗体および抗体薬物コンジュゲートを作製するプロセスの際、抗体凝集体も生じ得る。非天然アミノ酸残基も、部位特異的コンジュゲーションのための化学ハンドルとして、抗体に組み込まれている。非特許文献４を参照されたい。この方法論を実践するためには、アンバーサプレッサーｔＲＮＡとアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼとの直交対を、最初に、発現宿主に組み込まなければならない。次いで、当該変異体抗体を、当該非天然アミノ酸の培地補充物を伴うこの特異的ホストにおいて発現させることができる。このプロセスは、時間がかかるだけでなく、抗体発現収率も非常に低い。
近年、トランスグルタミナーゼ使用してＡＤＣを作製するための酵素的アプローチが研究されている。トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）は、トランスグルタミネーションによって、アミンドナー基を有する部分をアクセプターグルタミン残基へと移す。ヒトアイソタイプの全長ＩｇＧ抗体は、重鎖の位置２９５に保存されたグルタミン残基を有する（Ｑ２９５）。このグルタミン残基は、Ｎ−グリコシル化部位（Ｎ２９７）に近接しているため、一般的に、全長抗体上のＱ２９５は、抗体がＮ−グリコシル化されている場合、ＴＧａｓｅにはアクセスできないと考えられていた。ＴＧａｓｅを全長抗体に作用できるようにするため、ＴＧａｓｅ媒介コンジュゲーションの前にＮ−グリコシル化部位を除去するために当該抗体のＦｃ領域を脱グリコシル化または変異させた。特許文献１を参照されたい。あるいは、アクセプターグルタミン部位を提供するために、グルタミン含有配列「タグ」が抗体の軽鎖または重鎖に挿入された。特許文献２を参照されたい。したがって、全ての現在の部位特異的ＡＤＣ技術は、改変抗体変異体に依拠しており、これは、結果として、潜在的免疫原性およびインビボでの不安定さを生じ得る。そのため、インタクトな抗体を直接使用することができる効率的な部位特異的抗体コンジュゲーションツールが強く必要とされている。
本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
国際公開第２０１３／０９２９９８号 国際公開第２０１２／０５９８８２号
Ｔａｎａｋａら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５７９：２０９２−２０９６（２００５） Ｊｕｎｕｔｕｌａら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２６：９２５−９３２（２００８） Ｇｏｍｅｚら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０５（４）：７４８−７６０（２００９） Ａｘｕｐａら，ＰＮＡＳ，１０９：１６１０１−１６１０６（２０１２）
本発明は、一態様において、コンジュゲート部分に部位特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドが、Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、ならびに当該コンジュゲート部分が、アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされている、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供する。
いくつかの実施形態において、当該アクセプターグルタミン残基は、グルタミン残基に対して＋２の位置においてＮ−グリコシル化部位に隣接する。いくつかの実施形態において、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸２９０から３００を含み、ここで、当該番号付けは、Ｋａｂａｔインデックスに従う。いくつかの実施形態において、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域は、天然に存在する免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域である。
上記の実施形態のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ含有ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖である。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ含有ポリペプチドは、全長抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体の両重鎖は、当該コンジュゲート部分にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、当該アクセプターグルタミン残基は位置２９５にあり、ならびに当該Ｎ−グリコシル化部位は、位置２９７にあり、ここで、番号付けは、Ｋａｂａｔインデックスに従う。
上記の実施形態のいずれかに従ういくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、当該Ｆｃ含有ポリペプチドの薬物動態特性を向上させる部分、治療的部分、および診断的部分からなる群より選択される活性部分を含む。いくつかの実施形態において、当該活性部分は毒素である。
上記の実施形態のいずれかに従ういくつかの実施形態において、当該Ｆｃ含有ポリペプチドおよび当該コンジュゲート部分は、リンカー、例えば切断性リンカーまたは非切断性リンカーなど、を介してコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態において、上記において説明されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートのうちのいずれか１つを含む組成物であって、当該組成物中のＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のいずれか）が、Ｆｃ領域においてグリコシル化されている、組成物が提供される。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のいずれか）は、１：１または１：２のＦｃ含有ポリペプチドとコンジュゲート部分のモル比を有する。
一態様において、抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基を介してコンジュゲート部分にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートであって、Ｆｃ領域においてグリコシル化されている、抗体薬物コンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態において、当該抗体薬物コンジュゲートは、Ｆｃ領域においてＮ−グリコシル化されている。いくつかの実施形態において、当該抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、ヒト化抗体である。
上記において説明した抗体薬物コンジュゲートのうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該抗体の両重鎖は、当該コンジュゲート部分にコンジュゲートされている。
上記において説明した抗体薬物コンジュゲートのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、抗体の薬物動態特性を向上させる部分、治療的部分、および診断的部分からなる群より選択される活性部分を含む。いくつかの実施形態において、当該活性部分は毒素である。
上記において説明した抗体薬物コンジュゲートのうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該抗体および当該コンジュゲート部分は、リンカーを介してコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、当該リンカーは、切断性リンカーである。いくつかの実施形態において、当該リンカーは、非切断性リンカーである。
いくつかの実施形態において、上記において説明された抗体薬物コンジュゲートのうちのいずれか１つを含む組成物であって、当該組成物中の抗体薬物コンジュゲートの少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のいずれか）が、Ｆｃ領域においてグリコシル化されている組成物が提供される。いくつかの実施形態において、当該組成物中の抗体薬物コンジュゲートの少なくとも８０％は、１：１または１：２の抗体とコンジュゲート部分のモル比を有する。
別の態様において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを作製する方法であって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で、当該Ｆｃ含有ポリペプチドを当該コンジュゲート部分と反応させる工程を含み、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、当該コンジュゲート部分が、当該アクセプターグルタミン残基を介して当該Ｆｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされている、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを作製する方法であって、ａ）当該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で、当該Ｆｃ含有ポリペプチドを当該低分子ハンドルと反応させる工程と、ｂ）当該中間コンジュゲートを活性部分とカップリングさせ、それにより、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを得る工程であって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、当該コンジュゲート部分が、当該アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされている、工程と、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する野生型トランスグルタミナーゼである。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、改変トランスグルタミナーゼ、例えば、配列番号１６に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼなど、である。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼとＦｃ含有ポリペプチドのモル比は、約１０：１から約１：１００である。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、固体支持体上に固定される。他の実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドは、固体支持体上に固定される。
上記において説明される方法のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該アクセプターグルタミン残基は、当該グルタミン残基に対して＋２の位置においてＮ−グリコシル化部位に隣接する。いくつかの実施形態において、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域は、免疫グロブリン重鎖のアミノ酸２９０から３００を含み、ここで、当該番号付けは、Ｋａｂａｔインデックスに従う。いくつかの実施形態において、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域は、野生型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域である。いくつかの実施形態において、当該免疫グロブリンは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ含有ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖、例えば、全長抗体、例えばヒト抗体またはヒト化抗体など、である。いくつかの実施形態において、当該抗体の両重鎖は、当該コンジュゲート部分にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、当該アクセプターグルタミン残基は位置２９５にあり、ならびに当該Ｎ−グリコシル化部位は、位置２９７にあり、ここで、番号付けは、Ｋａｂａｔ番号付けに従う。
上記において説明される方法のいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、Ｆｃ含有ポリペプチドの薬物動態特性を向上させる部分、治療的部分、および診断的部分からなる群より選択される活性部分を含む。いくつかの実施形態において、当該活性部分は毒素である。
別の態様において、抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、当該抗体薬物コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で抗体組成物を当該コンジュゲート部分に接触させる工程を含み、当該組成物中の当該抗体の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のいずれか）が、Ｆｃ領域においてグリコシル化され、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、方法が提供される。
別の態様において、低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）当該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートした抗体を含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で抗体組成物を当該低分子ハンドルに接触させる工程と、ｂ）当該中間コンジュゲートを活性部分に接触させ、それにより、抗体薬物コンジュゲートを得る工程を含み、当該組成物中の当該抗体の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％のいずれか）が、Ｆｃ領域においてグリコシル化され、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、方法が提供される。
上記において説明される抗体薬物コンジュゲートを作製する方法のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、野生型トランスグルタミナーゼである。いくつかの実施形態において、当該野生型トランスグルタミナーゼは、配列番号１６のアミノ酸配列を有する。
上記において説明される抗体薬物コンジュゲートを作製する方法のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、改変トランスグルタミナーゼである。いくつかの実施形態において、当該改変トランスグルタミナーゼは、配列番号１６に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
上記において説明される抗体薬物コンジュゲートを作製する方法のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のいずれか）の純度を有する。
上記において説明される抗体薬物コンジュゲートを作製する方法のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼと抗体組成物とのモル比は、約１０：１から約１：１０である。
上記において説明される抗体薬物コンジュゲートを作製する方法のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、固体支持体上に固定される。
上記において説明される抗体薬物コンジュゲートを作製する方法のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該抗体は、固体支持体上に固定される。
上記において説明される抗体薬物コンジュゲートを作製する方法のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。
上記において説明される抗体薬物コンジュゲートを作製する方法のうちのいずれか１つに従ういくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、抗体組成物の薬物動態特性を向上させる部分、治療的部分、および診断的部分からなる群より選択される活性部分を含む。いくつかの実施形態において、当該活性部分は毒素である。
別の態様において、改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分にＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）をコンジュゲートすることができる改変トランスグルタミナーゼであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）が、Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、反応の際に、当該コンジュゲート部分が、アクセプターグルタミン残基を介して当該Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）にコンジュゲートし、当該コンジュゲーションが、同じ反応条件下での野生型トランスグルタミナーゼより活性が少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、またはそれ以上のいずれか）高い、改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、配列番号１６に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼであって、Ｄ１〜Ｅ４、Ｐ２４４〜Ｐ２４７、およびＮ２８２〜Ｌ２８５からなる群より選択される欠失を含む、改変トランスグルタミナーゼが提供される。
さらに、本明細書において説明される改変トランスグルタミナーゼを使用することによってＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）を作製する方法が提供される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、当該抗体薬物コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、上記において説明される改変トランスグルタミナーゼのうちのいずれか１つの存在下で抗体組成物を当該コンジュゲート部分に接触させる工程を含み、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）当該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートした抗体を含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、上記において説明された改変トランスグルタミナーゼのうちのいずれか１つの存在下で抗体組成物を当該低分子ハンドルに接触させる工程と、ｂ）当該中間コンジュゲートを活性部分に接触させ、それにより、抗体薬物コンジュゲートを得る工程であって、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、工程と、を含む方法が提供される。
本明細書において説明される様々な実施形態の特性の１つ、いくつか、または全てを組み合わせることにより、本発明の他の実施形態を形成することができるということは理解されたい。本発明のこれらの態様および他の態様は、当業者には明らかとなるであろう。
図１は、様々なタイプのヒト、マウス、およびラットＩｇＧのＣＨ２ドメイン配列の配列アラインメントを示す図である。ＴＧａｓｅ媒介性反応のための内因性グルタミン（Ｑ２９５）およびＮ−グリコシル化部位（Ｎ２９７）が線で囲まれている。 図２は、ストレプトマイセス・ラダカヌム（Ｓｔｒｅｐ Ｌａｄａｋａｎｕｍ）（ＴＧ＿ＳＬ、配列番号１６）およびストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐ Ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）（ＴＧ＿ＳＭ、配列番号１８）由来のＴＧａｓｅのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 図３は、ラダカヌム由来のＴＧａｓｅをベースとする欠失変異体の配列を示す図である。遺伝子組み換え野生型ＴＧ＿ＳＬの配列が示されている（配列番号１７）。 図４は、一段階抗体−薬物コンジュゲーション方法を示す図である。 図５は、二段階抗体−薬物コンジュゲーション方法を示す図である。 図６−１は、ＭＤＣにコンジュゲートされたＩｇＧ１、２、および４のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。図６−１はＭＤＣとＩｇＧ１の重鎖のみとのコンジュゲーションを示す。 図６−２は、ＭＤＣにコンジュゲートされたＩｇＧ１、２、および４のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。図６−２は１：１および１：２のモル比でのＩｇＧ１とＭＤＣとのコンジュゲーションを示す。 図６−３は、ＭＤＣにコンジュゲートされたＩｇＧ１、２、および４のＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。図６−３はＩｇＧ２（左）およびＩｇＧ４（右）とＭＤＣとの部位特異的コンジュゲーションを示す。 図７は、ＩｇＧ１−ＭＤＣコンジュゲートのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す図である。 図８は、分子量８９６．４２Ｄａの、一級アミン基を有する延長された非切断性の直鎖状ＰＥＧリンカーを含有するメイタンシン誘導体（本明細書において、ＭＡＹ−ＰＥＧ４と呼ぶ）を示す図である。 図９は、分子量１２２４．５８Ｄａの、自壊性スペーサーおよび末端リジンを有する切断性リンカーを含有するメイタンシン誘導体（本明細書において、ＭＡＹ−ＰＶＣＬと呼ぶ）を示す図である。 図１０は、ＩｇＧ１−ＭＡＹ−ＰＥＧ４のＤＡＲ０（すなわち、ネイキッドＩｇＧ１、上側のパネル）、ＤＡＲ１（中央のパネル）、およびＤＡＲ２（下側のパネル）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。 図１１は、ネイキッドＩｇＧ１（左側のパネル）およびＭＡＹ−ＰＶＣＬにコンジュゲートされたＩｇＧ１（右側のパネル）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。 図１２は、様々な数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ユニットを有する、非切断性リンカーを含有するモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）誘導体（上側のパネル）（本明細書においてＰＥＧｘ−ＭＭＡＥと呼び、ここで、ｘは、２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、または２４である）、および切断性リンカーを含有するＭＭＡＥ誘導体（下側のパネル）（本明細書においてＰＥＧ３ｃ−ＭＭＡＥと呼ぶ）を示す図である。 図１３は、ＢＴ４７４異種移植マウスにおいてＴＧａｓｅによって調製したトラスツズマブ−ＰＥＧｘ−ＭＭＡＥコンジュゲートのインビボでの効力を示す図である。 図１４は、ＮＣＩ Ｎ８７異種移植マウスにおいてＴＧａｓｅによって調製したトラスツズマブ−ＰＥＧ１２−ＭＭＡＥコンジュゲートのインビボでの安定性を示す図である。 図１５は、ＮＣＩ Ｎ８７異種移植マウスにおけるトラスツズマブ−ＰＥＧ３ｃ−ＭＭＡＥコンジュゲート（ＤＡＲ２、本明細書においてＴＰ３ｃＥと呼ぶ）およびＴＤＭ−１（ジェネンテック）コンジュゲートのインビボでの効力の比較を示す図である。 図１６は、ＮＣＩ Ｎ８７異種移植マウスにおけるトラスツズマブ−ＰＥＧ３ｃ−ＭＭＡＥコンジュゲート（ＤＡＲ２、本明細書においてＴＰ３ｃＥと呼ぶ）およびＴＤＭ−１（ジェネンテック）コンジュゲートのインビボでの安定性の比較を示す図である。 図１７は、ＳＫ＿Ｏｖ３異種移植マウスにおけるトラスツズマブ−ＰＥＧ３ｃ−ＭＭＡＥコンジュゲート（ＤＡＲ２、本明細書においてＴＰ３ｃＥと呼ぶ）およびＴＤＭ−１（ジェネンテック）コンジュゲートのインビボでの効力の比較を示す図である。プロットにおける矢印は、抗体薬物コンジュゲートの用量を投与した時点を示している。 図１８は、ＤＡＲ４ ＡＤＣ調製において使用した、それぞれ１つのアミン基および２つのアジド基を有する３アームＰＥＧリンカー（上側のパネル、１から５ｋＤａ）の群、およびアルキン−ＰＥＧ４ｃ−ＭＭＡＥ（下側のパネル）を示す図である。
本出願は、初めて、部位特異的かつ化学量論的な方式において、インタクトで未修飾の（例えば、グリコシル化立体配置が未変更のままである）抗体にコンジュゲート部分（例えば、薬物など）を付着させる方法を提供する。これは、特定の反応条件下において野生型ＴＧａｓｅを使用することによって、またはＦｃ領域における内因性グルタミン残基において部位特異的コンジュゲーションを実施するように特異的に設計された改変ＴＧａｓｅによってのどちらかにおいて達成される。本出願の方法は、優れたＰＫプロファイル、広範な治療指数、および最適な力価を提供するであろう、同種の部位特異的かつ化学量論的な抗体薬物コンジュゲートの製造を可能にする。当該方法は、変異の導入および／または抗体の脱グリコシル化なしに、インタクトな抗体への薬物のコンジュゲーションを可能にし、したがって、操作上のそのような余分な工程によって導入される免疫原性を最小限に抑える。インタクトな抗体上にグリカンが存在する場合、当該グリカンは、抗体が分解するのを防ぎ、より安定な抗体−薬物コンジュゲートを生じる。トランスグルタミネーション反応の前に抗体の操作が必要ないため、本明細書において説明されるＴＧａｓｅベースの抗体コンジュゲーション法は、今までに報告されている方法より著しく効率的である。
したがって、本出願は、一態様において、コンジュゲート部分にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）を含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）であって、当該Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含むＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、ならびに当該コンジュゲート部分が、アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）にコンジュゲートしている、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを提供する。
別の態様において、野生型または改変トランスグルタミナーゼを使用することによってＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲート）を作製する方法が提供される。
さらに、そのような反応を行うために特異的に設計された改変トランスグルタミナーゼを提供する。
（定義）
本明細書において相互互換的に「ＴＧａｓｅ」が使用される「トランスグルタミナーゼ」は、トランスグルタミネーション反応を行うことができる酵素を意味する。用語「トランスグルタミネーション」は、本明細書において使用される場合、タンパク質／ペプチド由来のアクセプターグルタミン残基のγ−グルタミニルが、アミン基、例えば、リジンの一級アミンまたはε−アミノ基など、に移される反応を意味する。
用語「アクセプターグルタミン残基」は、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸残基を参照する場合、好適な条件下においてＴＧａｓｅによって認識され、かつ、グルタミンとドナーアミン基（例えば、リジン、または構造的に関連する一級アミン、例えば、アミノペンチル基など）との間の反応により、ＴＧａｓｅによってドナーアミン基を含むコンジュゲート部分に架橋させることができるグルタミン残基を意味する。
本明細書において使用される「抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基」は、天然に存在する抗体のＦｃ領域におけるアクセプターグルタミン残基を意味する。そのような内因性アクセプターグルタミン残基は、典型的には、Ｋａｂａｔ番号付けによるとＱ２７５であり、Ａｓｎ２９７位のＮ−グリコシル化部位に隣接する。
本明細書において使用される「Ｆｃ含有ポリペプチド」は、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体またはＦｃ融合タンパク質）を意味する。本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、単一のポリペプチド鎖および複数ユニットのポリペプチドの両方を包含する。例えば、Ｆｃ含有ポリペプチドは、全長抗体（例えば、インタクトな抗体など）であり得、または全長抗体の単鎖であり得る。
「Ｆｃ領域」は、本明細書において使用される場合、最初の定常領域の免疫グロブリンドメインを除く抗体重鎖の定常領域を含むポリペプチドを意味する。ＩｇＧの場合、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインのＣＨ２およびＣＨ３、ならびにＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジを含み得る。
「全長抗体」は、本明細書において使用される場合、可変領域および定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する分子を意味する。例えば、ヒトおよびマウスを始めとするほとんどの哺乳動物において、ＩｇＧアイソタイプの全長抗体は、四量体であり、ならびに２つの免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、ここで、各対は、１つの軽鎖および１つの重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメインＶＬおよびＣＬを含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。いくつかの哺乳動物、例えば、ラクダおよびラマにおいて、ＩｇＧ抗体は、２つの重鎖のみからなり得、各重鎖は、Ｆｃ領域に付着する可変ドメインを含む。
本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、アミノ酸挿入および／またはアミノ酸欠失を意味する。本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、タンパク質配列における所定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸で置換することを意味する。ポリペプチドの「バリアント」は、参照ポリペプチド、典型的にはネイティブなポリペプチドまたは「親」ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。ポリペプチドバリアントは、ネイティブなアミノ酸配列内のある特定の位置において１以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸挿入を有し得る。
「保存的」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の物理化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において既知であり、そのようなものとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電されていない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、アクセプターグルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
用語「保護基」は、第１分子を第２分子に変換する間、官能基（例えば、アミノ基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基）を一時的に保護またはブロックする基、すなわち、それらが反応するのを防ぐことを意図する基を意味する。
語句「薬物動態特性を向上させる部分」は、より良好な治療効果または診断効果を得ることができるように、当該部分が付着された分子の薬物動態特性を変えるような部分を意味する。当該部分は、例えば、水溶性を高める、循環時間を増やす、または免疫原性を減じることができる。
語句「リンカー」は、ある化合物の１つの構造的要素を同じ化合物の１以上の他の構造的要素に連結する当該化合物の構造的要素を意味する。
本明細書において使用される場合、「治療する」または「治療」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的において、有益なまたは所望の臨床結果は、これらに限定されるわけではないが、以下：疾患の結果として生じる１以上の症状を緩和すること、疾患の程度を軽減すること、疾患を安定化させること（例えば、疾患の悪化を防ぐかまたは遅らせること）、疾患の再発を防ぐかまたは遅らせること、疾患の進行を遅らせるかまたは鈍化させること、疾患の状態を改善すること、病気の寛解（部分的または全体的）を提供すること、疾患を処置するために必要な１以上の他の医薬品の用量を減らすこと、疾患の進行を遅らせることや生活の質を高めること、のうちの１以上を含む。
用語「個体」は、哺乳動物を意味し、そのようなものとして、これらに限定されるわけではないが、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯動物、または霊長類が挙げられる。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
本明細書において説明される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むことを理解されたい。
「約」を伴う本明細書における値またはパラメータに対する言及は、その値またはパラメータ自体に対する変動を含む（およびそれらを記載する）。例えば、「約Ｘ」について言及する記載は、「Ｘ」の記載を包含する。用語「約Ｘ〜Ｙ」は、本明細書において使用される場合、「約Ｘから約Ｙまで」と同じ意味を有する。
本明細書においてまたは添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ｏｒ」、および「ｔｈｅ」は、文脈において特に明記されない限り、複数の参照物を包含する。
（Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲート）
本出願は、一態様において、コンジュゲート部分に部位特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）を含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）を提供する。当該Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）は、Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域を含む。当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域は、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、当該コンジュゲート部分は、アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）にコンジュゲートしている。
免疫グロブリンのＦｃ領域は、いくつかの実施形態において、ヒンジ領域の一部または全てを含む。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ含有ポリペプチドは、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ含有ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４サブタイプのＦｃ領域、あるいはＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ由来のＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ由来であり、当該Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔ番号付け方式に従うと、位置Ｇｌｕ２１６またはＡｌａ２３１のアミノ酸残基から、それらのカルボキシル末端までである。
いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ含有ポリペプチドは、１以上の機能性ポリペプチドがＦｃ領域に融合されているＦｃ含有融合ポリペプチドである。そのような機能性ポリペプチドとしては、これらに限定されるわけではないが、レセプターの標的−結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、およびケモカインが挙げられる。
本明細書において説明されるＦｃ領域は、Ｎ−グリコシル化することができる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｎ−グリコシル化部位に付着した多糖鎖は、少なくとも約１、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、または少なくとも約１００ユニットのいずれかである。
当該Ｎ−グリコシル化部位は、コンジュゲート部分が付着するアクセプターグルタミン残基に隣接している。本発明者は、本明細書においてさらに説明される方法により、Ｆｃ領域においてＮ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基にコンジュゲート部分を付着させることが可能であることを初めて実証した。いくつかの実施形態において、当該Ｎ−グリコシル化部位およびアクセプターグルタミン残基は、５以下のアミノ酸残基だけ離れている。いくつかの実施形態において、当該Ｎ−グリコシル化部位およびアクセプターグルタミンは、５、４、３、２、または１のアミノ酸だけ離れている。いくつかの実施形態において、当該Ｎ−グリコシル化部位および当該アクセプターグルタミンは、お互いに隣接する。いくつかの実施形態において、当該アクセプターグルタミン残基は、グルタミン残基に対して＋２の位置においてＮ−グリコシル化部位に隣接する。いくつかの実施形態において、当該アクセプターグルタミン残基は、グルタミン残基に対して＋１、＋２、＋３、＋４、または＋５の位置においてＮ−グリコシル化部位に隣接する。いくつかの実施形態において、当該アクセプターグルタミン残基は、グルタミン残基に対して−１、−２、−３、−４、または−５の位置においてＮ−グリコシル化部位に隣接する。
したがって、いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に部位特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、当該コンジュゲート部分が、当該アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされている、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に部位特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、当該Ｎ−グリコシル化部位から５以下のアミノ酸だけ（例えば、４、３、２、または１のアミノ酸だけを含む）離れているアクセプターグルタミン残基を含み、当該コンジュゲート部分が、当該アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされている、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に部位特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該アクセプターグルタミン残基が、グルタミン残基に対して＋２の位置においてＮ−グリコシル化部位によって隣接されており、当該コンジュゲート部分が、当該アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされている、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に部位特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、配列番号１のアミノ酸配列を含み（ＫＰＲＥＥＱＸ１ＮＳＴＸ２Ｒ、ここで、Ｘ１は、ＹまたはＦであり、Ｘ２は、ＹまたはＦである）、当該コンジュゲート部分が、配列番号１の位置６において、当該アクセプターグルタミン残基を介して当該Ｆｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされており、当該Ｎ−グリコシル化が、配列番号１の位置８においてである、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、配列番号２のアミノ酸配列を含み（ＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）、当該コンジュゲート部分が、配列番号２の位置６において、当該アクセプターグルタミン残基を介して当該Ｆｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされており、当該Ｎ−グリコシル化が、配列番号２の位置８においてである、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に部位特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、配列番号３のアミノ酸配列を含み（ヒトＩｇＧ１のＣＨ２配列、図１を参照されたい）、当該コンジュゲート部分が、配列番号３の位置６５において、当該アクセプターグルタミン残基を介して当該Ｆｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされており、当該Ｎ−グリコシル化が、配列番号３の位置６７においてである（図１に示された枠内の残基を参照されたい）、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、配列番号４のアミノ酸配列を含み（ヒトＩｇＧ２のＣＨ２配列、図１を参照されたい）、当該コンジュゲート部分が、配列番号４の位置６４において、当該アクセプターグルタミン残基を介して当該Ｆｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされており、当該Ｎ−グリコシル化が、配列番号４の位置６６においてである（図１に示された枠内の残基を参照されたい）、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、配列番号５のアミノ酸配列を含み（ヒトＩｇＧ３のＣＨ２配列、図１を参照されたい）、当該コンジュゲート部分が、配列番号５の位置６５において、当該アクセプターグルタミン残基を介して当該Ｆｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされており、当該Ｎ−グリコシル化が、配列番号５の位置６７においてである（図１に示された枠内の残基を参照されたい）、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、配列番号６のアミノ酸配列を含み（ヒトＩｇＧ４のＣＨ２配列、図１を参照されたい）、当該コンジュゲート部分が、配列番号６の位置６５において、当該アクセプターグルタミン残基を介して当該Ｆｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされており、当該Ｎ−グリコシル化が、配列番号６の位置６７においてである（図１に示された枠内の残基を参照されたい）、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートが提供される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートされた抗体を含む抗体薬物コンジュゲートであって、当該抗体がＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、当該コンジュゲート部分が、アクセプターグルタミン残基を介して当該抗体にコンジュゲートされている、抗体薬物コンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態において、当該抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、キメラ抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、二重特異性もしくは多重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、トラスツズマブである。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分にコンジュゲートした全長抗体であって、当該全長抗体がＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該コンジュゲート部分が、当該抗体の重鎖の位置２９５において、アクセプターグルタミン残基を介して当該全長抗体にコンジュゲートされており、番号付けが、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従う、全長抗体が提供される。いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分にコンジュゲートした抗体であって、当該抗体がＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該コンジュゲート部分が、当該抗体の重鎖の位置２９５において、アクセプターグルタミン残基を介して当該抗体にコンジュゲートされており、当該Ｎ−グリコシル化が、当該重鎖の位置２９７においてであり、番号付けが、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従う、抗体が提供される。
いくつかの実施形態において、抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基を介してコンジュゲート部分にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートであって、当該抗体薬物コンジュゲートが、Ｆｃ領域においてＮ−グリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）されている、抗体薬物コンジュゲートが提供される。いくつかの実施形態において、当該抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、キメラ抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、二重特異性もしくは多重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、トラスツズマブである。
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域においてＮ−グリコシル化されているトラスツズマブを含む抗体薬物コンジュゲートであって、当該トラスツズマブが、Ｎ−グリコシル化部位に隣接する内因性アクセプターグルタミン残基を介してコンジュゲート部分にコンジュゲートされている、抗体薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態において、位置２９７においてＮ−グリコシル化されているトラスツズマブを含む抗体薬物コンジュゲートであって、当該トラスツズマブが、位置２９５における内因性アクセプターグルタミン残基を介してコンジュゲート部分にコンジュゲートされており、番号付けが、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従う、抗体薬物コンジュゲートが提供される。
いくつかの実施形態において、本明細書において説明したＦｃ含有融合ポリペプチドを含む組成物であって、当該組成物中の当該Ｆｃ含有融合ポリペプチドの少なくともいくらか（しかし、必ずしも全てである必要はない）が、Ｆｃ領域においてグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）されている、組成物が提供される。例えば、いくつかの実施形態において、抗体薬物コンジュゲートを含む組成物であって、当該抗体薬物コンジュゲートが、抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基を介してコンジュゲーション部分にコンジュゲートした抗体を含み、当該組成物中の抗体薬物コンジュゲートの少なくともいくらか（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも９５％のいずれか）が、Ｆｃ領域においてグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）されている、組成物が提供される。いくつかの実施形態において、当該抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、キメラ抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、二重特異性もしくは多重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、当該抗体は、トラスツズマブである。
本明細書において説明されるコンジュゲーション方法は、特異的かつ化学量論的に制御された方式においてコンジュゲート部分にコンジュゲートされているＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）の製造を可能にする。本明細書において使用される場合、用語「特異的にコンジュゲートした」は、Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）の特定の部位でのコンジュゲート部分の、すなわち、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するＦｃ領域でのアクセプターグルタミン残基の、特異的コンジュゲーションもしくは架橋を意味する。部位特異性は、様々な技術、例えば、これらに限定されるわけではないが、ペプチドマッピングおよびタンパク質配列決定法など、によって確認することができる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲート）上でのコンジュゲート部分とＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）のモル比は、約１：１である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲート）上でのコンジュゲート部分とＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）とのモル比は、約２：１である。いくつかの実施形態において、当該組成物中のＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）の少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上のいずれか）は、約１：１のＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）とコンジュゲート部分のモル比を有する。いくつかの実施形態において、当該組成物中のＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）の少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上のいずれか）は、約１：２のＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）とコンジュゲート部分のモル比を有する。いくつかの実施形態において、当該組成物中のＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）の少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上のいずれか）は、約１：１または約１：２のＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）とコンジュゲート部分のモル比を有する。
本明細書において説明されるコンジュゲート部分は、直接的に、または本明細書においてさらに詳細説明される低分子ハンドルを介して、アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートさせることができる任意の部分であり得る。コンジュゲーション部分とアクセプターグルタミン残基との間のコンジュゲーションは、当該コンジュゲート部分または当該低分子ハンドルのアミンドナー基を当該アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートさせることによって実施される。したがって、アミンドナー基を有する任意のコンジュゲート部分は、直接的に、Ｆｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートさせることができる。アミンドナー基を有さない任意のコンジュゲート部分は、アミンドナー基を有する低分子ハンドルを介して間接的にＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートさせることができる。
用語「アミンドナー基」は、本明細書において使用される場合、１以上の反応性アミン（例えば、一級アミン）を有する反応性基を意味する。例えば、当該コンジュゲート部分は、アミンドナー基（例えば、一級アミン、−ＮＨ２）、任意のリンカー、および活性部分（例えば、低分子など）を含み得る。当該コンジュゲート部分はさらに、反応性Ｌｙｓ（例えば、内因性Ｌｙｓ）を有するポリペプチドまたは生体適合性ポリマーでもあり得る。当該アミンドナー基は、いくつかの実施形態において、アクセプターグルタミンを介したＦｃ含有ポリペプチドへの薬剤部分のコンジュゲーションを可能にするためにトランスグルタミナーゼに対して基質を提供する、一級アミン（−ＮＨ２）である。したがって、ドナーグルタミンとアミンドナー基との間の結合は、式−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−であり得る。
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドおよびコンジュゲート部分は、リンカーを介して連結している。いくつかの実施形態において、当該リンカーは、非切断性リンカーである。好適な非切断性リンカーとしては、これらに限定されるわ けではないが、ＮＨ２−Ｒ−Ｘ、ＮＨ２ＮＨ−Ｒ−Ｘ、およびＮＨ２−Ｏ−Ｒ−Ｘが挙げられ、ここで、Ｒは、アルキルまたはポリエチレングリコール基（ＰＥＧとも呼ばれる）であり、Ｘは活性部位である。ポリエチレングリコール基またはＰＥＧ基は、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−の式を有し得、ここで、ｎは、少なくとも１の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは、２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、または２４のいずれかである。
いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ含有ポリペプチドおよびコンジュゲート部分は、切断性リンカーによって連結されている。好適な切断性リンカーとしては、これらに限定されるわけではないが、Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｘ、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−Ｘ、ＮＨ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−Ｘ、およびＮＨ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−（Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−Ｘ）２が挙げられ、ここで、Ｘは活性部分であり、ｎは、少なくとも１（例えば、２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、または２４のいずれか）の整数である。ＰＡＢＣは、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニルを意味する。Ｃｉｔは、シトルリンを意味する。
他の例示的アミンドナー基−リンカーとしては、これらに限定されるわけではないが、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、アミノカプロン酸、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ、アミノ−ＰＥＧ２（ポリエチレングリコール）−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ（バリン）−Ｃｉｔ（シトルリン）−ＰＡＢＣ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ、プトレシン、およびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、−ＮＨ−（Ｃ）ｎ−リンカーを介してアクセプターグルタミン残基に連結されており、ここで、（Ｃ）ｎは、置換または非置換のアルキルまたはヘテロアルキル鎖であり、ｎは、約１から約６０の整数である。いくつかの実施形態において、当該鎖の炭素は、アルコキシル、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アルキル−Ｓ−、チオール、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、アミン、アルキルアミン、アミド、またはアルキルアミドで置換されている。いくつかの実施形態において、ｎは、約２から約２０である。
いくつかの実施形態において、当該リンカーは分岐鎖状である。いくつかの実施形態において、当該リンカーは直鎖状である。いくつかの実施形態において、当該リンカーは、活性部分を付着させるための１よりも多く（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）の付着部位を有する。これらの活性部分は、お互いに同じかまたは異なり得る。例えば、当該コンジュゲート部分は、複数の活性部分（例えば、薬物分子など）に連結したポリアセタールに基づく、またはポリアセタール誘導体に基づくポリマーを含み得る。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、Ａｌｅｘａ ４８８カダベリン、５−ＦＩＴＣカダベリン、Ａｌｅｘａ ６４７カダベリン、Ａｌｅｘａ ３５０カダベリン、５−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭカダベリン、ＳＲ１０１カダベリン、５，６−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭリジン、Ａｃ（アセチル）−ＬｙｓＧｌｙ−ＭＭＡＤ（モノメチルオーリスタチンＤ）、アミノ−ＰＥＧ３（ポリエチレングリコール）−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−アミノ−ノナノイル−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−Ｖａｌ（バリン）−Ｃｉｔ（シトルリン）−ＰＡＢＣ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−β−Ａｌａ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２−ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）、アミノカプロイル−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、プトレシニル−ゲルダナマイシン、およびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンからなる群より選択される。ＭＭＡＥは、モノメチルオーリスタチンＥまたはそれらの誘導体を意味する。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、ジアミンを含む化合物である。いくつかの実施形態において、当該化合物は、プトレシン（ブタン−１，４−ジアミン）、エチレンジアミン、カダベリン（ペンタン−１，５−ジアミン）、スペルミジン、スペルミン、ヒドラジン、１，３−ジアミノプロパン、ヘキサメチレンジアミン、フェニレンジアミン、キシリレンジアミン、ジフェニルエチレンジアミン、１，８−ジアミノナフタレン、ならびにそれらの立体異性体、同配体（ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ）、類似体（ａｎａｌｏｇｓ）、または誘導体からなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、メイタンシン誘導体、例えば、図８に示されたＭＡＹ−ＰＥＧ４または図９に示されたＭＡＹ−ＰＶＣＬなど、である。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、非切断性リンカー（例えば、アミノ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、例えば、図１２に示されるようなＰＥＧｘ−ＭＭＡＥなど）を含むＭＭＡＥ誘導体である。いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、切断性リンカー（例えば、図１２に示されるＰＥＧ３ｃ−ＭＭＡＥなど）を含むＭＭＡＥ誘導体である。
いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域においてＮ−グリコシル化されているトラスツズマブを含む抗体薬物コンジュゲートであって、当該トラスツズマブが、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基によって、少なくとも１つのＭＭＡＥ（例えば、１、２、またはそれ以上）を含むコンジュゲート部分にコンジュゲートされている、抗体薬物コンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、図１２に示されるようなＰＥＧｘ−ＭＭＡＥであり、ここで、ｘは、２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、および２４から選択される整数である。いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、図１２に示されるようなＰＥＧ３ｃ−ＭＭＡＥである。いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、２つのＭＭＡＥおよび３アームＰＥＧリンカーである。
いくつかの実施形態において、トラスツズマブを含む上記において説明される抗体薬物コンジュゲートのいずれかを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分における活性部分（例えば、薬物など、例えば、ＭＭＡＥ）と、組成物中におけるトラスツズマブの間の平均モル比は、約１：１、２：１、または４：１のいずれかである。いくつかの実施形態において、当該組成物中におけるトラスツズマブを含む抗体薬物コンジュゲートの少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上のいずれか）は、約２：１の、当該コンジュゲート部分における活性部分（例えば、薬物など、例えば、ＭＭＡＥ）と当該トラスツズマブの間のモル比を有する。いくつかの実施形態において、当該組成物中におけるトラスツズマブを含む抗体薬物コンジュゲートの少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上のいずれか）は、約４：１の、当該コンジュゲート部分における活性部分（例えば、薬物など、例えば、ＭＭＡＥ）と当該トラスツズマブの間のモル比を有する。
いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、インビボでの投与の少なくとも約１日後に約５０％以上において個体（例えば、哺乳動物）内に存在する。いくつかの実施形態において、当該Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、インビボでの投与の少なくとも約２時間、少なくとも約２〜６時間、少なくとも約６〜１２時間、少なくとも約１２〜１８時間、少なくとも約１８〜２４時間、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約１週間、または少なくとも約２週間後に、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％、またはそれ以上のいずれかにおいて個体（例えば、哺乳動物）内に存在する。
（活性部分）
本明細書において説明されるコンジュゲート部分は、いくつかの実施形態において、活性部分を含む。いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、ペプチドまたはポリペプチドである活性部分を含む。いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、生体適合性ポリマーである活性部分を含む。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、細胞傷害性薬剤、免疫抑制剤、または造影剤（例えば、フルオロホア）である活性部分を含む。いくつかの実施形態において、当該細胞傷害性薬剤は、化学療法剤である。いくつかの実施形態において、当該活性部分は、当該Ｆｃ含有ポリペプチドの薬物動態を向上させる部分、治療的部分、および診断的部分のうちのいずれかである。いくつかの実施形態において、当該活性部分は、低分子である。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、細胞傷害性薬剤である活性部分を含む。細胞傷害性薬剤の例としては、これらに限定されるわけではないが、アントラサイクリン、オーリスタチン、ドラスタチン、ＣＣ−１０６５、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、メイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、ＳＮ−３８、チューブリシン、ヘミアスタリン、ならびにそれらの立体異性体、同配体、類似体、または誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）を含む。いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分はＴＡＭ１を含む。いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を含む。
当該アントラサイクリンは、細菌ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に由来し、幅広い癌、例えば、白血病、リンパ腫、乳房、子宮、卵巣、および肺の癌など、を処置するために使用されている。アントラサイクリンの例としては、これらに限定されるわけではないが、ダウノルビシン、ドキソルビシン（すなわち、アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、およびミトキサントロンが挙げられる。
ドラスタチンならびにそれらのペプチド性類似体および誘導体であるオーリスタチンは、抗癌性および抗真菌性活性を有することが分かっている非常に強力な抗分裂剤である。例えば、米国特許第５，６６３，１４９号およびＰｅｔｔｉｔら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５（１９９８）を参照されたい。例示的ドラスタチンおよびオーリスタチンとしては、これらに限定されるわけではないが、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、および５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）が挙げられる。
デュオカルマイシンおよびＣＣ−１０６５は、細胞傷害性効力を有するＤＮＡアルキル化剤である。Ｂｏｇｅｒ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：３６４２−３６４９（１９９５）を参照されたい。例示的ドラスタチンおよびオーリスタチンとしては、これらに限定されるわけではないが、（＋）−デュオカルマイシンＡ、および（＋）−デュオカルマイシンＳＡ、および（＋）−ＣＣ−１０６５が挙げられる。
エンジインは、９員環および１０員環または共役した三重−二重−三重結合の環状系の存在のどちらかによって特徴付けられる抗腫瘍性細菌産物のクラスである。例示的エンジインとしては、これらに限定されるわけではないが、カリチアマイシン、エスペラマイシン、およびダイネミシンが挙げられる。
ゲルダナマイシンは、Ｈｓｐ９０（熱ショックタンパク質９０）に結合したベンゾキノンアンサマイシン抗生物質であり、抗腫瘍薬として使用されている。例示的ゲルダナマイシンとしては、これらに限定されるわけではないが、１７−ＡＡＧ（１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）および１７−ＤＭＡＧ（１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）が挙げられる。
メイタンシンまたはそれらの誘導体のメイタンシノイドは、チューブリンの重合の阻害により有糸核分裂の際の微小管形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する。Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２−１００５（１９７５）を参照されたい。例示的メイタンシンおよびメイタンシノイドとしては、これらに限定されるわけではないが、メルタンシン（ＤＭ１）およびその誘導体ならびにアンサマイトシンが挙げられる。
タキサンは、抗チューブリン剤または分裂阻害剤として機能するジテルペンである。例示的タキサンとしては、これらに限定されるわけではないが、パクリタキセル（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標））およびドセタクセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））が挙げられる。
ビンカアルキロイドも抗チューブリン剤である。例示的ビンカアルキロイドとしては、これらに限定されるわけではないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、免疫抑制剤である活性部分を含む。免疫抑制剤の例としては、これらに限定されるわけではないが、ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、ならびにグルココルチコイドおよびその類似体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、造影剤（例えば、フルオロホア）、例えば、フルオレセイン、ローダミン、ランタニド蛍光体、およびそれらの誘導体など、である活性部分を含む。フルオロホアの例としては、これらに限定されるわけではないが、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（例えば、５−ＦＩＴＣ）、フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）（例えば、５−ＦＡＭ）、エオシン、カルボキシフルオレセイン、エリスロシン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（例えば、Ａｌｅｘａ ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６４７、６６０、６８０、７００、または７５０）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（例えば、５−ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、およびスルホローダミン（ＳＲ）（例えば、ＳＲ１０１）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、ポリペプチドである活性部分を含む。いくつかの実施形態において、当該ポリペプチドは、抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはマウスモノクローナル抗体など、である。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、毒素ポリペプチド（例えば、毒素タンパク質）である活性部分を含む。毒素ポリペプチドの例としては、これらに限定されるわけではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリアオフィキナリス阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、トリコテセン類、阻害因子シスチンノット（ＩＣＫ）ペプチド（例えば、セラトトキシン類）、およびコノトキシン（例えば、ＫＩＩＩＡまたはＳｍＩＩＩａ）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、放射性同位体などの標識を含む。放射性同位体または他の標識の例としては、これらに限定されるわけではないが、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉｎ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、および１５３Ｐｂが挙げられる。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、Ａｌｅｘａ ４８８カダベリン、５−ＦＩＴＣカダベリン、Ａｌｅｘａ ６４７カダベリン、Ａｌｅｘａ ３５０カダベリン、５−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭカダベリン、ＳＲ１０１カダベリン、５，６−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＦＡＭリジン、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−アミノ−ノナノイル−ＭＭＡＤ］、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−ｂｅｔａ−Ａｌａ−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−ＭＭＡＦ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、アミノ−ＰＥＧ２−Ｃ２−ＭＭＡＦ、アミノ−ＰＥＧ３−Ｃ２−ＭＭＡＦ、プトレシニル−ゲルダナマイシン、およびＡｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシンからなる群より選択される活性部分を含む。いくつかの実施形態において、アミンドナー剤は、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＦ、Ａｃ−Ｌｙｓ−プトレシニル−ゲルダナマイシン、Ａｃ−Ｌｙｓ−ｂｅｔａ−Ａｌａ−ＭＭＡＤ、Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、アミノカプロイル−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＤ、およびアミノ−ＰＥＧ６−Ｃ２−ＭＭＡＤである。
いくつかの実施形態において、当該コンジュゲート部分は、生体適合性ポリマーである活性部分を含む。当該Ｆｃ含有ポリペプチドは、Ｆｃ含有ポリペプチドの生物学的特徴を向上させるため、例えば、血中半減期および生理活性を増加させるためやインビボでの半減期を延ばすために、生体適合性ポリマーにコンジュゲートさせることができる。生体適合性ポリマーの例は、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはそれらの誘導体、ならびに両性イオン含有生体適合性ポリマー（例えば、ホスホリルコリン含有ポリマー）など、である。
（Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを作製する方法）
別の態様において、本出願は、野生型または改変トランスグルタミナーゼを使用することによってＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）を作製する方法を提供する。
本発明者は、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）のＦｃ領域上のアクセプターグルタミン残基にコンジュゲート部分を特異的にコンジュゲートするように設計された、改変ＴＧａｓｅを作り出した。Ｎ−グリコシル化部位に隣接するＦｃ領域上のグルタミン残基は、ＴＧａｓｅの作用に対してアクセス可能ではないであろうと以前に信じられていたことに反し、本発明者はさらに驚くべきことに、特定の反応条件（例えば、酵素の特定の濃度）を利用することによって、野生型ＴＧａｓｅも、部位特異的かつ化学量論的な方式において、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するＦｃ領域上のアクセプターグルタミン残基にコンジュゲート部分をコンジュゲートさせることができることを見出した。
本明細書において説明される方法は、いくつかの実施形態において、単一のコンジュゲーション段階を伴う。そのような方法は、例えば、相当量のＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを生じるのに２０〜９８％のコンジュゲーション収率で十分である場合などに、特に好適である。当該一段階法は、リンカーのサイズが最小であることを必要とする場合、Ｆｃ含有ポリペプチドの複数の供給が存在する場合、薬物溶解度が中程度（例えば、約１００ｍｇ／Ｌ）の場合、および、高収率を得るより時間節約の方に関心が高い場合においても有用である。
いくつかの実施形態において、当該方法は、二段階を伴う。最初に、低分子ハンドルが、ＴＧａｓｅを介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされて、中間コンジュゲートを生じる。続いて、活性部分が、当該低分子ハンドルを介して、共有結合的または非共有結合的のどちらかにおいて、当該中間コンジュゲートにカップリングされる。当該低分子ハンドルは、特異的に設計することにより当該活性部分のカップリングを適合させることができ、したがって、Ｆｃ含有ポリペプチドへの任意の種類の活性部分のコンジュゲーションを可能にし得る。Ｆｃ含有ポリペプチドおよび／または活性部分の供給が制限される場合、ならびに活性部分（例えば、毒素など）が、低水溶性を有したりポリペプチドの凝集を引き起こしたりする場合、二段階法は特に有用である。低分子ハンドルを使用することにより、第一酵素カップリング段階は、コンジュゲーションでの高収率の達成を可能にし得る。次いで、第二化学選択的カップリング段階は、１．２から１．５の間の活性部分：Ｆｃ含有ポリペプチドの反応物の比率のみを必要とする。これは、一段階プロセスより高い全コンジュゲーション収率につながり得る。
したがって、いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを作製する方法であって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で、当該Ｆｃ含有ポリペプチドを当該コンジュゲート部分に接触させ、ここで、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、当該コンジュゲート部分が、当該アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされている、工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを作製する方法であって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で、当該Ｆｃ含有ポリペプチド含む組成物を当該コンジュゲート部分に接触させる工程、を含み、少なくともいくらか（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上）のＦｃ含有ポリペプチドが、Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、当該コンジュゲート部分が、当該アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされている、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、当該抗体薬物コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で、当該抗体を当該コンジュゲート部分に接触させる工程、を含み、当該抗体が、Ｆｃ領域においてグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）され、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、方法が提供される。いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、当該抗体薬物コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で抗体組成物を当該コンジュゲート部分に接触させる工程を含み、当該組成物中の当該抗体の少なくともおよそいくらか（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上）が、Ｆｃ領域においてグリコシル化され、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを作製する方法であって、ａ）当該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で、当該Ｆｃ含有ポリペプチドを当該低分子ハンドルに接触させる工程と、ｂ）当該中間コンジュゲートを活性部分に接触させ、それにより、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを得る工程であって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、当該コンジュゲート部分が、当該アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされている、工程と、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含むＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを作製する方法であって、ａ）当該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートしたＦｃ含有ポリペプチドを含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で、当該Ｆｃ含有ポリペプチドを含む組成物を当該低分子ハンドルに接触させる工程と、ｂ）当該中間コンジュゲートを活性部分に接触させ、それにより、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを得る工程であって、少なくともいくらか（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上）のＦｃ含有ポリペプチドが、Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該化Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、当該コンジュゲート部分が、当該アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされている、工程と、を含む方法が提供される。
いくつかの実施形態において、低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）当該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートした抗体を含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で、当該抗体を当該低分子ハンドルに接触させる工程と、ｂ）当該中間コンジュゲートを活性部分に接触させ、それにより、抗体薬物コンジュゲートを得る工程であって、当該抗体が、Ｆｃ領域においてグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）され、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、工程と、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）当該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートした抗体を含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で抗体組成物を当該低分子ハンドルに接触させる工程と、ｂ）当該中間コンジュゲートを活性部分に接触させ、それにより、抗体薬物コンジュゲートを得る工程であって、当該組成物中の当該抗体の少なくともいくらか（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上のいずれか）が、Ｆｃ領域においてグリコシル化（Ｎ−グリコシル化）され、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、工程と、を含む方法が提供される。
本明細書において説明される低分子ハンドルは、概して、−ＮＨ２−Ｒの構造を有し、ここで、Ｒは、活性部分の付着を可能にする部分である。本明細書において説明される方法への低分子ハンドルの導入は、当該方法の可撓性を著しく高める。具体的には、当該低分子ハンドルの構造は、所望の活性部分の付着に適合させることができる。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒは、結合パートナーに特異的に結合するリガンドである。これは、結合パートナーを有する任意の分子（例えば、タンパク質）の付着を可能にする。好適なリガンド／結合パートナーの対としては、これらに限定されるわけではないが、抗体／抗原、抗原／抗体、アビジン／ビオチン、ビオチン／アビジン、ストレプトアビジン／ビオチン、ビオチン／ストレプトアビジン、グルタチオン／ＧＳＴ、ＧＳＴ／グルタチオン、マルトース結合タンパク質／アミロース、アミロース／マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、およびセルロース、セルロース／セルロース結合タンパク質などが挙げられる。
本明細書において説明される他の好適な低分子ハンドルとしては、これらに限定されるわけではないが、ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−ＮＨ２、ＮＨ２−Ｒ−（ＯＲ’）２、ＮＨ２−Ｒ＝Ｏ、ＮＨ２−Ｒ−ＳＨ、ＮＨ２−Ｒ−アジドが挙げられる。これらの低分子ハンドルは、好適なリンカー、例えば、ＮＨ２−Ｏ−Ｒ−Ｘ、マレイミド−Ｒ−Ｘ、およびシクロオクチン−Ｒ−（Ｒ’−Ｘ）２など、によるコンジュゲート部分の付着を可能にし、ここで、Ｘは活性部分であり、ＲおよびＲ’は、独立して、リンカー基、例えば、アルキル基またはポリエチレングリコール基を有するリンカー基など、である。いくつかの実施形態において、当該低分子ハンドルは、１つのアミノ基と２つのアジド基を有する３アームＰＥＧリンカー（例えば、図１８の上側のパネルに表された３アームＰＥＧリンカー）であり、ここで、当該アジド基のそれぞれは、活性部分にコンジュゲートされ得る。
ＴＧａｓｅ−触媒反応は、数時間から数日において（例えば、終夜）実施することができる。コンジュゲート部分または低分子ハンドルは、４００μｍｏｌ／Ｌと６００μｍｏｌ／Ｌとの間のリガンド濃度において、Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、１ｍｇ／ｍＬ）と反応させることができ、Ｆｃ含有ポリペプチドに対して６０から９０倍過剰な基質、または必要に応じて、より少ない過剰量の基質、例えば、１から２０倍または１０から２０倍を提供する。当該反応は、３７℃においてカリウム不含リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ８）中で実施することができる。４時間から数日後、定常状態条件が達成される。次いで、遠心分離−透析（ＶＩＶＡＳＰＩＮ（登録商標） ＭＷＣＯ ５０ｋＤａ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ、ウィンケル、スイス）または透析ろ過（ＰＥＬＬＩＣＯＮ（登録商標） ＭＷＭＣＯ ５０ｋＤａ、ミリポア）を使用して、過剰なリガンドおよび酵素が除去される。反応は、ＨＰＬＣによってモニターされ得る。
結果として得られるＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートは、任意の好適な方法を使用して分析することができる。例えば、コンジュゲートしたポリペプチドの化学量論は、抗体にコンジュゲートしたコンジュゲート部分または低分子ハンドルの数、ならびに特に当該組成物の均質性を評価するために、トップダウンアプローチを使用して液体クロマトグラフィ−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によって特徴付けることができる。コンジュゲートは、ＬＣ／ＭＳ分析の前に還元することができ、軽鎖および重鎖は別々に測定される。
一実施形態において、当該生成物は、薬物負荷（例えば、Ｆｃ含有ポリペプチドあたりのコンジュゲート中の活性部分の数）について分析される。そのような方法は、Ｆｃ含有ポリペプチドあたりのコンジュゲートまたは活性部分（例えば、薬物など）の平均数、ならびに組成物中の抗体あたりのコンジュゲートまたは活性部分（例えば、薬物など）の数の分散、すなわち、任意の所定のレベルの薬物負荷またはＤＡＲでの総抗体の割合、を特定するために使用することができる。ある数（ｎ）のコンジュゲートされたアクセプターグルタミン（例えば、ｎ＝１、２、３、４、５、６、など）を有する、抗体の一部分が特定され得る。そのような特定およびより一般的な薬物負荷に適合する技術の１つは、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）であり、ＨＩＣは、例えば、Ｈａｍｂｌｅｔｔら（２００４） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：７０６３−７０７０；Ｗａｋａｎｋａｒら（２０１１） ｍＡｂｓ ３（２）：１６１−１７２；およびＬｙｏｎら（２０１２） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５０２：１２３−１３８に記載されるようにして実施することができ、これらの文献の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
コンジュゲーション反応におけるトランスグルタミナーゼとＦｃ含有ポリペプチドの間のモル比を制御することより、効率的なトランスグルタミネーション反応を可能にすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼとＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体または抗体組成物など）のモル比は、約１０：１から約１：１００、例えば、約１０：１から約９：１、約９：１から約８：１、約８：１から約７：１、約７：１から約６：１、約６：１から約５：１、約５：１から約４：１、約４：１から約３：１、約３：１から約２：１、約２：１から約１：１、約１：１から約１：２、約１：２から約１：３、約１：３から約１：４、約１：４から約１：５、約１：５から約１：６、約１：６から約１：７、約１：７から約１：８、約１：８から約１：９、約１：９から約１：１０、約１：１０から約１：２０、約１：２０から約１：３０、約１：３０から約１：４０、約１：４０から約１：５０、約１：５０から約１：６０、約１：６０から約１：７０、約１：７０から約１：８０、約１：８０から約１：９０、または約１：９０から約１：１００のいずれかである。
当該反応混合物中のトランスグルタミナーゼの量を制御することによって、効率的なトランスグルタミナーゼ反応を可能にすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、当該反応混合物中のトランスグルタミナーゼの濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌのいずれか、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍｌから約０．０２ｍｇ／ｍｌ、約０．０２ｍｇ／ｍｌから約０．０３ｍｇ／ｍｌ、約０．０３ｍｇ／ｍｌから約０．０４ｍｇ／ｍｌ、約０．０４ｍｇ／ｍｌから約０．０５ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約０．０６ｍｇ／ｍｌ、約０．０６ｍｇ／ｍｌから約０．０７ｍｇ／ｍｌ、約０．０７ｍｇ／ｍｌから約０．０８ｍｇ／ｍｌ、約０．０８ｍｇ．ｍｌから約０．０９ｍｇ／ｍｌ、約０．０９ｍｇ／ｍｌから約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌから約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌから約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌから約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌから約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌから約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌから約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌから約０．９ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌから約２ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌから約３ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌから約４ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌから約５ｍｇ／ｍｌのいずれかである。いくつかの実施形態において、反応混合物中のトランスグルタミナーゼの濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．２ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼ反応は、固体支持体上において実施される。例えば、当該Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）は、固体支持体に付着され得る。次いで、コンジュゲート部分の残りの構成要素が、当該固体支持体上のＦｃ含有ポリペプチドに接触させられ、その後に除去される。あるいは、トランスグルタミナーゼを、固体支持体に付着させてもよい。次いで、コンジュゲート部分の残りの構成要素が、当該固体支持体上のトランスグルタミナーゼに接触させられ、その後に固体支持体のトランスグルタミナーゼから分離される。
本明細書において説明される方法にとって有用な固体支持体としては、例えば、プレート、チューブ、ボトル、フラスコ、磁気ビーズ、磁気シート、多孔性マトリックス、または任意の固体表面などが挙げられる。ＴＧａｓｅまたはＦｃ含有ポリペプチドを固体支持体に連結させるために使用することができる薬剤または分子としては、これらに限定されるわけではないが、レクチン類、アビジン／ビオチン、無機または有機連結分子が挙げられる。物理的分離は、例えば、ろ過、単離、磁場、遠心分離、洗浄などによって達成することができる。
いくつかの実施形態において、当該固体支持体は、ビーズ、膜、カートリッジ、フィルター、マイクロタイタープレート、試験管、固体粉末、キャスト成形もしくは押出成形されたモジュール、メッシュ、繊維、磁気粒子複合材料、または任意の他の固体材料である。当該固体支持体は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリエチレンテレフタレート、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、二フッ化ポリビニリデン（ＰＣＤＦ）、シリコーン類、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロースなどの物質でコーティングしてもよい。いくつかの実施形態において、当該固体支持体は、リガンドでコーティングされ得るか、またはリガンドを含浸させられ得る。
いくつかの実施形態において、当該支持材料は、磁気ビーズである。いくつかの実施形態において、当該磁気ビーズは、約１〜２００ミクロン、例えば、約１〜２ミクロン、２〜１０ミクロン、１０〜３０ミクロン、３０〜５０ミクロン、５０〜１００ミクロン、および１０〜２００ミクロンのいずれかなど、の平均サイズを有する。いくつかの実施形態において、当該磁気ビーズは、単分散である。いくつかの実施形態において、当該磁気ビーズは、例えば、プロテインＡでコーティングされる。
本明細書において説明される方法において使用することができる他の固体支持体としては、これらに限定されるわけではないが、ゼラチン、ガラス、セファロース、マクロビーズ、デキストランマイクロキャリア、例えば、ＣＹＴＯＤＥＳ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ウプサラ、スウェーデン）など、が挙げられる。さらに、多糖類例えば、アガロース、アルギン酸塩、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストランもしくはデンプン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリアクロレイン、ポリビニルアルコール、ポリメチルアクリレート、パーフルオロカーボン、無機化合物、例えば、シリカ、ガラス、珪藻土、アルミナ、酸化鉄、または他の金属酸化物など、あるいは、２種以上の天然に存在するポリマー、合成ポリマー、または無機化合物による任意の組み合わせからなるコポリマーが想到される。
当該反応混合物中のトランスグルタミナーゼの量（すなわち、固体支持体として樹脂が使用される場合には樹脂１ｍｌあたりの量）を制御することにより、効率的なトランスグルタミナーゼ反応を可能にすることができる。例えば、いくつかの実施形態において、反応混合物中のトランスグルタミナーゼの濃度（樹脂１ｍｌあたりの量）は、およそ、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌのいずれか、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍｌから約０．０２ｍｇ／ｍｌ、約０．０２ｍｇ／ｍｌから約０．０３ｍｇ／ｍｌ、約０．０３ｍｇ／ｍｌから約０．０４ｍｇ／ｍｌ、約０．０４ｍｇ／ｍｌから約０．０５ｍｇ／ｍｌ、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約０．０６ｍｇ／ｍｌ、約０．０６ｍｇ／ｍｌから約０．０７ｍｇ／ｍｌ、約０．０７ｍｇ／ｍｌから約０．０８ｍｇ／ｍｌ、約０．０８ｍｇ．ｍｌから約０．０９ｍｇ／ｍｌ、約０．０９ｍｇ／ｍｌから約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌから約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌから約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌから約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌから約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌから約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌから約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌから約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌから約０．９ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌから約１ｍｇ／ｍｌのいずれかである。
いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分とＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）の間の濃度比は、約２：１から約８００：１、例えば、これらに限定されるわけではないが、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１、約６０：１、約７０：１、約８０：１、約９０：１、約１００：１、約２００：１、約３００：１、約４００：１、約５００：１、約６００：１、約７００：１、および約８００：１のいずれかである。
いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）およびコンジュゲート部分におけるコンジュゲーション効率は、少なくとも約３０％である。本明細書において使用される場合、用語「コンジュゲーション効率」または「架橋効率」は、改変ポリペプチドコンジュゲートにおける予想される最大量によって除した、実験により測定された改変ポリペプチドコンジュゲートの量の間の比率である。コンジュゲーション効率または架橋効率は、当業者に周知の様々な技術、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィなど、によって測定することができる。コンジュゲーション効率は、異なる温度、例えば、室温または３７℃など、においても測定することができる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドおよびコンジュゲート部分のコンジュゲーション効率は、少なくとも約３０％〜３５％、少なくとも約３５％〜４０％、少なくとも約４５％〜５０％、少なくとも約５０％〜５５％、少なくとも約５６％〜６０％、少なくとも約６１％〜６５％、少なくとも約６６％〜７０％、少なくとも約７１％〜７５％、少なくとも約７６％〜８０％、少なくとも約８１％〜８５％、少なくとも約８６％〜９０％、少なくとも約９１％〜９５％、または少なくとも約９６％〜９９％のいずれかである。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有ポリペプチドおよびコンジュゲート部分のコンジュゲーション効率は、少なくとも約３２％、少なくとも約３４％、少なくとも約３６％、少なくとも約３８％、少なくとも約４０％、少なくとも約４２％、少なくとも約４４％、少なくとも約４６％、少なくとも約４８％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のいずれかである。
（ＴＧａｓｅ）
ＴＧａｓｅは、あるタンパク質のリジンドナー残基と別のタンパク質のアクセプターグルタミン残基との間においてプロテイナーゼ抵抗性イソペプチド結合を形成することによって共有結合性のタンパク質の架橋を触媒し、その際に、アンモニアの放出を伴う。トランスグルタミナーゼの触媒メカニズムは、以下のように提案されている。グルタミン含有第１基質（アクセプターまたはＱ基質）が酵素に結合した後、それは、アシルコエンザイム中間体として知られる、ＴＧａｓｅの活性中心にシステイン残基を有するγ−グルタミルチオエステルを形成し、その際に、アンモニアの放出を伴う。次いで、第２基質（ドナーまたはＫ基質）が、当該アシルエンザイム中間体に結合し、チオエステル結合を攻撃する。生成物（Ｎε（γ−グルタミル）リジンイソペプチドブリッジによって架橋された２つのタンパク質）が形成され、放出される。これは、活性中心である酵素のＣｙｓ残基をその元の形態に再構築し、それらが触媒の別のサイクルに関与するのを可能にする。共有結合性アシルエンザイム中間体の形成は、この反応における律速段階であると考えられる。多くのトランスグルタミナーゼの触媒三残基は、パパイン様であり、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ（ここで、Ｈｉｓはヒスチジンであり、Ａｓｐはアスパラギン酸である）および、重要なことに、活性中心Ｃｙｓから３６残基離れて位置するトリプトファン（Ｔｒｐ）残基を含有する。対照的に、ストレプトバーチシリウム属（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ）（上記参照）から単離された細菌性ＴＧａｓｅは、非定型的触媒三残基を有し、他のＴＧａｓｅのパパイン様触媒三残基との配列相同性を示さない。
いくつかのタイプのトランスグルタミナーゼが、微生物を含む様々な生物において報告されている。その例は、以下のものに由来するＴＧａｓｅ：モルモット肝臓（ＧＴＧａｓｅ）、魚肝臓（ＦＴＧａｓｅ）、および微生物（ｍＴＧａｓｅ）ならびに任意の遺伝子組み換えＴＧａｓｅ（ｒＴＧａｓｅ）、である。ここに列挙したもの以外のＴＧａｓｅも、本発明により使用することができる。有用なＴＧａｓｅの例としては、微生物トランスグルタミナーゼ、例えば、米国特許第５，１５６，９５６号において開示されるストレプトマイセス・モバレンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）、ストレプトマイセス・シナモネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）、およびストレプトマイセス・グリセオカルネウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃａｒｎｅｕｍ）に由来するもの、ならびに米国特許第５，２５２，４６９号において開示されるストレプトマイセス・ラベンデユラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）に由来するもの、ならびに特開２００３−１９９５６９号において開示されるストレプトマイセス・ラダカヌムに由来するものなど、が挙げられる。他の有用な微生物トランスグルタミナーゼが、枯草菌（バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ））（米国特許第５，７３１，１８３号において開示されている）および様々な変形菌から単離されている。有用な微生物トランスグルタミナーゼの他の例は、国際公開第９６／０６９３１号（例えば、バシラス・リディカス（Ｂａｃｉｌｕｓ ｌｙｄｉｃｕｓ）に由来するトランスグルタミナーゼ）および国際公開第９６／２２３６６号において開示されているものである。有用な非微生物トランスグルタミナーゼとしては、モルモット肝臓トランスグルタミナーゼ、ならびにカレイ目マダイ（欧州特許第０５５５６４９号において開示される）および日本カキ類マガキ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）（米国特許第５，７３６，３５６号において開示される）のような様々な海洋資源由来のトランスグルタミナーゼが挙げられる。例示的ＴＧａｓｅは、細菌性トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）である（例えば、ＥＣ２．３．２．１３、タンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼを参照されたい）。別の例示的実施形態において、当該ＴＧａｓｅは、ストレプトマイセス・モバレンスに由来する。別の実施形態において、当該ＴＧａｓｅは、ネイティブＴＧａｓｅと少なくとも８０％の配列相同性を有する変異体（例えば、改変された）ＴＧａｓｅである。例は、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）（Ｚｅｄｉｒａから入手可能、ダルムシュタット、ドイツ）に由来する遺伝子組み換え細菌性トランスグルタミナーゼである。
ストレプトマイセス・ラダカヌムＡＴＣＣ ２７４４１もしくはＮＲＲＬ３１９１ ｍＴｇａｓｅは、Ｐｒｅ−Ｐｒｏ−ｍＴｇａｓｅ（ジェンバンクアクセス番号ＡＹ２４１６７５）として発現される。プレ−プロ−ｍＴＧａｓｅには、成熟酵素における３３１にプレの３０およびプロの４９を加えた、４１０アミノ酸残基が存在する。プロペプチドは、成熟酵素の強力な阻害因子である。ＡＹ２４１６７５に従って設計されたプライマーを使用して、ＡＴＣＣ ２７４４１ ＤＮＡからｐＥＴ２９ｂ（＋）ベクターのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位中にプロ−ｍＴｇａｓｅおよび成熟ｍＴｇａｓｅをクローンした。活性ｍＴＧａｓｅは、プロ−ｍＴＧａｓｅのエンテロキナーゼ軽鎖（ＥＫＬ）の消化または成熟ｍＴＧａｓｅのリフォールディングのいずれかから得ることができる。ストレプトマイセス・ラダカヌム（ＴＧ＿ＳＬ）由来のｍＴＧａｓｅは、少数のアミノ酸が異なっているだけで、ストレプトマイセス・モバラエンシス（ＴＧ＿ＳＭ、ＡＣＴＩＶＡ（登録商標）としてＡｊｉｎｏｍｏｔｏによって販売されている）由来のｍＴＧａｓｅに非常によく似ている（図２に示されたアラインメント）。
本明細書において説明される方法において使用されるトランスグルタミナーゼは、様々な供給元から得るかまたは作製することができる。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、酵素の立体配座変化を引き起こし酵素の活性化を可能にするためにカルシウムを必要とする、カルシウム依存性トランスグルタミナーゼである。例えば、トランスグルタミナーゼは、モルモット肝臓由来であり得、商業的供給元（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ （セントルイス、ミズーリ州）およびＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（アーバイン、カリフォルニア州）から得ることができる。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、酵素の立体配座変化を引き起こし酵素の活性化を可能にするためにカルシウムを必要としない、カルシウム非依存性トランスグルタミナーゼである。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、微生物ゲノム、例えば、ストレプトベルティシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｉｃｅｓ）（例えば、ストレプトマイセス・モバラエンシスまたはストレプトベルティシリウム・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）に由来するトランスグルタミナーゼなど、に由来する微生物トランスグルタミナーゼである。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、哺乳動物タンパク質（例えば、ヒトトランスグルタミナーゼ）、細菌タンパク質、植物タンパク質、真菌タンパク質（例えば、卵菌トランスグルタミナーゼおよびアクチノミセテス（Ａｃｔｉｎｏｍｉｃｅｔｅｓ）トランスグルタミナーゼなど）、または原核生物タンパク質である。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ツロルプシス（Ｔｕｒｏｌｐｓｉｓ）、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来である。
好適なＴＧａｓｅとしては、これらに限定されるわけではないが、細菌トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）、例えば、ＥＣ参照番号ＥＣ ２．３．２．１３を有する酵素（タンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ）など、が挙げられる。いくつかの実施形態において、当該ＴＧａｓｅは、ストレプトマイセス・ラダカヌム（ＴＧ＿ＳＬ、配列番号１６、図２を参照されたい）由来である。いくつかの実施形態において、当該ＴＧａｓｅは、ストレプトマイセス・モバラエンシス（ＴＧ−ＳＭ、配列番号１８、図２を参照されたい）由来である。いくつかの実施形態において、当該ＴＧａｓｅは、ストレプトマイセス・ラダカヌム（ＴＧ＿ＳＬ、配列番号１７、図３を参照されたい）由来のＴＧａｓｅをベースとする遺伝子組み換えＴＧａｓｅである。
いくつかの実施形態において、本明細書において説明される方法において使用されるトランスグルタミナーゼは、遺伝子組み換え技術を用いて作り出された遺伝子組み換えタンパク質である。
いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、野生型の、例えば、配列番号１６の配列を有するＴＧａｓｅである。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、配列番号１６の配列を有する野生型ＴＧａｓｅを含む遺伝子組み換え野生型ＴＧａｓｅであり、この場合、遺伝子組み換え野生型ＴＧａｓｅはさらに、Ｎ末端に追加のプロリンと、必要に応じて、精製タグ（例えば、ポリヒスチジンタグ）を含む。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、図３に示されるような配列番号１７の配列を有する遺伝子組み換え野生型ＴＧａｓｅである。野生型トランスグルタミナーゼは、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミンへのトランスグルタミネーション反応を触媒することができないと当技術分野において一般的に考えられているのとは対照的に、驚くべきことに、そのような反応は、本明細書において説明されるようなある特定の条件下において、かなりの効率と特異度において実施することができるということが見出された。
いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、改変される。いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、Ｎ−グリコシル化部位に近接するアクセプターグルタミンに対してトランスグルタミネーション反応を実施するように特異的に設計された、改変トランスグルタミナーゼである。そのような改変トランスグルタミナーゼについては、さらに、以下において詳細に説明する。
いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、精製タンパク質である。例えば、いくつかの実施形態において、当該トランスグルタミナーゼは、少なくとも約５０％の純度である。本明細書において使用される場合、「純粋な」タンパク質または「精製」タンパク質は、他のタンパク質不純物を含まないタンパク質（例えば、トランスグルタミナーゼ）を意味する。いくつかの実施形態において、精製トランスグルタミナーゼは、少なくとも約５５％〜６０％、少なくとも約６０％〜６５％、少なくとも約６５％〜７０％、少なくとも約７０％〜７５％、少なくとも約７５％〜８０％、少なくとも約８０％〜８５％、少なくとも約８５％〜９０％、少なくとも約９０％〜９５％、少なくとも約９５％〜９８％、または少なくとも約９９％の純度のいずれかである。いくつかの実施形態において、当該精製トランスグルタミナーゼは、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の純度のいずれかである。
（改変トランスグルタミナーゼ）
本出願は、別の態様において、Ｎ−グリコシル化部位に近接するアクセプターグルタミンに対してトランスグルタミネーション反応を実施するように特異的に設計された改変トランスグルタミナーゼを提供する。本発明者らは、ＴＧａｓｅの触媒残基Ｃｙｓ６４（図３）へのＦｃ領域（Ｑ２９５特異的）におけるグルタミン残基の接近性を高めるためにＴＧａｓｅの基質結合ポケットを再モデル化して、Ｑ２９５においてトランスグルタミネーション反応を特異的に実施する改変ＴＧａｓｅを得た。
いくつかの実施形態において、当該改変ＴＧａｓｅは、ストレプトマイセス・ラダカヌム（配列番号１６または配列番号１７）由来の野生型ＴＧａｓｅをベースとする。いくつかの実施形態において、当該改変ＴＧａｓｅは、ストレプトマイセス・モバラエンシス（配列番号１８）由来の野生型ＴＧａｓｅをベースとする。ストレプトマイセス・ラダカヌムから単離されたＴＧａｓｅの配列は、２つの配列間における合計で２２のアミノ酸の違いを除いてストレプトマイセス・モバラエンシス由来の配列と同一のアミノ酸配列を有する（Ｙｉ−Ｓｉｎ Ｌｉｎら，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（５），５９１−５９８（２００４））。
いくつかの実施形態において、当該改変トランスグルタミナーゼは、Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域においてアクセプターグルタミン部位でのトランスグルタミネーション反応を特異的に実施する。この文脈において使用される用語「特異的」は、Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）上の他の特定のグルタミン残基と比較した場合の、Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域での１以上の特定のグルタミン残基との反応に対するＴＧａｓｅの優先性を説明するものである。
したがって、例えば、いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分にＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）をコンジュゲートさせることができる改変トランスグルタミナーゼであって、当該Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）がＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、当該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、反応の際に、当該コンジュゲート部分が、アクセプターグルタミン残基を介してＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）にコンジュゲートされ、当該コンジュゲーションが、同じ反応条件下において野生型トランスグルタミナーゼよりも少なくとも約１０％活性が高い、改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、当該改変ＴＧａｓｅは、配列番号１６に対して少なくとも約８０％の同一性を有し、さらに、少なくとも１つの変異（例えば、置換、欠失、または挿入など）を含む。
いくつかの実施形態において、配列番号１６に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９５％のいずれかなど）の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼであって、Ｄ１〜Ｅ４、Ｐ２４４〜Ｐ２４７、およびＨ２７９〜Ｈ２８９からなる群より選択される欠失を含む、改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｄ１〜Ｅ４、Ｐ２４４〜Ｐ２４７、およびＨ２７９〜Ｈ２８９からなる群より選択される１以上の欠失を除いて、配列番号１６に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。
いくつかの実施形態において、配列番号１７に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９５％のいずれか）の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼであって、Ｐ１〜Ｅ５、Ｐ２４５〜Ｐ２４８、およびＨ２８０〜Ｈ２９０からなる群より選択される欠失を含む、改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｐ１〜Ｅ５、Ｐ２４５〜Ｐ２４８、およびＨ２８０〜Ｈ２９０からなる群より選択される１以上の欠失を除いて、配列番号１７に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。
いくつかの実施形態において、配列番号１６に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９５％のいずれかなど）の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼであって、Ｄ１〜Ｅ４の欠失、Ｐ２４４〜Ｐ２４７の欠失、Ｎ２８２〜Ｌ２８５の欠失、ＧによるＨ２７９〜Ａ２８７の置換、およびＧによるＡ２８０〜Ｈ２８９の置換からなる群より選択される変異を含む、改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｄ１〜Ｅ４の欠失、Ｐ２４４〜Ｐ２４７の欠失、およびＮ２８２〜Ｌ２８５の欠失、ＧによるＨ２７９〜Ａ２８７の置換、およびＧによるＡ２８０〜Ｈ２８９の置換からなる群より選択される変異からなる群より選択される１以上の欠失を除いて、配列番号１６に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。
いくつかの実施形態において、配列番号１７に対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９５％のいずれかなど）の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼであって、Ｐ１〜Ｅ５の欠失、Ｐ２４５〜Ｐ２４８の欠失、Ｎ２８３〜Ｌ２８６の欠失、ＧによるＨ２８０〜Ａ２８８の置換、およびＧによるＡ２８１〜Ｈ２９０の置換からなる群より選択される変異を含む、改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｐ１〜Ｅ５の欠失、Ｐ２４５〜Ｐ２４８の欠失、Ｎ２８３〜Ｌ２８６の欠失、ＧによるＨ２８０〜Ａ２８８の置換、およびＧによるＡ２８１〜Ｈ２９０の置換からなる群より選択される変異からなる群より選択される１以上の欠失を除いて、配列番号１７に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。
いくつかの実施形態において、Ｄ１〜Ｅ４の欠失を除いて、配列番号１６に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｐ２４４〜Ｐ２４７の欠失を除いて、配列番号１６に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｈ２７９〜Ｈ２８９の欠失を除いて、配列番号１６に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｎ２８２〜Ｌ２８５の欠失を除いて、配列番号１６に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｄ１〜Ｅ４の欠失およびＮ２８２〜Ｌ２８５の欠失を除いて、配列番号１６に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｄ１〜Ｅ４の欠失、Ｐ２４４〜Ｐ２４７の欠失、およびＮ２８２〜Ｌ２８５の欠失を除いて、配列番号１６に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｄ１〜Ｅ４の欠失およびＧによるＨ２８０〜Ａ２８８の置換を除いて、配列番号１６に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｄ１〜Ｅ４の欠失およびＧによるＡ２８０〜Ｈ２８９の置換を除いて、配列番号１６に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。
いくつかの実施形態において、Ｐ１〜Ｅ５の欠失を除いて、配列番号１７に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｐ２４５〜Ｐ２４８の欠失を除いて、配列番号１７に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｈ２８０〜Ｈ２９０の欠失を除いて、配列番号１７に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｎ２８３〜Ｎ２８６の欠失を除いて、配列番号１７に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｐ１〜Ｅ５の欠失およびＮ２８３〜Ｎ２８６の欠失を除いて、配列番号１７に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｐ１〜Ｅ５の欠失、Ｐ２４５〜Ｐ２４８の欠失、およびＮ２８３〜Ｎ２８６の欠失を除いて、配列番号１７に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｐ１〜Ｅ５の欠失およびＧによるＨ２８０〜Ａ２８８の置換を除いて、配列番号１７に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。いくつかの実施形態において、Ｐ１〜Ｅ５の欠失およびＧによるＡ２８１〜Ｈ２９０の置換を除いて、配列番号１７に対して１００％同一のアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼが提供される。
本明細書において相互互換的に使用される用語「配列同一性」または「同一性」は、２つ以上のアミノ酸残基の連続の間の一致の数によって特定されるような、ペプチド間の配列関連性の程度を意味する。配列同一性は、例えば、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によってアドレスされる、（もし存在する場合には）ギャップアラインメントを有する２つ以上の配列の小さい方の間の完全な一致のパーセントによって測定することができる。同一性を特定するいくつかの方法が、試験された配列間での最も大きな一致を得るために設計されている。同一性を特定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて説明される。２つの配列の間の同一性を特定するための例示的コンピュータプログラム方法としては、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））などのＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給元（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，上記）から公的に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を特定するために使用することができる。
いくつかの実施形態において、当該改変トランスグルタミナーゼは、配列番号１６または配列番号１８によってコードされたＴＧａｓｅよりも高いトランスグルタミナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態において、当該改変トランスグルタミナーゼの特異的活性は、野生型ＴＧａｓｅ（例えば、配列番号１６または配列番号１７によってコードされたＴＧａｓｅなど）よりも少なくとも約１．２５倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、または少なくとも約１０．５倍高い。
本明細書において説明される改変ＴＧａｓｅは、当技術分野において既知のアッセイを使用することにより、ＴＧａｓｅ活性について分析することができる。例えば、米国特許第５，１５６，９５６号には、Ｃａ２＋の不在下において基質としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシンおよびヒドロキシルアミンを使用して反応を行い、結果として得られるヒドロキサム酸によってトリクロロ酢酸の存在下で鉄錯体を形成させ、５２５ｎｍでの吸光度を測定し、活性を計算するための較正曲線によってヒドロキサム酸の量を特定することによって実施される、所定のペプチドの活性の測定について記載されている。本明細書の目的から、上記アッセイにおいてトランスグルタミナーゼ活性を示すペプチドは、トランスグルタミナーゼ活性を有すると考えられる。特に、本発明のペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を有するストレプトマイセス・ラダカヌム由来のＴＧａｓｅの活性を３０％上回る、例えば、５０％上回る、７０％上回る、９０％上回る活性を示す。
さらに、本明細書において説明される改変ＴＧａｓｅのいずれか１つをコードする核酸（例えば、単離された核酸など）も、本明細書において提供される。本明細書において使用される場合、用語「核酸」は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはＲＮＡ起源のうちのいずれかの核酸分子示すことが意図される。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、それらは、関心対象のタンパク質をコードする完全にまたは部分的に天然由来のヌクレオチド配列をベースとし得る。核酸は、任意選択により、他の核酸セグメントを含んでもよい。
さらに、本明細書において説明される改変ＴＧａｓｅをコードする核酸を含む遺伝子組み換えベクター（例えば、増幅ベクターおよび／または発現ベクターなど）も本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、遺伝子組み換えベクターを含む宿主細胞が提供される。
改変ＴＧａｓｅをコードする核酸を含む遺伝子組み換えベクターは、好都合に遺伝子組み換えＤＮＡ手法を施すことができる任意のベクターであり得、ベクターの選択は、それらが導入される宿主細胞に依存し得る。したがって、当該ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その複製が染色体複製に非依存的である染色体外存在物として存在するベクター、例えばプラスミドなど、であり得る。あるいは、当該ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに、宿主細胞ゲノム中に統合されて、当該ベクターが統合された染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。当該ベクターは、いくつかの実施形態において、改変ＴＧａｓｅをコードするＤＮＡ配列がＤＮＡの転写に必要な追加のセグメントに作動可能に連結された、発現ベクターである。用語「作動可能に連結された」は、当該セグメントが、それらの本来の目的のため協力して機能するように、例えば、転写がプロモーターにおいて開始されタンパク質をコードするＤＮＡ配列によって進行するように配置されることを示す。プロモーターは、選択された宿主細胞中において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得、宿主細胞に対して相同または異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。当該改変ＴＧａｓｅをコードするＤＮＡ配列はさらに、必要であれば、好適なターミネーターに作動可能に接続してもよい。
いくつかの実施形態において、当該遺伝子組み換えベクターはさらに、当該の宿主細胞において当該ベクターが複製することを可能にするＤＮＡ配列および／または選択可能なマーカー、例えば、その産生が宿主細胞における欠失を補完する遺伝子（例えば、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子またはシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＴＰＩ遺伝子（Ｐ．Ｒ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｇｅｎｅ ４０，１２５−１３０（１９８５）に記載）など）、あるいは薬物（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなど）に対する抵抗性を付与するもの、を含む。糸状菌の場合、選択可能なマーカーとしては、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤ、およびｓＣが挙げられる。
当該改変ＴＧａｓｅをコードする核酸を含むベクターが導入される宿主細胞は、当該改変ＴＧａｓｅを産生することができる任意の細胞であり得、そのような細胞としては、細菌、酵母、真菌、および高等真核細胞が挙げられる。上記において説明した形質転換または形質移入された宿主細胞は、次いで、本ペプチドの発現を可能にする条件下で、好適な栄養培地において培養され、その後、結果として得られたタンパク質が当該培地から回収される。いくつかの実施形態において、当該宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態において、当該宿主細胞は、ストレプトマイセス・ラダカヌムである。いくつかの実施形態において、当該宿主細胞は、ストレプトマイセス・モバラエンシスである。いくつかの実施形態において、当該宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
さらに、本明細書において説明される改変ＴＧａｓｅを調製する方法が、本明細書において提供される。本明細書において説明される改変ＴＧａｓｅは、様々な方法において調製することができる。例えば、いくつかの実施形態において、当該改変ＴＧａｓｅは、当該改変ＴＧａｓｅをコードする核酸を含むベクターを含む宿主細胞を培養し、当該細胞から当該改変ＴＧａｓｅを単離することによって調製される。
本発明のタンパク質を宿主細胞の分泌経路へと向かわせるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても知られる）が、遺伝子組み換えベクターにおいて提供され得る。当該分泌シグナル配列は、正しいリーディングフレームにおいて当該タンパク質をコードするＤＮＡ配列に連結される。分泌シグナル配列は、一般的に、当該タンパク質をコードするＤＮＡ配列に対して５’に位置される。当該分泌シグナル配列は、通常はタンパク質に関連するものであり得るか、または別の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来し得る。あるいは、当該タンパク質は、封入体において発現し得、それに続いて変性／再生により得ることができる。
当該細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞の成長にとって好適な任意の従来の培地、例えば、適切な補足物質を含有する最小培地または複合培地など、であり得る。当該細胞によって産生されるタンパク質は、次いで、当該のタンパク質のタイプに応じて、遠心分離またはろ過によって培地から宿主細胞を分離する工程、塩、例えば硫酸アンモニウムなど、によって上澄みまたはろ液のタンパク質様成分を沈殿させる工程、様々なクロマトグラフ手法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど、による精製、を含む、従来の手法によって当該培養培地から回収され得る。
いくつかの実施形態において、ＴＧａｓｅ、例えば本明細書において説明されるＴＧａｓｅのうちのいずれか１つ、を精製する方法が提供される。いくつかの実施形態において、当該方法は、（ａ）ＴＧａｓｅを発現する宿主細胞を提供する工程、（ｂ）封入体としてＴＧａｓｅが発現する当該宿主細胞（例えば、原核細胞など）を培養する工程、（ｃ）当該宿主細胞を破壊して、可溶画分および不溶画分を有する細胞溶解物を作製する工程、ならびに（ｄ）当該可溶画分を当該不溶画分から分離する工程であって当該不溶画分がＴＧａｓｅを含む、工程を含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ＴＧａｓｅを含む当該不溶画分を変性剤（例えば、尿素など）に接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、当該変性ＴＧａｓｅを再生緩衝液（例えば、ＤＴＴを含む緩衝液）に含ませる工程を含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、クロマトグラフィーによって（例えば、親和クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによってなど）ＴＧａｓｅを精製する工程を含む。いくつかの実施形態において、当該ＴＧａｓｅは、精製を容易にするためにタグ付加される（例えば、Ｈｉｓタグ付加など）。
いくつかの実施形態において、（ａ）ＴＧａｓｅのプロ−酵素をコードする核酸を含むベクターを含む宿主細胞（例えば、原核細胞など）を培養する工程、および（ｂ）（例えば、エンドキナーゼ軽鎖による）プロ−酵素のプロ−配列の切断によって成熟ＴＧａｓｅを得る工程を含む、ＴＧａｓｅを精製する方法が提供される。
本明細書において説明される成熟ＴＧａｓｅは、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）を作製するために使用することができる。例えば、いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、当該抗体薬物コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、変異トランスグルタミナーゼ（例えば、本明細書において説明される変異トランスグルタミナーゼのうちのいずれかなど）の存在下で、当該抗体を当該コンジュゲート部分に接触させる工程、を含み、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上のアクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、方法が提供される。いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、当該抗体薬物コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、変異トランスグルタミナーゼ（例えば、本明細書において説明される変異トランスグルタミナーゼのうちのいずれかなど）の存在下で、当該抗体を当該コンジュゲート部分に接触させる工程、を含み、当該抗体が、Ｆｃ領域においてグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）され、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、方法が提供される。いくつかの実施形態において、コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、当該Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、変異トランスグルタミナーゼ（例えば、本明細書において説明される変異トランスグルタミナーゼのうちのいずれかなど）の存在下で、当該抗体を含む組成物を当該コンジュゲート部分に接触させる工程、を含み、当該組成物中の当該抗体の少なくともいくらか（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上）が、Ｆｃ領域においてグリコシル化（Ｎ−グリコシル化）され、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、方法が提供される。
いくつかの実施形態において、低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）当該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートした抗体を含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼ（例えば、本明細書において説明される変異トランスグルタミナーゼのうちのいずれか）の存在下で、当該抗体を当該低分子ハンドルに接触させる工程と、ｂ）当該中間コンジュゲートを活性部分に接触させ、それにより、抗体薬物コンジュゲートを得る工程であって、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上のアクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、工程と、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）当該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートした抗体を含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼ（例えば、本明細書において説明される変異トランスグルタミナーゼのうちのいずれか）の存在下で、当該抗体を当該低分子ハンドルに接触させる工程と、ｂ）当該中間コンジュゲートを活性部分に接触させ、それにより、抗体薬物コンジュゲートを得る工程であって、当該抗体が、Ｆｃ領域においてグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）され、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、工程と、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、ａ）当該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートした抗体を含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼ（例えば、本明細書において説明される変異トランスグルタミナーゼのうちのいずれか）の存在下で、抗体を含む組成物を当該低分子ハンドルに接触させる工程と、ｂ）当該中間コンジュゲートを活性部分に接触させ、それにより、抗体薬物コンジュゲートを得る工程であって、当該組成物中の当該抗体の少なくともいくらか（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上）が、Ｆｃ領域においてグリコシル化（Ｎ−グリコシル化）され、当該コンジュゲート部分が、当該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、工程と、を含む方法が提供される。
（医薬組成物、単位用量、およびキット）
さらに、本明細書において説明されるＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲート）を含む医薬組成物も提供される。いくつかの実施形態において、当該医薬組成物はさらに、薬学的に許容される担体も含む。いくつかの実施形態において、当該医薬組成物中のＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のいずれかなど）は、当該Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）に付着された１つのコンジュゲート部分を有する。いくつかの実施形態において、当該医薬組成物中のＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のいずれかなど）は、当該Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）に付着された２つのコンジュゲート部分を有する。いくつかの実施形態において、当該医薬組成物中のＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％のいずれかなど）は、当該Ｆｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）に付着された１つまたは２つのコンジュゲート部分を有する。
用語「薬学的に許容される担体」は、本発明の化合物以外の任意の原料成分を説明するために使用される。賦形剤の選択は、大体において、特定の投与様式、溶解性および安定性に対する賦形剤の効果、ならびに投薬形態の性質などの要因に依存する。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性である、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。薬学的に許容される賦形剤のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、これらに限定されるわけではないが、糖類、ポリアルコール（例えば、マニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムなどの等張剤が、当該医薬組成物に含まれる。薬学的に許容される物質のさらなる例としては、これらに限定されるわけではないが、湿潤剤または少量の補助物質（例えば湿潤剤または乳化剤など）、保存料、または緩衝剤が挙げられ、これらは、抗体の保存寿命または有効性を高めるものである。
いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）は、脱免疫化することにより、既知の技術、例えば国際特許出願公開第９８／５２９７６号および国際公開第００／３４３１７号に記載のものなど、を必要とする対象への投与の際の免疫原性を減少させることができる。
本明細書において説明される医薬組成物は、単回単位用量として、または複数の単回単位用量として、調製、パッケージ化、またはバルクで販売することができる。本明細書において使用される場合、「単位用量」は、所定の量の有効成分を含む医薬組成物の離散的な量である。有効成分の量は、概して、対象に投与されるであろう当該有効成分の投薬量またはそのような投薬量の好都合な分割量、例えばそのような投薬量の１／２または１／３など、に等しい。当技術分野において認められたペプチド、タンパク質、または抗体を投与するための任意の方法は、本明細書において説明されるＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートに対して好適に用いることができる。
本明細書において説明される医薬組成物は、いくつかの実施形態において、非経口投与に好適である。医薬組成物の非経口投与は、対象者の組織の物理的破壊口の開設および当該組織の破壊口による医薬組成物の投与によって特徴付けられる任意の投与経路を含み、したがって、概して、結果として、血流中、筋肉中、または内臓中への直接投与を生じる。例えば、非経口投与としては、これらに限定されるわけではないが、医薬組成物の注射、外科的切開による当該組成物の適用、組織貫通性非外科的創傷による当該組成物の適用などによる当該組成物の投与が挙げられる。特に、非経口投与は、これらに限定されるわけではないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨下、脈内、動脈内、髄腔内、心室内、尿管内、頭蓋内、滑液嚢内注射もしくは注入、ならびに腎透析注入技術を含むことが想到される。いくつかの実施形態において、非経口投与は、静脈内または皮下経路である。
非経口投与にとって好適な医薬組成物の製剤は、ボーラス投与または連続投与にとって好適な剤形において調製、パッケージ化、または販売され得る。注射用製剤は、アンプルにおいてまたは保存料を含む複数回用量容器においてなどの単位投薬形態において調製、パッケージ化、または販売され得る。非経口投与用の製剤としては、これらに限定されるわけではないが、懸濁剤、液剤、油性もしくは水性ビヒクル中の乳剤、ペーストなどが挙げられる。そのような製剤はさらに、これらに限定されるわけではないが、懸濁化剤、安定化剤、もしくは分散剤を初めとする１種または複数種の追加の原料成分を含んでいてもよい。非経口投与用の製剤の一実施形態において、有効成分は、再構成された組成物の非経口投与前での、好適なビヒクル（例えば、無菌発熱性物質不含水）による再構成のために、乾燥（すなわち、粉末または顆粒）形態において提供される。非経口製剤はさらに、塩などの賦形剤、炭水化物、および緩衝剤（好ましくは、３から９のｐＨへ）を含有し得る水溶液も含むが、いくつかの用途では、それらは、無菌非水性溶液として、または無菌の発熱性物質不含水などの好適なビヒクルと一緒に使用されるべき乾燥形態として、より好適に製剤化され得る。例示的非経口投与形態としては、液剤または無菌水性溶液中における懸濁剤、例えば、水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液など、が挙げられる。そのような投薬形態は、所望であれば、好適に緩衝化することができる。有用な他の非経口的に投与可能な製剤としては、微結晶形態においてまたはリポソーム製剤において有効成分を含むものが挙げられる。非経口投与用の製剤は、即放や調整放出であるように製剤化することができる。調整放出製剤としては、制御放出、遅延放出、持続放出、脈動放出、標的化放出、およびプログラム化放出製剤が挙げられる。例えば、一態様において、無菌注射液は、Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲート、例えば、抗体薬物コンジュゲートまたは二重特異的抗体薬物コンジュゲートなど、を必要量において適切な溶媒中に、上記によって列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に組み入れ、必要であれば、その後にろ過殺菌することによって調製することができる。一般的に、分散剤は、有効化合物を、基本的分散媒および上記において列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に組み入れることによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製の例示的方法は、予め無菌ろ過したそれらの溶液から有効成分および任意の所望の追加の成分の粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥である。液体の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持、および界面活性剤の使用などによって、維持することができる。注射可能な組成物における延長された吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアレート塩およびゼラチンなど、を組成物中に含ませることによって得ることができる。
Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）の例示的な非限定的医薬組成物は、約５．０から約６．５の範囲のｐＨ有し、約１ｍｇ／ｍＬから約２００ｍｇ／ｍＬの本明細書において開示された改変ポリペプチドコンジュゲート、約１ミリモルから約１００ミリモルのヒスチジン緩衝剤、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、約１００ミリモルから約４００ミリモルのトレハロース、および約０．０１ミリモルから約１．０ミリモルのＥＤＴＡ脱水物を含む、無菌水溶液としての製剤である。
投薬計画は、最適な所望の応答を提供するように適合させることができる。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、数回に分割された用量を時間経過と共に投与してもよく、あるいは当該用量を、治療情況の緊急性によって示されるように比例的に増減してもよい。投与の容易さおよび投薬量の均一性のための投薬単位形態に非経口組成物を処方することが、とりわけ有利である。単位投薬形態は、本明細書において使用される場合、治療すべき患者／対象者にとっての単一の投薬として適した物理的に分離された単位を意味し、各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された有効化合物の所定量を、必要な医薬担体と共に含有する。本発明の単位投薬形態の仕様は、概して、（ａ）薬剤部分（例えば、細胞傷害性剤などの低分子）の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果もしくは予防効果、ならびに（ｂ）個体における感度の処置のためにそのような有効化合物を配合する際の当技術分野に固有の制限、により決定され、ならびにこれらに直接的に依存する。
当業者は、本明細書において提供される開示に基づいて、用量および投与計画が、治療技術分野において周知の方法に従って調節されることを理解するであろう。すなわち、最大耐量は、容易に確立することができ、患者に対して検出可能な治療効果を提供する有効量も特定され得、したがって、患者に対して検出可能な治療効果を提供するために各薬剤を投与する時間的要件も特定され得る。したがって、ある特定の用量および投与計画が本明細書において例示されるが、これらの例は、本発明の実施において患者に対して提供され得る用量および投与計画を決して制限するものではない。
投薬量値は、緩和されるべき状態のタイプおよび重症度によって変わり得、単回投与または複数回投与を含み得ることに留意されたい。任意の特定の対象者に対し、特定の投薬計画は、個体のニーズおよび当該組成物を投与する人または投与を監督する人による専門的な判断に従って、時間の経過と共に調節されるべきであること、ならびに本明細書において詳細に説明される投薬計画は例示に過ぎず、権利請求される組成物の範囲または実施を制限することを意図するものではないということも、さらに理解されたい。さらに、本発明の組成物による投薬計画は、疾患のタイプ、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、当該状態の深刻さ、投与経路、および用いられる特定の抗体など、様々な要因に基づき得る。したがって、当該投薬計画は、大きく変わり得るが、標準的な方法を用いて通常の方式によって特定することができる。例えば、用量は、薬物動態または薬力学的パラメータに基づいて調節され得、これらは、毒性作用などの臨床効果や実験室での値を含み得る。したがって、本発明は、当業者によって特定される患者内用量漸増（ｉｎｔｒａ−ｐａｔｉｅｎｔ ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ）を包含する。適切な投薬量および投薬計画の決定は、関連技術分野において周知であり、本明細書において開示される教示を提供すれば、それらに包含されることは当業者によって理解されるであろう。
本発明はさらに、上記において説明される障害の処置に使用されるキット（または製造物品）も提供する。本発明のキットは、疾患を処置するためのＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）を含む１以上の容器を含む。例えば、指示書は、癌（例えば、膵臓癌、卵巣癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、または肺癌）などの疾患を処置するための当該改変Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）の投与の説明を含む。当該キットはさらに、個体が疾患および当該疾患の段階を有するか否かの識別に基づいた処置にとって好適な個体の選択についての説明を含む。当該改変Ｆｃ含有ポリペプチドコンジュゲート（例えば、抗体薬物コンジュゲートなど）の使用に関連する指示書は、概して、意図された処置のための投薬、服薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。当該容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回投与パッケージ）、または部分単位用量であり得る。本発明のキットにおいて供給される指示書は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）上に書かれた指示であるが、機械可読性指示（例えば、磁気もしくは光学ストレージディスク上の指示）も許容可能である。本発明のキットは、好適なパッケージングである。好適なパッケージングとしては、これらに限定されるわけではないが、バイアル瓶、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージ（例えば、密封されたマイラーまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。さらに、特定の装置、例えば、吸入器、鼻腔内投与装置（例えば、噴霧器）、またはミニポンプなどの注入装置、と組み合わせて使用するためのパッケージも想到される。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、当該容器は、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静脈注射用の溶液バッグまたはバイアル瓶であり得る）。当該容器はさらに、無菌アクセスポートも有し得る（例えば、当該容器は、皮下注射針によって穿孔可能な栓を有する静脈注射用の溶液バッグまたはバイアル瓶であり得る）。当該組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、本明細書において説明されるような改変ポリペプチドである。当該容器はさらに、第二薬学的活性薬剤を含んでいてもよい。当該キットは、任意選択により、緩衝液などの追加要素および解釈情報を提供し得る。通常、当該キットは、容器と、当該容器上の、または当該容器に関連付けられたラベルまたは添付文書とを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＧａｓｅ（例えば、改変ＴＧａｓｅ、例えば、本明細書において説明される改変ＴＧａｓｅのうちのいずれか１つ）を含むキットが提供される。いくつかの実施形態において、当該キットはさらに、トランスグルタミネーション反応を実施するための他の試薬も含む。いくつかの実施形態において、当該キットはさらに、本明細書において説明されるコンジュゲーション方法のいずれか１つの実施に関する指示書を含む。いくつかの実施形態において、当該キットはさらに、ＴＧａｓｅ（例えば、改変ＴＧａｓｅなど）またはＦｃ含有ポリペプチド（例えば、抗体など）を固定するための固体支持体も含む。いくつかの実施形態において、当該キット中のＴＧａｓｅ（例えば、改変ＴＧａｓｅなど）は、当該固体支持体上に固定される。
本発明は、以下の実施例を参照することによってさらに理解することができ、これらの実施例は、例示のために提供されるのであって限定を意味するものではない。
実施例１．ＴＧａｓｅ変異体の生成
この実施例は、ＴＧａｓｅ変異体の生成について説明するものである。図３を参照すると、活性部位入口に近い３つの領域が、基質結合性ポケットを拡大するために欠失または変異されていた。野生型ＴＧ＿ＳＬを、過剰なプロリンと共にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを使用してｐＥＴ３９＋ベクター中へとクローンした（配列番号１７）。以下の欠失変異体を、ＩｇＧ１およびＴＧ＿ＳＭのドッキングに基づいて作製した：変異体１：Ｐ１〜Ｅ５からの欠失、変異体２：Ｐ２４５〜Ｐ２４８からの欠失、変異体３：Ｎ２８３〜Ｌ２８６からの欠失、変異体４：Ｐ１〜Ｅ５およびＮ２８３〜Ｌ２８６の欠失、変異体５：変異体１，２、および３によって特定される３つ全ての領域の欠失、変異体６：Ｐ１〜Ｅ５の欠失およびＧによるＨ２８０〜Ａ２８８の置換、変異体７：Ｐ１〜Ｅ５の欠失およびＧによるＡ２８１〜Ｈ２９０の置換。欠失エリアは、図３に示されるように、灰色に着色されるか、下線または取り消し線が引かれる。これらの変異体は、ＩｇＧ１に向けてより活性であった。
ＰＣＲテンプレートとしてストレプトマイセス・ラダカヌム（ＡＴＣＣ２７４４１）から精製したＤＮＡを使用して、野生型のプロ−ｍＴＧａｓｅもしくは成熟ｍＴＧａｓｅ（野生型ＴＧ＿ＳＬ）およびその変異体１〜３（上記を参照されたい）をコードするＤＮＡ配列を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位においてｐＥＴ３９ｂベクター中へとクローンした。成熟した野生型ＴＧ＿ＳＬおよび変異体１〜３の封入体を、それぞれのベクターにより形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から得た。８Ｍの尿素において可溶化した後、野生型ＴＧ＿ＳＬおよび変異体を、再生緩衝液（１ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）中へと希釈することによってリフォールディングした。当該酵素を、Ｎｉ−ＮＴＡおよびカチオン交換カラムによってさらに精製した。あるいは、プロ−ｍＴＧａｓｅを、大腸菌において可溶性の不活性プロ−酵素として発現させた。次いで、エンドキナーゼ軽鎖（ＥＫＬ）によってプロドメインを切断した後で、当該活性酵素を得た。
実施例２．ｍＴＧａｓｅによって触媒される、モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）とのＩｇＧ１のコンジュゲーション
ＭＤＣは一級アミンを有しており、ならびにその蛍光は容易にモニターすることができるため、この実験にＭＤＣを選択した。ここでは、ｍＡＢへのコンジュゲーションを実証するために、ＭＤＣを使用する。Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５〜８．５）中における精製されたＩｇＧ１（１〜１０ｍｇ／ｍｌ）に、１〜５ｍＭの最終濃度（最終的なＤＭＳＯは２〜１０％）まで、ＤＭＳＯ中におけるＭＤＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。０．０５〜１．０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで、精製した野生型ＴＧ＿ＳＬまたはその変異体を加えた。当該反応混合物を３７℃においてインキュベートする。反応後に、フェニル疎水性相互作用カラム（ＰＨＩＣ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ）を使用してＨＰＬＣを行った。反応の開始時、生成物は、ＩｇＧ１の１つの重鎖のみがＭＤＣとカップリングしたＤＡＲ１が支配的であった。反応が進行するに従い、ＩｇＧ１の両方の重鎖がＭＤＣとカップリングしたＤＡＲ２が、主要生成物となった。反応の終わりに向かって（ｐＨ７において０．２ｍｇ／ｍｌのｍＴＧａｓｅで８時間）、コンジュゲーション収率は，ＤＡＲ２の８０％および残存ＤＡＲ１の２０％に達し、または、試料が１０ｍＭのＴＣＥＰによって還元され、Ｃ４−１０００Ａカラム（Ｖｙｄａｃ）において分析される場合には重鎖（ＨＣ）の９０％に達した（図６を参照されたい）。ＨＣへのＭＤＣの選択的コンジュゲーションは、ＳＤＳ ＰＡＧＥにおいて可視化した（図７）。他のｍＴＧａｓｅ、例えば、ストレプトマイセス・モバラエンシス由来のＴＧ＿ＳＭ（ＡｊｉｎｏｍｏｔｏのＡｃｔｉｖａ ＴＩから精製した）なども試験した。変異体は、ＩｇＧ１に対して野生型よりも活性が高かったが、野生型ＴＧａｓｅも、高濃度（＞０．１ｍｇ／ｍｌ）においてＡＤＣ反応を触媒することができた。ＴＧ＿ＳＭ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏによって販売され、ＰｆｉｚｅｒおよびＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａによって使用される）も、高濃度において機能するが、ＴＧ＿ＳＬと比べて約３０％の活性しか有していないこともさらに見出された。
実施例３．ｍＴＧａｓｅ触媒作用による、１ｋＤａのｍＰＥＧ−ＮＨ２を用いたＩｇＧ１のペグ化
この実験は、実質的に、実施例２において説明される通りに実施した。アシルアクセプターＭＤＣに代えて、１〜２ｍＭの最終濃度のｐＨ７．０における１ｋＤａのメトキシ−ＰＥＧ−アミン（ＪｅｎＫｅｍ、米国）によってＰＥＧ化ＩｇＧ１を得た。３７℃で終夜反応させた反応物をＴＣＥＰで還元した後にＣ４カラムにおいて試料分析した結果、重鎖の９０％修飾を示した。
実施例４．固定されたｍＴＧａｓｅによって触媒される、モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）とのＩｇＧ１のコンジュゲーション
ｍＴＧａｓｅの除去を単純化して酵素の再利用を可能にするために、固定されたｍＴＧａｓｅを触媒作用において使用した。固定されたｍＴＧａｓｅのカラムの調製において、カーボネート緩衝液（ｐＨ８．３）中における１５ｍｇ／ｍｌのｍＴＧａｓｅの１ｍｌを、製造元のプロトコルに従って、１．０ｍｌ（ＧＥ）のＮＨＳ活性化ＨＩＴＲＡＰ（登録商標） ＨＰカラムそれぞれに対して使用した。１〜５ｍＭのＭＤＣを伴うＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６〜８．０）中における１〜１０ｍｇ／ｍｌの精製したＩｇＧ１の０．５ｍｌを、ＨＩＴＲＡＰ（登録商標）−ｍＴＧａｓｅカラムに注入した。当該カラムの両端を密封し、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、反応混合物をＴｒｉｓ緩衝液で溶出させた。当該カラムは、次のコンジュゲーション反応のために、１〜２０ｍＭのＴＣＥＰで再生させた。各使用後に、固定されたｍＴＧａｓｅの活性の損失はなかった。ｍＴＧａｓｅを用いない場合に得られた収率と同様に、９０％ＨＣの収率が各実施において達成された。
実施例５．ｍＴＧａｓｅによって触媒される、細胞毒素とのＩｇＧ１、２、および４のコンジュゲーション
ＭＤＣと全く同じように、アミンリンカーを有する毒素を一段階プロトコルにおいてＩｇＧ１にコンジュゲートさせることができた（図４）。リンカーは−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（リジン側鎖と同様にｎ≧４である）のように単純であるが、エチレングリコール足場の使用は、リンカー−薬物の溶解性を増加させ、コンジュゲーション反応を容易にすることができた。この実施例は、ＩｇＧ１へのＭＡＹ−ＰＥＧ４（非切断性リンカー、図８）およびＭＡＹ−ＰＶＣＬ（切断性リンカー、図９）のコンジュゲーションを実証するものである。
ＭＷ：８９６．４２Ｄａの、一級アミン基を有する延長された非切断性の直鎖状ＰＥＧリンカーを有するメイタンシン誘導体を図８に示す。ＤＭＳＯ中におけるＭＡＹ−ＰＥＧ４を、１〜２ｍＭの最終濃度まで、ＩｇＧ１（ｐＨ８．０のトリス緩衝剤中において１〜１０ｍｇ／ｍｌ）に加えた。０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌの最終濃度までｍＴＧａｓｅを加え、当該反応物を３７℃でインキュベートした。当該反応を、実施例２において説明した通りにＨＰＬＣ分析によってモニターした。一晩後、６０％の収率の修飾された重鎖を得た。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２生成物の両方が見られた（図１０）。
１２２４．５８Ｄａの分子量の、自壊性スペーサーおよび末端リジンを伴う切断性リンカーを有するメイタンシン誘導体を図９に示す。ＭＡＹ−ＰＥＧ４をＭＡＹ−ＰＶＣＬ（１．０ｍｇ／ｍｌ）に換えて、上記と同じ方法において、コンジュゲーション反応を実施した。３７℃で８時間インキュベートした後、４０％の重鎖が修飾された（図１１）。低収率は、当該薬物の低溶解度の結果と考えられる。
実施例６．抗体に対する薬物の比率（ＤＡＲ）の特定およびＩｇＧ１へのコンジュゲーション部位のマッピング
グリカン鎖の異質性に起因して、ＩｇＧ１は、その質量分析スペクトルにおいて複数のピークを示すであろう。質量分析を簡素化するために、全てのｍＡＢコンジュゲートを、ＰＮＧａｓｅＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を使用した質量分析の前に脱グリコシル化し、それにより、単一のピークが、同じ荷電のそれぞれの種に対して観察されるであろう。そうすることにより、元のグリカン結合アスパラギン（Ｎ）が、アスパルテート（Ｄ）に変換される。
ＤＡＲ１およびＤＡＲ２の質量確認。実施例５からのＩｇＧ１−ＭＡＹ−ＰＥＧ４の予想されるＤＡＲ１およびＤＡＲ２を、フェニルＨＩＣにおいて精製した。脱グリコシル化の後、試料を、１９６ウェルのスチールプレート上に滴下し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＡＢＩ ４７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、レッドウッドシティ、カリフォルニア州）において分析した。対照として、ネイキッドＩｇＧ１を使用した（ＤＡＲ０）。質量分析スペクトルは、ポジティブ高分解能質量分析リニアモードにおいて取得し、多重荷電種（二重および三重）を使用して分子量を計算した。ＭＡＹ−ＰＥＧ４薬物は、８９６Ｄａの分子量を有する。したがって、ＩｇＧ１へのＭＡＹ−ＰＥＧ４の１分子のコンジュゲーション（ＤＡＲ１）は、結果として、予想された質量と異なる８７９Ｄａ（８９６−ＮＨ３を失った分の１７＝８７９Ｄａ）が得られるであろうが、その一方で、ＩｇＧ１への２つの分子のコンジュゲーション（ＤＡＲ２）は、結果として、１７５８Ｄａの質量の違いを生じるであろう。図１０におけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルにより、ＤＡＲ１およびＤＡＲ２を確認した。
重鎖のみへのコンジュゲーションの確認。薬物分子がＩｇＧ１の重鎖（ＨＣ）にコンジュゲートし軽鎖（ＬＣ）にはコンジュゲートしていないことを確認するために、実施例５からのＩｇＧ１−ＭＡＹ−ＰＶＣＬの精製されたＤＡＲ２を脱グルコシル化し、２０ｍＭのＤＴＴによって３７℃で３０分間還元した。質量分析スペクトルは、ＡＢＩ４７００を使用してポジティブ高分解能質量分析リニアモードにおいて取得した。ＭＡＹ−ＰＶＣＬ薬物は、１２２４Ｄａの分子量を有する。したがって、重鎖への１つのＭＡＹ−ＰＶＣＬのコンジュゲーションは、結果として、予想した質量とは異なる１２０７Ｄａ（１２２４−１７＝１２０７Ｄａ）が得られるであろうが、軽鎖の分子量に違いはなかった（図１１）。その一方で、ＤＡＲ１は、質量分析スペクトルにおいて未修飾ＨＣおよびＨＣ−ＭＡＹ−ＰＶＣＬの両方のピークを有した。このことは、ＤＡＲ１が、コンジュゲートされたＨＣを１つだけ有していることを示している。
Ｑ２９５での部位特異的コンジュゲーションを検証するためのペプチドマッピング。実施例２からの精製したＤＡＲ２（ＭＤＣを含むＩｇＧ１の両重鎖）およびネイキッドＩｇＧ１を、脱グルコシル化し、還元し、アルキル化し、トリプシンやキモトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）を使用してペプチドへと消化し、逆相クロマトグラフィ（Ｃ１８）によって分離した後、質量分析を行った。消化されたペプチドは、３２８ｎｍ（ＭＤＣのλｍａｘ）でのＵＶ吸収によってＨＰＬＣにおいてモニターした。３２８ｎｍの１つだけのピークが、ＤＡＲ２試料において同定されたが、その一方で、対照抗体ではピークは検出されなかった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、そのピークを、ちょうど１つのＭＤＣを伴う、グルタミン２９８（配列のＱ２９８、Ｋａｂａｔ番号付け方式ではＱ２９５）を含有する、トリプシン消化に由来するＥＥＱＹＤＳＴＹＲまたはキモトリプシン消化に由来するＮＡＫＴＫＰＲＥＥＹの単一荷電されたペプチドとして同定した（１５０８．７（実測）−１１９０．５（ペプチド）＋３３５（ＭＤＣ）−１７（ＮＨ３）＝３１８Ｄａ；１６８１．９（実測）−１３６３．６（ペプチド）＝３１８）（表１の灰色の行）。追加のコンジュゲーション部位としての他のグルタミン（Ｑ２９８以外）を排除するために、未修飾ＩｇＧ１およびＩｇＧ１−ＭＤＣコンジュゲートを使用して、完全ペプチドマッピング実験を実施した。消化された試料を、精製することなく直接分析して、重鎖の全てのグルタミン含有ペプチドを同定した。１６全てのグルタミンのうち、Ｑ２９８は、ＭＤＣが結合した唯一のコンジュゲーション部位であり（表１）、その一方で、他の全てのグルタミン含有ペプチドは、非荷電のままであった。
実際の細胞毒素が使用された場合のＩｇＧ１上の特定のコンジュゲーション部位としてＱ２９８を確認するために、ＭＡＹ−ＰＥＧ４およびＴＡＭ１（アミンリンカーを有するチューブリシンＡ誘導体）のＩｇＧ１コンジュゲートを脱グルコシル化し、還元し、アルキル化し、トリプシンを使用してペプチドへと消化し、逆相クロマトグラフィによって分離した後、質量分析を行った。Ｑ２９８を含む同じペプチドＥＥＱＹＮＳＴＹＲが、付着した１つの薬物分子に対応する質量を伴うＩｇＧ１−ＴＡＭ１およびＩｇＧ１−ＭＡＹ−ＰＥＧ４コンジュゲートの両方において同定された：それぞれ、２１３４．０（１１９０．５＋９６０．５−１７）および２０６９．８（１１９０．５＋８９５．５−１７）（表２）。
実施例７．ｍＴＧａｓｅによって触媒されるＩｇＧサブクラスのコンジュゲーション
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）中における１〜１０ｍｇ／ｍｌの精製したヒトＩｇＧ２またはＩｇＧ４を、２〜５ｍＭのＭＤＣと反応させた後、０．１〜１ｍｇ／ｍＬの精製したｍＴＧａｓｅを加えた。当該混合物を３７℃において８〜１６時間インキュベートし、次いで、フェニル疎水性相互作用カラムにおいて分析するか、またはＣ４カラムにおいて１０ｍＭのＴＣＥＰによって還元した。ＩｇＧ１と同様に、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４をＭＤＣとコンジュゲートしたところ、時間と共にＤＡＲ１およびＤＡＲ２の蓄積を示した（図６）
実施例８．ｍＴＧａｓｅを使用して抗体薬物コンジュゲートを調製する二段階プロトコル
一段階コンジュゲーション反応は単純で容易であるが、収率は、薬物の溶解性に影響される。薬物濃度が低い場合、脱アミド化の副産物を無視することができない。脱アミド化を抑制するために、化学ハンドルを含む高可溶性アミンを、ｍＴＧａｓｅによって触媒される第一段階コンジュゲーションにおいて、過剰（化学ハンドル：ｍＡＢのモル比＞１０）に使用した。次いで、第二段階において化学選択的連結反応によって、薬物分子をｍＡＢに架橋させた（図５）。以下の多くの化学選択的対を使用することができる。
アミノオキシー／アルデヒドまたはケトン
スルフヒドリル／マレイミド
アジド／アルキン
アミノプロピルアセタールを介したｍＴＧａｓｅによるＰＥＧのＩｇＧ１コンジュゲーション。ｐＨ７．０〜８．０のＴｒｉｓ緩衝液中における１〜１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ１に、２〜５０ｍＭの最終濃度まで３−アミノプロピオンアルデヒドジエチルアセタール（ＣＡＳ＃４１３６５−７５−７）を加え、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌまでｍＴＧａｓｅを加えた。反応が完了に達するまで、当該反応混合物を３７℃で２〜１６時間インキュベートした。過剰なアセタールを除去するために透析ろ過を行った後、ギ酸またはＨＣｌによって、室温で２〜１０時間においてｐＨを２〜４に調節することにより、アルデヒド基を再生させる。ＩｇＧ１−アルデヒドのｐＨを炭酸ナトリウムによって再び５〜８に調節する。アミノ−オキシ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）を、ＩｇＧ１（モル比）と５０〜１００ｍＭのアニリンもしくは１０ｍＭの５−メトキシアントラニル酸の触媒の３〜４倍まで加える。室温で終夜インキュベートした後、ＩｇＧ１−（ＰＥＧ２０ｋ）２は９５％の収率に達した。
アミン−アジドを介したｍＴＧａｓｅによる薬物のＩｇＧ１コンジュゲーション。ｐＨ７．０〜８．０のＴｒｉｓ緩衝液中における１〜１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ１に、２〜５０ｍＭの最終濃度まで３−アジド−１−プロパンアミン（ＣＡＳ＃８８１９２−１９−２）を加え、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌまでｍＴＧａｓｅを加える。当該反応混合物を３７℃で２〜１６時間インキュベートした。収率は１００％に達した。過剰なアジドプロピルアミンを除去するために透析ろ過を行った後、ＤＢＣＯ−メイタンシンを、ＩｇＧの３倍（モル比による）まで加えた。ＩｇＧ１−（メイタンシン）２の収率は９５％を超えた。
実施例９．ｍＴＧａｓｅによって調製されるＡＤＣ効力を評価するためのインビトロ細胞アッセイ
ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、９６ウェルの黒色透明底プレートに１０ｋ細胞／ウェルにおいて播種し、２４時間培養した。三連において、細胞を、２倍に連続的に希釈した抗体薬物コンジュゲートによって９６時間処理した。細胞生存率を、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ（商標） Ｂｌｕｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ウィスコンシン州）によって特定した。相対的細胞生存率を、未処理の対照の割合として特定した。ＸＬｆｉｔからの４パラメータロジスティックモデルを使用して、ＩＣ５０を計算した。表３は、抗体に対する薬物の比率と、様々なトラスツズマブ−薬物コンジュゲートを使用したＳＫ−ＢＲ−３細胞でのＩＣ５０を示している。
実施例１０．安定な非切断性リンカーを用いてｍＴＧａｓｅにより調製される部位特異的ＡＤＣは、異種移植マウスにおいて非常に安定で強力である
トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍｌ）およびモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）を、９種の非切断性のＰＥＧリンカー（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ（ｘ＝２、４、６、８、１０、１２、１６、２０、および２４、図１２）のそれぞれを用いて、実施例５において説明されるように、それぞれコンジュゲートさせた。ＡＤＣは、プロテインＡカラムによって精製し、ｍＴＧａｓｅおよび過剰なＭＭＡＥを除去した。還元されたＡＤＣ試料をＣ４カラムを使用してＨＰＬＣにおいて分析した場合、平均ＤＡＲは約１．９である。ＳＫ−ＢＲ−３細胞ベースのアッセイにおいて、これらのＡＤＣは全て強力で、３８〜１４８ｐＭのＩＣ５０を有する（表４）。
トラスツズマブ−ＭＭＡＥコンジュゲートの６種を、ＢＴ４７４異種移植マウスを使用したインビボ試験のために選択した。各雌の無胸腺ヌードマウス（４週齢、１８〜２２ｇ、Ｈａｒｌａｎ）に対し、細胞注入の２〜３日前に、１つのエストロゲン３ｍｍ（６０日の緩慢な放出、 Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）錠剤を与えた。最終５０００〜６０００万細胞／ｍｌまでＢＴ４７４細胞を再懸濁させ、マトリゲルと１：１で混合し、次いで、２００μｌを、各マウスの側部に皮下注入した。３週間後に腫瘍体積（１／２×Ｌ×Ｗ×Ｈ）が約２００ｍｍ３に達したとき、処置を開始する。ＡＤＣを、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度までＰＢＳ緩衝液で希釈し、１０ｍｇ／ｋｇ用量に達するように約２００μｌにおいてマウスの尾に静脈内投与した。デジタル式ノギスを使用して、腫瘍サイズを毎日測定した。リンカーＰＥＧ６および８は、ＢＴ４７４細胞ベースのアッセイにおいて最適と思われたが（表４）、インビボでの効果の違いは非常に小さい（図１３）。
６種全てのＡＤＣが強力であるため、発明者らは、血液中での安定性について、１種のＡＤＣのみについて、ＰＥＧ１２リンカーを用いて試験した。エストロゲン錠剤を使用しなかったことを除き、ＢＴ４７４異種移植マウスと同じ方法によってマウスあたり約５００万細胞を用いてＮＣＩ Ｎ８７異種移植マウスを作り出した。ＡＤＣ投与の後、マウスの尾に打鍼することによって、２１日まで１〜２日毎に２０μｌの血液試料を採取し、１２０μｌの保存緩衝液（１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１ＭのＮＨ４Ｃｌを含むＰＢＳ）と混合した。次に、総トラスツズマブおよび総ＡＤＣを、サンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。黒色ＮＵＮＣ（登録商標）マキシソープ９６プレートを、１００ｎｇ／ウェルにおいてＨｅｒ２タンパク質でコーティングした。試料をさらに、必要に応じてＰＢＳで希釈して、（トラスツズマブまたはＡＤＣのどちらかに対し）１０ｐｇから２ｎｇまでの直線検出範囲に適合させた。試料を適用し（総ｍＡＢおよび総ＡＤＣの両方の標品として新鮮なＡＤＣ希釈を使用した）、洗浄した後、ウサギポリクローナル抗トラスツズマブ（総ｍＡＢに対して）または抗ＭＭＡＥ（総ＡＤＣに対して）を二次抗体として適用し、その一方で、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｌｉｆｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を検出抗体として使用した。ＡＭＰＬＥＸ（登録商標） Ｒｅｄ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）／４−ヨードフェノール（Ｓｉｇｍａ）／Ｈ２Ｏ２混合物を、蛍光基質として使用した。プレートを、５５５ｎｍのＥｘおよび５８５ｎｍのＥｍによってＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ＧＥＭＩＮＩ（商標）において読み取った。ＡＤＣ／ｍＡｂ対時間の比率を図１４にプロットした。安定した非切断性リンカーを有する部位特異的ＡＤＣが血液中で完全に安定していることは、明確である。
実施例１１．切断性リンカーを有するｍＴＧａｓｅにより調製されるＤＡＲ２部位特異的ＡＤＣは、異種移植モデルにおいて市販のＴＤＭ−１より安定で強力である。
トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍｌ）およびＭＭＡＥを切断性ＰＥＧ３ｃリンカー（図１２）によってコンジュゲートし、実施例１０において説明されるように精製した。ＴＰ３ｃＥと命名されたこのＡＤＣは、１．９のＤＡＲおよびインビトロでの高い効力を有する（表４）。ＮＣＩ Ｎ８７異種移植モデルおよびＳＫ＿Ｏｖ３異種移植モデルの両方においてＴＤＭ−１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）と比較するためにインビボ研究を行った。ＮＣＩ Ｎ８７モデルにおいて、ＴＰ３ｃＥは、単回静脈内注入によるＴＤＭ−１より４倍有効である（図１５）。血液試料分析は、ＴＰ３ｃＥが２１日まで血液中において完全に安定していることを示しているが、ＴＤＭ−１は、５日でその毒素の５０％を失っていた（図１６）。ＳＫ＿Ｏｖ３異種移植片において、ＴＰ３ｃＥは、１５ｍｇ／ｋｇまたは８ｍｇ／ｋｇのいずれかの３週間投与により、結果として、完全な腫瘍寛解を生じたが、その一方で、ＴＤＭ−１は、１５ｍｇ／ｋｇのみにおいて有効性を示した（図１７）。
実施例１２．二段階プロセスによるｍＴＧａｓｅにより調製されるＤＡＲ４部位特異的ＡＤＣ
トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍｌ）と、１つのアミン基および２つのアジド基を有する３アームＰＥＧリンカー（１〜５ｋＤａ）の基のいずれか（図１８、上側、Ｃｏｎｊｕ−ｐｒｏｂｅおよびＪｅｎｋｅｍ）（４〜８ｍｇ／ｍｌ）とをコンジュゲートさせ、それぞれ、実施例１０において説明されるように精製した。当該抗体−リンカーコンジュゲーション反応は、Ｃ４カラムを用いてＨＰＬＣにより分析し還元した場合、＞９０％変換率に達した。
次いで、５倍モル過剰のアルキン−ＰＥＧ４ｃ−ＭＭＡＥ（図１８、下側）を、０．１〜１ｍＭのＣｕＳＯ４および１〜５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムの存在下において１０〜３００分間、上記の生成物の１つであるトラスツズマブ−３アームＰＥＧ（１ｋＤａ）（１〜１０ｍｇ／ｍｌ）にカップリングさせた。次いで、ＴＰ６ＴＰ４ｃＥと命名された最終ＤＡＲ４ ＡＤＣ生成物を、実施例１０において説明されるようにプロテインＡによって精製し、Ｃ４カラムを使用してＨＰＬＣによって特定した場合、実際のＤＡＲは３．８であった。ＴＰ６ＴＰ４ｃＥのインビボ活性は、表５に示されるように、ＤＡＲ２のＴＰ３ｃＥより高い。

Claims (29)

  1. 抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基を介してコンジュゲート部分にコンジュゲートした該抗体を含む抗体薬物コンジュゲートであって、Ｆｃ領域においてグリコシル化されている抗体薬物コンジュゲート。
  2. 前記抗体薬物コンジュゲートがＦｃ領域においてＮ−グリコシル化されている、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  3. 前記抗体がヒト抗体である、請求項１または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  4. 前記抗体がヒト化抗体である、請求項１または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  5. 前記抗体の両重鎖が、前記コンジュゲート部分にコンジュゲートされている、請求項１〜４に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  6. 前記コンジュゲート部分が、前記抗体の薬物動態特性を向上させる部分、治療的部分、および診断的部分からなる群より選択される活性部分を含む、請求項１〜５に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  7. 前記活性部分が毒素である、請求項６に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  8. 前記抗体および前記コンジュゲート部分が、リンカーを介してコンジュゲートされている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  9. 前記リンカーが、切断性リンカーである、請求項８に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  10. 前記リンカーが、非切断性リンカーである、請求項８に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートを含む組成物であって、前記組成物中の抗体薬物コンジュゲートの少なくとも約５０％が、前記Ｆｃ領域においてグリコシル化されている組成物。
  12. 前記組成物中の前記抗体薬物コンジュゲートの少なくとも８０％が、１：１または１：２である前記抗体とコンジュゲート部分とのモル比を有する、請求項１１に記載の組成物。
  13. コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを製造する方法であって、該抗体薬物コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で、抗体組成物を該コンジュゲート部分に接触させる工程を含み、該組成物中の該抗体の少なくとも約５０％が、前記Ｆｃ領域においてグリコシル化されており、該コンジュゲート部分が、該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、方法。
  14. 低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを製造する方法であって、
    ａ）該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートした抗体を含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、トランスグルタミナーゼの存在下で、抗体組成物を該低分子ハンドルに接触させる工程と、
    ｂ）該中間コンジュゲートを活性部分に接触させ、それにより、該抗体薬物コンジュゲートを得る工程であって、該組成物中の該抗体の少なくとも約５０％が、Ｆｃ領域においてグリコシル化されており、該コンジュゲート部分が、該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、工程と、
    を含む方法。
  15. 前記トランスグルタミナーゼが、野生型トランスグルタミナーゼである、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 前記野生型トランスグルタミナーゼが、配列番号１６のアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記トランスグルタミナーゼが、改変トランスグルタミナーゼである、請求項１３または１４に記載の方法。
  18. 前記改変トランスグルタミナーゼが、配列番号１６に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記トランスグルタミナーゼが、少なくとも約９０％の純度を有する、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記トランスグルタミナーゼと前記抗体組成物のモル比が、約１０：１から約１：１０である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記トランスグルタミナーゼが、固体支持体に固定されている、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記抗体が、固体支持体に固定されている、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記抗体が、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記コンジュゲート部分が、前記抗体組成物の薬物動態特性を向上させる部分、治療的部分、および診断的部分からなる群より選択される活性部分を含む、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記活性部分が毒素である、請求項２４に記載の方法。
  26. Ｆｃ含有ポリペプチドをコンジュゲート部分にコンジュゲートさせることができる改変トランスグルタミナーゼであって、
    該Ｆｃ含有ポリペプチドがＮ−グリコシル化Ｆｃ領域を含み、
    該Ｎ−グリコシル化Ｆｃ領域が、Ｎ−グリコシル化部位に隣接するアクセプターグルタミン残基を含み、
    反応の際、該コンジュゲート部分が、該アクセプターグルタミン残基を介して該Ｆｃ含有ポリペプチドにコンジュゲートされ、ならびに、
    該コンジュゲーションが、同じ反応条件下において野生型トランスグルタミナーゼよりも少なくとも約１０％活性が高い、
    改変トランスグルタミナーゼ。
  27. 配列番号１６に対して少なくとも約８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む改変トランスグルタミナーゼであって、Ｄ１〜Ｅ４、Ｐ２４４〜Ｐ２４７、およびＮ２８２〜Ｌ２８５からなる群より選択される欠失を含む、改変トランスグルタミナーゼ。
  28. コンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを製造する方法であって、該抗体薬物コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、請求項２６または２７に記載の改変トランスグルタミナーゼの存在下で、抗体組成物を該コンジュゲート部分に接触させる工程を含み、該コンジュゲート部分が、該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、方法。
  29. 低分子ハンドルおよび活性部分を含むコンジュゲート部分に特異的にコンジュゲートした抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを製造する方法であって、
    ａ）該低分子ハンドルに特異的にコンジュゲートした抗体を含む中間コンジュゲートを生じるのに十分な条件下において、請求項２６または２７に記載の改変トランスグルタミナーゼの存在下で、抗体組成物を該低分子ハンドルに接触させる工程と、
    ｂ）該中間コンジュゲートを活性部分に接触させ、それにより、抗体薬物コンジュゲートを得る工程であって、該コンジュゲート部分が、該抗体上の内因性アクセプターグルタミン残基にコンジュゲートされる、工程と、
    を含む方法。
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