JP2017516500A - 標的特異的ヌクレアーゼを用いた標的ｄｎａの敏感な検出方法 - Google Patents

標的特異的ヌクレアーゼを用いた標的ｄｎａの敏感な検出方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2017516500A
JP2017516500A JP2017515647A JP2017515647A JP2017516500A JP 2017516500 A JP2017516500 A JP 2017516500A JP 2017515647 A JP2017515647 A JP 2017515647A JP 2017515647 A JP2017515647 A JP 2017515647A JP 2017516500 A JP2017516500 A JP 2017516500A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
genotype
specific
sample
nuclease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2017515647A
Other languages
English (en)
Inventor
ソ キム、ジン
ソ キム、ジン
ジュン キム、ソ
ジュン キム、ソ
ファン イ、スン
ファン イ、スン
ジュン キム、ソク
ジュン キム、ソク
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toolgen Inc
Institute for Basic Science
Original Assignee
Toolgen Inc
Institute for Basic Science
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toolgen Inc, Institute for Basic Science filed Critical Toolgen Inc
Publication of JP2017516500A publication Critical patent/JP2017516500A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/301—Endonuclease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G01N2800/245—Transplantation related diseases, e.g. graft versus host disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

本発明は、標的特異的ヌクレアーゼを用いた遺伝子型分析方法に関し、具体的には、標的特異的ヌクレアーゼまたはその変異体を利用して野生型ＤＮＡまたは特定の遺伝子型ＤＮＡを除去して突然変異などの変異または遺伝子型の差異がある目的とする少量のＤＮＡのみを増幅するか、濃縮して癌の診断または遺伝子型の分析をする方法、及び標的特異的ヌクレアーゼまたはその変異体を利用して目的とするＤＮＡを分離する方法に関する。このような方法は、既存の単純なＰＣＲの後、正常遺伝子型と発癌遺伝型を認識する標的特異的ヌクレアーゼとは反対の新しいパラダイムの方法により癌の早期診断または類似の遺伝子型の分析に有用に用いることができる。

Description

本発明は、標的特異的ヌクレアーゼを用いた遺伝子型分析方法に関し、具体的には、標的特異的ヌクレアーゼまたはその変異体を利用して野生型ＤＮＡまたは特定の遺伝子型ＤＮＡを除去して突然変異などの変異または遺伝子型の差異がある目的とする少量のＤＮＡのみを増幅したり、濃縮して癌の診断または遺伝子型の分析をする方法、及び標的特異的ヌクレアーゼまたはその変異体を利用して目的とするＤＮＡを分離する方法に関する。
血漿ＤＮＡは身体の種々の細胞に由来するＤＮＡ断片を有している。ヒトのすべての細胞は同じ遺伝情報を有しているが、外部の細胞が加わる場合（細胞治療または臓器移植など）または内部の細胞において突然変異が起こる場合、非均一（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）の状態になることがある。
このような状況の例としては、１）癌（癌は、様々な突然変異により発生）２）妊娠（胎児のＤＮＡは母体と一致していない）、３）細胞及び臓器移植（ドナーのＤＮＡは、移植される患者のＤＮＡと一致していない）などがある。それぞれの場合、非常に低い比率であっても、同じ遺伝子に対する少しずつ異なる配列の断片が血漿ＤＮＡに存在し得る。したがって、これを敏感に分子診断的方式によって観察する技術が重要である。
特に、既に発生した癌患者の血液などの試料内には過量の正常ＤＮＡと突然変異が誘発された少量の癌由来ＤＮＡが混在するため、これを分析するための方法が必要である。しかし、既存の方法であるＰＣＲ−ＲＦＬＰなどの診断方法は、ＰＣＲを通じた試料ＤＮＡを増幅した後、突然変異特異的制限酵素で切断して切断如何をチェックする方法が主に用いられてきた（非特許文献１）。このような方式は、様々な診断において容易に診断が可能であるという利点があるが、依然として癌の初期診断などでは、偽陽性／陰性などに検索され正確な情報の提供には限界があるという欠点がある。
一方、従来の分子診断方法であるＰＣＲまたはＩＣＡ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｃｈａｉｎ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）などは、類似した配列を有する類似種の遺伝子型の分析が困難であるという点があった。例えば、病原性細菌／ウイルスと非病原性細菌／ウイルスと非常に類似した配列を有する場合、韓牛と輸入牛のようにほぼ類似するが、特定の部位で異なる配列を有する場合など、類似種または同種内の他の個体のゲノムを特異的に検出する方式が必要である。既存の分子診断方法が類似した配列を完全に区別しなければ偽陽性／陰性が発生する可能性が高いためである。
米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書 米国特許出願公開第２００６／０１８８９８７号明細書 米国特許第６，４７９，６２６号明細書 米国特許第６，９０３，１８５号明細書 米国特許第７，１５３，９４９号明細書
Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．２００３ Ｍａｙ；２１（５）：５３５−４１ Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１ Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０ Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０ Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７ Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６
本発明者らは、より正確な診断及び遺伝子型分析方法を見出すために鋭意努力した結果、驚くべきことに、既存の診断または遺伝子型分析方法のパラダイムとは反対に、標的特異的ヌクレアーゼを用いて目的としないＤＮＡを切断してあらかじめ除去したり、目的ＤＮＡに対するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９タンパク質の複合体を利用して目的ＤＮＡは切断からマスキング（ｍａｓｋｉｎｇ）して目的としないＤＮＡを切断して除去することにより、突然変異などの変異または遺伝子型に差異がある、目的とする少量のＤＮＡを濃縮し得ることを確認した。また、目的ＤＮＡに対するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９タンパク質の複合体を利用して目的のＤＮＡを分離精製することにより、目的とする少量のＤＮＡを濃縮し得ることを確認した。特に、細胞由来のＤＮＡを対象に不活性化されたＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡを利用して、目的ＤＮＡを非共有結合により分離することができることを確認した。このように濃縮された目的とするＤＮＡを分子検出または分離精製することにより、癌の診断、癌の予後予測、妊娠産前診断、細胞／臓器移植など様々な分野に利用できることを確認し、本発明を完成した。
本発明の一つの目的は、（ｉ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記特定の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する他の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップとを含む、遺伝子型分析方法を提供することにある。
本発明の他の一つの目的は、（ｉ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、他の遺伝子型ＤＮＡを認識するＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、前記他の遺伝子型ＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記他の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップとを含む、遺伝子型分析方法を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、（ｉ）細菌ＤＮＡを含む分離された試料に非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを処理して非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡを切断して試料内から除去するステップ、及び（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内に病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供することにある。
さらに、本発明の他の目的は、（ｉ）病原性細菌ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して病原性細菌またはウイルスＤＮＡを非病原性細菌またはウイルスに特異的なＲＧＥＮの切断からマスキングして保
護し、分離された試料内の非病原性細菌またはウイルスＤＮＡを試料内から切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料に病原性細菌またはウイルスＤＮＡを分析するステップを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供することにある。
さらに、本発明の他の目的は、二種類以上のＤＮＡを含む分離された試料から目的とするＤＮＡを、前記目的とするＤＮＡに特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップとを含む、目的とするＤＮＡを分離する方法を提供することにある。
さらに、本発明の他の目的は、遺伝体ＤＮＡを含む分離された試料から目的とするＤＮＡを、前記目的とするＤＮＡに特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップを含む、目的とするＤＮＡを分離する方法を提供することにある。
さらに、本発明の他の目的は、（ｉ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型に特異的な不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップ、及び（ｉｉ）前記分離された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップとを含む、遺伝子型分析方法を提供することにある。
本発明は、従来の遺伝子型分析方法または診断方法とは全く反対の概念で、試料内の目的とするＤＮＡの増幅前に目的としないＤＮＡ、例えば、正常ＤＮＡを標的特異的ヌクレアーゼ、例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＲＧＥＮを利用して切断したり、目的とするＤＮＡを不活性化されたＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体を利用して目的とするＤＮＡを分離するなど、目的とするＤＮＡを濃縮することにより、遺伝子型分析または癌の診断をもたらすことができる。本発明の方法では、目的ＤＮＡの検出前に、これを濃縮する過程を経ることにより偽陽性／陰性の信号などを除去して癌の初期に診断を可能にする方法を提供するだけでなく、癌患者の予後予測において正確な診断が可能な新たなパラダイムの方法を提供する。また、これにより癌細胞を早期診断したり、癌の予後予測、手術及び化学療法後の転移癌の発生のモニタリングなどが可能である。
ＲＧＥＮを利用して標的ＤＮＡを濃縮する本発明に係る二つの方法に関する模式図を示した図である。 遺伝子ハサミにより誘導された突然変異の割合を増加させる方法の模式図を示した図である。 ０．００５４％〜５４％の突然変異率を有している遺伝体ＤＮＡの混合物において切断前と切断後の突然変異率の変化を確認した図である。 癌遺伝子の突然変異の診断を、本発明の新たなパラダイムを適用して行えるかどうかを確認する方法に関する模式図を示した図である。 癌遺伝子の突然変異に関するＲＦＬＰ用ＲＧＥＮの開発及びその結果を示した図である。 癌遺伝子の突然変異に関するＲＦＬＰ用ＲＧＥＮを利用して確認した結果を示した図である。 ＣＵＴ−ＰＣＲを用いた変異遺伝子の増幅及び検出過程の模式図を示した図である。 プラスミドを用いたＫＲＡＳ変異遺伝子検出の実験結果を示した図である。右側の図は野生型及び変異ＫＲＡＳを含むプラスミドを示す。ＷＴ：野生型の正常遺伝子、ＭＴ：変異遺伝子。 ＫＲＡＳ正常及び変異遺伝子の割合（左）とＫＲＡＳ変異遺伝子の割合の増加率（右）を示した図である。 様々な進行段階の大腸癌患者と健常者の血漿から得た細胞遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ＤＮＡ）を利用してＣＵＴ−ＰＣＲを２回行った結果を示す図である。血漿から得たそれぞれの細胞遊離ＤＮＡに対して発生頻度の高いＫＲＡＳのｃ．３５Ｇ＞ Ａ、ｃ．３５Ｇ＞ Ｔ変異遺伝子をそれぞれターゲットし、１番目及び２番目のサイクルで増幅された変異遺伝子数（％）を示した。ＲＧＥＮ １ｓｔ：正常遺伝子特異的なＲＧＥＮを一回処理してＰＣＲした結果、ＲＧＥＮ ２ｎｄ：正常遺伝子特異的なＲＧＥＮを二回処理してＰＣＲした結果。 ｄＣａｓ９を利用した標的ＤＮＡ断片精製実験過程に対する模式図を示した図である。 プラスミド断片をｄＣａｓ９を利用して精製する実験過程に対する模式図を示した図である。 それぞれの標的ＤＮＡを１つのｓｇＲＮＡまたは２つのｓｇＲＮＡで精製した結果を示した図である。Ｉｎｐｕｔは精製前のプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断したサンプルである。 ３つの標的ＤＮＡ中、２つの標的ＤＮＡを精製した結果を示した図である。Ｉｎｐｕｔは精製前のプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断したサンプルである。 標的ＤＮＡの精製後に観察される各標的ＤＮＡのアガロースゲルバンドの強度（％）を示した図である。 ＨｅＬａ細胞とＳＷ４８０細胞のＴＰ５３遺伝子エクソン（ｅｘｏｎ）を精製し、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ｑＰＣＲを行った結果を示した図である。 類似した配列の病原性細菌ＤＮＡを区別して診断・確認する方法に対する模式図を示した図である。
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを除去し、目的とする他の遺伝子型ＤＮＡを分析する方法を提供する。
具体的には、前記遺伝子型分析方法は、（ｉ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）目的とする他の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップとを含む、遺伝子型分析の方法によって行うことができる。
前記他の遺伝子型ＤＮＡはＰＣＲによる増幅、またはその他の当業界の公知の方法で検出する方法により確認することができる。
具体的には、ＰＣＲ、シーケンシング（例えば、ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）、標的特異的ヌクレアーゼを用いるＲＦＬＰ（例えば、ＲＧＥＮ ＲＦＬＰ）を利用して他の遺伝子型ＤＮＡを分析することができる。
前記記述された除去は、特定の遺伝子型ＤＮＡを切断してＰＣＲなどで増幅することができないという概念を含むものであり、試料内における完全または一部の除去を含む概念である。
より具体的には、前記方法は、（ａ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップ、（ｂ）前記特定の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する他の遺伝子型ＤＮＡを増幅するステップ、 及び（ｃ）前記増幅された他の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含めて行う、遺伝子型分析方法を提供することができる。
さらに、前記遺伝子型分析方法は、他の遺伝子型ＤＮＡが癌由来ＤＮＡである場合、癌の診断のための情報を提供するための、遺伝子型分析方法であってもよい。
具体的には、前記癌の診断方法は、前記ステップ（ａ）の特定の遺伝子型ＤＮＡは野生型ＤＮＡであり、分離された試料内の野生型ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼにより前記野生型ＤＮＡを切断して試料内から除去するステップであり、前記ステップ（ｂ）の他の遺伝子型ＤＮＡは癌特異的な突然変異を含むＤＮＡであり、前記野生型ＤＮＡが除去された試料内の癌特異的な突然変異ＤＮＡを増幅するステップであり、及び前記ステップ（ｃ）の配列を分析して癌の診断のための情報を提供するための、方法であってもよい。
本発明者らは、従来の診断方法または遺伝子型分析方法のパラダイムとは異なる全く新たな方法である、正常ＤＮＡを標的特異的ヌクレアーゼで切断して試料内で除去した後、少量の癌由来ＤＮＡのみを増幅してＲＦＬＰまたは配列分析を行う場合、偽陽性／偽陰性が現われずに診断できることを確認して本発明を完成した。このようにＰＣＲなどの増幅前に突然変異ＤＮＡではなく、正常ＤＮＡを切断して除去するという概念は、本発明者らによって初めて開発された概念である。
本発明において、用語「標的特異的ヌクレアーゼ」とは、目的とするゲノム上のＤＮＡの特定の位置を認識して切断可能なヌクレアーゼであってもよい。前記ヌクレアーゼは、ゲノム上の特定の標的配列を認識するドメインと切断するドメインが融合されたヌクレアーゼが含まれてもよく、その例としてメガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、ゲノム上の特定の標的配列を認識するドメインである植物病原性遺伝子に由来するＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ
ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＴＡＬ作動因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）ドメインと切断するドメインが融合された融合タンパク質、ジンク−フィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、またはＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を制限なく含むことができる。本発明の目的上、ＲＧＥＮを利用した方法は、簡単でありながらも、より好ましい結果をもたらすことができる。
本発明の他の具現例において、前記ヌクレアーゼは、ジンク−フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であってもよい。ＺＦＮは、選択された遺伝子及び切断ドメインまたは切断ハーフ−ドメイン内の標的部位に結合するように操作されたジンク−フィンガータンパク質を含む。ジンク−フィンガー結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作することができる。例えば、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６を参照する。自然発生したジンクフィンガータンパク質と比較し、操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、新規な結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的な設計及び様々なタイプの選択が含まれるが、これに限定されない。合理的設計としては、例えば、三重（または四重）ヌクレオチド配列、及び個別ジンクフィンガーのアミノ酸配列を含むデータベースの利用が含まれるが、このとき、各三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重の配列に結合するジンクフィンガーの一つ以上の配列と連合される。
標的配列の選択、融合タンパク質（及びそれを暗号化するポリヌクレオチド）の設計と構成は、当業者において公知となっており、全文が参考資料として添付される特許文献１及び特許文献２に詳しく説明される。また、このような参考文献及び他の文献に開示された通り、ジンクフィンガードメイン及び／または多重−フィンガージンクフィンガータンパク質が、任意の適切なリンカー配列、例えば、５個以上のアミノ酸の長さのリンカーを含むリンカーにより共に連結することができる。６個以上のアミノ酸の長さのリンカー配列の例は、特許文献３、特許文献４、特許文献５を参照とする。ここで説明するタンパク質は、タンパク質の各ジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含む
ことができる。
また、ＺＦＮ及び／またはメガヌクレアーゼのようなヌクレアーゼは、切断ドメインまたは切断ハーフ−ドメインを含む。前記周知のように、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと一つのヌクレアーゼからの切断ドメインまたはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインとは異なるヌクレアーゼからの切断ドメインのように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに異種性であってもよい。異種性切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼ剤やエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来しうる例示的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼを含むが、これに限定されない。
類似して、切断ハーフ−ドメインは、上述したように、切断活性のために二量体化を必要とする任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。融合タンパク質が切断ハーフ−ドメインを含む場合、一般的に２つの融合タンパク質が切断に必要である。代案として、２つの切断ハーフ−ドメインを含む単一タンパク質が使用されてもよい。２つの切断ハーフ−ドメインは、同一なエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することもでき、または各切断ハーフ−ドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することもできる。また、２つの融合タンパク質の標的部位は、２つの融合タンパク質と、その各標的部位の結合により切断−ハーフドメインが互いに対して空間的に配向されて位置されることにより、切断ハーフ−ドメインが、例えば、二量体化により機能性切断ドメインを形成することができるようにする関係で配置されることが好ましい。したがって、一具現例において、５−８個のヌクレオチドまたは１５〜１８個のヌクレオチドにより標的部位の隣接エッジが分離される。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２つの標的部位の間に介在され得る（例えば、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）。一般に、切断部位は標的部位の間に置かれる。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに配列−特異的に結合し（標的部位で）、すぐに結合部位やその付近でＤＮＡを切断することができる。如何なる制限酵素（例えば、Ｔｙｐｅ ＩＩＳ）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合と切断可能なドメインを有する。例えば、Ｔｙｐｅ ＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、一本鎖上の認識部位から９個のヌクレオチドで、そして残りの一本鎖上の認識部位から１３個のヌクレオチドからのＤＮＡの二重鎖の切断を触媒する。したがって、一具現例において、融合タンパク質は、少なくとも１つのＴｙｐｅ ＩＩＳ制限酵素からの切断ドメイン（または切断ハーフ−ドメイン）と１つ以上の亜鉛−フィンガー結合ドメイン（操作されることもあり、そうでないこともある）を含む。
本発明において、用語「ＴＡＬＥＮ」とは、ＤＮＡのターゲット領域を認識及び切断することができるヌクレアーゼを指す。ＴＡＬＥＮはＴＡＬＥドメイン及びヌクレオチド切断ドメインを含む融合タンパク質を指す。本発明において、「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ」及び「ＴＡＬＥＮ」という用語は、互換が可能である。ＴＡＬエフェクターはキサントモナスウイルスが様々な植物種に感染されるとき、これらのタイプＩＩＩ分泌システムを通じて分泌されるタンパク質である。前記タンパク質は、宿主植物内のプロモーター配列と結合してバクテリア感染を助ける植物遺伝子の発現を活性化させることができる。前記タンパク質は、３４個以下の様々な数のアミノ酸の繰り返しで構成された中心繰り返しドメインを通じて植物のＤＮＡ配列を認識する。したがって、ＴＡＬＥはゲノム工学のツールのための新規なプラットフォームになることができると考えられる。ただし、ゲノム−編集活性を有する機能ＴＡＬＥＮを製作するために、次のように、現在まで知られていなかった少数の主要なパラメータが定義されなければならない。ｉ）ＴＡＬＥの最小ＤＮＡ−結合ドメイン、ｉｉ）一つのターゲット領域を構成する２つの半分−座間のスペーサーの長さ、及びｉｉｉ）ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをｄＴＡＬＥに連結するリン
カーまたは融合接合（ｆｕｓｉｏｎ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）。
本発明のＴＡＬＥドメインは、一つ以上のＴＡＬＥ−繰り返しモジュールを介して配列−特異的な方式でヌクレオチドに結合するタンパク質ドメインを指す。前記ＴＡＬＥドメインは、少なくとも一つのＴＡＬＥ−繰り返しモジュール、好ましくは１〜３０個のＴＡＬＥ−繰り返しモジュールを含むが、これに限定されない。本発明において、「ＴＡＬエフェクタードメイン」及び「ＴＡＬＥドメイン」という用語は、互換可能である。前記ＴＡＬＥドメインはＴＡＬＥ−繰り返しモジュールの半分を含むことができる。
本発明において、用語「ＲＧＥＮ」とは、標的ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質からなるヌクレアーゼを意味する。
本発明において、用語「Ｃａｓタンパク質」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要タンパク質構成要素であり、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）と複合体を形成して活性化されたエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）を形成する。
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であってもよいが、これに限定されない。また、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｓ）由来であってもよいが、これに限定されない。
Ｃａｓタンパク質または遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができるが、これに限定されない。
Ｃａｓタンパク質は、タンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）と連結されてもよい。前記タンパク質伝達ドメインは、ポリ−アルギニンまたはＨＩＶ由来のＴＡＴタンパク質であってもよいが、これに限定されない。
Ｃａｓタンパク質は、目的に応じて分離及び／または精製に有利なタグと連結され得る。その例として、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓタグ、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ
Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タグ、ＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、ＣＢＰ（ｃｈｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）タグ、ポリグルタミン酸（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅ）タグ、Ｅタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＳＢＰタグ、ソフタグ１（ｓｏｆｔａｇ １）、ソフタグ３（ｓｏｆｔａｇ ３）、ストレプ（ｓｔｒｅｐ）タグ、ＴＣタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＢＣＣＰ（ｂｉｏｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、またはＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグなどを目的に応じて連結することができるが、これに限定されない。
本発明において、用語「ガイド（ｇｕｉｄｅ）ＲＮＡ」とは、標的ＤＮＡ特異的なＲＮＡを意味し、Ｃａｓタンパク質と結合してＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡに導くことができる。前記標的ＤＮＡは、目的とするＤＮＡと混合することができる。
本発明においてガイドＲＮＡは、二つのＲＮＡ、即ち、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）で構成されてもよい。またはｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分の融合で製造されたｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ＲＮＡ）であってもよい。
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌＲＮＡ）であってもよい。
ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡと結合することができる。
ＲＧＥＮは、Ｃａｓタンパク質及びｄｕａｌＲＮＡで構成されるか、またはＣａｓタンパク質及びｓｇＲＮＡで構成されてもよい。ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡまたはｄｕａｌＲＮＡのｃｒＲＮＡの５’末端に１つ以上の追加のヌクレオチドを含むことができる。
ガイドＲＮＡは、細胞内にＲＮＡまたは前記ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で伝達されてもよい。
前記癌の診断は、初期診断であってもよい。
前記癌の診断は、癌の予後を予測する方法であってもよい。
前記突然変異を含むＤＮＡは、癌細胞由来であってもよい。
前記二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料は、癌の疑いのある個体から分離された血液試料であってもよい。
前記遺伝子型分析方法は、細胞または臓器移植を受けた個体の予後予測に関する情報を提供するために用いることができ、この場合、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは、細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つの以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、細胞または臓器移植を受けた個体の分離された試料から、前記個体のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは、移植を受けた細胞または臓器のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記個体のＤＮＡが除去された試料内に、移植を受けた細胞または臓器のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。
前記遺伝子型分析方法は、また、犯罪現場に関する情報を収集するために用いることができ、この場合、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記被害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記被害者のＤＮＡが除去された試料内に、加害者のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。または、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記加害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記加害者のＤＮＡが除去された試料内に、被害者のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。
もう一つの態様として、本発明は、特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用する、遺伝子型分析方法を提供する。
具体的には、前記方法は、（ｉ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質を利用して二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、他の遺伝子型ＤＮＡを認識するＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、前記他の遺伝子型ＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記他の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含む、遺伝子型分析方法であってもよい。
より具体的には、前記方法は、（ａ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質を利用して二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の前記特定の遺伝子型ＤＮＡを、他の遺伝子型ＤＮＡを認識するＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、前記他の遺伝子型ＤＮＡを切断して除去するステップ、（ｂ）前記他の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含めて行う、遺伝子型分析方法を提供する。
さらに、前記遺伝子型分析方法は、他の遺伝子型ＤＮＡが癌由来のＤＮＡである場合、癌の診断のための情報を提供するための、遺伝子型分析方法であってもよい。
具体的には、前記癌の診断は、前記ステップ（ａ）の他の遺伝子型ＤＮＡは野生型ＤＮＡであり、特定の遺伝子型ＤＮＡは癌特異的な突然変異を含むＤＮＡであり、突然変異を含む特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる、不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）を利用して野生型ＤＮＡに特異的なＲＧＥＮの切断から特定の遺伝子型ＤＮＡをマスキングして保護し、分離された試料内野生型ＤＮＡを切断して除去するステップ、（ｂ）前記野生型ＤＮＡが除去された試料内の癌特異的突然変異を含むＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された突然変異を含むＤＮＡを分析して癌の診断のための情報を提供するための、方法であってもよい。
前記癌の診断は、癌の初期診断であってもよい。
前記癌の診断は、癌の予後を予測する方法であってもよい。
前記突然変異を含むＤＮＡは癌細胞由来であってもよい。
前記二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料は、癌の疑いのある個体から分離された試料であってもよい。具体的には、ｃｆＤＮＡを含む分離された血液試料またはｃｆＤＮＡ試料であってもよい。
本発明において、用語「不活性化されたＲＧＥＮ」とは、ヌクレアーゼの機能が全部又は一部不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質を含むＲＧＥＮを意味する。前記不活性化されたＣａｓはｄＣａｓと命名される。前記ＣａｓはＣａｓ９タンパク質であってもよい。不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質の製造は、ヌクレアーゼの活性が不活性化される方法は、制限なく含まれるが、その例として、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質にＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ変異を導入して製造することができる。Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９、Ｈ８４０Ａ Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質、即ち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質中、一つの活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）にのみ変異を導入して作製したＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、ガイドＲＮＡと結合したとき、ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）として作用することができる。
このようなニッカーゼは、２つを使用する場合、両方のＤＮＡ鎖の両方とも切断してＤＳＢ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋａｇｅ）を引き起こすことができるため、ＲＧＥＮのカテゴリに含まれる。
また他の例としてＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質にＤ１０ＡとＨ８４０Ａ突然変異をいずれも導入してＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｃａｓ９タンパク質、即ち、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの両活性部位にいずれも突然変異を導入して作製したｄＣＡＳ９タンパク質は、ガイドＤＮＡと結合したとき、ＤＮＡを切断しないＤＮＡ結合複合体として作用し得る。
前記遺伝子型分析方法は、細胞または臓器移植を受けた個体の予後予測に関する情報を
提供するために用いることができ、この場合、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは、細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つの以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、細胞または臓器移植を受けた個体の分離された試料から、前記個体のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは、移植された細胞または臓器のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記個体のＤＮＡが除去された試料内に、移植された細胞または臓器のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。
前記遺伝子型分析方法は、また、犯罪現場に関する情報を収集するために用いることができ、この場合、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記被害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記被害者のＤＮＡが除去された試料内に、加害者のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。または、前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡは加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）は、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記加害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡは被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）は、前記加害者のＤＮＡが除去された試料内に、被害者のＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。
もう一つの態様として、本発明は、（ｉ）細菌またはウイルスＤＮＡを含む分離された試料に非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを処理して非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡを切断して試料内から除去するステップ、（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内に病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを分析するステップを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供する。
具体的には、前記方法は、（ａ）細菌またはウイルスＤＮＡを含む分離された試料に非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを処理して非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡを切断して試料内から除去するステップ、（ｂ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内の病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを分析するステップを含めて行う、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供する。
前記ヌクレアーゼは、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ
ｎｕｃｌｅａｓｅ）、及びＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）からなる群から選択されたヌクレアーゼであるものであってもよいが、これに限定されない。
もう一つの態様として、本発明は、（ｉ）病原性細菌またはウイルスＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）を利用して病原性細菌またはウイルスＤＮＡを非病原性細菌またはウイルスに特異的なＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、分離された試料内の非病原性細菌またはウイルスＤＮＡを試料内から切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料に病原性細菌またはウイルスＤＮＡを分析するステップを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供
する。
具体的には、前記方法は、（ａ）病原性細菌またはウイルスＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）を利用して病原性細菌またはウイルスＤＮＡを非病原性細菌またはウイルスに特異的なＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、分離された試料内の非病原性細菌またはウイルスＤＮＡを試料内から切断して除去するステップ、（ｂ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内の病原性細菌またはウイルスＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された病原性細菌またはウイルスＤＮＡを分析するステップを含めて行う、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法を提供する。
もう一つの態様として、本発明は、二種類以上のＤＮＡを含む分離された試料から目的とするＤＮＡを、前記目的とするＤＮＡに特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップを含む、目的とするＤＮＡを分離する方法を提供する。
具体的には、前記目的とするＤＮＡを分離する方法は、目的とするＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）が、目的とするＤＮＡとｄＣａｓ−ｇＲＮＡ−目的とするＤＮＡの複合体を形成するステップ、及び前記複合体を前記試料から分離するステップを含む、目的とするＤＮＡを分離する方法により行うことができる。
前記目的とするＤＮＡは、ＰＣＲによる増幅、または公知の方法で検出する方法により確認することができる。
前記分離方法は、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞−遊離 ＤＮＡ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ＤＮＡ）に適用することができ、ＤＮＡとｇＲＮＡ及びｄＣａｓタンパク質間の架橋共有結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｅ）の形成なしに行われるものであってもよい。
前記分離方法は、前記複合体から目的とするＤＮＡを分離するステップをさらに含むことができる。
目的とするＤＮＡを分離するために、前記不活性化されたＣａｓタンパク質は、分離のための親和性タグ（ｔａｇ）を含むことができ、例えば、前記親和性タグは、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓタグ、ＧＳＴ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タグ、ＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、ＣＢＰ（ｃｈｉｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリン（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）タグ、ポリグルタミン酸（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅ）タグ、Ｅタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＳＢＰタグ、ソフタグ１（ｓｏｆｔａｇ １）、ソフタグ３（ｓｏｆｔａｇ ３）、ストレプ（ｓｔｒｅｐ）タグ、ＴＣタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＢＣＣＰ（ｂｉｏｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグ、またはＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）タグであってもよいが、これに限定されるものではない。
前記不活性化されたＣａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質のＤＮＡ切断活性が欠如したものであってもよく、具体的には、前記不活性化されたＣａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０ＡまたはＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９タンパク質変異体であってもよいが、これに限定されるものではない。
前記Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｓ）由来であってもよい。
前記方法は、前記タグに結合する親和性カラムまたは磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ
ｂｅａｄ）を利用して目的とするＤＮＡを分離するものであってもよい。例えば、前記分離のための親和性タグはＨｉｓタグであり、前記Ｈｉｓタグに結合する金属親和性カラム（ｍｅｔａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎ）または磁性ビーズを用いて目的とするＤＮＡを分離するものであってもよく、前記磁性ビーズは、例えば、Ｎｉ−ＮＴＡ磁性ビーズであってもよいが、これに限定されるものではない。
前記複合体から目的とするＤＮＡの分離は、ＲＮａｓｅ及びタンパク質加水分解酵素を利用して行われるものであってもよい。
前記目的とするＤＮＡを分離する方法を利用して二種類以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料から特定の遺伝子型ＤＮＡを分離することができ、二つ以上の目的とするＤＮＡを分離することもできる。二つ以上の目的とするＤＮＡを分離する場合、二つ以上の目的とするＤＮＡのそれぞれに特異的なガイドＲＮＡを利用して目的とするＤＮＡを分離することができる。
前記ガイドＲＮＡは、単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよく、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌＲＮＡ）であってもよい。また、前記ガイドＲＮＡは、分離されたＲＮＡ形態であるか、またはプラスミドにコードされている形態であってもよい。
もう一つの態様として、本発明は、遺伝体ＤＮＡを含む分離された試料から目的とするＤＮＡを、前記目的とするＤＮＡに特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップを含む、目的とするＤＮＡを分離する方法を提供する。
具体的には、前記方法は、目的とするＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）が、目的とするＤＮＡとｄＣａｓ−ｇＲＮＡ−目的とするＤＮＡの複合体を形成するステップ、及び前記複合体を前記試料から分離するステップを含めて行われるものであってもよい。
前記目的とするＤＮＡを分離する方法の各ステップの構成は、前述した通りである。
もう一つの態様として、本発明は、（ｉ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型に特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップ、及び（ｉｉ）前記分離された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含む、遺伝子型分析方法を提供する。
具体的には、前記分析方法は、（ａ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料から特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて分離するステップ、（ｂ）前記分離された特定の遺伝子型ＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含めて行うものであってもよい。
併せて、前記遺伝子型分析方法は、特定の遺伝子型ＤＮＡが癌由来のＤＮＡである場合、癌の診断用の情報を提供するための遺伝子型分析方法であってもよい。
具体的には、前記癌の診断方法は、前記特定の遺伝子型ＤＮＡは、癌特異的な突然変異を含むＤＮＡであり、前記特定の遺伝子型ＤＮＡを分析して癌の診断用の情報を提供するための方法であってもよい。
本発明者らは、特定の遺伝子型に特異的な、不活性化されたヌクレアーゼを用いて特定の遺伝子型ＤＮＡを精製した後、少量の癌由来ＤＮＡのみを増幅してＲＦＬＰまたは配列分析を行う場合、偽陽性／偽陰性が現われずに診断できることを確認し、本発明を完成した。
前記ヌクレアーゼは、例えば、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、またはＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
前記癌の診断は、癌の初期診断であってもよく、癌の予後を予測するものであってもよい。
前記方法は、具体的には、（ｉ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ）を前記試料に処理してｄＣａｓ−ｇＲＮＡ−特定の遺伝子型ＤＮＡの複合体を形成するステップ、及び前記複合体を前記試料から分離するステップ、（ｉｉ）前記複合体に分離された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含むものであってもよい。
前記不活性化されたＣａｓタンパク質は分離のための親和性タグ（ｔａｇ）を含むことができ、その例は先に説明した通りである。
前記不活性化されたＣａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質の切断活性が欠如したものであってもよく、これについては前述した通りである。
前記方法は、前記タグに結合する親和性カラムまたは磁性ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ）を利用して特定の遺伝子型ＤＮＡを分離するものであってもよい。
前記複合体からの特定遺伝子型ＤＮＡの分離は、ＲＮａｓｅ及びタンパク質加水分解酵素を利用して行われるものであってもよい。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものとは解釈されない。
（実施例）
実施例１：標的特異的ヌクレアーゼを用いた標的ＤＮＡの濃縮の確認
標的特異的ヌクレアーゼを用いた標的ＤＮＡの濃縮が可能であるかを確認するために、標的特異的ヌクレアーゼの代表的な例であるＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を利用して標的ＤＮＡの濃縮を確認した。
その模式図を図１に示した。
即ち、図１で示されるように、正常ＤＮＡではなく、突然変異したＤＮＡ配列（ボックスに表示された部分）を含むゲノムを下記の二種類の方法により標的ＤＮＡを濃縮することを確認する。
１）突然変異したＤＮＡをマスキング（ｍａｓｋｉｎｇ）して捕獲する方法：
標的配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質（ｄｅａｄ Ｃａｓ９タンパク質またはｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃａｓ９タンパク質）からなるＲＧＥＮを利用して、突然変異したＤＮＡをランダム切断酵素の切断からマスキングして保護したり、捕獲して標的ＤＮＡを増幅して濃縮する方法。
２）正常ＤＮＡを除去した後、増幅する方法：
正常ＤＮＡを非標的配列特異的ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなるＲＧＥＮで切断して除去した後、標的ＤＮＡを増幅して濃縮する方法。
実施例２：遺伝子ハサミにより誘導された極小量の突然変異観測
ＲＧＥＮにより細胞内の標的、または標的の類似配列に誘導された突然変異の割合が非常に低いとき、これを観察するためには、正常ＤＮＡに対する突然変異ＤＮＡの割合を増加させる過程が必要である。そのため、ＲＧＥＮが処理された細胞から遺伝体ＤＮＡを分離した後、標的の正常配列のみを認識するＲＧＥＮを処理して突然変異がある遺伝体ＤＮＡは残して正常遺伝体ＤＮＡだけを切り取った（図２）。その後、ＰＣＲを通じて標的の周りの配列を増幅させると、切断されない突然変異遺伝体ＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の割合が、切断された正常遺伝体ＤＮＡから増幅されたＰＣＰ産物より相対的に増えるようになる。
具体的には、ＶＥＧＦＡ遺伝子を切断するＲＧＥＮを細胞内に処理して突然変異を誘導した後、この細胞の遺伝体ＤＮＡを分離し、突然変異を観測しようとする標的類似配列に対するそれぞれのＲＧＥＮを利用して正常ＤＮＡを切断した。その後、切断された配列の周辺をＰＣＲで増幅させた後、シーケンス（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）機械で配列を読み出して正常ＤＮＡと突然変異ＤＮＡの割合を観察した。その結果、ＲＧＥＮで切断されない場合と比較したとき、最高１．４〜３０倍程度の突然変異率の増加が観察された（表１）。
（Ｍｏｃｋ＿ｕｎｃｕｔ：正常細胞のｇＤＮＡを切断していないサンプル、Ｍｏｃｋ＿ｃｕｔ：正常細胞のｇＤＮＡを切断したサンプル、ＲＧＥＮ＿ｕｎｃｕｔ：ＲＧＥＮによる突然変異が誘導された細胞のｇＤＮＡを切断していないサンプル、ＲＧＥＮ＿ｃｕｔ：ＲＧＥＮによる突然変異が誘導された細胞のｇＤＮＡを切断したサンプル）
次に、非常に少ない突然変異の割合でどれだけの突然変異配列の増加が見られたかを確認するために、ＦＡＮＣＦ遺伝子に対するＲＧＥＮを細胞に処理し、５４％の突然変異を含む遺伝体ＤＮＡの混合物を得た。
その後、前記突然変異遺伝体ＤＮＡの混合物に、正常遺伝体ＤＮＡの量を１０倍ずつ増やしながら混ぜて０．００５４％から５４％までの割合で突然変異が混在している遺伝体ＤＮＡの混合物を得、これを再び前記ＦＡＮＣＦ遺伝子の正常配列だけを切断するＲＧＥＮで切断した。その結果、すべての突然変異の割合の範囲で、切断した後の突然変異の割合が増加し、最大５２０倍（２．８％／０．００５４％）増加する効果を確認した（図３）。
前記実験で使用されたＲＧＥＮの標的塩基配列及びｓｇＲＮＡ配列は、表２にまとめた。
実施例３：癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）に高い頻度で発生する突然変異の診断確認
一般的な癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）は、野生型の正常ＤＮＡとは異なり、突然変異を有している。このような癌遺伝子の突然変異を有している断片は、試料内に１％以下、一般的には０．０１％〜０．１％以下で混在しているので観察が困難で、初期癌の診断が困難である。
よって、このような癌遺伝子の突然変異の診断を、本発明の新たなパラダイムを適用して行うことができるかどうかを確認する方法を図４に模式図で示した。
即ち、検診患者の血漿ＤＮＡ内の突然変異が存在する癌遺伝子の存在を確認する方法において、本発明の新しいパラダイムの方法の優秀性を確認するために、正常なＤＮＡを切断しない対照区（濃縮前）及び正常なＤＮＡをＲＧＥＮを利用して切断した後、突然変異が存在する癌遺伝子の切片だけを増幅した実験区（濃縮後）を利用してそれぞれＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）及び配列分析を行った結果、ＲＦＬＰ分析の際、対照群では１％以下で混在している標的ＤＮＡ切片の観察が困難であることが確認された。しかし、実験区は標的ＤＮＡ切片である突然変異癌遺伝子を容易に確認することができる。
さらに、配列分析結果も対照区は０．０１％〜０．１％以下で混在している標的ＤＮＡ断片の観察は困難であるが、実験区は正確に標的ＤＮＡだけを対象に配列分析を行うことができるため、観察が容易なことを確認することができる。
実施例４：癌遺伝子の突然変異に対するＲＦＬＰ用ＲＧＥＮ製造
本発明者らは、癌遺伝子の突然変異に対するＲＦＬＰ用ＲＧＥＮの製造を試みた。
例えば、様々な癌から高頻度で突然変異が発生するＫ−Ｒａｓ癌遺伝子の突然変異ホットスポット（ｈｏｔｓｐｏｔ）の１２番目のアミノ酸の位置に対する突然変異（Ｇ１２Ｓ）特異的または正常なＤＮＡ特異的ＲＧＥＮを開発した（図５）。
よって、このようなＫ−Ｒａｓ Ｇ１２Ｓ突然変異を含む癌患者の血漿ＤＮＡから、前記実施例１の二つの方法が適用されるか否かを実験を通じて確認し、その結果を図６に示した。図６に示されるように、偽陰性などがなく、Ｋ−ＲＡＳ Ｇ１２Ｓ突然変異を正確に確認できることが分かる。
実施例５：ＲＧＥＮを利用した極小量のｃｔＤＮＡ突然変異の高感度観測技術の開発
次に、癌特異的マーカーであるｃｔＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ）を標的として癌の早期診断を試みた。早期癌患者のｃｔＤＮＡは、正常遺伝子に混在し、血液中に非常に少量存在するため、体液内に循環する細胞遊離ＤＮＡ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ＤＮＡ）中に微量存在するｃｔＤＮＡを増幅して検出する。発癌遺伝子中に頻繁に発生する変異を含むＤＮＡを残し、正常遺伝子にのみ特異的に作動するＲＧＥＮ（ＲＮＡ Ｇｕｉｄｅｄ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）を製作して処理することによって、正常遺伝子のみを切断して変異遺伝子がＰＣＲにより正常遺伝子に比べて相対的に増幅されるようになる。その後Ｉｎｄｅｘ ＰＣＲと標的化されたディープシーケンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行って得た塩基配列情報によって、正常遺伝子に比べて増加した変異遺伝子の割合を算出することができる（図７）。
まず、高濃度の正常遺伝子と混合した変異遺伝子が検出できるかどうかをＣＵＴ−ＰＣＲで確認するために、大腸癌に発生頻度の高い遺伝子（ＫＲＡＳ）の変異遺伝子（ＫＲＡＳ ｃ．３５Ｇ＞ Ａ、ｃ．３５Ｇ＞ Ｔ）と、正常遺伝子（ＫＲＡＳ ｃ．３５Ｇ）を含むプラスミドをそれぞれ作成し、様々な割合で混合して変異遺伝子が正常遺伝子に比べて少ない割合（１／１０００の水準まで）で希釈した状態で、ＣＵＴ−ＰＣＲ（正常遺伝子特異的ＲＧＥＮ処理後のＰＣＲ）を行った。ＫＲＡＳ正常遺伝子を切断し、Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ比ＫＲＡＳ、正常遺伝子が増幅された割合を算出した。また、発生頻度の高い癌誘発変異遺伝子を正常遺伝子で１／１０００に希釈した濃度でＣＵＴ−ＰＣＲを通じて変異遺伝子が増加される倍率を算出した。前記正常遺伝子特異的ＲＧＥＮの標的塩基配列及びｓｇＲＮＡ塩基配列は表３で示した。
その結果、対照群プライマーで増幅された産物に比べてＫＲＡＳ遺伝子を増幅したとき、正常遺伝子特異的に製作されたＲＧＥＮが正常遺伝子に正確に作動することを確認した（図８）。さらに、増幅された産物の変異が起こった部分をディープシーケンシング（ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で分析したとき、ＫＲＡＳ変異遺伝子が正常遺伝子に１／１０００に希釈された程度で、最大３０〜４０倍程度が増幅されて正確に検出されることを示した（図９、表４）。
＜大腸癌変異中、発生頻度が最も高い５つの単一塩基置換変異の塩基配列情報と、ＰＡＭと認識される領域の変異を利用して正常遺伝子のみを切断することができるｓｇＲＮＡの標的塩基配列情報を示した。正常遺伝子特異的ＲＧＥＮの処理前、処理後のそれぞれの変異の増加率を算出した。太い色文字：ＰＡＭ塩基配列、下線で示された部分：置換で生じた変異＞
前記プラスミド検証の後、人体の血漿から得た細胞遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）においても癌特異的な遺伝子変異を含んでいるｃｔＤＮＡ検出実験を行った。血漿中ｃｔＤＮＡが極少量含まれているため、ＣＵＴ−ＰＣＲ（正常遺伝子に特異的なＲＧＥＮ処理（表５）とＰＣＲ増幅）の過程を繰り返して行いながら変異遺伝子を増幅させた。その結果、健常者のサンプルよりも大腸癌患者から得られるサンプルにおいて発生頻度が高いＫＲＡＳ変異（ｃ．３５Ｇ＞ Ａ（最大１９２倍）、ｃ．３５Ｇ＞ Ｔ（最大７９倍））が観測された（図１０）。ＣＵＴ−ＰＣＲで増幅された結果は、従来のパイロシーケンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で測定した結果よりも大幅に増加した敏感度を示す（表５）
。
実施例６：ｄＣＡＳ９：ｇＲＮＡ複合体を用いた標的ＤＮＡの濃縮
本発明では、特定の遺伝子型ＤＮＡを精製するためにガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）タンパク質からなる不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）を用いた。前記ｄＣａｓ９タンパク質には、精製のためのヒスチジンタグ（Ｈｉｓ ｔａｇ）が付いており、Ｈｉｓ ｔａｇと選択的に結合するＮｉ−ＮＴＡ磁石ビーズを用いてｄＣａｓ９タンパク質のみを選択的に精製することができる。また、ＤＮＡの塩基配列に特異的に結合することができるリボヌクレアーゼ活性を持たないｄＣａｓ９−タンパク質−ｓｇＲＮＡ複合体の性質を利用して目的とする標的ＤＮＡだけを選択的に精製することができる（図１１）。
実施例６−１．プラスミド断片の選択的分離
ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）によって目的とする標的ＤＮＡのみを分離できるか否かを確認するために、まず、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ、ｐＵＣ１９）をサイズで区別できるように制限酵素（ＳｐｅＩ、ＸｍａＩ、ＸｈｏＩ）で切断し、それぞれ４１３４ ｂｐ、２５７０ ｂｐ、及び１２６３ ｂｐのサイズのプラスミドＤＮＡ断片を製造した（図１２）。
その後、前記過程で制限酵素で切断されたそれぞれのプラスミドＤＮＡ断片に対するｓｇＲＮＡを２本ずつ製作し（４１３４ｂｐ＿ｓｇ＃１、４１３４ｂｐ＿ｓｇ＃２、２５７０ｂｐ＿ｓｇ＃１、２５７０ｂｐ＿ｓｇ＃２、１２６３ｂｐ＿ｓｇ＃１、及び１２６３ｂｐ＿ｓｇ＃２）、各標的ＤＮＡに対応するそれぞれのｓｇＲＮＡまたはこれらの組み合わせ（４１３４ｂｐ＿ｓｇ＃１＋２、２５７０ｂｐ＿ｓｇ＃１＋２、及び１２６３ｂｐ＿ｓｇ＃１＋２）を利用して精製過程を行った。それぞれのｓｇＲＮＡ塩基配列は下記表６の通りである。
＊ｓｇＲＮＡ配列は標的塩基配列と同一であり、ただし、ＴはＵである。
その後、ＤＮＡ：ｄＣａｓ９タンパク質：ｓｇＲＮＡ＝１：２０：１００のモル濃度比で計２００μｌの混合溶液を製造して混ぜた後、３７℃で１時間３０分間反応させた。その後、前記溶液をヒスチジンタグと特異的に結合することができるＮｉ−ＮＴＡ磁石ビーズ５０μｌと混合し、２００μｌの洗浄緩衝液で２回洗浄した後、２００μｌの溶出緩衝液（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋ−７２００）を用いてｄＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−標的ＤＮＡ複合体を精製した。
その後、ＲＮａｓｅ Ａ（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｅ８６６）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃で２時間反応させ、分解タンパク質加水分解酵素Ｋ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、１３０４Ｇ）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で添加して５５℃で４５分間反応させてｓｇＲＮＡ及びｄＣａｓ９タンパク質を除去した後、エタノール精製を通じて標的ＤＮＡだけを精製した。
その結果、ｓｇＲＮＡそれぞれまたは標的タンパク質に対するｓｇＲＮＡ ２種類を混合して使用した場合のいずれにも、３つのＤＮＡ断片から各サイズ別に目的とする標的ＤＮＡ断片のみ分離されて検出されることを確認することができた（図１３）。
また、２種類の標的ＤＮＡに対してｓｇＲＮＡをそれぞれ２個ずつ使用し、計４個のｓｇＲＮＡを利用して一度に複数の標的ＤＮＡを精製したとき、使用されたｓｇＲＮＡに対する標的ＤＮＡが混合されて精製されることを確認した（図１４）。
それぞれのプラスミドＤＮＡ断片を精製した結果を図１５に示した。これを通じてそれぞれの標的ＤＮＡが９５％以上純粋な状態で精製されることを確認することができた。
実施例６−２．標的エクソン（ｅｘｏｎ）の選択的分離の確認
次に、ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる不活性化されたＲＧＥＮ（ｄＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体）を通じて、実際細胞の遺伝体ＤＮＡ
（ｇＤＮＡ）上のエクソン（ｅｘｏｎ）を精製することができるかどうか確認するために、ＨｅＬａ細胞とＳＷ４８０細胞のｇＤＮＡを抽出し、４００ｂｐのサイズの断片に切断した後、標的エクソンを精製する実験を行った。
具体的には、癌細胞のＴＰ５３遺伝子のエクソンを標的とし、それぞれの標的エクソン別に３つのｓｇＲＮＡを使用し、それぞれのｓｇＲＮＡの配列は下記表７に示した。前記実施例６−１と同一条件で標的ＤＮＡを精製した。
＊ｓｇＲＮＡ配列は標的塩基配列と同一であり、ただし、ＴはＵである。
その後、標的エクソンが精製されたかを確認するために、サンプル中の標的ＤＮＡの量
を測定することができるＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲを行い、その結果、各エクソンが実際に増幅されたことを確認し、標的エクソン部位が他のエクソンに比べて２〜２０倍増幅されたことを確認することができた（図１６）。
実施例７：類似した配列の病原性細菌ＤＮＡを区別して診断を確認
既存の分子診断の方式により区分して診断し難い同等性の高い配列を、本発明の方法により区分が可能かどうかを確認しようとした。例えば、病原性細菌／ウイルスと非病原性細菌／ウイルスは非常に類似した配列を有しているため、このような病原性及び非病原性細菌を区分した診断を、本発明の新しいパラダイムを適用して行うことができるかどうかを確認する方法を図１７に模式図で示した。
即ち、非病原性細菌ＤＮＡ及び病原性細菌ＤＮＡを単に増幅すれば、配列の類似性により非特異的増幅が起こり、非病原性細菌ＤＮＡ及び病原性細菌ＤＮＡを区別することができない（図１７の上段）。
しかし、個体の正常な反応を引き起こす非病原性細菌ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を利用して切断して増幅し、病原性細菌ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質（ｄｅａｄ Ｃａｓ９タンパク質）からなるＲＧＥＮを利用して病原性細菌のＤＮＡを捕獲して分離して増幅を行う場合、類似した配列により容易に 区分できない病原性細菌のみを特異的に増幅できることを確認することができる（図１７の下段）。
前記のような結果は、本発明の新しい遺伝子型分析方法である標的特異的ヌクレアーゼ、特にＲＧＥＮを、既存の遺伝子型分析方法とは異なり、試料内の正常ＤＮＡを切断して除去した後に標的ＤＮＡだけを増幅するか、または標的ＤＮＡだけを捕獲して増幅させる場合、既存のＰＣＲ方法などとは異なり、偽陽性／陰性などが現われることなく、正確に分析することができることを示唆するものである。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形で実施できることを理解するであろう。なお、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的なものではないことを理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (26)

  1. （ｉ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記特定の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する他の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含む、遺伝子型分析方法。
  2. 前記遺伝子型分析方法が、（ａ）二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、前記特定の遺伝子型特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップ、（ｂ）前記特定の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する他の遺伝子型ＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された他の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含めて行うものである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
  3. 前記ヌクレアーゼが、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ
    ｎｕｃｌｅａｓｅ）、及びＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）からなる群から選択されたヌクレアーゼである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
  4. 前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡが野生型ＤＮＡであり、分離された試料内の野生型ＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを用いて前記野生型ＤＮＡを切断して試料内から除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）の他の遺伝子型ＤＮＡが癌特異的な突然変異を含むＤＮＡであり、前記野生型ＤＮＡが除去された試料内の癌特異的な突然変異ＤＮＡを分析するステップを含む、癌の診断のためのものである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
  5. 前記癌の診断が癌の初期診断である、請求項４に記載の遺伝子型分析方法。
  6. 前記癌の診断が癌の予後を予測するものである、請求項４に記載の遺伝子型分析方法。
  7. 二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料が、癌の疑いのある個体から分離された血液試料である、請求項４に記載の遺伝子型分析方法。
  8. 前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡが細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）が、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、細胞または臓器移植を受けた個体の分離された試料から前記個体のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが移植された細胞または臓器のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）が前記個体のＤＮＡが除去された試料内に、移植された細胞または臓器のＤＮＡを分析するステップを含む、細胞または臓器移植を受けた個体の予後予測のためのものである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
  9. 前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡが被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）が、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記被害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）が、前記被害者のＤＮＡが除去された試料内に加害者のＤＮＡを分析するステップを含む、犯罪現場に関する情報を収集するためのものである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
  10. 前記ステップ（ｉ）において特定の遺伝子型ＤＮＡが加害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉ）が、二つ以上の遺伝子型ＤＮＡが含まれた、犯罪現場に由来する分離されたＤＮＡ試料から前記加害者のＤＮＡを、これに特異的なヌクレアーゼを用いて切断して除去するステップであり、前記ステップ（ｉｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが被害者のＤＮＡであり、前記ステップ（ｉｉ）が、前記加害者のＤＮＡが除去された試料内に、被害者のＤＮＡを分析するステップを含む、犯罪現場に関する情報を収集するためのものである、請求項１に記載の遺伝子型分析方法。
  11. （ｉ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｇＲＮＡ）及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを、他の遺伝子型ＤＮＡを認識するＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、前記他の遺伝子型ＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記他の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内に存在する特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含む、遺伝子型分析方法。
  12. 前記分析方法が、（ａ）特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料内の前記特定の遺伝子型ＤＮＡを、他の遺伝子型ＤＮＡを認識するＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、前記他の遺伝子型ＤＮＡを切断して除去するステップ、（ｂ）前記他の遺伝子型ＤＮＡが除去された試料内の特定の遺伝子型ＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された特定の遺伝子型ＤＮＡを分析するステップを含めて行うものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
  13. 前記ステップ（ｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが野生型ＤＮＡであり、特定の遺伝子型ＤＮＡは癌特異的な突然変異を含むＤＮＡであり、前記癌特異的な突然変異を含む特定の遺伝子型ＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して野生型ＤＮＡに特異的なＲＧＥＮの切断から特定の遺伝子型ＤＮＡをマスキングして保護し、分離された試料内の野生型ＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記野生型ＤＮＡが除去された試料内に存在する癌特異的突然変異を含むＤＮＡを分析するステップを含む、癌の診断のためのものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
  14. 前記癌の診断が癌の初期診断である、請求項１３に記載の遺伝子型分析方法。
  15. 前記癌の診断が癌の予後を予測するものである、請求項１３に記載の遺伝子型分析方法。
  16. 二つ以上の遺伝子型ＤＮＡの混合物を含む分離された試料が、癌の疑いのある個体から分離された血液試料である、請求項１３に記載の遺伝子型分析方法。
  17. 前記ステップ（ｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡであり、特定の遺伝子型ＤＮＡが移植された細胞または臓器のＤＮＡであり、前記移植された細胞または臓器のＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡに特異的なＲＧＥＮの切断から前記特定の遺伝子型ＤＮＡをマスキングして保護し、分離された試料内の細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記細胞または臓器移植を受けた個体のＤＮＡが除去された試料内に存在する移植された細胞または臓器のＤＮＡを分析するステップを含む、細胞または臓器移植を受けた個体の予後予測のためのものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
  18. 前記ステップ（ｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが被害者のＤＮＡであり、特定の遺伝子型ＤＮＡは加害者のＤＮＡであり、前記加害者のＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して被害者のＤＮＡに特異的なＲＧＥＮの切断から前記特定の遺伝子型ＤＮＡをマスキングして保護し、分離された試料内の被害者のＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記被害者のＤＮＡが除去された試料内に存在する加害者のＤＮＡを分析するステップを含む、犯罪現場に関する情報を収集するためのものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
  19. 前記ステップ（ｉ）において他の遺伝子型ＤＮＡが加害者のＤＮＡであり、特定の遺伝子型ＤＮＡが被害者のＤＮＡであり、前記被害者のＤＮＡに特異的に結合するガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して加害者のＤＮＡに特異的なＲＧＥＮの切断から前記特定の遺伝子型ＤＮＡをマスキングして保護し、分離された試料内の加害者のＤＮＡを切断して除去するステップ、及び（ｉｉ）前記加害者のＤＮＡが除去された試料内に存在する被害者のＤＮＡを分析するステップを含む、犯罪現場に関する情報を収集するためのものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
  20. 前記不活性化されたＣａｓタンパク質が、Ｃａｓタンパク質のＤＮＡ切断活性の欠如したものである、請求項１１に記載の遺伝子型分析方法。
  21. 前記不活性化されたＣａｓタンパク質が、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０ＡまたはＤ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９タンパク質の変異体である、請求項２０に記載の遺伝子型分析方法。
  22. （ｉ）細菌またはウイルスＤＮＡを含む分離された試料に非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを処理して非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡを切断して試料内から除去するステップ、及び（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内に病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを分析するステップを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法。
  23. 前記分析方法が、（ａ）細菌またはウイルスＤＮＡを含む分離された試料に非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡに特異的なヌクレアーゼを処理して非病原性細菌または非病原性ウイルスＤＮＡを切断して試料内から除去するステップ、（ｂ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内の病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された病原性細菌または病原性ウイルスＤＮＡを分析するステップを含めて行うものである、請求項２２に記載の試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法。
  24. 前記ヌクレアーゼが、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ
    ｎｕｃｌｅａｓｅ）、及びＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）からなる群から選択されたヌクレアーゼである、請求項２２に記載の方法。
  25. （ｉ）病原性細菌またはウイルスＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して病原性細菌またはウイルスＤＮＡを非病原性細菌またはウイルスに特異的なＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、分離された試料内の非病原性細菌またはウイルスＤＮＡを試料内から切断して除去するステップ、
    及び（ｉｉ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料に病原性細菌またはウイルスＤＮＡを分析するステップを含む、試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法。
  26. 前記分析方法が、（ａ）病原性細菌またはウイルスＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び不活性化されたＣａｓヌクレアーゼタンパク質（ｄＣａｓ）を利用して病原性細菌またはウイルスＤＮＡを非病原性細菌またはウイルスに特異的なＲＧＥＮの切断からマスキングして保護し、分離された試料内の非病原性細菌またはウイルスＤＮＡを試料内から切断して除去するステップ、（ｂ）前記非病原性細菌またはウイルスＤＮＡが除去された試料内の病原性細菌またはウイルスＤＮＡを増幅するステップ、及び（ｃ）前記増幅された病原性細菌またはウイルスＤＮＡを分析するステップを含めて行うものである、請求項２５に記載の試料内ＤＮＡの遺伝子型分析方法。
JP2017515647A 2014-05-28 2015-05-28 標的特異的ヌクレアーゼを用いた標的ｄｎａの敏感な検出方法 Pending JP2017516500A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140064526 2014-05-28
KR10-2014-0064526 2014-05-28
PCT/KR2015/005383 WO2015183025A1 (ko) 2014-05-28 2015-05-28 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 dna의 민감한 검출 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2017516500A true JP2017516500A (ja) 2017-06-22

Family

ID=54699286

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017515647A Pending JP2017516500A (ja) 2014-05-28 2015-05-28 標的特異的ヌクレアーゼを用いた標的ｄｎａの敏感な検出方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20170191123A1 (ja)
EP (1) EP3150718A4 (ja)
JP (1) JP2017516500A (ja)
KR (2) KR101815695B1 (ja)
CN (1) CN106687601A (ja)
WO (2) WO2015183025A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020534863A (ja) * 2018-02-06 2020-12-03 ジェネッカー カンパニー リミテッド 突然変異細胞遊離遺伝子分離キット及びそれを用いた突然変異細胞遊離遺伝子分離方法

Families Citing this family (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US20150166984A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting alpha-antitrypsin point mutations
EP4467654A3 (en) 2014-02-04 2025-02-19 Jumpcode Genomics, Inc. Genome fractioning
EP4063503A1 (en) 2014-02-11 2022-09-28 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
US10150985B2 (en) 2014-02-13 2018-12-11 Takara Bio Usa, Inc. Methods of depleting a target molecule from an initial collection of nucleic acids, and compositions and kits for practicing the same
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
EP3957745A1 (en) * 2014-12-20 2022-02-23 Arc Bio, LLC Compositions and methods for targeted depletion, enrichment, and partitioning of nucleic acids using crispr/cas system proteins
EP3262173A2 (en) 2015-02-23 2018-01-03 Crispr Therapeutics AG Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
AU2016225179C1 (en) 2015-02-23 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
SG10202104041PA (en) 2015-10-23 2021-06-29 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
US12043843B2 (en) 2015-11-04 2024-07-23 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2017136603A1 (en) * 2016-02-02 2017-08-10 Guardant Health, Inc. Cancer evolution detection and diagnostic
JP6974349B2 (ja) * 2016-04-18 2021-12-01 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト ヘモグロビン異常症の処置のための材料及び方法
WO2017191503A1 (en) * 2016-05-05 2017-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
CN109312386B (zh) * 2016-06-15 2022-10-25 株式会社图尔金 使用中靶靶标和脱靶靶标的多重靶标系统筛选靶特异性核酸酶的方法及其用途
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
ES2915562T3 (es) 2016-06-24 2022-06-23 Univ Colorado Regents Métodos para generar bibliotecas combinatorias con código de barras
KR20250103795A (ko) 2016-08-03 2025-07-07 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
KR101964746B1 (ko) * 2016-09-07 2019-04-03 울산대학교 산학협력단 dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법
WO2018048194A1 (ko) * 2016-09-07 2018-03-15 울산대학교 산학협력단 dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
EP3592381A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cancer vaccine
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018176009A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
US10081829B1 (en) 2017-06-13 2018-09-25 Genetics Research, Llc Detection of targeted sequence regions
EP3638809A4 (en) * 2017-06-13 2021-03-10 Genetics Research, LLC, D/B/A ZS Genetics, Inc. NEGATIVE-POSITIVE ENRICHMENT FOR THE DETECTION OF NUCLEIC ACIDS
US20180355417A1 (en) * 2017-06-13 2018-12-13 Genetics Research, Llc, D/B/A Zs Genetics, Inc. Rare nucleic acid detection
US10947599B2 (en) 2017-06-13 2021-03-16 Genetics Research, Llc Tumor mutation burden
US10527608B2 (en) 2017-06-13 2020-01-07 Genetics Research, Llc Methods for rare event detection
WO2018231963A1 (en) * 2017-06-13 2018-12-20 Genetics Research, Llc, D/B/A Zs Genetics, Inc. Selective protection of nucleic acids
CA3069938A1 (en) 2017-06-13 2018-12-20 Genetics Research, Llc, D/B/A Zs Genetics, Inc. Isolation of target nucleic acids
US20180355437A1 (en) * 2017-06-13 2018-12-13 Genetics Research, Llc, D/B/A Zs Genetics, Inc. Plasma/serum target enrichment
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
HUE058668T2 (hu) 2017-06-30 2022-09-28 Inscripta Inc Automatizált sejtkezelési eljárások, modulok, berendezések és rendszerek
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
EP3676376B1 (en) 2017-08-30 2025-01-15 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
BR112020005287A2 (pt) 2017-09-29 2020-09-24 Intellia Therapeutics, Inc. composições e métodos para edição de gene ttr e tratar amiloidose attr
WO2019068022A1 (en) 2017-09-30 2019-04-04 Inscripta, Inc. CONTINUOUS FLOW ELECTROPORATION INSTRUMENTATION
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
SG11202005147WA (en) 2017-12-05 2020-06-29 Vertex Pharma Crispr-cas9 modified cd34+ human hematopoietic stem and progenitor cells and uses thereof
WO2019118949A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
US11268077B2 (en) 2018-02-05 2022-03-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2019150196A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2019156475A1 (ko) * 2018-02-06 2019-08-15 주식회사 진씨커 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 키트 및 이를 이용한 돌연변이 세포 유리 유전자 분리 방법
CN108445212B (zh) * 2018-03-21 2019-03-26 杭州观梓健康科技有限公司 一种用于检测艰难梭菌的胶体金试纸条和试剂盒
WO2019190874A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Inscripta, Inc. Automated control of cell growth rates for induction and transformation
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
US10508273B2 (en) 2018-04-24 2019-12-17 Inscripta, Inc. Methods for identifying selective binding pairs
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10526598B2 (en) 2018-04-24 2020-01-07 Inscripta, Inc. Methods for identifying T-cell receptor antigens
CN112534063A (zh) 2018-05-22 2021-03-19 安序源有限公司 用于核酸测序的方法、系统和组合物
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
AU2019292919A1 (en) 2018-06-30 2021-03-11 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
EP3820495A4 (en) 2018-07-09 2022-07-20 The Broad Institute Inc. RNA-PROGRAMMABLE EPIGENETIC RNA MODIFIERS AND THEIR USES
CN109295181B (zh) * 2018-08-08 2019-10-15 西安市中心血站 一种用于检测细菌的杂交干扰实时pcr方法
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11965154B2 (en) 2018-08-30 2024-04-23 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
KR102200109B1 (ko) * 2018-09-12 2021-01-08 한국과학기술정보연구원 표적 서열 증폭용 올리고 뉴클레오타이드 및 이를 이용한 표적 서열의 증폭 방법
EP3870697A4 (en) 2018-10-22 2022-11-09 Inscripta, Inc. GMO ENZYMES
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
EP3942043A2 (en) 2019-03-19 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
CN113631713A (zh) 2019-03-25 2021-11-09 因思科瑞普特公司 酵母中的同时多重基因组编辑
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
US10837021B1 (en) 2019-06-06 2020-11-17 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
WO2020257395A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in e. coli
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
WO2021101835A1 (en) * 2019-11-19 2021-05-27 Xiao Bing Wang Method for identifying gene fusions by circle cdna amplification
KR20250033331A (ko) 2019-12-10 2025-03-07 인스크립타 인코포레이티드 신규 mad 뉴클레아제
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
CA3157127A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Aamir MIR Cascade/dcas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
KR20220133257A (ko) 2020-01-27 2022-10-04 인스크립타 인코포레이티드 전기천공 모듈 및 기구
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
BR112022022603A2 (pt) 2020-05-08 2023-01-17 Broad Inst Inc Métodos e composições para edição simultânea de ambas as fitas de sequência alvo de nucleotídeos de fita dupla
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
WO2022060749A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Inscripta, Inc. Crispr editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
CA3204158A1 (en) 2021-01-04 2022-07-07 Juhan Kim Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
KR102604416B1 (ko) * 2021-02-03 2023-11-20 연세대학교 산학협력단 가이드 rna를 이용한 유전자 분석 방법
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
KR102616916B1 (ko) * 2021-05-11 2023-12-21 주식회사 애이마 발암성 돌연변이 유전자 검출용 가이드 rna 내지 이의 용도
CN118318049A (zh) 2021-09-28 2024-07-09 安序源有限公司 用于处理核酸样品的方法以及核酸样品的组合物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090317818A1 (en) * 2008-03-26 2009-12-24 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
WO2014065596A1 (en) * 2012-10-23 2014-05-01 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
JP2016519652A (ja) * 2013-03-14 2016-07-07 カリブー・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 核酸ターゲティング核酸の組成物および方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
CN103224947B (zh) * 2013-04-28 2015-06-10 陕西师范大学 一种基因打靶系统
CN103757053B (zh) * 2014-01-28 2016-05-25 中国医学科学院医学生物学研究所 一种特异性的dna病毒基因组定点改造及筛选方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090317818A1 (en) * 2008-03-26 2009-12-24 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
WO2014065596A1 (en) * 2012-10-23 2014-05-01 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
JP2016519652A (ja) * 2013-03-14 2016-07-07 カリブー・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 核酸ターゲティング核酸の組成物および方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LUNG CANCER, vol. 74, JPN6019026827, 24 March 2011 (2011-03-24), pages 226 - 232, ISSN: 0004223727 *
NATURE COMMUNICATIONS, vol. Vol. 5, 3157, JPN6019026825, 20 January 2014 (2014-01-20), ISSN: 0004223726 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020534863A (ja) * 2018-02-06 2020-12-03 ジェネッカー カンパニー リミテッド 突然変異細胞遊離遺伝子分離キット及びそれを用いた突然変異細胞遊離遺伝子分離方法
JP7006873B2 (ja) 2018-02-06 2022-02-10 ジェネッカー カンパニー リミテッド 突然変異細胞遊離遺伝子分離キット及びそれを用いた突然変異細胞遊離遺伝子分離方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20170191123A1 (en) 2017-07-06
KR101815695B1 (ko) 2018-01-08
EP3150718A4 (en) 2018-03-28
WO2015183025A1 (ko) 2015-12-03
KR101886381B1 (ko) 2018-08-10
EP3150718A1 (en) 2017-04-05
KR20150138075A (ko) 2015-12-09
WO2015183026A1 (ko) 2015-12-03
CN106687601A (zh) 2017-05-17
KR20150138074A (ko) 2015-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101815695B1 (ko) 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 dna의 민감한 검출 방법
Aman et al. iSCAN-V2: A one-pot RT-RPA–CRISPR/Cas12b assay for point-of-care SARS-CoV-2 detection
CN110541022B (zh) 基于CRISPR-Cas12a系统的结核分枝杆菌复合群检测试剂盒
AU767983B2 (en) Methods for detecting nucleic acids indicative of cancer
EP3192900B1 (en) Method for constructing nucleic acid single-stranded cyclic library and reagents thereof
JP7819093B2 (ja) 遺伝子変異分析
JP2021515579A (ja) 配列決定用途および他の核酸物質インテロゲーションのための核酸物質を濃縮するための方法および試薬
US11603562B2 (en) Methods, systems, and compositions for nucleic acid sequencing
JP2010521156A (ja) Ｈｉｖ薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法
Chen et al. A CRISPR-Cas12b–based platform for ultrasensitive, rapid, and highly specific detection of hepatitis B virus genotypes B and C in clinical application
JP7006873B2 (ja) 突然変異細胞遊離遺伝子分離キット及びそれを用いた突然変異細胞遊離遺伝子分離方法
US6528256B1 (en) Methods for identification and isolation of specific nucleotide sequences in cDNA and genomic DNA
CN108699101A (zh) 用于基因组dna片段的靶向纯化的制备型电泳方法
CN113388691A (zh) 一种基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a的核酸检测方法及应用
Qiu et al. A CRISPR‐based nucleic acid detection platform (CRISPR‐CPA): Application for detection of Nocardia farcinica
WO2014096421A1 (en) Probability-directed isolation of nucleotide sequences (pins)
KR101912488B1 (ko) 분자 검출 분석법
WO2024159093A2 (en) Diagnostic using crispr rna and cas 13 a enzyme
Chathuranga et al. A Genomic Surveillance During the Evolution of SARS-CoV-2 Omicron Variants in Sri Lanka
EP3283646B1 (en) Method for analysing nuclease hypersensitive sites.
Samashaptak et al. CRISPR-Cas methods: culminating in crescendo of the COVID-19 pandemic to FELUDA test
Khare et al. DNA extraction and gene amplification from saliva deposited on skin using double swab technique
CN118696131A (zh) 用于靶向核酸捕获和条形码编码的系统和方法
Shoemaker et al. DNA molecular biology in the diagnosis of pulmonary disease
HK1243142B (en) Method for analysing nuclease hypersensitive sites

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20180511

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190716

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20200303