JP2023526450A - グリコシル化Ｆｃドメインを含むタンパク質の部位特異的コンジュゲーションのための方法 - Google Patents

グリコシル化Ｆｃドメインを含むタンパク質の部位特異的コンジュゲーションのための方法 Download PDF

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Abstract

本明細書では、トランスグルタミナーゼによるグリカン無傷抗体の部位特異的コンジュゲーションのための方法が提供される。特定の実施形態によれば、反応条件は、抗体脱グリコシル化を必要とせずに効率的かつ迅速なコンジュゲーションを可能にする低イオン強度条件に維持又は低減される。コンジュゲーション方法に関連する医薬組成物及び使用も記載される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２０年５月２０日出願の米国仮出願第６３／０２７，４００号の優先権の利益を主張するものであり、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(配列表)
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みである、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年４月２７日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、名称がＪＢＩ６３０３ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１２，２８８バイトである。
（発明の分野）
本発明は、より良好な製造性及びインビボ特性を有する最適化された抗体－薬物コンジュゲート（antibody-drug-conjugate、ＡＤＣ）を生成するための最適化された緩衝液条件下でのトランスグルタミナーゼによるグリカン無傷抗体の部位特異的コンジュゲーションのための方法に関する。
モノクローナル抗体（monoclonal antibody、ｍＡｂ）などの大きなタンパク質上の特定の部位への分子の共有結合は、重要性が増している技術である。抗体－薬物コンジュゲートなどの部位特異的コンジュゲーションを使用する治療プラットフォームが、一層多く臨床開発に入っている。結果として、既存のアプローチを補完するか又は置き換えるための新規な方法には、大きな価値がある。
上述の部位特異的コンジュゲーションに対する１つのアプローチは、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）酵素を利用する。トランスグルタミナーゼは、微生物及びより高等な生物に代表される大きなクラスの酵素である（Ｓａｖｏｃａら、Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅ（２０１８）９（１１）：５６２）。これらの酵素は、リジンのε－アミノ基と、タンパク質のグルタミン側鎖のγ－カルボキサミド基との間の共有結合形成を触媒し、イソペプチド結合をもたらす。ＴＧａｓｅは、血液凝固、細胞外マトリックスアセンブリ、及び胞子形成を含む複数の生物学的プロセスにおいて役割を果たす。それらの自然の機能に加えて、いくつかのＴＧａｓｅは、グルタミン又はリジン側鎖の代わりに他のアミド又はアミンをそれぞれ使用し、それによって小分子基質のタンパク質への共有結合コンジュゲーションを触媒することができる。例えば、それらは、薬物の第一級アミンをタンパク質又はペプチドのグルタミン残基の側鎖カルボキシアミド基にコンジュゲートさせ、薬物とタンパク質又はペプチドとの間にイソペプチド結合を形成することができる。
Ｓ．モバレンシス（S.mobarensis）由来の微生物ＴＧａｓｅ（microbial TGase、ＭＴＧ）は、小分子のタンパク質側鎖への共有結合コンジュゲーションに特に有用であることが証明されている。ＭＴＧは、組換えヒトＩＬ２（Ｓａｔｏ、Ａｄｖａｎｃｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｒｅｖｉｅｗｓ（２００２），５４（４）：４８７～５０４）、インターフェロン（Ｓｐｏｌａｏｒｅら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１６）、２７（１１）：２６９５～２７０６）及びヒト成長ホルモン（Ｍｅｒｏら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１１）、１５４（１）：２７－３４）を含む様々なタンパク質へのＰＥＧの付加を、タンパク質のグルタミン側鎖とのコンジュゲーションのためにアミン修飾ＰＥＧを使用することによって、又はタンパク質のリジン側鎖へのコンジュゲーションのためにＧｌｎ含有ジペプチドで修飾されたＰＥＧを使用することによって触媒することが示されている。いずれの場合も、ＰＥＧを１つのみの又は小さなサブセットのＧｌｎ又はＬｙｓ側鎖に選択的に添加した。Ｓ．モバラエンシス（S. mobaraensis）微生物ＴＧａｓｅ（ＭＴＧ）の基質特異性は十分に理解されていないが、様々な研究がグルタミン基質に対するある程度の配列選択性（Ｓｕｇｉｍｕｒａら、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ（２００８）、４７７（２）：３７９～３８３）及び二次構造へのある程度の依存性（Ｓｐｏｌａｏｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１２）、５１（４３）：８６７９－８６８９）を示している。現在、ＭＴＧが特定のタンパク質の選択的コンジュゲーションに使用できるかどうかを判定するために、典型的には経験的アプローチが使用されている。
ＭＴＧは、小分子を特異的部位でモノクローナル抗体に選択的にコンジュゲートするために使用されてきた。２つの異なるアプローチが、ｍＡｂ上のＧｌｎ側鎖へのアミン含有ペイロードのコンジュゲーションについて実証されており、１つはタグ付けアプローチを使用し、もう１つは特定のＧｌｎ残基が特定の条件下で良好なＭＴＧ基質であり得るという偶然に見出した発見を利用する。リジン側鎖へのＧｌｎ含有ペイロードのコンジュゲーションのためのタグベースのアプローチも記載されてきた。
Ｊｅｇｅｒらは、放射性免疫コンジュゲートを調製する過程で、ＭＴＧによるｍＡｂの修飾速度が、Ａｓｎ２９７のＮ結合グリカンが無傷である場合よりも脱グリコシル化抗体ではるかに速いこと（Ｊｅｇｅｒら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ（２０１０）、４９（５１）：９９９５－９９９７）、及び修飾がｍＡｂ上の１つの特定のＧｌｎ部位に高度に特異的であることを実証した。コンジュゲーション部位は、Ｇｌｎ２９５であると特定され、これは、全てのヒトＩｇＧアイソタイプにわたって保存されており、グリコシル化部位から２つ上流の残基であるＣＨ２ドメイン中の位置である。それ以来、脱グリコシル化とそれに続くＧｌｎ２９５へのＭＴＧ触媒コンジュゲーションは、抗体－放射性コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート及び他の分子を調製するための従来的なアプローチとなっている。ＭＴＧ駆動コンジュゲーション法は、抗体操作を必要としないが、このアプローチのコンジュゲーションは、Ａｓｎ２９７におけるグリカンの除去を必要とする。Ａｓｎ２９７におけるグリカンの除去は、Ｆｃ受容体への結合が抑制されることから、抗体の免疫学的特性に影響を及ぼすことが示されており、また、グリカン除去後の最大７～８℃のＣＨ２ドメインの融解温度の低下を伴う熱安定性の低下が観察されたことから、抗体の生物物理学的特性に影響を及ぼすことが示されている。
トランスグルタミナーゼとの部位選択的ｍＡｂコンジュゲーションのためのタグベースの方法も実証されている。ｍＡｂ中の特定の位置に「Ｑ－タグ」－ＬＬＱＧなどの短いＧｌｎ含有ペプチド－を付加又は挿入すると、脱グリコシル化を必要とせずにタグでの選択的コンジュゲーションが可能になることが示された（Ｓｔｒｏｐら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２０１３）、２０（２）：１６１－１６７）。好ましいアプローチは、外因性ペプチド配列の付加によってｍＡｂ軽鎖及び重鎖のＣ末端にＱタグを導入することであった。同様のアプローチが、ｃ－ｍｙｃタグを使用して記載されている（Ｄｅｎｎｌｅｒら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ（２０１５）、１６（５）：８６１－８６７）。
部位特異的コンジュゲーションは、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）分野において重要な焦点領域となっており（Ａｇａｒｗａｌ，Ｐ．及びＣ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，（２０１５）、２６（２）：１７６－９２）、ＡＤＣの有効性及び安全性の両方が、ランダムなコンジュゲーションと比較して部位特異的方法で向上され得ることが実証されている。
しかしながら、例えば、Ｎ結合グリカンを保存し、Ｇｌｎ含有ペプチドタグを導入しない、コンジュゲート抗体の免疫学的及び生物物理学的特性を保存する抗体の部位特異的コンジュゲーションの効率的な方法は、安全かつ有効なＡＤＣを生成するために依然として必要とされている。
本明細書では、抗体脱グリコシル化を必要としない、抗体の部位特異的コンジュゲーションのための方法が提供される。いくつかの実施形態では、本発明は、コンジュゲート抗体を生成する方法であって、低イオン強度条件においてトランスグルタミナーゼの存在下で、グリコシル化抗体又はグリカン無傷抗体又はＦｃ融合タンパク質をアミン化合物と反応させることを含む、方法を提供する。
一態様では、グリコシル化抗体のコンジュゲーションのための方法が本明細書で提供される。本方法の一実施形態は、グリカンの存在にもかかわらず、第一級アミンと抗体との反応を可能にする低イオン強度条件下においてトランスグルタミナーゼの存在下で、グリカン無傷抗体を第一級アミン化合物と接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、抗体はグリコシル化される。いくつかの実施形態では、抗体はＡｓｎ２９７においてグリコシル化される。本開示は、低イオン強度緩衝液条件がグリコシル化抗体のコンジュゲーションを可能にし、従来のコンジュゲーション方法で必要とされる予備的な脱グリコシル化工程を必要としないという発見に基づく。
本方法の実施形態は、アミン化合物と反応させる前にトランスグルタミナーゼ調製物及び／又は抗体調製物のイオン強度を低減させて、低イオン強度トランスグルタミナーゼ調製物及び／又は抗体調製物を提供することを更に含む。この追加の工程は、抗体及び／又は微生物トランスグルタミナーゼ調製物が高イオン強度緩衝液中で提供されるか、又はトランスグルタミン化反応の速度に影響を及ぼす不要な添加剤を含有する場合に好ましい。
特定の実施形態では、低イオン強度条件は、１０ｍＭ以下のリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、又はＴｒｉｓ緩衝液を含む。別の態様では、得られたコンジュゲート抗体の標識度（degree of labeling、ＤＯＬ）は、少なくとも１．８である。いくつかの実施形態では、ＤＯＬは２である。
上述の「発明の概要」及び以降の「発明を実施するための形態」は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明は、図面に示される正確な実施形態に限定されない点を理解する必要がある。
異なる反応緩衝液組成物における、無傷の脱グリコシル化トラスツズマブへの３－ＡＰＡのＭＴＧ触媒コンジュゲーションの速度を示す。重鎖当たりの標識度（ＤＯＬ）を時間の関数として示す。 グリカン－無傷トラスツズマブのペプチドマッピングを示す。トラスツズマブをトリプシンで消化し、ペプチドをＬＣ－ＭＳによって分析した。Ｇｌｎ２９５グリコシル化Ｇｌｎ２９５を含有するＨＣペプチド２８９－３１７に対応するピークは、２８．６５分の保持時間を示す。 ２５～３５分のＬＣトレースの拡大バージョンを示し、無傷のｍＡｂ中のＧｌｎ２９５アミノ酸を含むピークを強調している。 ３－ＡＰＡで修飾されたグリカン－無傷トラスツズマブのペプチドマッピングを示す。３－ＡＰＡ付加部位を、トリプシン消化とそれに続くＬＣ－ＭＳ分析によって特定した。無傷の試料で観察されたグリコシル化Ｇｌｎ２９５の部位を含むＨＣペプチド２８９－３１７に対応するピーク（保持時間２８．６５分）は、アジドコンジュゲート試料には存在せず、Ｇｌｎ２９５位置に＋８３Ｄａ修飾を有するＨＣ ２８９－３１７に対応するペプチド（保持時間３０．３分）で置き換えられている。 ２５～３５分のＬＣトレースの拡大バージョンを示し、アジドコンジュゲート抗体中のＧｌｎ２９５アミノ酸を含むピークを強調している。 低イオン強度法によって製造されたアジドコンジュゲートトラスツズマブ（グリコシル化トラスツズマブ－３ＡＰＡ）及び脱グリコシル化法によって製造されたアジドコンジュゲートトラスツズマブと比較した、無傷のトラスツズマブ（グリコシル化トラスツズマブ）の融解温度を示す。 低イオン強度法によって製造されたアジドコンジュゲートトラスツズマブ（グリコシル化トラスツズマブ－３ＡＰＡ）及び脱グリコシル化法によって製造されたアジドコンジュゲートトラスツズマブと比較した、無傷のトラスツズマブ（グリコシル化トラスツズマブ）の凝集温度を示す。 確立されたトランスグルタミナーゼ法によって、又はグリカン－無傷ｍＡｂを使用した低塩反応条件下で脱グリコシル化トラスツズマブで生成されたトラスツズマブ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＭＭＡＦ（Ｔ－ｖｃＭＭＡＦ）薬物コンジュゲートの殺細胞活性を比較する。ＳＫ－ＢＲ３細胞を様々な濃度のコンジュゲートで７２時間処理し、殺細胞をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏアッセイによって測定した。
背景技術において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
本明細書全体を通して、抗体定常領域のアミノ酸残基の付番は、本明細書に別途明示的に記載のない限り、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載のＥＵインデックスに従う。
本明細書に引用される全ての参照（特許出願、特許又は文献を含む）は、その全体を参照することにより、それぞれの個別の文献又は特許若しくは特許出願書があらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示した場合と同程度にあらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
用語
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用することができるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が使用される。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上必要としない限り、「含む（comprise）」という用語並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、指定の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。本明細書で使用するとき、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」又は「含む（including）」という用語に置き換えることができ、又はときに本明細書で使用するとき、「有する（having）」という用語に置き換えることもできる。
移行句「備える／含む（comprising）」、「から本質的になる（consisting essentially of）」、及び「からなる（consisting）」は、特許用語において概ね受け入れられている意味を含意することを意図しており、すなわち、（ｉ）「備える／含む（comprising）」は、「含む」、「含有する」、又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非制限的なものであり、その他の列挙されていない要素又は方法工程を除外するものではなく、（ｉｉ）「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲において特定されていない、あらゆる要素、工程、又は成分を除外し、並びに（ｉｉｉ）「から本質的になる」は、特定される材料又は工程、並びに、特許請求される発明の「基本的かつ新しい特徴（複数可）に実質的に影響しないもの」に、特許請求の範囲の範囲を制限する。語句「備える／含む（comprising）」（又はその同等語）を伴って記載される実施形態はまた、「からなる」及び「から本質的になる」を伴って独立して記載される実施形態として提供する。
本明細書で使用するとき、「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲の要素において指定されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書で使用するとき、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又はステップは除外しない。本発明の態様又は実施形態に関連して本明細書で使用するとき、本開示の範囲を変化させるために、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」、及び「有する」という上記用語のいずれかを、用語「からなる」又は「から本質的になる」に置き換えることができる。
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしの第１の要素の適用性を指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。
「抗原結合断片」又は「抗原結合ドメイン」は、抗原に結合するタンパク質の一部を指す。抗原結合断片は、合成ポリペプチド、酵素的に入手可能なポリペプチド、又は遺伝的に操作されたポリペプチドであってよく、これには、抗原に結合する免疫グロブリンの一部、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ及びＶＬ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ及びＦｖ断片、１つのＶＨドメイン又は１つのＶＬドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、ＶＨＨドメイン、ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４部分などの抗体のＣＤＲを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニット、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及び／又はＨＣＤＲ３、並びにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び／又はＬＣＤＲ３、抗原に結合するオルタナティブスカフォールド、並びに抗原結合断片を含む多重特異性タンパク質が挙げられる。抗原結合断片（ＶＨ及びＶＬなど）は、合成リンカーを介して互いに連結して、ＶＨ及びＶＬドメインが別々の一本鎖により発現された場合にＶＨ／ＶＬドメインが分子内又は分子間で対合して一価の抗原結合ドメイン、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又はダイアボディを形成することができる、様々な種類の一本鎖抗体設計を形成することができる。抗原結合断片はまた、二重特異性及び多重特異性タンパク質を遺伝子操作するために、単一特異性又は多重特異性であり得る他の抗体、タンパク質、抗原結合断片、又はオルタナティブスカフォールドにコンジュゲートされてもよい。本明細書で使用するとき、用語「抗原結合フラグメント」は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ若しくは２つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部分から形成される多重特異的抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントを指す。抗原結合断片は、親抗体又は親抗体断片が結合する同じ抗原に結合することができる。
本明細書で使用するとき、用語「単鎖抗体」は、約１５～約２０個のアミノ酸の短いペプチドによって接続される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、この分野において従来既知の単鎖抗体を指す。本明細書で使用するとき、用語「単一ドメイン抗体」は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むか、又は重鎖可変領域のみを含む、この分野において従来既知の単一ドメイン抗体を指す。
本明細書で使用する場合、用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は広い意味で用いられ、ポリクローナル抗体を含む免疫グロブリン又は抗体分子、マウス、ヒト、ヒト適合、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体、並びにそれらの抗原結合フラグメントを含むモノクローナル抗体を含む。
一般に抗体とは、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖であり、本明細書では「標的」と称される。抗体の構造は、公知である。無傷の「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（参照によりその全体があらゆる目的のために組み込まれる）を参照されたい。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。免疫グロブリンは、重鎖定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ（κ）及びラムダ（λ）のうちの一方に割り当てることができる。したがって、本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖定常ドメインを含有することができる。特定の実施形態に従うと、本発明の抗体は、マウス抗体又はヒト抗体の重鎖及び／又は軽鎖定常領域を含む。４つのＩｇＧサブクラスのそれぞれは、エフェクター機能として既知の異なる生物学的機能を有する。これらのエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用によって、又はＣ１ｑの結合及び補体の固定によって媒介される。ＦｃγＲへの結合は、抗体依存性細胞媒介性細胞溶解をもたらし得るが、補体因子への結合は、補体媒介性細胞溶解をもたらし得る。本発明に有用な抗体は、エフェクター機能を有さないか又は最小であってもよいが、ＦｃＲｎに結合するその能力を保持する。「完全長抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された、２本の重鎖（ＨＣ）及び２本の軽鎖（ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えばＩｇＭ）から構成される。
用語「Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｃ末端融合又はＮ末端融合によって目的のタンパク質又はペプチドに連結された少なくとも１つのＦｃポリペプチドを含む融合タンパク質を指し、Ｆｃ融合タンパク質のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメイン配列を含む。
本明細書で使用するとき、「操作された抗体」という用語は、少なくとも１つの操作された定常領域、例えば、操作されたＦｃ領域、操作されたＣκ領域、及び／又は操作されたＣλ領域を含む、抗体又はその断片を指す。操作された抗体は、１つ以上の変異、１つ以上のアミノ酸残基欠失、又は１つ以上のアミノ酸挿入を含むことができる。
用語「グリカン」は、多糖又はオリゴ糖を指す。グリカンはまた、抗体などの糖コンジュゲートの炭水化物部分を指すために使用される。Ｏ結合グリカン及びＮ結合グリカンは、真核生物において非常に一般的である。Ｎ結合グリカンは、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ配列又はＡｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ配列においてアスパラギンのＲ基窒素（Ｎ）に結合していることが見出されており、Ｘは任意のアミノ酸である。
用語「エキソ－グリコシダーゼ」又は「エキソグリコシダーゼ」は、グリカン構造の末端グリコシド結合を加水分解することができる酵素を指す。好適なエキソ－グリコシダーゼの例としては、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルファ－フコシダーゼ、アルファ－マノシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。用語「エンド－グリコシダーゼ」又は「エンドグリコシダーゼ」は、グリカン構造の末端残基ではない残基間のグリコシド結合を加水分解することができる酵素を指す。エンド－グリコシダーゼは、グリカン全体の内部部位からグリカン結合をランダムに加水分解する。例としては、エンド－Ｈ、エンド－Ｆ３、エンド－Ｆ２、及びエンド－Ｆ１が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「脱グリコシル化抗体」は、Ｎ２９７のグリカン基が除去され、それによってＱ２９５がトランスグルタミナーゼとのコンジュゲーションを開始した抗体を指す。当該技術分野で既知の従来のコンジュゲーション方法は、トランスグルタミナーゼとのコンジュゲーションの前にＮ２９７でグリカンを除去するためのこの脱グリコシル化プロセスを包含する方法を提供する。「グリコシル化抗体」又は「グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質」は、それぞれ、位置Ｎ２９７及び／又は他の残基にＮ結合グリカンを有する抗体又はＦｃ融合タンパク質を指す。
本明細書で使用するとき、「抗体グリカン」という用語は、モノクローナル抗体重鎖のＦｃ領域内の位置Ａｓｎ２９７にあるＮ結合グリカンを指す。
用語「グリカン無傷抗体」又は「無傷抗体」又は「自然抗体」は、無傷のグリカン含有量を有し、そのグリカン含有量が自然抗体と比較して変化しない抗体分子を指す。グリカン無傷抗体は、グリカンがエンド－グリコシダーゼ又はエキソ－グリコシダーゼ（例えば、限定されないが、ＰＮＧａｓｅ Ｆ若しくはエンドＦ）によって加水分解されていない抗体であるか、又はグリカン操作によって修飾されていない抗体（すなわち、グリカンを還元すること、又は天然若しくは非天然の糖のいずれかをグリカンに付加することなどによって抗体が「グリカン操作されて」いない）である。グリカン無傷抗体では、異種Ｎ結合グリカンがモノクローナル抗体重鎖のＦｃ領域のＣＨ２ドメイン内の位置２９７（Ｎ２９７）のアスパラギンに結合している。
ＩｇＧのＦｃ領域は、アスパラギン（Ａｓｎ）２９７の単一の保存されたグリコシル化部位に結合した、重鎖当たり１つずつの２つのグリカンを含有している。各グリカンは、体液性免疫を微調整する機会を与える多様性である３０を超える異なる形態をとることができる。グリカンには３つの主要なクラスがあり、それぞれ末端ガラクトースの数０、１、又は２に応じて、Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２である。末端ガラクトースに加えてコアフコースを含む複合型オリゴ糖は、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ（例えば、Ｇ２Ｆは２つの末端ガラクトース及びコアフコースを指す）として記載される。末端ガラクトースを欠くグリコフォーム（Ｇ０と称され、０ガラクトースを示す）は、補体を固定し、活性化ＩｇＧ受容体ＦｃγＲＩＩＩａに係合する能力を高めると同時に、シアル化及び／又はビガラクトシル化（Ｇ２）グリカンを介して媒介される抗炎症機構を遮断する能力を高めるので、特に炎症促進性である。他の小さな形態のグリカンとしては、Ｇ０Ｆ（ガラクトースなし、バイセクトＮ－アセチルグルコサミンなし、コアフコースあり）、及びＧ１Ｆ（α１，６アーム又はα１，３アームのいずれかに結合したガラクトース）が挙げられる。
用語「コンジュゲート抗体」又は「コンジュゲート」は、１つ以上の化学的部分に共有結合した抗体を指し、用語「コンジュゲートＦｃ融合タンパク質」は、１つ以上の化学的部分に共有結合したＦｃ融合タンパク質を指す。抗体又はＦｃ融合タンパク質に共有結合している化学的部分は、リンカー、反応性リンカー、アミンリンカー、ペイロード、反応性ペイロード、アミンペイロード、及び／又は反応性リンカー－ペイロードを含み得る。
本明細書で使用するとき、用語「抗体－ペイロードコンジュゲート」、「反応性ペイロード」、「コンジュゲート」又は「抗体薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」という用語は、本明細書で「ペイロード」と呼ばれる細胞傷害性の又は細胞質ゾルの薬物／薬剤、毒素又は放射性核種に化学的に連結されており、腫瘍特異的又は腫瘍関連の細胞表面抗原に結合することができる抗体又はその断片を指す。典型的には、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、安定したリンカー系を介して抗がん薬をｍＡｂに共有結合させることによって形成される。例えば、腫瘍細胞の死滅は、薬物コンジュゲートが腫瘍細胞に結合し、薬物部分の細胞傷害活性を解除又は／及び促進すると起こり得る。薬物コンジュゲートによってもたらされる選択性は、正常細胞に対する毒性を最小限に抑え、それによって患者における薬物の忍容性を高める。
本開示を考慮して、当業者に既知の任意の好適なペイロードを本発明で使用することができる。ペイロードは、例えば、薬物／薬剤、リンカー、クリック反応パートナーなどであり得る。特定の実施形態によれば、ペイロードは、例えば、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、ビオチン、リンカー、又は第１のクリック反応パートナーであり得る。
本明細書で使用するとき、「医薬組成物」は、少なくとも１つの活性医薬成分（active pharmaceutical ingredient、ＡＰＩ）を含む組成物を指す。本発明での使用に好適なＡＰＩの例は、コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質である。医薬組成物中のＡＰＩ以外の成分は、１つ以上の賦形剤を含み得る。好ましくは、賦形剤は、実質的に又は完全に薬学的に不活性である。
本明細書で使用するとき、「共有結合した」という用語は、ペイロードが少なくとも１つの共有結合を介して抗体に結合していることを意味する。結合は、直接、すなわちリンカーを含なくてもよく、又は間接的に、すなわちリンカーを介してもよい。
本明細書で使用するとき、用語「リンカー」は、２つの分子を結合する化学的部分を指す。本開示を考慮して、当業者に既知の任意の好適なリンカーを本発明で使用することができる。リンカーは、例えば、単一の共有結合、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、ペプチドリンカー、糖系リンカー、又はジスルフィド結合、若しくはバリン－シトルリン－ＰＡＢなどのプロテアーゼ開裂部位などの開裂可能なリンカーであり得る。
本明細書で使用するとき、「アミン含有ペイロード」という用語は、１つ以上の反応性アミン（例えば、第一級アミン）を含有するペイロードを指す。例えば、アミン含有ペイロードは、アミン供与体ユニット（例えば、第一級アミンＮＨ２）、リンカー（例えば、アミン供与体ユニットに連結され、小分子、ポリペプチド、若しくは生体適合性ポリマーなどのペイロードに結合するための更なる機能性を有する分子）、及び薬剤部分（例えば、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、ビオチン、リンカー、又は第１のクリック反応パートナーなどのペイロード）を含むことができる。アミン含有ペイロードはまた、１つ以上の反応性リジン、Ｎ末端、又は反応性アミンを含有するポリペプチド（例えば、抗体）又は生体適合性ポリマーであり得る。
用語「薬物対抗体比」又は「ＤＡＲ」は、ＡＤＣの抗体に結合した薬物、例えば３－ＡＰＡの数を指す。抗体部分当たりの結合した薬物分子の数又は標識度は、当該技術分野で一般的に使用されるパラメータであり、「薬物－抗体比」の略である「ＤＡＲ」と呼ばれる。ＡＤＣのＤＡＲは、１～８の範囲であり得るが、抗体上の結合部位の数に応じて、より高い負荷量、例えば１０も可能である。ＤＡＲという用語は、個々の抗体に負荷された薬物の数に関して使用され得る。ＤＡＲ２は、薬物負荷種が２つであることを指す。生物学的試料中のＤＡＲの挙動は、ＡＤＣの安定性を表す。２つの試料間のＤＡＲの減少は、ＡＤＣの安定性を表す。
用語「ＤＯＬ」又は「標識度」は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の抗体の重鎖当たりの、共有結合的にコンジュゲートされた標識、例えば３－ＡＰＡの数を指す。ＤＯＬは、１～８の範囲であり得るが、抗体上の結合部位の数に応じて、より高い負荷、例えば１０も可能である。ＤＯＬという用語は、個々の抗体に負荷された薬物の数に関して使用され得る。ＤＯＬ２は、標識度が２であることを指す。標識度は、当該技術分野で一般的に使用されるパラメータである。「置換度」又は「ＤＯＳ」という用語は、ＤＯＬと互換可能に使用することができる。標識度は、質量分析、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法、又は逆相ＨＰＬＣ及び疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法によって実験的に測定される。部位特異的標識法のための所望のＤＯＬは、多くの場合、標識が所望の部位を完全に占有し、他の部位にはない。例えば、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含み、各重鎖がＧｌｎ２９５コンジュゲーション部位を含む典型的な抗体の場合、最適なＤＯＬは、抗体の両方のＧｌｎ２９５残基が薬物分子に完全にコンジュゲートしている２のＤＯＬである。
用語「反応性基」は、別の化学基と反応して共有結合を形成することができる、すなわち好適な反応条件下で共有結合反応性であり、概して、別の物質の結合点を表す基を指す。
用語「低イオン強度」又は「低塩」条件は、緩衝液の塩濃度が約３０ｍＭ未満の濃度（本明細書では「低イオン強度の溶液」とも呼ばれる）に保持される、又はそうされる緩衝液条件である。塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、又は任意の種類の他の塩であり得る。低塩濃度は、約２５ｍＭ以下、又は約２４ｍＭ以下、又は約２３ｍＭ以下、又は約２２ｍＭ以下、又は約２１ｍＭ以下、又は約２０ｍＭ以下、又は約１９ｍＭ以下、又は約１８ｍＭ以下、又は約１７ｍＭ以下、又は約１６ｍＭ以下、又は約１５ｍＭ以下、又は約１４ｍＭ以下、又は約１３ｍＭ以下、又は約１２ｍＭ以下、又は約１１．２ｍＭ以下、又は約１１ｍＭ以下、又は約１０ｍＭ以下であり得る。低塩濃度は、例えば、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、又は約１ｍＭ～約１０ｍＭ、又は約２ｍＭ～約１０ｍＭ、又は約０．１ｍＭ～約１２ｍＭ、又は約１ｍＭ～約１２ｍＭ、又は約２ｍＭ～約１２ｍＭであり得る。低塩濃度は、例えば、２５ｍＭ、２４ｍＭ、２３ｍＭ、２２ｍＭ、２１ｍＭ、２０ｍＭ、１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭ、１１ｍＭ、１０ｍＭ、９ｍＭ、８ｍＭ、７ｍＭ、６ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、又は０ｍＭであり得る。低塩又は低イオン強度条件は、例えば、希釈による方法、又は、透析、ダイアフィルトレーション、濾過、沈殿、及び／又はクロマトグラフィー法などの緩衝液交換による方法、並びに／又は沈殿若しくは凍結乾燥などの他の方法によって達成することができるが、これらに限定されない。溶液又は調製物の「イオン強度を低減させる」方法は、当該溶液又は調製物の塩濃度を低減させることを指す。
「Ｔｍ」又は「中間点温度」は、熱変性曲線の温度中間点である。これは、アミノ酸配列の５０％がその自然のコンホメーションにあり、他の５０％が変性されている温度を指す。熱変性曲線は、典型的には温度の関数としてプロットされる。Ｔｍは、タンパク質の安定性を測定するために使用される。概して、より高いＴｍは、より安定なタンパク質の指標である。Ｔｍは、当業者に周知の方法、例えば、円偏光二色性分光法、示差走査熱量測定、示差走査蛍光測定（内因性及び外因性色素ベースの両方）、ＵＶ分光法、ＦＴ－ＩＲ及び等温熱量測定（ＩＴＣ）を用いて容易に測定することができる。
「Ｔａｇｇ」は、タンパク質が二量体化又はオリゴマー化のいずれかによって凝集し始める温度を指す。凝集温度は、凝集の開始を検出し、タンパク質が凝集する傾向を示す温度である。Ｔａｇｇは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）、又は円二色性（ＣＤ）によって測定することができる。これらの技術は、タンパク質のコンホメーションの小さな変化を検出することができ、したがって凝集の開始点を検出することができる。Ｔａｇｇ値は、Ｔｍよりも低くても高くてもよい。ＴａｇｇがＴｍよりも低い場合、タンパク質は、最初に二量体化及び／又はオリゴマー化し、次いで、Ｔａｇｇよりも高い温度で後にアンフォールディングを開始する。ＴａｇｇがＴｍよりも高い場合、タンパク質は最初にアンフォールディングし始め、次いでＴｍよりも高い温度で凝集する。いずれの事象も、一般に観察され、アミノ酸組成及びタンパク質コンホメーションに依存する。
本明細書に記載の「Ｑ２９５」又は「Ｇｌｎ２９５」は、抗体定常領域のＣＨ２ドメインに見られるＦｃコンジュゲーション部位を指す。Ｇｌｎ２９５は、トランスグルタミナーゼの基質である。特定の抗体は２つの重鎖及び２つのＧｌｎ２９５残基を有するため、トランスグルタミナーゼ抗体コンジュゲーションは、最大２．０の薬物対抗体比（ＤＡＲ）で各Ｇｌｎ２９５残基上にコンジュゲートを有する抗体を提供することができる。コンジュゲーションは、グルタミンとアミンコンジュゲートペイロードとの間で起こる。グルタミンとアミン含有ペイロードとの間の結合は、式ＣＯ－ＮＨ－のイソペプチド結合であり、ＮＨ－はリンカー及びペイロード部分に結合している。
「Ｎ２９７」又は「Ａｓｎ２９７」は重鎖Ｆｃグリコシル化部位を指す。微生物トランスグルタミナーゼを使用する従来的なコンジュゲーション方法では、この部位はコンジュゲーションの前に脱グリコシル化される。
本明細書で使用するとき、用語「トランスグルタミナーゼ」は、抗体又はその抗原結合断片中のペイロード上の遊離アミン基と、グルタミン残基の側鎖上のアシル基との間のイソペプチド結合の形成を触媒する酵素を指す。トランスグルタミナーゼは、タンパク質－グルタミンγ－グルタミルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．２．１３）であり、典型的には、リジン残基とのグルタミン残基のｐＨ依存性トランスアミド化を触媒する。トランスグルタミナーゼの例としては、微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）、ヒトトランスグルタミナーゼ、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）、及び第ＸＩＩＩ因子が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトトランスグルタミナーゼの例としては、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２２７３５）、組織トランスグルタミナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２１９８０）、表皮トランスグルタミナーゼ及び前立腺トランスグルタミナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素は、天然源由来であっても組換え源由来であってもよい。ペプチド又はポリペプチド中のグルタミン及びリジンアミノ酸は、トランスグルタミナーゼ架橋のための基質であり得る。例えば、ペイロードは、リジンを含むリンカーに連結され得る。
トランスグルタミナーゼは、当業者によって好適であると考えられる任意のトランスグルタミナーゼであり得る。本明細書に記載の本発明において使用されるトランスグルタミナーゼは、様々な供給源から取得又は作製され得る。いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼは、酵素のコンホメーションの変化を誘導して酵素活性を可能にするためにカルシウムを必要とするカルシウム依存性トランスグルタミナーゼである。例えば、トランスグルタミナーゼは、モルモット肝臓に由来し、商業的供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ））から入手することができる。
いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼは、真菌タンパク質（例えば、卵菌属（Oomycetes）、放線菌属（Actinomycetes）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、カンジダ属（Candida）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、モナスカス属（Monascus）、又はリゾプス・トランスグルタミナーゼ（Rhizopus transglutaminases））に由来する。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼポリペプチドは、変形菌に由来する（例えば、モジホコリ（Physarum polycephalum）トランスグルタミナーゼ）。いくつかの実施形態では、ｍＴＧａｓｅポリペプチドは、ストレプトベルチシリウム（Streptoverticillium）属又はストレプトマイセス（Streptomyces）属（例えば、ストレプトマイセス・モバレンシス（Streptomyces mobarensis）又はストレプトベルチシリウム・モバレンシス（Streptoverticillium mobarensis））からのトランスグルタミナーゼなどの細菌タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼポリペプチドは、ストレプトベルチシリウム・モバレンシス（Streptoverticillium mobarensis）、ストレプトベルチシリウム・グリセオカム（Streptoverticillium griseocameum）、ストレプトベルチシリウム・ラダカナム（Streptoverticillium ladakanum）、ストレプトマイセス・モバレンシス（Streptomyces mobarensis）、ストレプトマイセス・ビリディス（Streptomyces viridis）、ストレプトマイセス・ラダカナム（Streptomyces ladakanum）、ストレプトマイセス・カニフェルス（Streptomyces caniferus）、ストレプトマイセス・プラテンシス（Streptomyces hygroscopius）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopius）、ストレプトマイセス・ネトロプシス（Streptomyces netropsis）、ストレプトマイセス・フラジエ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・ロゼオベルチビラタス（Streptomyces roseovertivillatus）、ストレプトマイセス・シナマオネオス（Streptomyces cinnamaoneous）、ストレプトマイセス・グリセオカメウム（Streptomyces griseocameum）、ストレプトマイセス・ラベンデュラ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・リジカス（Streptomyces lydicus）、ストレプトマイセス・シオヤエンシス（Streptomyces sioyansis）、アクチノマヅラ属（Actinomadura sp）、バチルス属（例えば、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）など）、コリネバクテリウム・アンモニア遺伝子、コリネバクテリウム・グルタミカム、クロストリジウム、エンテロバクター属種。ミクロコッカス属（Micrococcus）、プロビデンシア属（Providencia sp.）、又はその単離物などの細菌タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼは、酵素のコンホメーションの変化を誘導して酵素活性を可能にするためにカルシウムを必要としないカルシウム非依存性トランスグルタミナーゼである。いくつかの実施形態において、トランスグルタミナーゼポリペプチドは、Ｓ．モバレンシスに由来する。
ＡＣＴＩＶＡ（味の素）などの市販のカルシウム非依存性トランスグルタミナーゼも本発明に好適である。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される本発明において使用されるトランスグルタミナーゼはまた、当業者に公知の組換え技術を使用して産生される組換えタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明において使用されるトランスグルタミナーゼは、精製タンパク質であり得る。
本明細書全体を通して、抗体の定常領域のアミノ酸残基の付番は、別途明示的に記載のない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７（５）：１７０９－１９）に記載のＥＵインデックスに従う。
従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードを、表１に示すとおりに本明細書で使用する。
Figure 2023526450000001
本発明の方法
本出願の読者を助けるために、記載は、様々な段落若しくはセクションに分けられているか、又は本出願の様々な実施形態を対象としている。これらの分離は、段落又はセクション又は実施形態の実体を別の段落又はセクション又は実施形態の実体から切り離すものと見なされるべきではない。反対に、当業者であれば、本明細書の記載が広範な用途を有し、想到され得る様々な段落、パラグラフ、及び文章の全ての組み合わせを包含することを理解するであろう。
本発明の実施形態は、単なる例示であることを意図しており、当業者は、本発明の特定の手順に対する多数の等価物を、日常的な実験のみを用いて認識するか、又は確認することができるであろう。かかる等価物はいずれも、本発明の範囲内であると見なされ、以下の特許請求の範囲に含まれる。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、腫瘍関連抗原に対する高い選択性、好ましい薬物動態及び比較的低い固有毒性から、薬物送達を標的化するための使用が増加している。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、通常はｍＡｂ上の特定の部位への安定なリンカー系を介して抗がん薬をｍＡｂに共有結合させることによって形成される。ｍＡｂのＦｃ重鎖のＣＨ２ドメインに位置するグルタミン２９５（Ｑ２９５）は、一般的に使用されるコンジュゲーション部位である。コンジュゲーションは、典型的には、グルタミン側鎖と細胞傷害性薬剤の遊離アミンとの間の安定したイソペプチド結合の形成を触媒する微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を使用して行われる。
ＡＤＣ製造における主要な課題は、コンジュゲーション部位、コンジュゲーション速度、及び標識度（ＤＯＬ）に対する厳密な制御を可能にする方法での細胞傷害性薬剤の抗体への結合である。コンジュゲーション生成物は、そのＤＯＬに対してかなり不均一な混合物であることが多く、このことはＡＤＣの発生を複雑にするだけでなく、最終薬物の治療域を最適でないものにすることもある。
抗体は、Ｑ２９５コンジュゲーション部位の近くの残基Ｎ２９７でグリコシル化されることが多い。抗体グリカンの除去は、Ｈ－Ｄ交換（Ｈｏｕｄｅ Ｄ．ら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ（２００９），８１（７）：２６４４）によって実証されるように、Ｃ’Ｄ／Ｅ鎖の移動性を高めることが知られている。更に、ＭＴＧとの反応性は、プロテアーゼ感受性と相関することが実証されている（Ｓｐｏｌａｏｒｅら、２０１２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１（４３）：８６７９～８６８９）と共に、主鎖の柔軟性の指標になる可能性も高い。Ｎ２９７におけるグリカン分子の立体効果は、Ｑ２９５でのコンジュゲーションを妨げると考えられる。残基Ｎ２９７でのグリコシル化は、Ｑ２９５でのトランスグルタミナーゼコンジュゲーションを妨げ、標識度（ＤＯＬ）又は薬物対抗体比（ＤＡＲ）に影響を及ぼす。その結果、従来の緩衝液条件下でのグリカン無傷抗体のコンジュゲーションは、標識度及び有効性の低い生成物を生成する。
当該分野で既知の従来のコンジュゲーション方法では、抗体をＮ２９７で脱グリコシル化又は非グリコシル化して、Ｑ２９５でのコンジュゲーションを可能にする。得られた抗体は、グリコシル化を妨害することなく、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）による処理に好適であり、第一級アミン化合物と反応してグルタミル修飾抗体を産生することができる。
従来のコンジュゲーション方法では、最初の脱グリコシル化工程を必要とすることから、グリカンの除去が抗体とＦｃ受容体との相互作用を抑制するため、あまり好ましくない製造性で抗体になってきた。Ｆｃグリカンは、構造的完全性、Ｆｃ受容体との連通及び下流の免疫学的応答を維持するために重要である。特にＮ２９７におけるＮ結合グリカンの存在及び構造は、免疫複合体によるエフェクター機能の活性化に必要であると理解されている。脱グリコシル化抗体又はグリカン操作された抗体を必要とする従来のコンジュゲーション方法によって生成されたコンジュゲート抗体は、典型的には、グリカン修飾含有量を有するために活性が低く、かつ／又は安定性が低い。例えば、抗体が安定性、親和性、又は選択性を有していないことがある。
本明細書に記載の発明は、グリコシル化抗体をコンジュゲートする方法を提供し、したがって、製造にとってより好適な抗体薬物コンジュゲートの生成を可能にする。本発明は、所望のＤＯＬを提供し、任意の反応性種又は抗体に適用可能な条件を提供する。本発明の条件は、グリカン操作又はグリカン除去を必要としない。
脱グリコシル化された、又はグリカン操作された抗体を使用する従来の微生物トランスグルタミナーゼコンジュゲーション方法は、概して、ＰＢＳ又は同様のイオン強度を有する緩衝液などの従来の緩衝液条件下で行われる。標識度（ＤＯＬ）を調節するために使用される既存の方法は、概して、担体分子の濃度の変化又は反応性標識種の濃度の変化に依存する。ＤＯＬはまた、反応性種の化学的性質によっても異なり得る。しかしながら、そのような変化は、典型的には、グリカン無傷抗体での使用の場合にはＤＯＬにほとんど影響を与えない。既知の手順とは対照的に、本発明の低イオン強度条件は、トランスグルタミナーゼを使用したアミン化合物又はアミン含有ペイロードとの抗体の部位特異的コンジュゲーションを可能にし、予備的な脱グリコシル化工程及び抗体グリカンの除去を必要とせずに所望のＤＯＬを提供し、したがってより良好な製造性で抗体薬物コンジュゲートを可能にする。
いくつかの実施形態では、第一級アミン化合物は、トランスグルタミン化後に更に反応することができる反応性基を含む。いくつかの実施形態では、グルタミル修飾抗体を反応性ペイロード化合物と反応させて、抗体ペイロードコンジュゲートを形成することができる。いくつかの実施形態では、第一級アミン化合物は、アジドを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、脱グリコシル化及びその後の精製が不要であることによる回収の改善、並びに脱グリコシル化が抗体のＴｍ及びＴａｇｇ値を低下させることが示されたように安定性の改善を含む、従来のコンジュゲーション方法を超える多くの利点を提供し得る。
特定の実施形態では、本発明は、コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法であって、低イオン強度条件においてトランスグルタミナーゼの存在下で、グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質をアミン化合物と反応させることを含む、方法を提供する。グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ酸Ａｓｎ２９７にＮ結合グリカンを含む。好ましくは、グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質は、無傷のグリカン含有量を有する。好ましくは、グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質は、低イオン強度条件においてトランスグルタミナーゼの存在下でグリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質をアミン化合物と反応させる前に、エンド－グリコシダーゼ又はエキソ－グリコシダーゼによる処理を受けていない。好ましくは、グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化部位は、低イオン強度条件においてトランスグルタミナーゼの存在下でグリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質をアミン化合物と反応させる前に、グリカン操作又はグリカン修飾されていない。
特定の実施形態では、本発明の方法で使用される抗体は、グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質であり、部分的に修飾された、又は部分的に操作されたグリカンを有するが、アミノ酸Ａｓｎ２９７にＮ結合グリカンを依然として保持する。
いくつかの実施形態によれば、グリコシル化抗体は、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ｇ０、Ｇ１、又はＧ２グリカンを有する。
いくつかの実施形態では、抗体は、当業者に既知のものに由来する任意の抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＭ重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、κ軽鎖又はλ軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。
いくつかの実施形態では、アミン化合物は、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、ビオチン、造影剤、又は第１のクリック反応パートナーのうちの１つ以上を含むアミン含有ペイロードである。
いくつかの実施形態では、低イオン強度条件下でコンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、約２５ｍＭ以下、又は約２０ｍＭ以下、又は約１５ｍＭ以下、又は約１０ｍＭ以下の塩濃度を有する溶液中で行われる。
本発明の別の実施形態では、コンジュゲーション反応は、リン酸塩、酢酸塩又はＴｒｉｓで緩衝された水中で行われるが、これらに限定されない。代替の実施形態では、低イオン強度の溶液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ、酢酸ナトリウム、又はＴｒｉｓを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、コンジュゲーション反応は、１０ｍＭ以下のリン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、又はＴｒｉｓを含む低イオン強度条件で行われる。
本発明の特定の実施形態では、コンジュゲーション反応は、１０ｍＭ以下のリン酸カリウム、１０ｍＭ以下のリン酸ナトリウム、１０ｍＭ以下の酢酸ナトリウム、又は１０ｍＭ以下のＴｒｉｓを含む低イオン強度条件下で行われる。
本発明の別の実施形態では、本方法は、アミン化合物と反応させる前に抗体又は抗体調製物のイオン強度を低減させて、低イオン強度抗体調製物を提供することを更に含み、すなわち、コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質を含有する溶液のイオン強度を低減させて、低イオン強度条件を提供することを含む。
本発明の別の実施形態では、本方法は、アミン化合物と反応させる前にトランスグルタミナーゼ調製物のイオン強度を低減させて、低イオン強度トランスグルタミナーゼ調製物を提供することを更に含み、すなわち、コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、トランスグルタミナーゼを含有する溶液のイオン強度を低減させて、低イオン強度条件を提供することを更に含む。
別の実施形態では、イオン強度は、希釈によって、又は、透析、ダイアフィルトレーション、濾過、沈殿、及び／若しくはクロマトグラフィー法による緩衝液交換によって低減される。コンジュゲーション方法の実施形態では、塩及び／又は添加剤は、例えば、希釈による方法によって、又は、透析、ダイアフィルトレーション、濾過、沈殿及び／若しくは、ゲル浸透、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーを含む好適なクロマトグラフィー法による緩衝液交換などの方法によって除去される。塩及び／又は添加剤の除去は、透析膜チューブ、タンパク質を保持するが緩衝液を通過させるサイズの多孔質膜を有する遠心分離装置、及び／又はクロマトグラフィー支持体を使用して行うことができる。代替的又は追加的に、塩及び／又は添加剤の除去は、沈殿又は凍結乾燥によるものであり得る。塩又は添加剤の濃度は、好ましくは、コンジュゲーション反応の開始前に低下させることが好ましい。理想的には、塩及び／又は添加剤の濃度は、抗体のグリカン含有量を、除去及び／又は操作することなくコンジュゲートのコンジュゲーションを可能にするレベルまで低減される。理想的には、塩及び／又は添加剤の濃度は、抗体の９０％以上が重鎖当たり１つのアミン含有ペイロードにコンジュゲートされるレベルまで低減される。
一実施形態によれば、コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質を、当該グリコシル化抗体又は当該グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質の８０～１００％又は９０～１００％が、それぞれ、重鎖当たりで１つのアミン含有ペイロードにコンジュゲートされた（例えば、２のＤＯＬ）抗体又はＦｃ融合タンパク質に変換されるのに十分な低イオン強度条件においてトランスグルタミナーゼの存在下で、アミン化合物と反応させることを含む。
本発明の他の実施形態では、トランスグルタミナーゼは微生物トランスグルタミナーゼである。上述のように、トランスグルタミナーゼは、当業者によって好適であると考えられる任意のトランスグルタミナーゼであり得る。
本発明のいくつかの態様では、反応は、少なくとも１８時間行われる。
本発明の他の態様では、反応は、少なくとも２４時間行われる。
特定の実施形態では、アミン化合物は、アジドを含む第一級アミン化合物である。いくつかの実施形態では、第一級アミン化合物は、反応性基又は保護された反応性基を含む。反応性基及び保護された反応性基は、一部の当業者によって好適であると考えられる任意の基であり得る。いくつかの実施形態では、反応性基は、反応性ペイロード化合物と共有結合を形成することができる。有用な反応性基としては、アジド、アルキン、シクロアルキン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、酸、エステル、ヒドラジド、アニリン、テトラジン、シクロオクテン、シクロプロペンが挙げられる。特定の実施形態では、第一級アミン基はカルボキシルを含み、反応性ペイロードはアミンを含む。
別の実施形態では、本方法は、コンジュゲート抗体を反応性ペイロード化合物と反応させて、抗体－ペイロードコンジュゲートを形成することを更に含む。反応性ペイロード化合物のペイロードは、当業者によって好適であると考えられる任意のペイロードであり得る。特定の実施形態では、ペイロードは、第一級アミン化合物上の反応性基と共有結合を形成することができる反応性基を含む反応性ペイロード化合物の形態で提供される。反応性ペイロード化合物の反応性基としては、アジド、アルキン、シクロアルキン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、酸、エステル、ヒドロジアイド（hydrozide）、アニリン、及びアミンが挙げられる。
本発明のいくつかの態様では、本発明の方法は、少なくとも１．８の標識度（ＤＯＬ）を提供する。
本発明のいくつかの態様では、本発明の方法は、少なくとも１．９の標識度（ＤＯＬ）を提供する。
本発明のいくつかの態様では、本発明の方法は、２の標識度（ＤＯＬ）を提供する。
本発明のいくつかの態様では、本発明の方法は、２．０の薬物対抗体比（ＤＡＲ）を提供する。
本発明のいくつかの態様では、本発明の方法によって生成された抗体又はＦｃ融合タンパク質の９０％以上が、２個のアミン化合物にコンジュゲートされる。
本発明のいくつかの態様では、本発明の方法によって生成された抗体又はＦｃ融合タンパク質の９５％以上が、２個のアミン含有ペイロードにコンジュゲートされる。
本発明のいくつかの態様では、本発明の方法によって生成された抗体又はＦｃ融合タンパク質の１００％が、２個のアミン含有ペイロードにコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは、抗体のＦｃドメインで生じる。
いくつかの実施形態では、コンジュゲーションはＧｌｎ２９５で生じる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、好ましくはＧｌｎ２９５でリンカーを介してアミン含有ペイロードにコンジュゲートされた抗体を提供し、ペイロードは、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、ビオチン、及び第１のクリック反応パートナーからなる群から選択される１つ以上の試薬を含む。いくつかの実施形態では、細胞傷害性薬剤は、細胞の成長、生存性、又は増殖に有害な任意の薬剤を含む。ペイロードはまた、キレート化剤又は放射性核種を含み得る。例示的な放射性核種としては、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、２２７Ｔｈ及び１８６Ｒｅが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、アミン化合物は、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、ビオチン、及び第１のクリック反応パートナーのうちの１つ以上を含むアミン含有ペイロードである。
特定の実施形態では、アミン含有ペイロードは第１のクリック反応パートナーを含み、好ましくは、本方法は、抗体－ペイロードコンジュゲートを、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、及びビオチンのうちの１つ以上を含む第２のクリック反応パートナーと反応させて、第２の抗体－ペイロードコンジュゲートを得ることを更に含む。
いくつかの実施形態では、第１のクリック反応パートナーは、３－アジド－１－プロピルアミンであり、第２のクリック反応パートナーは、ＤＢＣＯ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＭＭＡＦ又はＤＢＣＯ－ＭＭＡＦである。
本発明による使用に好適なクリックケミストリー方法の例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＵＳ２０１８／０６５９１３号に記載されている。
番号付けされた実施形態
本発明の例示的な番号付けされた実施形態を以下に提供する。
１． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法であって、低イオン強度条件においてトランスグルタミナーゼの存在下で、グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質をアミン化合物と反応させることを含む、方法。
２． グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質は、無傷のグリカン含有量を有する、実施形態１に記載の方法。
３． アミン化合物は、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、ビオチン、造影剤、又は第１のクリック反応パートナーのうちの１つ以上を含むアミン含有ペイロードである、実施形態１又は２に記載の方法。
４． グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質は、低イオン強度条件下においてトランスグルタミナーゼの存在下でグリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質をアミン化合物と反応させる前に、エンド－グリコシダーゼ又はエキソ－グリコシダーゼによる処理を受けていない、実施形態１～３のいずれか一つに記載の方法。
５． グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化部位は、低イオン強度条件下においてトランスグルタミナーゼの存在下でグリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質をアミン化合物と反応させる前に、グリカン操作又はグリカン修飾されていない、実施形態１～４のいずれか一つに記載の方法。
６． グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ酸Ａｓｎ２９７にＮ結合グリカンを含む、実施形態１～５のいずれか一つに記載の方法。
７． 低イオン強度条件でコンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、約２５ｍＭ以下の塩濃度を含む溶液中で行われる、実施形態１～６のいずれか一つに記載の方法。
８． 低イオン強度条件でコンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、約２０ｍＭ以下の塩濃度を含む溶液中で行われる、実施形態１～６のいずれか一つに記載の方法。
９． 低イオン強度条件でコンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、約１５ｍＭ以下の塩濃度を含む溶液中で行われる、実施形態１～６のいずれか一つに記載の方法。
１０． 低イオン強度条件でコンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、約１０ｍＭ以下の塩濃度を含む溶液中で行われる、実施形態１～６のいずれか一つに記載の方法。
１１． 低イオン強度の溶液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ、酢酸ナトリウム、又はＴｒｉｓを含む、実施形態７～１０のいずれか一つに記載の方法。
１２． 低イオン強度の溶液はリン酸カリウムを含む、実施形態１１に記載の方法。
１３． 低イオン強度の溶液はリン酸ナトリウムを含む、実施形態１１に記載の方法。
１４． 低イオン強度の溶液はＨＥＰＥＳを含む、実施形態１１に記載の方法。
１５． 低イオン強度の溶液はＴｒｉｓを含む、実施形態１１に記載の方法。
１６． 低イオン強度の溶液は酢酸ナトリウムを含む、実施形態１１に記載の方法。
１７． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質を含有する溶液のイオン強度を低減させて、低イオン強度条件を提供することを更に含む、実施形態１～１６のいずれか一つに記載の方法。
１８． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、トランスグルタミナーゼを含有する溶液のイオン強度を低減させて、低イオン強度条件を提供することを更に含む、実施形態１～１７のいずれか一つに記載の方法。
１９． イオン強度は、希釈によって、又は、透析、ダイアフィルトレーション、濾過、沈殿、及び／若しくはクロマトグラフィー法による緩衝液交換によって低減される、実施形態１７又は１８に記載の方法。
２０． トランスグルタミナーゼは微生物トランスグルタミナーゼである、実施形態１～１９のいずれか一つに記載の方法。
２１． アミン化合物は第一級アミン化合物である、実施形態１～２０のいずれか一つに記載の方法。
２２． 第一級アミン化合物はアジドを含む、実施形態２１に記載の方法。
２３． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、コンジュゲート抗体を反応性ペイロード化合物と反応させて、抗体－ペイロードコンジュゲートを形成することを更に含む、実施形態１～２２のいずれか一つに記載の方法。
２４． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、重鎖当たり少なくとも０．９の平均標識度（ＤＯＬ）を提供する、実施形態１～２３のいずれか一つに記載の方法。
２５． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、重鎖当たり１の平均標識度（ＤＯＬ）を提供する、実施形態２４に記載の方法。
２６． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、抗体当たり少なくとも１．８のＤＯＬを提供する、実施形態１～２３のいずれか一つに記載の方法。
２７． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、抗体当たり２．０のＤＯＬを提供する、実施形態２６に記載の方法。
２８． グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質の８０％以上が、それぞれ、２のＤＯＬを有するコンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質（すなわち、２のＤＯＬを有する抗体種又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質種）に変換される、実施形態１～２３のいずれか一つに記載の方法。
２９． グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質の９０％以上が、それぞれ、２のＤＯＬのコンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質に変換される、実施形態１～２３のいずれか一つに記載の方法。
３０． グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質の１００％が、それぞれ、２のＤＯＬのコンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質に変換される、実施形態１～２３のいずれか一つに記載の方法。
３１． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法は、それぞれ、コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質と比較して１０％未満の副生成物を提供する、実施形態１～２３のいずれか一つに記載の方法。
３２． ＬＣ－ＭＳによって標識度（ＤＯＬ）を測定することを含む、実施形態２４～３０のいずれか一つに記載の方法。
３３． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質は、そのＦｃドメインでコンジュゲートされる、実施形態１～３２のいずれか一つに記載の方法。
３４． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質は、Ｇｌｎ２９５でコンジュゲートされる、実施形態３３に記載の方法。
３５． コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質は、Ｇｌｎ２９５でリンカーを介してアミン含有ペイロードにコンジュゲートされ、ペイロードは、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、キレート剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、ビオチン、造影剤、及び第１のクリック反応パートナーからなる群から選択される１つ以上の反応性基を含む、実施形態１～３２のいずれか一つに記載の方法。
３６． アミン含有ペイロードは、第１のクリック反応パートナーを含み、方法は、コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、造影剤、又はビオチンのうちの１つ以上を含む第２のクリック反応パートナーと反応させて、第２のコンジュゲートを得ることを更に含む、実施形態３５に記載の方法。
３７． 第１のクリック反応パートナーは、３－アジド－１－プロピルアミンであり、第２のクリック反応パートナーは、ＤＢＣＯ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＭＭＡＦ又はＤＢＣＯ－ＭＭＡＦである、実施形態３６に記載の方法。
３８． コンジュゲート抗体を生成するための、実施形態１～３７のいずれか一つに記載の方法であって、低イオン強度条件においてトランスグルタミナーゼの存在下でグリコシル化抗体をアミン化合物と反応させることを含む、方法。
３９． コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成するための、実施形態１～３７のいずれか一つに記載の方法であって、低イオン強度条件においてトランスグルタミナーゼの存在下でグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質をアミン化合物と反応させることを含む、方法。
４０． 実施形態１～３８のいずれか一つに記載の方法に従って作製されたコンジュゲート抗体。
４１． 実施形態４０に記載のコンジュゲート抗体を含む医薬組成物。
４２． 実施形態１～３７又は３９のいずれか一つに記載の方法に従って作製されたコンジュゲートＦｃ融合タンパク質。
４３． 実施形態４２に記載のコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物。
本発明の以下の実施例は、特定の実施形態を更に説明するために提供される。以下の実施例は本発明の範囲を限定しないことを理解されたい。
以下の実施例で使用される抗体は市販されており、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標））及びパニツムマブ（Ｖｉｃｔｉｂｉｘ（登録商標））を含む。トラスツズマブ及びペルツズマブは、ヒトＨｅｒ２に結合する。パニツムマブは、ヒトＥＧＦＲに結合する。
実施例１：Ｚｅｄｉｒａ製の微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を使用した低イオン強度条件下でのトラスツズマブと３－ＡＰＡとのコンジュゲーション
抗体及びトランスグルタミナーゼ調製
大腸菌で産生された専売の組換え微生物トランスグルタミナーゼ（細菌トランスグルタミナーゼの場合はＭＴＧ又はＢＴＧ）をＺｅｄｉｒａ）から購入した（カタログ番号Ｔ００１。凍結乾燥粉末を水に再懸濁し、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて低イオン強度緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２など）に緩衝液交換した。トラスツズマブ、ヒト化ＩｇＧ１抗体もまた、Ｚｅｂａ脱塩カラムを使用して低イオン強度緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウムなど）に緩衝液交換した。次いで、緩衝液交換トラスツズマブ及び微生物トランスグルタミナーゼを水又は所望の反応条件のための適切な緩衝液で希釈し、ｍＡｂについては１ｍｇ／ｍＬ、酵素については１０Ｕ／ｍｇの最終濃度とした。抗体及び酵素を、ペイロード結合に好適な反応性を有するアジド含有試薬である３－アジドプロピルアミン（３－ＡＰＡ）基質のｍＡｂに対して２０～１００倍モル過剰でインキュベートした。
コンジュゲーション反応
微生物トランスグルタミナーゼの活性部位システインを不可逆的にアルキル化するＺｅｄｉｒａ製のＭＴＧ遮断薬であるＣ１０２の添加によって、示された時点で反応を停止させた。使用したＭＴＧ遮断薬の最終濃度は１００ｕＭであった。無傷質量分析では、ｍＡｂをＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ（２％ ｖ／ｖ）で脱グリコシル化して試料の不均一性を低減し、分析を容易にし、質量減少分析では、ジチオスレイトール又はＴＣＥＰを添加した。
ＬＣ－ＭＳを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ６２２４ ＭＳ－ＴＯＦ質量分析計に接続されたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣシステムで行った。ＬＣを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＰ－ｍＡｂ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３．５ミクロン）で、流速１ｍＬ／分、移動相水中０．１％ギ酸（Ａ）及びアセトニトリル中０．１％ギ酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号３４６８８）（Ｂ）、並びに２０％ Ｂ（０～２分）、２０～６０％ Ｂ（２～３分）、６０～８０％ Ｂ（３～５．５分）の勾配で実行した。機器を正のエレクトロスプレーイオン化モードで操作し、ｍ／ｚ ６００から６０００まで走査した。機器設定には、キャピラリー電圧３５００Ｖ、フラグメンター１７５Ｖ、スキマー６５Ｖ；ガス温度３２５Ｃ、乾燥ガス流量５．０Ｌ／分、ネブライザー圧力３０ｐｓｉｇ、０．４２走査速度の取得モード範囲１００～７０００が含まれた。
最大エントロピアルゴリズムを使用して質量対電荷スペクトルをデコンボリューションし、８３Ｄａの倍数（３－ＡＰＡに対応する）を追加した無傷のｍＡｂ又はｍＡｂ重鎖に対応するデコンボリューションした質量の相対強度を使用して、各反応の標識度（ＤＯＬ）を推定した。
図１は、異なる反応緩衝液組成物における、無傷の及び脱グリコシル化トラスツズマブへの３－ＡＰＡのＭＴＧ触媒コンジュゲーションの速度を示す。脱グリコシル化ｍＡｂのＰＢＳ緩衝液中でのコンジュゲーション速度は非常に速く、反応は３時間以内に完了した。脱グリコシル化ｍＡｂのコンジュゲーション速度は、１０ｍＭリン酸緩衝液中では更に速いように思われた。グリカン無傷ｍＡｂのコンジュゲーション速度は、ＰＢＳ中では遅く、５時間で２５％の変換にしか達せず、一晩での変換の進捗は４０～６０％であった（データは示さず）。しかしながら、５又は１０ｍＭリン酸緩衝液中のグリカン－無傷ｍＡｂのコンジュゲーションは、ＰＢＳ緩衝液中よりも有意に速く、５時間後に約７０～８０％が完了し、より長いインキュベーション時間の後では完全又はほぼ完全な変換に達した（データは示さず）。低イオン強度条件下で行われた反応は、ＰＢＳ中で行われた反応と比較してコンジュゲーション速度の向上を示した。１０ｍＭ及び５ｍＭリン酸緩衝液は両方ともに、ＰＢＳ（８ｍＭのリン酸ナトリウム、１．５ｍＭのリン酸カリウム、２．７ｍＭのＫＣｌ、１３８ｍＭのＮａＣｌ）と比較して有意な速度の向上を示した。
トランスグルタミナーゼ反応を、様々な緩衝液条件のパネルで、１ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ１抗体トラスツズマブ、１００モル過剰（６９０ｕＭ）の３－ＡＰＡ、及び１０Ｕ／ｍｇの抗体でのＺｅｄｉｒａトランスグルタミナーゼ（カタログ番号Ｔ００１）を用いて試験した。表２は、一連の反応条件でＭＴＧ及び３－ＡＰＡと３７℃で１８～２０時間インキュベーションした後の（ＤＯＬ＝２に）完全に修飾されたグリカン無傷ＷＴヒトトラスツズマブの分率を示す。多くの低イオン強度製剤は、修飾の増加を示し、多くの場合、完全又はほぼ完全な修飾を可能にした。
Figure 2023526450000002
Figure 2023526450000003
低イオン強度条件下において、リン酸カリウム緩衝液中でｐＨ５．８、７．２又は８．０、ＨＥＰＥＳ中でｐＨ７．２又は８．０、Ｔｒｉｓ緩衝液中でｐＨ７．２、８．０又は９．２、及び酢酸ナトリウム緩衝液中でｐＨ５．６で行われた反応は、３－ＡＰＡによるｍＡｂの修飾の増加をもたらした。全ての場合において、２．２ｍＭ緩衝液では、ｍＡｂのＤＯＬ＝２種への完全又はほぼ完全な変換が、３７℃で１６～２０時間後に達成された。多くの場合、完全なコンジュゲーション（２のＤＯＬを達成する反応）が６．２ｍＭ及び１１．２ｍＭで達成され、これらの場合、低塩条件は、ＰＢＳ又は他のより高いイオン強度反応条件よりも有意に多くのコンジュゲートを生成した。低ｐＨ条件下（ｐＨ３．６及び４．２）において、酢酸ナトリウム緩衝液中では、高い可能性でＭＴＧに最適でないｐＨ条件のために、試験したほとんどの条件下で限られた生成物が作製された。一つの例外は、３－ＡＰＡによるｍＡｂの完全な修飾をもたらした、２．２ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．２の反応であり、これは低いｐＨを維持できない限られた緩衝能によって説明され得る。
ペプチドマッピング
得られたコンジュゲートについてペプチドマッピング実験を行い、コンジュゲーション部位を特定した。５０μＬのＰＢＳ中の５０μｇのｍＡｂを、１５０μＬの８ＭのＧｕＨＣｌ、４ｍＭのＥＤＴＡ、及び３０ｍＭのＤＴＴとｐＨ８．０で混合し、３７℃で１時間インキュベートした。システインを、２４μＬの０．５Ｍヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を添加し、反応混合物を暗所にて室温で１時間インキュベートすることによってアルキル化した。次いで、Ｚｅｂａスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してｍＡｂを５０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ８．０に交換し、次いで、トリプシン消化のための９０μｌ溶液と、キモトリプシンによる消化のための１３０μｌ溶液とに分割した。１５μＬの、１ｍＭ ＨＣｌ中０．１ｍｇ／ｍＬトリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｖ５０７）又は０．１ｍｇ／ｍＬキモトリプシンを添加し、試料をトリプシン／Ｌｙｓ－Ｃ消化のために３７℃で４時間、又はキモトリプシン消化のために暗所にて室温で４時間インキュベートした。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータを、ＳＣＩＥＸ Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ ６６００で取得した。データを、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓソフトウェア、Ｂｙｏｓ（バージョン３．５－１０×６４）を使用して処理した。ペプチドマッピング実験は、修飾がＧｌｎ２９５に局在することを実証した（図２Ａ～２Ｄ）。
コンジュゲートの生物物理学的特性解析
溶融温度及び凝集温度
コンジュゲートトラスツズマブの生物物理学的特性解析を実施して、抗体の安定性に対するコンジュゲーションの効果を測定した。データを、非コンジュゲート野生型（ＷＴ）トラスツズマブと比較した。Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ製のＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ｎａｎｏＤＳＦ装置を使用した示差走査蛍光測定によって、ＰＢＳ中でアンフォールディング温度（Ｔｍ）（図３Ａ）及び凝集温度（Ｔａｇｇ）（図３Ｂ）を求めた。Ｔｍは、２０℃から９５℃までの熱走査時の３３０ｎｍ及び３５０ｎｍでの蛍光強度の変化をモニタリングすることによって求め、Ｔａｇｇは散乱をモニタリングすることによって求めた。トラスツズマブアジドコンジュゲートのＴｍは、最初の遷移（ＣＨ２ドメインに対応）については６８．３℃と求められ、グリコシル化ＷＴ ｍＡｂに対して２．１℃の差があった。第２の遷移（Ｆａｂに対応）については７９．２℃と求められ、グリコシル化野生型ｍＡｂに対して０．３℃の差があった。対照的に、トラスツズマブの脱グリコシル化は、ＣＨ２ドメインのＴｍを約８℃低下させた。グリコシル化トラスツズマブコンジュゲート及び脱グリコシル化トラスツズマブコンジュゲートの凝集温度（Ｔａｇｇ）は、７７．７℃のＴａｇｇと類似していたが、グリコシル化非コンジュゲートトラツズマブと比較した場合、１．１℃低かった（表３）。
Figure 2023526450000004
分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
アジド修飾ｍＡｂ、並びに薬物ペイロードＤＢＣＯ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＭＭＡＦがアジド修飾ｍＡｂに結合しているコンジュゲートｍＡｂの両方について、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによってコンジュゲートｍＡｂのオリゴマー化状態を測定した。いずれの場合にも、溶出プロファイルは、非コンジュゲートトラスツズマブと本質的に一致し、１００％のモノマーと一致した。
コンジュゲートの活性
グリコシル化ｍＡｂに対する低イオン強度条件下で生成されたコンジュゲートの活性が、確立された方法によって生成されたコンジュゲートに匹敵することを実証するために、低塩条件下で生成されたアジド－ｍＡｂを薬物ペイロードにコンジュゲートさせ、その活性を細胞アッセイで実証した（図４）。トラスツズマブを、上記のように低塩条件下で３－ＡＰＡにコンジュゲートさせるか、又は１Ｕ／ｍＬのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３７℃で一晩脱グリコシル化した後、ＰＢＳ緩衝液中の３－ＡＰＡ（１００倍モル過剰）及びＭＴＧ（Ａｃｔｉｖａ ＴＩ、５～２０％ ｗ／ｖ又はＺｅｄｉｒａ、５～２０単位／ｍｇのｍＡｂ）と３７℃で２～４時間反応させた。ＤＢＣＯ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＦ薬物ペイロードを、１０倍モル過剰でアジドコンジュゲートｍＡｂに添加し、室温で２～６時間、歪み促進型クリックケミストリー（strain-promoted click chemistry、ＳＰＡＡＣ）によって反応させた。Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、得られたＡＤＣから遊離薬物を除去した。
高Ｈｅｒ２細胞株であるＳＫＢＲ３細胞を様々な濃度のＡＤＣで３７℃で７２時間処理した。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏを使用して、処理の終了時の細胞生存率を測定した。脱グリコシル化工程を含む従来のコンジュゲーション方法によって生成されたトラスツズマブ－ｖｃＭＭＡＦの殺細胞活性は、グリコシル化抗体を用い低イオン強度条件下で生成されたトラスツズマブ－ｖｃＭＭＡＦの細胞活性と同様であることが見出された（図４）。
実施例２：Ａｃｔｉｖａ ＴＩ微生物トランスグルタミナーゼを使用した低イオン強度条件下でのトラスツズマブと３－ＡＰＡとのコンジュゲーション
味の素から購入したＡｃｔｉｖａ ＴＩ ＭＴＧ酵素を用いた低イオン強度コンジュゲーション法の実証にも成功した。
緩衝液交換されたＡｃｔｉｖａ ＴＩ微生物トランスグルタミナーゼを使用した低イオン強度条件下でのトラスツズマブのコンジュゲーション。
Ａｃｔｉｖａ ＴＩ ＭＴＧは、典型的には食品添加物として、及び他の用途のために使用される多糖であるマルトデキストリンと共に製剤化される。最初のコンジュゲーション実験を、再可溶化したＡｃｔｉｖａ ＴＩ ＭＴＧを用いて行った。Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してトラスツズマブを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２に交換し、Ａｃｔｉｖａ ＴＩ粉末を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に溶解し、３－ＡＰＡを水に溶解した。反応成分を、１０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．２中の１ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ、６９０ｕＭの３－ＡＰＡ、及び２０％ ｗ／ｖのＡｃｔｉｖａ ＴＩ ＭＴＧの最終濃度の反応混合物中で合わせた。比較のために、ＰＢＳ緩衝液（１ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ、６９０ｕＭの３－ＡＰＡ、２０％ ｗ／ｖのＡｃｔｉｖａ ＴＩ ＭＴＧ、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ ｐＨ７）中で同一の反応を設定した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。分析のために、ＭＴＧをＭＴＧ遮断薬の添加によって不活性化し、ｍＡｂをＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ（１％ ｖ／ｖ）を用いて５０℃で２０分間脱グリコシル化し、ＤＴＴを用いて５０ｍＭまで還元し、続いてＬＣ－ＭＳを行ってＤＯＬを測定した。
データは、マルトデキストリンの存在下ではＤＯＬが低いままであり、緩衝液組成を変更してもコンジュゲーション速度が増加しないことを示した（表４）。
精製されたＡｃｔｉｖａ ＴＩ微生物トランスグルタミナーゼを使用した低イオン強度条件下でのトラスツズマブのコンジュゲーション。市販のＭＴＧからマルトデキストリンを除去するために、味の素から入手したＭＴＧを陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によってＡｃｔｉｖａ ＴＩ製剤から精製し、更に低塩緩衝液に交換した。５０ｍｇのＡｃｔｉｖａトランスグルタミナーゼ粉末を５００ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．２に溶解した。試料を、Ａｋｔａ Ａｖａｎｔに取り付けられた５ｍＬ ＳＰ ＨＰ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ）を使用して、室温にて５ｍＬ／分の流速で精製した。この方法は、５カラム容量（column volume、ＣＶ）の平衡化、５ＣＶの洗浄、続いて２０ＣＶにわたって０～５５％の勾配の緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＝２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．２、緩衝液Ｂ＝２０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ ５．２、１ＭのＮａＣｌ）を含む。ＭＴＧを含有する画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ濃縮器（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）で濃縮した。次いで、濃縮した酵素を、Ｚｅｂａ脱塩カラムで１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２に交換した。
トラスツズマブを、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２中で、１ｍｇ／ｍｌの抗体、６９μＭのトランスグルタミナーゼ、及び６９０μＭの３－ＡＰＡのそれぞれの濃度でトランスグルタミナーゼ及び３－ＡＰＡと共に３７℃で一晩インキュベートした。この精製されたＭＴＧでは、ＤＯＬ＝２の精製ｍＡｂの生成は、標準条件と比較して低塩条件下で４倍増加した（表４）。
Figure 2023526450000005
実施例３：ＰＳＭＡモノクローナル抗体のコンジュゲーション
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合するヒトＩｇＧ４ ｍＡｂであるＰＳＭＢ１２７を、低イオン強度条件下でＭＴＧとコンジュゲートさせた。Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、ＰＳＭＢ１２７を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２に交換した。Ｚｅｄｉｒａ ＭＴＧを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に交換し、３－ＡＰＡを水に溶解した。成分を、０．９ｍＭリン酸カリウムｐＨ ７．２中の１ｍｇ／ｍＬのＰＳＭＢ １２７、６９０ｕＭの３－ＡＰＡ、及び１０Ｕ／ｍｇのＺｅｄｉｒａ ＭＴＧの最終濃度の反応混合物中で合わせた。比較のために、ＰＢＳベースの緩衝液（１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭのＫＣｌ、１６７ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ ７中の１ｍｇ／ｍＬのＰＳＭＢ１２７、６９０ｕＭの３－ＡＰＡ、１０Ｕ／ｍｇのＺｅｄｉｒａ ＭＴＧ）中で同一の反応を設定した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。分析のために、ＭＴＧをＭＴＧ遮断薬の添加によって不活性化し、ｍＡｂをＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ（１％ ｖ／ｖ）を用いて５０℃で２０分間脱グリコシル化し、ＤＴＴを用いて５０ｍＭまで、又はＴＣＥＰを用いて５ｍＭまで還元し、続いてＬＣ－ＭＳを行ってＤＯＬを測定した。
Figure 2023526450000006
実施例４：低イオン強度条件下でのペルツズマブの３－ＡＰＡとのコンジュゲーション
Ｈｅｒ２に結合するヒトＩｇＧ１ ｍＡｂであるペルツズマブを、低イオン強度条件下でＭＴＧとコンジュゲートさせた。臨床グレードのペルツズマブをＧｅｎｅｎｔｅｃｈから入手し、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２に交換した。Ｚｅｄｉｒａ ＭＴＧを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に交換し、３－ＡＰＡを水に溶解した。成分を、０．９ｍＭリン酸カリウムｐＨ ７．２中の１ｍｇ／ｍＬのペルツズマブ、６９０ｕＭの３－ＡＰＡ、及び１０Ｕ／ｍｇのＺｅｄｉｒａ ＭＴＧの最終濃度の反応混合物中で合わせた。比較のために、同一の反応を、ｍＡｂ及び酵素製剤からの更なる緩衝液成分を含むＰＢＳベースの緩衝液（１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、７．８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．６ｍＭのｎＫＣｌ、１６３ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの酢酸ナトリウム、０．６ｍＭの酢酸ヒスチジン、３．９ｍＭのスクロース、０．００１％のポリソルベート２０ ｐＨ ７中の１ｍｇ／ｍＬのペルツズマブ、６９０ｕＭの３－ＡＰＡ及び１０Ｕ／ｍｇのＺｅｄｉｒａ ＭＴＧ）中で設定した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。分析のために、ＭＴＧをＭＴＧ遮断薬の添加によって不活性化し、ｍＡｂをＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ（１％ ｖ／ｖ）を用いて５０℃で２０分間脱グリコシル化し、ＤＴＴを用いて５０ｍＭまで、又はＴＣＥＰを用いて５ｍＭまで還元し、続いてＬＣ－ＭＳを行ってＤＯＬを測定した。
Figure 2023526450000007
実施例５：低イオン強度条件下でのパニツムマブの３－ＡＰＡとのコンジュゲーション
ＥＧＦＲに結合するヒトＩｇＧ２ ｍＡｂであるパニツムマブを、低イオン強度条件下でＭＴＧとコンジュゲートさせた。臨床グレードのパニツムマブをＧＳＫから入手し、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２に交換した。Ｚｅｄｉｒａ ＭＴＧを１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に交換し、３－ＡＰＡを水に溶解した。成分を、０．９ｍＭリン酸カリウムｐＨ ７．２中の１ｍｇ／ｍＬのパニツムマブ、６９０ｕＭの３－ＡＰＡ、及び１０Ｕ／ｍｇのＺｅｄｉｒａ ＭＴＧの最終濃度の反応混合物中で合わせた。比較のために、同一の反応を、ｍＡｂ及び酵素製剤からの更なる緩衝液成分を含むＰＢＳベースの緩衝液（１．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、７．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．６ｍＭのＫＣｌ、１６５ｍＭのＮａＣｌ、８．６ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ ７中の１ｍｇ／ｍＬのパニツムマブ、６９０ｕＭの３－ＡＰＡ及び１０Ｕ／ｍｇのＺｅｄｉｒａ ＭＴＧ）中で設定した。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。分析のために、ＭＴＧをＭＴＧ遮断薬の添加によって不活性化し、ｍＡｂをＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ（１％ ｖ／ｖ）を用いて５０℃で２０分間脱グリコシル化し、ＤＴＴを用いて５０ｍＭまで、又はＴＣＥＰを用いて５ｍＭまで還元し、続いてＬＣ－ＭＳを行ってＤＯＬを測定した。
１０ｍＭのリン酸カリウム中で行われた反応は６９％のコンジュゲーションを示したが、ＰＢＳ中で行われた反応では、パニツムマブの２８％しか２のＤＯＬを達成しなかった（表７）。
Figure 2023526450000008
実施例６：低イオン強度条件下でのトラスツズマブの一連の基質へのコンジュゲーション
低塩条件下でのＭＴＧとのコンジュゲーションのために一連のアミン含有基質を得た。様々なサイズの３つの更なるアジド含有アミンを試験し、アミンとアジドとの間のリンカーの長さは１１～７１原子の範囲であった。ビオチン結合アミンペンチルアミノビオチンも、細胞傷害性ペイロードＭＭＡＦに結合したアミンと同様に試験した。試験した基質を表８に示す：
Figure 2023526450000009
低イオン強度条件下でのコンジュゲーション効率を評価するために、トラスツズマブ及びＺｅｄｉｒａ ＭＴＧを、Ｚｅｂａ脱塩カラムを使用して５ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２に交換した。成分を、５ｍＭリン酸カリウムｐＨ ７．２中の１ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ、６９０ｕＭの基質、及び１０Ｕ／ｍｇのＺｅｄｉｒａ ＭＴＧの最終濃度の反応混合物中で合わせた。比較のために、同一の反応を、ｍＡｂ及び酵素製剤からの更なる緩衝液成分を含むＰＢＳベースの緩衝液（１．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、７．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．６ｍＭのＫＣｌ、１６５ｍＭのＮａＣｌ、８．６ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ ７中の１ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブ、６９０ｕＭの基質及び１０Ｕ／ｍｇのＺｅｄｉｒａ ＭＴＧ）中で設定した。反応物を３７℃で１８時間インキュベートした。分析のために、ＭＴＧをＭＴＧ遮断薬の添加によって不活性化し、ｍＡｂをＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ（１％ ｖ／ｖ）を用いて５０℃で２０分間脱グリコシル化し、ＤＴＴを用いて２０ｍＭまで還元し、続いてＬＣ－ＭＳを行ってＤＯＬを測定した。
５ｍＭリン酸カリウム中で行った反応は、ＰＢＳ反応と比較してコンジュゲーションの増加を示した（表９）。一連のアジド含有アミンは全て、低塩条件下でｍＡｂのＤＯＬ＝２種への変換の増加を示した。全般的に、より大きな基質は、ＰＢＳ中及び５ｍＭリン酸塩中の両方において、より小さい基質よりも生成物が少なかった。ペンチルアミノビオチン基質は、低塩条件下では９８％がＤＯＬ＝２にコンジュゲートしたが、ＰＢＳ中では４０％しかコンジュゲートしなかった。アミン－ｖｃＭＭＡＦ分子は、これらの条件下で、５ｍＭリン酸塩中では５０％がＤＯＬ ２に変換されたが、ＰＢＳ中では４％しか変換されなかった。
Figure 2023526450000010
上記の様々なアイソタイプ及び特性の様々なヒトＩｇＧ抗体は、低イオン強度条件下でコンジュゲーション速度の向上を示した。これらには、ヒトＩｇＧ４ ｍＡｂであるＰＳＭＢ１２７（実施例３）、ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂであるトラスツズマブ及びペルツズマブ（実施例１、２及び４）、並びにヒトＩｇＧ２ ｍＡｂであるパニツムマブ（実施例５）が含まれた。ほとんどが、本発明の低イオン強度条件下で、ＤＯＬ ２への＞９０％のコンジュゲーションを示した。要約すると、様々なアミン基質を使用して、ＭＴＧ触媒反応において、ＷＴヒトＩｇＧがＧｌｎ２９５で完全修飾（ＤＯＬ＝２）にコンジュゲートすることができる反応条件が特定されている。グリカン操作は必須ではなく、グリカンは無傷のままであり、ｍＡｂの生物物理学的特性及び免疫学的特性を維持した。
これらの結果は、低イオン強度緩衝液条件の使用が、グリカン無傷抗体の一貫した再現性のある標識を提供することを実証している。低イオン強度条件（例えば、約１５ｍＭ以下の塩緩衝液、又は約１２ｍＭ以下の塩緩衝液、又は約１０ｍＭ以下の塩緩衝液、又は約１０ｍＭの塩緩衝液）では、抗体又は薬物コンジュゲートの性質にかかわらず、抗体の９０％以上が一貫して２のＤＯＬを示す。
Figure 2023526450000011

Claims (37)

  1. コンジュゲート抗体又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法であって、低イオン強度条件においてトランスグルタミナーゼの存在下で、グリコシル化抗体又はグリコシル化Ｆｃ融合タンパク質をアミン化合物と反応させることを含む、方法。
  2. 前記グリコシル化抗体又は前記グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質は、無傷のグリカン含有量を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記アミン化合物は、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、ビオチン、造影剤、又は第１のクリック反応パートナーのうちの１つ以上を含むアミン含有ペイロードである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記グリコシル化抗体又は前記グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質は、前記低イオン強度条件下において前記トランスグルタミナーゼの存在下で前記グリコシル化抗体又は前記グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質を前記アミン化合物と反応させる前に、エンド－グリコシダーゼ又はエキソ－グリコシダーゼによる処理を受けていない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記グリコシル化抗体又は前記グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質の前記グリコシル化部位は、前記低イオン強度条件下において前記トランスグルタミナーゼの存在下で前記グリコシル化抗体又は前記グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質を前記アミン化合物と反応させる前に、グリカン操作又はグリカン修飾されていない、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記グリコシル化抗体又は前記グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ酸Ａｓｎ２９７にＮ結合グリカンを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 低イオン強度条件で前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する前記方法は、約２５ｍＭ以下の塩濃度を有する溶液中で行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 低イオン強度条件で前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する前記方法は、約２０ｍＭ以下の塩濃度を有する溶液中で行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 低イオン強度条件で前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する前記方法は、約１５ｍＭ以下の塩濃度を有する溶液中で行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  10. 低イオン強度条件で前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する方法が、約１０ｍＭ以下の塩濃度を有する溶液中で行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  11. 低イオン強度の前記溶液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ、酢酸ナトリウム、又はＴｒｉｓを含む、請求項７～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 低イオン強度の前記溶液はリン酸カリウムを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 低イオン強度の前記溶液はリン酸ナトリウムを含む、請求項１１に記載の方法。
  14. 低イオン強度の前記溶液はＨＥＰＥＳを含む、請求項１１に記載の方法。
  15. 低イオン強度の前記溶液はＴｒｉｓを含む、請求項１１に記載の方法。
  16. 低イオン強度の前記溶液は酢酸ナトリウムを含む、請求項１１に記載の方法。
  17. 前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する前記方法は、前記グリコシル化抗体又は前記グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質を含有する溶液の前記イオン強度を低減させて、前記低イオン強度条件を提供することを更に含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する前記方法は、前記トランスグルタミナーゼを含有する溶液の前記イオン強度を低減させて、前記低イオン強度条件を提供することを更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記イオン強度は、希釈によって、又は、透析、ダイアフィルトレーション、濾過、沈殿、及び／若しくはクロマトグラフィー法による緩衝液交換によって低減される、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 前記トランスグルタミナーゼは微生物トランスグルタミナーゼである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記アミン化合物は第一級アミン化合物である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記第一級アミン化合物はアジドを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する前記方法は、前記コンジュゲート抗体を反応性ペイロード化合物と反応させて、抗体－ペイロードコンジュゲートを形成することを更に含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する前記方法は、重鎖当たり少なくとも０．９の平均標識度（ＤＯＬ）を提供する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する前記方法は、重鎖当たり１の平均標識度（ＤＯＬ）を提供する、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する前記方法は、抗体当たり少なくとも１．８のＤＯＬを提供する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する前記方法は、抗体当たり２．０のＤＯＬを提供する、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記グリコシル化抗体又は前記グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質の８０％以上が、それぞれ、２のＤＯＬを有する前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質（すなわち、２のＤＯＬを有する抗体種又はコンジュゲートＦｃ融合タンパク質種）に変換される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記グリコシル化抗体又は前記グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質の９０％以上が、それぞれ、２のＤＯＬの前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質に変換される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記グリコシル化抗体又は前記グリコシル化Ｆｃ融合タンパク質の１００％が、それぞれ、２のＤＯＬの前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質に変換される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を生成する前記方法は、それぞれ、前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質と比較して１０％未満の副生成物を提供する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  32. ＬＣ－ＭＳによって標識度（ＤＯＬ）を測定することを含む、請求項２４～３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質は、そのＦｃドメインでコンジュゲートされる、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質は、Ｇｌｎ２９５でコンジュゲートされる、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質は、Ｇｌｎ２９５でリンカーを介してアミン含有ペイロードにコンジュゲートされ、前記ペイロードは、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、キレート剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、ビオチン、造影剤、及び第１のクリック反応パートナーからなる群から選択される１つ以上の反応性基を含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記アミン含有ペイロードは、前記第１のクリック反応パートナーを含み、前記方法は、前記コンジュゲート抗体又は前記コンジュゲートＦｃ融合タンパク質を、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤、化学療法剤、毒素、放射性核種、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、造影剤、又はビオチンのうちの１つ以上を含む第２のクリック反応パートナーと反応させて、第２のコンジュゲートを得ることを更に含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記第１のクリック反応パートナーは、３－アジド－１－プロピルアミンであり、前記第２のクリック反応パートナーは、ＤＢＣＯ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＭＭＡＦ又はＤＢＣＯ－ＭＭＡＦである、請求項３６に記載の方法。
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