JP2017514897A

JP2017514897A - ループス腎炎を処置するためのジンセノサイドｍ１の使用

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Publication number: JP2017514897A
Application number: JP2017508732A
Authority: JP
Inventors: シャウ−ロンリー; ユー−チーリー; アンチェン; クオ−フェンフア; シュク−マンカ
Original assignee: シャウ−ロンリー
Priority date: 2014-05-02
Filing date: 2015-05-04
Publication date: 2017-06-08
Anticipated expiration: 2035-05-04
Also published as: KR20170005045A; WO2015165422A1; TWI672143B; TW201613610A; US9844560B2; EP3137089A4; ES2704027T3; DK3137089T3; US20170049792A1; JP6696972B2; EP3137089B1; KR102402139B1; CN106573009A; EP3137089A1; CN106573009B

Abstract

ループス腎炎に罹患した被検体を処置する方法であって、被検体を処置するのに効果的である一定量のジンセノサイドＭ１を被検体に投与することを含む方法。必要とする被検体のループス腎炎を処置するための薬物を製造するための、ジンセノサイドＭ１の使用。【選択図】なし

Description

本発明は、ループス腎炎を処置するためのジンセノサイドＭ１の新規な使用に関する。

ループス腎炎は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ：ｓｙｓｔｅｍｉｃｌｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）の患者のサブポピュレーションに起こり、著しく高い罹患率および死亡率を伴う、ＳＬＥの最も重度の合併症の１つである。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己抗体産生および異常な細胞免疫による多臓器損傷を含む自己免疫障害である。重度のループス腎炎患者では、末期腎不全の累積リスクが特に高かった。重度のループス腎炎患者の病理組織は、１９８２年の世界保健機関分類（ＷｏｒｌｄＨｅａｌｔｈＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によりカテゴリーＩＩＩ、カテゴリーＩＶならびにカテゴリーＶｃおよびＶｄと最初に定義された明確な損傷のパターンを含む。ループス腎炎の発生または進行の正確なメカニズムは不明のままである。ループス腎炎の決定的な処置はない。ループス腎炎の現在の治療には、コルチコステロイドと他の細胞傷害性薬剤または免疫調節剤との様々な組み合わせがあるが、これらの多くは様々な副作用を有する。

ニンジン（ｇｉｎｓｅｎｇ）の主要な活性成分ジンセノサイドは、種々の薬理活性、たとえば抗腫瘍活性、抗糖尿病活性、抗疲労（ａｎｔｉｆａｔｉｑｕｅ）、抗アレルギー活性および抗酸化活性を有することが知られている。ジンセノサイドは、１７個の炭素原子が４つの環に配置されたゴナンステロイド核からなる基本的な構造を共有する。ジンセノサイドは体内で金属化され、いくつかの最近の研究からは、ジンセノサイド代謝物が、天然に存在するジンセノサイドよりむしろ体内で吸収されやすく、活性成分として働くことが示唆される。中でも、ジンセノサイドＭ１は、ヒト腸内細菌によるギペノサイド経路を経たプロトパナキサジオール系ジンセノサイドの代謝物の１つとして知られている。これまで、ループス腎炎の処置におけるジンセノサイドＭ１の作用を報告した従来技術の参考文献はない。

本発明では、ジンセノサイドＭ１がループス腎炎の症状を軽減するのに効果的であることが、予想外に見出される。したがって本発明は、被検体のループス腎炎の処置のための新規なアプローチを提供する。

特に、本発明は、治療有効量のジンセノサイドＭ１を被検体に投与することを含む、ループス腎炎の処置を必要とする被検体を処置するための方法を提供する。

具体的には、本発明の方法は、（１）糸球体における：固有細胞の増殖、半月体、好中球浸潤およびフィブリノイド壊死；ならびに（２）尿細管間質コンパートメントにおける：間質（特に糸球体周囲の）単核白血球炎症およびタンパク円柱を伴う尿細管萎縮からなる群から選択される、被検体のループス腎炎の１つまたは複数の症状を減少させるのに効果的である。さらに、本発明の方法は、被検体のタンパク尿もしくは血尿を減少させるまたは血清尿素窒素レベルもしくは血清クレアチニンレベルを低下させるのにも効果的である。

いくつかの実施形態では、ジンセノサイドＭ１は、以下に限定されるものではないが、コルチコステロイド（プレドニゾロンなど）、非ステロイド性（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｉｏｄａｌ）抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ：ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇ）、細胞傷害性薬（シクロホスファミド、クロラムブシルおよびアザチオプリンなど）、免疫抑制剤（シクロスポリンおよびミコフェノール酸モフェチルなど）、および血管拡張薬（アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤など））など当該技術分野において公知の、ループス腎炎を処置するための１つまたは複数の治療薬と組み合わせて投与される。

ループス腎炎を処置するための薬物を製造するための、ジンセノサイドＭ１の使用をさらに提供する。

本発明の一実施形態または複数の実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本発明の他の特徴または利点は、いくつかの実施形態の以下の詳細な説明、およびさらに添付の特許請求の範囲から明らかになる。

本発明を説明するため、実施形態を図に示す。しかしながら、本発明は、示された好ましい実施形態に限定されるものではないことを理解すべきである。

マウスの尿タンパク質、血尿および腎機能の評価を示す。（Ａ）尿中アルブミン／クレアチニン比、（Ｂ）血尿レベル、（Ｃ）血中尿素窒素（ＢＵＮ：ｂｌｏｏｄｕｒｅａｎｉｔｒｏｇｅｎ）レベル、（Ｄ）血清クレアチニン。各バーは平均±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００５。符号「＃」は「不検出」を意味する。符号「ｎｓ」は「有意差なし」を意味する。Ｈ＆Ｅ染色による腎臓の病理組織学的評価（元の倍率、各々×４００）を示す。スコアリング（半定量的解析）を示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊＊＊ｐ＜０．００５は統計学的有意性を示す。符号「＃」は「不検出」を意味する。符号「ｎｓ」は「有意差なし」を意味する。マウスの血清抗ｄｓＤＮＡ抗体レベルを示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５。マウスの腎組織中のスーパーオキシドアニオンレベルを示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５。マウスの腎臓のｉｎｓｉｔｕＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ）産生（元の倍率は各々×４００）を示す。陽性染色の核の％の半定量的解析を示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５。炎症性サイトカインＩＮＦ−γの血清レベルを示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５。符号「＃」は「不検出」を意味する。符号「ｎｓ」は「有意差なし」を意味する。炎症性サイトカインＭＣＰ−１の血清レベルを示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５。符号「＃」は「不検出」を意味する。符号「ｎｓ」は「有意差なし」を意味する。炎症性サイトカインＩＬ−１２ｐ７０の血清レベルを示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５。符号「＃」は「不検出」を意味する。符号「ｎｓ」は「有意差なし」を意味する。炎症性サイトカインＩＬ−６の血清レベルを示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５。符号「＃」は「不検出」を意味する。符号「ｎｓ」は「有意差なし」を意味する。炎症性サイトカインＴＮＦ−αの血清レベルを示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５。符号「＃」は「不検出」を意味する。符号「ｎｓ」は「有意差なし」を意味する。炎症性サイトカインＩＬ−１０の血清レベルを示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５。符号「＃」は「不検出」を意味する。符号「ｎｓ」は「有意差なし」を意味する。マウスの脾細胞におけるＴ細胞の増殖を示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５。符号「ｎｓ」は「有意差なし」を意味する。ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ）７のｍＲＮＡレベルを示す。各バーは平均±ＳＥを表す。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１。

他に記載がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味を有する。本明細書で使用する場合、以下の用語は、他に記載がない限り、それらに準ずる意味を有する。

本明細書では冠詞「１つの（「ａ」および「ａｎ」）」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）をいうのに使用される。例として、「１つのエレメント（ａｎｅｌｅｍｅｎｔ）」は１つのエレメントまたは２つ以上のエレメントを意味する。

本発明では、ジンセノサイドＭ１が、それを、ループスを起こしやすいＮＺＢ／ＷＦ１マウスに投与することにより、ループス腎炎の発生を予防できることが意外にも見出される。特に、ループス腎炎の動物は、（１）糸球体における：固有細胞の増殖、半月体、好中球浸潤およびフィブリノイド壊死；あるいは（２）尿細管間質コンパートメントにおける：間質（特に糸球体周囲の）単核白血球炎症およびタンパク円柱を伴う尿細管萎縮、またはタンパク尿もしくは血尿、または血清尿素窒素レベルもしくは血清クレアチニンレベルの上昇を含む様々な症状を呈することが見出される。本発明の方法は、ジンセノサイドＭ１を投与することにより、ループス腎炎の患者のこれらの症状のいずれか１つを改善するのに効果的である。

ジンセノサイドＭ１、２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、当該技術分野において公知のサポニン代謝物の１つである。ジンセノサイドＭ１の化学構造は、以下の通りである。

ジンセノサイドＭ１は、ヒト腸内細菌によるギペノサイド経路を経たプロトパナキサジオール系ジンセノサイドの代謝物の１つとして知られている。ジンセノサイドＭ１は、摂取後に血液中または尿中で見出され得る。ジンセノサイドＭ１は、その全内容を本明細書に援用する台湾特許出願第０９４１１６００５（Ｉ２８０９８２）号および米国特許第７，９３２，０５７号などの当該技術分野において公知の方法により、真菌発酵を介してニンジン植物から調製することができる。ある種の実施形態では、ジンセノサイドＭ１を調製するためのニンジン植物は、ウコギ（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）科、トチバニンジン（Ｐａｎａｘ）属、たとえばチョウセンニンジン（Ｐ．ｇｉｎｓｅｎｇ）およびトチバニンジン（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ）（サンシチ（Ｓａｎｑｉ）とも呼ばれる）を含む。一般に、ジンセノサイドＭ１の調製方法は、（ａ）ニンジン植物材料（たとえば葉または茎）の粉末を用意するステップ；（ｂ）ニンジン植物材料を発酵させるための真菌を用意するステップであって、発酵温度は２０〜５０℃にわたり、発酵湿度は７０〜１００％にわたり、ｐＨ値は４．０〜６．０にわたり、発酵期間は５〜１５日にわたるステップ；（ｃ）発酵産物を抽出および採取するステップ；および（ｄ）発酵産物から２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを単離するステップを含む。

本発明ではジンセノサイドＭ１を「単離された」または「精製された」と記載する場合、完全に単離されたまたは精製されたのではなく、比較的に単離されたまたは精製されたものと理解すべきである。たとえば、精製されたジンセノサイドＭ１とは、その天然に存在する形態と比較してより精製されたものをいう。一実施形態では、精製されたジンセノサイドＭ１を含む調製物は、全調製物の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超または１００％（ｗ／ｗ）の量でジンセノサイドＭ１を含み得る。本明細書で比率または投与量を示すのに特定の数字を使用する場合、前記数字は一般に、その数字より１０％超および未満の範囲内、またはさらに詳しくは５％超および未満の範囲内のものを含むことを理解すべきである。

本発明は、ループス腎炎を処置するための方法であって、治療有効量のジンセノサイドＭ１を、そうした処置を必要とする被検体に投与することを含む方法を提供する。さらに提供するのは、ループス腎炎の処置を必要とする被検体のそうした処置を行うための薬物を製造するための、ジンセノサイドＭ１の使用である。本発明の薬物は、（１）糸球体における：固有細胞の増殖、半月体、好中球浸潤およびフィブリノイド壊死；ならびに（２）尿細管間質コンパートメントにおける：間質（特に糸球体周囲の）単核白血球炎症およびタンパク円柱を伴う尿細管萎縮からなる群から選択される、被検体のループス腎炎の１つまたは複数の症状を減少させるのに効果的である。さらに本発明の薬物は、被検体のタンパク尿もしくは血尿を減少させるまたは血清尿素窒素レベルもしくは血清クレアチニンレベルを低下させるのにも効果的である。

本明細書に使用される「個体」または「被検体」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物、たとえばコンパニオンアニマル（イヌ、ネコおよび同種のものなど）、農用動物（雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよび同種のものなど）、または実験動物（ラット、マウス、モルモットおよび同種のものなど）を含む。

「処置すること」という用語は、本明細書で使用する場合、障害、障害の症状もしくは状態、障害により引き起こされた身体障害または障害の進行、を治癒させる、癒やす、軽減する、緩和する、変化させる、治療する、寛解させる、改善する、またはそれらに作用することを目的として、１種または複数種の活性剤を含む組成物を、障害、障害の症状もしくは状態、または障害の進行に悩む被検体に外用または投与することをいう。

本明細書に使用される「治療有効量」という用語は、処置される被検体に治療効果を与える活性成分の量をいう。たとえば、ループス腎炎を処置するための有効量は、ループス腎炎を有する被検体の（１）糸球体における：固有細胞の増殖、半月体、好中球浸潤およびフィブリノイド壊死；または（２）尿細管間質コンパートメントにおける：間質（特に糸球体周囲の）単核白血球炎症およびタンパク円柱を伴う尿細管萎縮、またはタンパク尿もしくは血尿、または異常に高い血清尿素窒素レベルまたは血清クレアチニンレベルなどの１つまたは複数の症状または状態を防止する、改善する、軽減するまたは減少させることができる量である。これらの症状は、たとえば尿タンパク質、血中尿素窒素または血清クレアチニンの量を解析することにより、または腎臓切片を解析することにより、様々な疾患進行関連指標に基づき、当該技術分野において公知の方法を用いて判定および評価することができる。治療有効量は、投与の経路および頻度、前記薬を投与される個体の体重および種、ならびに投与の目的など様々な理由に応じて変化してもよい。当業者は、それぞれの場合に本明細書の開示内容、確立された方法、および当業者自身の経験に基づき投与量を決定してもよい。たとえば、ある種の実施形態では、本発明に使用されるジンセノサイドＭ１の経口投与量は、１日１０〜１，０００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの例では、本発明に使用されるジンセノサイドＭ１の経口投与量は、１日１００〜３００ｍｇ／ｋｇ、１日５０〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１日２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、１日１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、または１日５〜３０ｍｇ／ｋｇである。さらに、本発明のいくつかの実施形態では、ジンセノサイドＭ１は、一定期間定期的に投与され、たとえば、少なくとも１５日間、１ヶ月間または２ヶ月間以上連日投与される。

本発明によれば、ジンセノサイドＭ１は、ループス腎炎を処置するための活性成分として使用することができる。一実施形態では、治療有効量の活性成分は、送達および吸収を目的として、薬学的に許容されるキャリアと共に適切な形態の医薬組成物に製剤化してもよい。投与モードに応じて、本発明の医薬組成物は好ましくは約０．１重量％〜約１００重量％の活性成分を含み、重量パーセントは全組成物の重量に基づき計算される。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」は、キャリアが組成物中の活性成分との適合性があり、好ましくは前記活性成分を安定化でき、処置を受ける個体に安全であることを意味する。前記キャリアは、活性成分に対する希釈剤、ビヒクル、賦形剤またはマトリックスであってもよい。適切な賦形剤の一部の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルボース、マンノース、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガントガム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップおよびメチルセルロースが挙げられる。組成物は、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油など滑沢剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエートなどの防腐剤；甘味料；ならびに着香剤をさらに含んでもよい。本発明の組成物は、患者への投与後の活性成分の迅速放出、持続放出または遅延放出の作用を持たせてもよい。

本発明によれば、前記組成物の形態は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ、パケット（ｐａｃｋｅｔ）剤、トローチ、エリキシル剤（ｅｌｉｘｅｒｓ）、懸濁剤、ローション、溶液剤、シロップ、軟質および硬質ゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射液、ならびに分包散剤であってもよい。

本発明の組成物は、経口法、非経口法（筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内など）、経皮法、坐剤法および経鼻法などの任意の生理学的に許容される経路により送達することができる。非経口投与については、本発明の組成物は好ましくは、溶液を血液に対して等張にするのに十分な塩またはグルコースなどの他の物質を含んでもよい滅菌水溶液の形態で使用される。水溶液は、必要に応じて（好ましくは３〜９のｐＨ値で）適切に緩衝化してもよい。滅菌条件下での適切な非経口組成物の調製は、当業者によく知られている標準的な薬理学的技法を用いて達成することができ、追加の創造的労力は必要としない。

本発明によれば、ジンセノサイドＭ１またはジンセノサイドＭ１を活性成分として含む組成物は、ループス腎炎の個体を処置するのに使用してもよい。具体的には、ジンセノサイドＭ１またはジンセノサイドＭ１を活性成分として含む組成物は、疾患の発症を予防するため、または症状を改善させるため、または症状の悪化を遅延させるためループス腎炎の個体またはループス腎炎に罹患するリスクがある個体に投与してもよい。

さらに、本発明によれば、ジンセノサイドＭ１またはジンセノサイドＭ１を活性成分として含む組成物は、既存の治療方法または薬物、たとえば、薬物治療、以下に限定されるものではないが、コルチコステロイド（プレドニゾロンなど）、非ステロイド性（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｉｏｄａｌ）抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、細胞傷害性薬（シクロホスファミド、クロラムブシルおよびアザチオプリンなど）、免疫抑制剤（シクロスポリンおよびミコフェノール酸モフェチルなど）、および血管拡張薬（アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤など））と組み合わせて使用してもよい。一実施形態では、組み合わせて使用される薬物または治療方法は、同時に（並行）使用しても、あるいは連続的に使用してもよい。薬物が組み合わせて使用される場合、薬物は同じ処方中で混合しても、あるいは別のカプセル、丸剤、錠剤および注射薬など異なる処方に別々に組み込んでもよい。

本発明について、限定ではなく実証を目的として提供する以下の例によりさらに説明する。

１．材料および方法
１．１動物モデルおよび実験プロトコル
雌ＮＺＢ／ＷＦ１マウスをジャクソンラボラトリー（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）から購入した。動物実験はすべて、国防医学院の動物実験委員会、台湾（ｔｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＤｅｆｅｎｓｅＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ，Ｔａｉｗａｎ）の倫理的承認を受けて実施し、実験動物の管理使用に関するＮＩＨ指針（ＮＩＨＧｕｉｄｅｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ）の倫理規定に準拠して行った。

Ｓｈｕｉら著、２００７年［５１］に記載されているように、リポ多糖（ＬＰＳ：ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、２０ｍｇ／ｋｇ体重）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州（ＮＯ）、米国）の週２回の腹腔内注射により、８週齢雌ＮＺＢ／ＷＦ１マウスを用いて重度進行性ループス腎炎（ＡＳＬＮ：ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｓｅｖｅｒｅｌｕｐｕｓｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）マウスモデルを樹立した。ＡＳＬＮ誘発のためのＬＰＳの初回投与から２日後、マウスを、各々６匹を超えるマウスの２群に分け、マウスを屠殺するまでジンセノサイドＭ１またはビヒクル（生理食塩水）を毎日強制経口投与した。生理食塩水を注射した８週齢ＮＺＢ／ＷＦ１雌マウス（自己抗体産生の開始前）を正常対照として使用した。マウスはすべて、疾患誘導後５週目に殺した。脾臓の組織標本、腎皮質組織、血液および尿を表記の時期に採取し、解析前に適切に保管した。

１．２ジンセノサイドＭ１
ジンセノサイドＭ１、２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールは、台湾特許出願第０９４１１６００５（Ｉ２８０９８２）号および米国特許第７，９３２，０５７号に記載された方法など当該技術分野において公知の方法により調製した。

１．３尿タンパク質および腎機能の解析
以前記載されたように（Ｋａ，Ｓ．Ｍ．ら著、Ｄｅｃｏｙｒｅｃｅｐｔｏｒ３ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓａｎａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓｍｏｄｅｌｉｎｍｉｃｅ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＮｅｐｈｒｏｌｏｇｙ、第１８巻：ｐ．２４７３〜２４８５；２００７年）、尿サンプルを代謝ケージ内で毎週採取し、尿タンパク質レベルを測定し、血清サンプルを採取して血中尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン（Ｃｒ）の血清レベルを測定した。

１．４病理学的評価
以前記載されたように、腎組織をホルマリン固定してパラフィンに包埋し、切片（３μｍ）を調製し、腎臓病理組織に対してヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。定量解析は、光学顕微鏡（ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１、反射蛍光システム（ＲｅｆｌｅｃｔｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＳｙｓｔｅｍ）、日本）により行った。腎臓の病態の検査およびスコアリングは、病理学者が盲検方式で行い、腎臓の病変の重症度をスコア化した。増殖、好中球浸潤、半月体形成、フィブリノイド壊死および糸球体周囲の炎症を示す糸球体の割合は、無作為にサンプル採取した少なくとも１００の糸球体から算出した。

１．５血清抗ｄｓＤＮＡ抗体の測定
抗ｄｓＤＮＡ抗体の血清レベルを、抗マウスｄｓＤＮＡ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（アルファダイアグノスティック（ＡｌｐｈａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ）、テキサス州、米国）を用いて製造者の指示に従い測定した。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（バイオテック（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）、ヴァーモント州、米国）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。

１．６Ｔ細胞活性化の解析
マウス由来の脾細胞を以前記載されたように調製し、次いで予め４℃にて一晩０．２５μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）抗体（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））でコートした９６ウェル平底マイクロタイタープレートのウェル（２．５×１０^５細胞／ウェル）に３ウェルずつ培養した。４８時間後、以前記載されたように培養物を１μｌの^３Ｈ−メチルチミジン（アマシャムファルマシアバイオテク（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州）でパルスし、１６〜１８時間後に回収し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（パッカード、パーキンエルマー（Ｐａｃｋａｒｄ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、ボストン、マサチューセッツ州）を用いて取り込まれた^３Ｈ−メチルチミジンを測定した。

１．７反応性酸素種（ＲＯＳ）の測定
腎のｉｎｓｉｔｕスーパーオキシドアニオン産生を、ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ：ｄｉｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｕｍ）標識により判定した。蛍光画像は、腎断面ごとに核全体における陽性核の割合をカウントすることにより定量化した。血清および腎臓組織中のスーパーオキシドアニオンレベルを、以前記載されたように測定し、結果を１ミリグラム乾燥重量当たり１５分毎の相対発光単位（ＲＬＵ：ｒｅａｃｔｉｖｅｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｕｎｉｔｓ）（すなわち、ＲＬＵ／１５分／ｍｇ乾燥重量）として表した。

１．８血清サイトカインの検出
標準的なプロトコルに従いＢＤＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃＢｅａｄＡｒｒａｙＭｏｕｓｅＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎキット（ＢＤバイオサイエンス）、続いてフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス）を使用することにより、血清中のＩＮＦ−γ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０のレベルを検出する。

１．９リアルタイムＰＣＲ
腎皮質ＲＮＡを、製造者の指示に従いＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて抽出し、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用してＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）７遺伝子発現を測定した。リアルタイム定量は、製造者の指示に従いＢｉｏ−ＲａｄｉＣｙｃｌｅｒｉＱシステムを用いて行った。増幅は、２^−ΔＣｔ法を用いてＧＡＰＤＨの値に対して正規化した。

１．１０統計解析
結果を平均値±ＳＥＭとして示す。２群間の比較は、スチューデントｔ検定を用いて行った。ｐ値が＜０．０５の場合に統計学的に有意と見なした。

２．結果
２．１ジンセノサイドＭ１はループス腎炎を寛解させた
タンパク尿を検出すると、正常対照群のマウスと比較してＡＳＬＮ群のマウスは、タンパク尿（図１Ａ）および血尿（図１Ｂ）の有意な増加を示した（ｐ＜０．００５）。タンパク尿および血尿の量は、ＡＳＬＮ群のマウスと比較してＡＳＬＮ＋ＬＣＨＫ１６８群のマウスで有意に減少した。ＬＣＨＫ１６８で処置したマウスの腎機能の保護を検出すると、正常対照群のマウスと比較してＡＳＬＮ群のマウスは、ＢＵＮ（図１Ｃ）および血清クレアチニン（図１Ｄ）の有意な増加を示した（ｐ＜０．０５）。ＡＳＬＮ群のマウスと比較して、ＢＵＮおよびクレアチニンの血清レベルは、ＡＳＬＮ＋ＬＣＨＫ１６８群のマウス（ｐ＜０．０５）で有意に減少した。

さらに、光学顕微鏡は、ビヒクルで処置した疾患対照ＡＳＬＮマウス（ＡＳＬＮ＋ビヒクルマウス）において、好中球浸潤、糸球体半月体様の形成および尿細管間質（特に糸球体周囲の）炎症、尿細管萎縮およびタンパク円柱、ならびにフィブリノイド壊死を含む重度の腎病変を示した（図２）。対照的にＡＳＬＮ＋Ｍ１マウスでは、軽度の糸球体増殖が存在したものの、そうした腎病変が大きく減少した（すべてｐ＜０．００５）（図２）。

２．２血清自己抗体レベルの測定
腎臓における自己抗体誘導性の免疫複合体沈着がループス腎炎の主な原因と考えられるため、我々は血清中の抗ｄｓＤＮＡ自己抗体レベルを測定した。図３に示すように、血清抗ｄｓＤＮＡ抗体レベルは、ＡＳＬＮ群のマウスで正常対照マウスより有意に高かった。次いで、ＡＳＬＮ＋ＬＣＨＫ１６８群のマウスではＡＳＬＮ群のマウスと比較して、ｄｓＤＮＡの血清レベルは、有意に減少した（ｐ＜０．０１）。

２．３ジンセノサイドＭ１は腎臓のＲＯＳ産生を減少させた
正常対照マウスと比較してＡＳＬＮ群のマウスは、早くも３週目に腎臓のＲＯＳ産生の発現の有意な増加を示し、ＡＳＬＮ群のマウスでは５週目で劇的に増加した。ＡＳＬＮ＋ＬＣＨＫ１６８群のマウスではＡＳＬＮ群のマウスと比較して、腎臓のＲＯＳ産生の発現は有意に減少した（ｐ＜０．０１）（図４Ａ）。

腎臓の局所的ＲＯＳ産生をさらに詳しく検出するため、腎組織のＲＯＳ産生のｉｎｓｉｔｕ検出を、ＤＨＥアッセイを用いて行った。図４Ｂおよび４Ｃに示すように、正常マウスの腎臓ではＤＨＥ蛍光は弱かったが、ＡＳＬＮ対照マウスの腎臓ではＤＨＥ蛍光は３週目で有意に増加し、５週目でさらに一層増強しており、したがってＡＳＬＮ群のマウスでは正常対照マウスと比較してｉｎｓｉｔｕＲＯＳ産生が増加することが示唆された。対照的に、ＡＳＬＮ＋ＬＣＨＫ１６８処置群では３週目および５週目の両方で非常に弱いＤＨＥ蛍光強度が観察された。

２．４ＬＣＨＫ１６８を用いた血清炎症性サイトカイン発現の抑制。
マウスにおけるインターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１０の血清レベルを測定する。図５Ａに示すように、ＩＮＦ−γの血清レベルは、ＡＳＬＮ群のマウスでは早くも３週目に有意に増加し、５週目で劇的に増加した。ＡＳＬＮ群のマウスと比較して、ＡＳＬＮ＋ＬＣＨＫ１６８群のマウスではＩＮＦ−γの発現は有意に減少した（ｐ＜０．０１）。次いで、図５Ｂ〜Ｆに示すように、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１０の血清レベルは、ＡＳＬＮ群のマウスでは早くも３週目に有意に増加し、５週目で劇的に増加した。ＡＳＬＮ群のマウスと比較して、ＡＳＬＮ＋ＬＣＨＫ１６８群のマウスではＭＣＰ−１、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１０の発現は、有意に減少した（ｐ＜０．００５）。

２．５ジンセノサイドＭ１はＴ細胞の増殖を阻害した
正常対照マウスと比較して、ＡＳＬＮ群のマウスは、脾細胞において早くも３週目にＴ細胞の増殖の有意な増加を示し、ＡＳＬＮ群のマウスでは５週目で劇的に増加した。ＡＳＬＮ群のマウスと比較して、ＡＳＬＮ＋ＬＣＨＫ１６８群のマウスでは脾細胞におけるＴ細胞の増殖は有意に減少した（ｐ＜０．０１）（図６）。

２．６Ｔｏｌｌ様受容体７ｍＲＮＡ産生の阻害。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果から、図７に示すように腎臓のＴＬＲ７ｍＲＮＡレベルの増加が立証され、ＴＬＲ７のｍＲＮＡレベルは、ＡＳＬＮ群のマウスでは有意に増加した（ｐ＜０．００５）。ＡＳＬＮ群のマウスと比較して、ＡＳＬＮ＋ＬＣＨＫ１６８群のマウスではＴＬＲ７のｍＲＮＡレベルは有意に減少した（ｐ＜０．０１）。

要約すると、我々の研究は、ジンセノサイドＭ１が、ループス腎炎の発生を予防するのに効果的であることを示す。これらすべての知見から、ジンセノサイドＭはループス腎炎の処置のための新規薬剤候補にさらになり得ることが示唆される。

本発明が属する当業者であれば、本発明をさらに説明する必要なく、本発明の記載に基づき最も広い範囲に利用することができると考えられる。したがって、提供した記載および特許請求の範囲は、本発明の範囲を何らかの点で限定するものではなく、例示目的であると理解されるべきである。

Claims

必要とする被検体に治療有効量のジンセノサイドＭ１を投与することを含む、ループス腎炎を処置する方法。
前記方法は、前記被検体の（１）糸球体における：固有細胞の増殖、半月体、好中球浸潤およびフィブリノイド壊死；ならびに（２）尿細管間質コンパートメントにおける：間質単核白血球炎症およびタンパク円柱を伴う尿細管萎縮からなる群から選択されるループス腎炎の１つまたは複数の症状を減少させるまたは軽減するのに効果的である、請求項１に記載の方法。
前記方法は前記被検体の糸球体周囲の単核白血球炎症を減少させるのに効果的である、請求項１に記載の方法。
前記方法は、前記被検体においてタンパク尿もしくは血尿を減少させるまたは血清尿素窒素レベルもしくは血清クレアチニンレベルを低下させるのに効果的である、請求項１に記載の方法。
前記ジンセノサイドＭ１は、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、細胞傷害性薬、免疫抑制剤および血管拡張薬からなる群から選択されるループス腎炎を処置するための１つまたは複数の治療薬と組み合わせて投与される、請求項１に記載の方法。
必要とする被検体のループス腎炎を処置するための薬物を製造するための、ジンセノサイドＭ１の使用。
前記薬物は、前記被検体の（１）糸球体における：固有細胞の増殖、半月体、好中球浸潤およびフィブリノイド壊死；ならびに（２）尿細管間質コンパートメントにおける：間質単核白血球炎症およびタンパク円柱を伴う尿細管萎縮からなる群から選択されるループス腎炎の１つまたは複数の症状を減少させるまたは軽減するのに効果的である、請求項６に記載の使用。
前記薬物は前記被検体の糸球体周囲の単核白血球炎症を減少させるのに効果的である、請求項６に記載の使用。
前記薬物は、前記被検体のタンパク尿もしくは血尿を減少させるまたは血清尿素窒素レベルもしくは血清クレアチニンレベルを低下させるのに効果的である、請求項６に記載の使用。
前記薬物は、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、細胞傷害性薬、免疫抑制剤および血管拡張薬からなる群から選択されるループス腎炎を処置するための１つまたは複数の治療薬と組み合わせて投与される、請求項６に記載の使用。