JP2022101529A

JP2022101529A - アレルギー疾患の治療方法

Info

Publication number: JP2022101529A
Application number: JP2022027845A
Authority: JP
Inventors: イェー・ビー・ウー; B Wu Yeh; ロ・ジャー－メン; Jir-Mehng Lo; リアン・ホイ・ジュー; Hui Ju Liang; リン・ペイ－シン; Pei-Hsin Lin
Original assignee: Arjil Biotech Holding Co Ltd
Current assignee: Arjil Biotech Holding Co Ltd
Priority date: 2018-07-06
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2022-07-06
Also published as: US20200009110A1; AU2019298342B2; AU2019298342A1; WO2020010346A1; US10688078B2; EP3810107A4; TW202011957A; JP2021524507A; CN112654347A; JP7376953B2; EP3810107A1

Abstract

【課題】アレルギー疾患治療のための方法および組成物を提供する。【解決手段】オバトジオリド、１’－アセトキシチャビコールアセテート、ゼルンボンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、アレルギー疾患の治療方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、アレルギー疾患の治療方法に関する。特に、本発明は、アレルギー疾患治療用組成物に関する。

アレルギーは、環境中のアレルゲンに過剰に反応する身体の免疫系障害に起因する。体内に侵入するアレルゲンとＩｇＥ抗体が組み合わさると、肥満細胞が刺激され、ヒスタミンなどの物質が放出され、これにより、身体組織で炎症反応が起こり、その結果、皮膚、粘膜組織、または血管の慢性的な炎症が生じる。近年、それは徐々に健康への大きな脅威となっている。アレルギーは、Ｂ細胞およびＴ細胞の中における第２のタイプのヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）に関連している。Ｔｈ２細胞の特徴的な反応は、インターロイキン－４、ＩＬ－４、およびＩＬ－５の産生である。ＩＬ－４は、Ｂ細胞が免疫グロブリンＥの感作抗体を産生するのを助ける。ＩＬ－５は、好酸球白血球を引き付け、いくつかの炎症性メディエーターを放出し、非常に重度のアレルギー症状を引き起こす。第１のタイプのＴヘルパー細胞は、細胞の免疫に関与し、インターフェロン：ＩＦＮ－γ、ＩｇＧ２ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３などの分泌などのサイトカインの分泌によって、Ｔｈ２応答を阻害し得る。

本発明は、予想外に、いくつかの化合物が抗アレルギー効果を有することを発見した。

したがって、一態様において、本発明は、オバトジオリド、１’－アセトキシチャビコールアセテート、ゼルンボンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、アレルギー疾患の治療方法、を提供する。

他の態様において、本発明は、アレルギー疾患の治療のための医薬の製造における、オバトジオリド、１’－アセトキシチャビコールアセテート、ゼルンボンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物の使用、を提供する。

さらなる態様において、本発明はまた、オバトジオリド、１’－アセトキシチャビコールアセテート、ゼルンボンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物の治療有効量を含む、アレルギー疾患の治療用の医薬組成物、を提供する。

他の態様において、本発明は、アレルギー疾患によって引き起こされる痛みを軽減するための、オバトジオリド、１’－アセトキシチャビコールアセテート、ゼルンボンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物の治療量を含む、ヘルスケア組成物、を提供する。

本発明の一実施形態において、該化合物は、植物またはハーブから提供され得る。例えば、オバトジオリド（ovatodiolide）および／またはゼルンボン（zerumbone）はアニソメレス・インディカ（Anisomeles indica）、１’－アセトキシチャビコールアセテート（1'-Acetoxychavicol acetate）はアルピニア・ガランガル（Alpinia galangal）、ゼルンボン（zerumbone）はジンジベル・ゼルンベット（Zingiber zerumbet）、の植物から、提供され得る。

さらなる他の態様において、本発明は、アニソメレス・インディカ、アルピニア・ガランガル、ジンジベル・ゼルンベットおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるハーブの抽出物を含む、ハーブ組成物または医薬組成物、を提供する。

本発明の実施形態によれば、アレルギー疾患は、環境中の通常は無害な物質に対する免疫系の過敏症によって引き起こされる病気であり、それは、花粉症、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、喘息、乾癬、アナフィラキシー乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎または湿疹、自己免疫疾患、骨関節炎、アレルギー性鼻炎、脂漏性皮膚炎、乾癬性関節炎、およびウルシかぶれ、からなる群から選択されるものであり得る。

特に、自己免疫疾患は、自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、反射性交感神経性ジストロフィー、心筋梗塞後症候群、リウマチ性鼻炎、多発性硬化症、および心筋症からなる群から選択される。本発明の一実施形態において、自己免疫疾患は自己免疫性肝炎である。

上記の一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも、例示的で説明的なものにすぎず、本発明を限定するものではないことを理解されたい。

上記の概要、および以下の本発明の詳細な説明は、添付された図面と併せて参照すれば、より十分に理解されるであろう。本発明を説明する目的で、現在の好ましい実施形態が図面に示されている。

図１は、動物に接触性皮膚炎を誘発するための計画図である。図２は、動物に乾癬を誘発するための計画図である。図３は、接触性皮膚炎の動物実験における耳介浮腫の観察結果である（＊＊：ｐ＜０．０１）。図４は、接触性皮膚炎の動物実験における肥満細胞浸潤の耳の生検の結果である（＊＊：ｐ＜０．０１）。図５は、接触性皮膚炎の動物実験における肥満細胞浸潤の皮膚生検の結果である（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。図６は、接触性皮膚炎の動物実験の結果である（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。図７は、本発明の一実施形態において、接触性皮膚炎を誘発するための動物実験における血清細胞依存の分析チャートである（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。図８Ａは、乾癬の動物実験における落屑のレベルを示すチャートである。図８Ｂは、乾癬の動物実験の発赤のレベルを示すチャートである。図９は、乾癬の動物実験におけるリアルタイムＰＣＲの結果である（ｎｓ：ｐ＞０．０５；＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１）。図１０は、乾癬の動物実験における脾臓重量の結果である。図１１は、乾癬の動物実験におけるリンパ細胞での細胞因子の発現を示すチャートである（ｎｓ：ｐ＞０．０５；＊：ｐ＜０．０５；＊：ｐ＜０．０１）。図１２は、ＧＯＰ、ＧＰＴおよび体重に対するＡＲ００１ＤＳ１の効果を示している。データは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝９）。＊：ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定によりＶｅｈに対して）。Ｖｅｈ、ビヒクル；Ｄｅｘ、デキサメタゾン。図１３は、肝損傷に対するＡＲ００１ＤＳ１の効果を示している。壊死の組織病理学的スコアは、平均±ＳＥＭとして表される（ｎ＝９）。＊＊＊：ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定によりＶｅｈに対して）。Ｖｅｈ、ビヒクル；Ｄｅｘ、デキサメタゾン。図１４Ａは、ＡＲ００１ＤＳ１またはＡＲ００１ＤＳ２の前処理が、ＴＨＰ－１細胞におけるＰＭＡ誘導ＩＬ－１β発現を阻害することを示している。ＡＲ００１ＤＳ１またはＡＲ００１ＤＳ２により０．５時間前処理し、続いてＰＭＡ誘導を４８時間行ったＴＨＰ－１細胞における、ＩＬ－１β ｍＲＮＡおよびタンパク質発現のＱ－ＰＣＲ分析（左）およびイムノブロッティング（右）である。図１４Ｂは、ＡＲ００１ＤＳ１処理が、ＴＨＰ－１細胞におけるＰＭＡ誘導ＩＬ－１β発現を阻害することを示している。ＰＭＡで２４時間刺激し、続いてＡＲ００１ＤＳ１またはＡＲ００１ＤＳ２の有無で２４時間の処理をしたＴＨＰ－１細胞における、ＩＬ－１β ｍＲＮＡ発現のＱ－ＰＣＲ分析である。図１５は、ＰＭＡ誘導サイトカインに対するＡＲ１００ＤＳ１処理（Ａ－ＰＭＡ）の効果をモニターするために、ヒト２７－ｐｌｅｘサイトカインアッセイを用いたｂｉｏ－ｐｌｅｘ分析の結果を示している。ＴＨＰ－１細胞をＡＲ００１ＤＳ１（１０μｇ／ｍｌ）で０．５時間処理した後、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。ＡＲ００１ＤＳ１で処理した細胞（Ａ－ＰＭＡ）を、ＰＭＡのみ、および未処理のＴＨＰ－１（Ｃｔｒｌ）とともに、Ｂｉｏ－ｐｌｅｘ分析にかけた。図１６は、ＡＲ００１ＤＳ１が、用量依存的に肥満細胞の脱顆粒を抑制し得ることの結果である。ＤＮＰ、ジニトロフェニル；ＤＮＰ－ＢＳＡ、ジニトロフェニル－ウシ血清アルブミン。図１７は、ＡＲ００１ＤＳ１が、用量依存的に樹状細胞（ＤＣ）によるＴＮＦ－α分泌を抑制し得ることの結果である。ＤＭＳＯ、ＤＣ＋０．１％ＤＭＳＯ；ＬＰＳ：ＤＣ＋ＬＰＳ＋０．１％ＤＭＳＯ；Ｑｕｅ：ＤＣ＋ＬＰＳ＋ケルセチン；非処置：ＤＣ＋培地；ＡＲ００１ＤＳ１：ＤＣ＋ＬＰＳ＋ＡＲ００１ＤＳ１。

特に断りのない限り、本明細書におけるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「サンプル」との記載は、そのようなサンプルの複数、および当業者に知られているその均等物、を含む。

本発明は、オバトジオリド、１’－アセトキシチャビコールアセテート、ゼルンボンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、アレルギー疾患の治療方法、を提供する。

本発明において、オバトジオリド（本明細書において「ＡＲ００１ＤＳ１」とも称する）は、アニソメレス・インディカから単離および精製することができ、以下の構造式で示される。

本発明において、１’－アセトキシチャビコールアセテート（本明細書において「ＡＲ００１ＤＳ２」とも称する）は、アルピニア・ガランガから単離および精製することができ、以下の構造式で示される。

本発明において、ゼルンボン（本明細書において「ＡＲ００１ＤＳ３」とも称する）は、ジンジベル・ゼルンベットから単離および精製され、以下の構造で示される。

本発明は、アレルギー疾患の治療のための医薬の製造における、オバトジオリド、１’－アセトキシチャビコールアセテート、ゼルンボンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物の使用、を提供する。

本発明はまた、オバトジオリド、１’－アセトキシチャビコールアセテート、ゼルンボンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物の治療有効量を含む、アレルギー疾患の治療用の、ヘルスケアまたは医薬組成物、を提供する。

化合物は、植物またはハーブから提供され得る。例えば、オバトジオリドおよび／またはゼルンボンは、植物アニソメレス・インディカから、１’－アセトキシチャビコールアセテートは、アルピニア・ガランガルから、そして、ゼルンボンは、ジンジベル・ゼルンベットから、提供され得る。したがって、本発明は、アニソメレス・インディカ、アルピニア・ガランガル、ジンジベル・ゼルンベットおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるハーブの抽出物を含む、ハーブ組成物または医薬組成物、を提供する。

本明細書において、「アレルギー疾患」との用語は、環境中の通常は無害な物質に対する免疫系の過敏症によって引き起こされる病気を意味し、特に、自己免疫疾患が挙げられる。本発明の実施形態において、アレルギー疾患は、花粉症、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、喘息、乾癬、アナフィラキシー乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎または湿疹、脂漏性皮膚炎、乾癬性関節炎、ウルシかぶれ、関節リウマチ、多発性硬化症、変形性関節症、アレルギー性鼻炎、および心筋症からなる群から選択される。症状としては、赤目、かゆみを伴う発疹、くしゃみ、鼻水、息切れ、腫れなどを挙げることができる。本発明の例において、アレルギー疾患は、アレルギー性皮膚炎、特に、アトピー性湿疹または乾癬である。

本明細書において、「自己免疫疾患」との用語は、正常な身体部分に対する異常な免疫応答から生じる病気を意味する。少なくとも８０種類の自己免疫疾患がある。自己免疫疾患としては、これに限定されるものではないが、例えば、自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎、セリアック病、１型糖尿病、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、反射性交感神経性ジストロフィー、心筋梗塞後症候群、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、心筋症、および全身性エリテマトーデス、が挙げられる。

本発明によれば、アニソメレス・インディカの抽出物は、以下の方法によって製造することができる。アニソメレス・インディカをエタノールで抽出して粗抽出物を得て、粗抽出物をシリカ充填クロマトグラフィーカラムに入れ、溶離液：ｎ－ヘキサン／酢酸エチル、ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、およびメタノール、のグラジエント溶出を行って、画分を得て、シリカ充填クロマトグラフィーカラムを用いて画分を分離し、その際、溶離液：ジクロロメタン、ジクロロメタン／メタノール、およびメタノール、のグラジエント溶出を行い、濃縮物を得て、濃縮物をｎ－ヘキサン／酢酸エチルで再結晶して結晶を得る。オバトジオリドおよび／またはゼルンボンは、アニソメレス・インディカの植物から得ることができる。

本発明によれば、アルピニア・ガランガルの抽出物は、以下の方法によって製造することができる。アルピニア・ガランガルをシクロヘキサンで抽出して粗抽出物を得て、粗抽出物をシリカ充填クロマトグラフィーカラムに入れ、溶離液：ｎ－ヘキサン／酢酸エチル、ｎ－ヘキサン／酢酸エチル／メタノール、およびメタノール、のグラジエント溶出を行い、分離物を得て、分離物をｎ－ヘキサン／酢酸エチルで再結晶して結晶を得る。１’－アセトキシチャビコールアセテートは、アルピニア・ガランガルから抽出することができる。

本明細書において、「対象」との用語は、ヒト、または、ペット動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、または実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）といったヒト以外の動物、が含まれる。

本明細書において、「治療」との用語は、アレルギー疾患や、アレルギー疾患の症状を有する、またはアレルギー疾患にかかっている、それを必要とする対象に、１つまたは複数の活性薬剤を投与することを意味する。その目的は、病気、病気の症状、または病気にかかることを、治癒し、治療し、緩和し、低減し、変更し、矯正し、改善し、または影響を与えることである。

本明細書において、「治療有効量」との用語は、そのような量を受けていない対応する対象と比較して、治療、治癒、予防、または、病気、障害または副作用の改善、または病気または障害の進行速度の低下、に効果をもたらす化合物または薬剤の量を意味する。この用語には、その範囲内に、正常な生理学的機能を増強するのに有効な量も含まれる。

治療に用いるために、治療有効量の組成物が、投与用の医薬組成物として製剤化される。したがって、本発明は、治療有効量の活性成分、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。

本明細書において、「薬学的に許容される担体」との用語は、製剤の他の成分と適合性があり、医薬組成物で投与される対象に有害ではないという意味において許容される、担体、希釈剤または賦形剤を意味する。医薬製剤の要件に応じて、当該分野で一般に知られている、または使用されている任意の担体、希釈剤または賦形剤が、本発明で使用することができる。

本発明によれば、医薬組成物の形態は、錠剤、ピル、粉末、飴、分包、トローチ、エリクサー、懸濁液、軟膏、ローション、溶液、シロップ、ソフトおよびハードゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射液、およびパッケージ粉末、であり得る。本発明の特定の一例では、医薬組成物は軟膏の形態で製剤化される。そのような製剤は、薬学分野で知られている方法によって製造することができる。

本発明によれば、医薬組成物は、これに限定されるものではないが、経口、直腸、経鼻、局所、膣、または非経口経路などの、適切な経路による投与のために適応させることができる。本発明の特定の一例では、医薬組成物は、局所投与用に製剤化される。そのような製剤は、薬学分野で知られている方法によって製造することができる。

本発明によれば、本明細書に記載の方法、使用または組成物は、少なくとも１つの追加のアレルギー薬と組み合わせて対象に投与することができる。対応するアレルギー薬としては、これに限定されるものではないが、例えば、ケトロラクトロメタミン、ペミロラストカリウム、ケトチフェン、ロラタジン、ネドクロミルナトリウム、フェキソフェナジン、ロテプレドノールエタボネート、アゼラスチン、臭化イプラトロピウム、エピネフリン、ベクロメタゾン、ジフェンヒドラミン、デスロラタジン、ロラタジン、デキサメタゾン、エピナスチン、フルチカゾン、が挙げられる。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明の残余部分を決して限定するものではない。さらなる説明なしに、当業者は、本明細書の記載に基づいて本発明を最大限に使用することができると考えられる。

調製例
１．接触性皮膚炎の動物実験

接触性皮膚炎動物モデル
ＢＡＬＢ／ｃマウスの誕生から７～８週間後、背部のシェービングを行い、アレルギー薬である１－クロロ－２，４－ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ）を刺激剤として使用して、アトピー性湿疹などのような接触性皮膚炎の症状を誘発した。図１に示すように、１～３日目に、背部に１００μｌの０．５％ＤＮＣＢを塗布し、１４日目に、皮膚に１００μｌの１％ＤＮＣＢを適用し、耳に２０μｌの１％ＤＮＣＢを適用した。１７、２１、２４、２８、３１、３５日目にも塗布を実施した。一方、１４日目から、試験軟膏を週に５回、３週間塗布した。３６日目に、マウスを屠殺した。

マウスのグルーピング
マウスを５つの群に分け、各群は４匹のマウスとした。表１に、名称、薬剤、および軟膏を示す。

マウスを、オバトジオリド（ＡＲ００１ＤＳ１）および１’－アセトキシチャビコールアセテート（ＡＲ００１ＤＳ２）を軟膏に添加した組成物、および、オバトジオリド（ＡＲ００１ＤＳ１）およびゼルンボン（ＡＲ００１ＤＳ３）を軟膏に添加した組成物で処置し、それぞれ、Ａ１００群およびＶ２群と称し、ここで、各化合物の量は２．５％である。

耳介浮腫の測定
実験後、マウスの耳の厚さを測定し、記録した。

ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色
皮膚および耳をマウスから採取し、ホルマリンで固定し、ワックス片にした。スライス後、ＨＥで染色し、好酸球の浸潤と皮膚浮腫の結果を観察した。

皮膚トルイジンブルー染色
マウスの皮膚および耳を固定およびスライスした後、それらをトルイジンブルーで染色し、肥満細胞の浸潤を観察した。

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による皮膚の遺伝子発現の分析
皮膚片を採取してそのｍＲＮＡを抽出し、ＩＬ－４およびＩＬ－５の遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲによって分析した。

２．乾癬の動物実験
乾癬動物モデル
動物は、国立実験動物センターからの５～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスであった。実験環境を２５℃に保った。明期と暗期は、１２時間ごとのサイクルとした。マウスには、自由に十分な餌と水が与えられた。

乾癬は、イミキモド（ＩＭＱ）によってマウスに誘発した。図２に示すように、実験の前日に、マウスをシェービングナイフと除毛クリームで除毛した後、マウスを２群に分けた。

オバトジオリド（ＡＲ００１ＤＳ１）および１’－アセトキシチャビコールアセテート（ＡＲ００１ＤＳ２）の組成物で処置した群を、ＡＲ１００と称し、オバトジオリド（ＡＲ００１ＤＳ１）で処置した群を、ＡＲ１１１と称し、オバトジオリド（ＡＲ００１ＤＳ１）およびゼルンボン（ＡＲ００１ＤＳ３）の組成物で処置した群を、ＡＲ１１２と称する。マウスは６群に分け、各群は８匹のマウスとした。表２に、名称、薬剤、および軟膏を示す。

感作群（Ｓ，ＩＭＱ／基剤）のマウスについて、マウス背部に６２．５ｍｇのＩＭＱを塗布した。４時間後、マウスを、５０ｍｇのＡＲ１００（ＩＭＱ／ＡＲ１００）、５０ｍｇのＡＲ１１１（ＩＭＱ／ＡＲ１１１）、または５０ｍｇのＡＲ１１２（ＩＭＱ／ＡＲ１１２）で処置した。薬剤は、１日１回、６日間塗布した。マウスの体重を記録し、マウスを毎日写真に撮った。皮膚の発赤および鱗屑の状態を観察し、スコアに付けた。実験の最終日、マウスを屠殺し、皮膚を採取して、免疫学的組織染色およびサイトカイン発現の分析を行った。

３．自己免疫性肝炎の動物実験
試薬
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）およびデキサメタゾン（Ｄｅｘ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から購入した。ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ（商標）イムノアッセイキットは、ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ．（ＵＳＡ）から購入した。ＧＯＰおよびＧＰＴＦｕｊｉドライケムスライドは、ＷｉｎｎｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＩｎｃ．（台湾）から購入した。

動物
雄のＢＡＬＢ／ｃマウス（７～９週齢）は、ＢｉｏＬＡＳＣＯＴａｉｗａｎＣｏ．，Ｌｔｄ、または国立実験動物センター（ＮＬＡＣ、台湾）から購入した。動物はケージごとに５匹飼育し、実験中は餌と水を自由に与えた。室温は２３±２℃に維持し、１２時間の明暗サイクルを交互に繰り返した。実験前にストレスの影響を最小限に抑えるために、動物を１週間順応させた。動物とその飼育を含むすべての実験プロトコルは、ITRIのInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）によって承認され（ITRI-IACUC-2018-041、および、ITRI-IACUC-2018-050；AAALACにより認可)、台湾の農業評議会の規律にしたがって、実施した。

実験計画および肝炎誘発
ＣｏｎＡを、３ｍｇ／ｍｌの濃度でパイロジェンフリーの生理食塩水に溶解し、１５ｍｇ／ｋｇ体重または２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で静脈注射して、肝炎を誘発した。ＡＲ１００ＤＳ１およびＤｅｘを、ＣｏｎＡ処置の３０分前、４時間後、８時間後に、経口投与した。ＣｏｎＡ処置の２４時間後に、血液および肝臓の組織を採取した。血清は分析まで－８０℃で保存した。

肝酵素の分析
ＣｏｎＡ処置後の肝細胞傷害のレベルを評価するために、血清ＧＰＴおよびＧＯＴレベルを、フジドライケムスライド（フジ、日本）によって測定した。

血清サイトカインの分析
同じ群の血清をサイトカインアッセイのためにプールした。サイトカインレベルは、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ（商標）イムノアッセイキットによって製造者の指示に従って測定した。

組織病理学
肝臓組織を１０％リン酸緩衝ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋し、組織病変を確認するためにヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。組織病変は、ＢｉｏＬＡＳＣＯＴａｉｗａｎＣｏ．，Ｌｔｄの獣医病理学者によって顕微鏡で検査した。すべての顕微鏡病変の重症度評価系の基準は、次のように０～４で評価した：０＝なし；１＝個別の細胞の壊死；２＝≦３０％の小葉壊死；３＝≦６０％の小葉壊死；４＝＞６０％の小葉壊死。

統計分析
データは平均±ＳＥＭとして表す。この研究では、スチューデントｔ検定を使用して、薬物処置群とビヒクル処置群との差を分析した。ｐ値が０．０５未満の場合、差は統計的に有意であると見なされる。

４．肥満細胞および樹状細胞の免疫応答
β－ヘキソサミニダーゼ分泌アッセイ
ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を２４ウェルプレートに播種し、次いで、抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）－ＩｇＥで、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気において、一晩感作させた。洗浄後、細胞をＡＲ００１ＤＳ１（１２．５、２５、５０、および１００μｇ／ｍｌ）で、３７℃で、３０分間処理し、ＤＮＰ－ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で３７℃で３０分間刺激して、脱顆粒を誘導した。上清を９６ウェルマイクロプレートに移し、等量の５ｍＭの４－ニトロフェニルＮ－アセチル－ｂ－グルコサミニドを含む０．１Ｍクエン酸バッファ（ｐＨ４．５）とともに、２時間インキュベートした。２００ｍｌの停止バッファ（０．０５Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ１０）を加えることにより反応を停止し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、４０５ｎｍでのＯＤを測定した。

ＴＮＦ－α分泌のためのＥＬＩＳＡアッセイ
ＤＣをＣ５７ＢＬ／６マウスから単離し、３７℃で７日間インキュベートした。次に、ＤＣを２４ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で、一晩培養した。ＤＣをＡＲ００１ＤＳ１（１２．５、２５、５０、および１００μｇ／ｍｌ）で１時間処理し、その後、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）で４時間刺激した。上清を収集し、培養上清中のＴＮＦ－α分泌をＥＬＩＳＡアッセイを用いて定量化した。

実施例１アトピー性皮膚炎誘発の動物実験
１．外観観察および分析
実験の終わりにマウスを屠殺した後、マウスの皮膚の外観を写真に撮った。正常群（Ｎ）のマウスは、無傷の皮膚を有していた。感作群（Ｓ）のマウスの皮膚は、荒れて炎症を起こし、耳は腫れていた。皮膚のリモデリング現象は、ＤＮＣＢの刺激から約３～４週間後に見られた。ＳＶ群では、皮膚の症状は改善されなかった。しかしながら、Ａ１００群とＶ２群のそれぞれにおいて、アトピー性湿疹の改善の効果が見られ、皮膚の発赤と腫れが著しく改善された。また、マウスの首を折る過程で、Ａ１００群とＶ２群は、皮膚のひび割れの現象が見られず、アトピー性湿疹による皮膚の脆さが改善された。したがって、アトピー性湿疹による症状は、オバトジオリドと１’－アセトキシチャビコールアセテートの組成物（Ａ１００）、および、オバトジオリドとゼルンボンの組成物（Ｖ２）の処置によって改善され得ると結論付けられた。

２．耳の厚さの測定および分析
ＳＶ群の耳の厚さは、０．６９±０．０８ｍｍと測定され、これは、正常群の耳の厚さ（Ｎ、０．２３±０．０４ｍｍ）よりも有意に厚かった。図３に示すように、Ａ１００群およびＶ２群の耳の厚さは、それぞれ、０．２７±０．０７ｍｍ（ｐ＜０．０１）および０．３１±０．１０ｍｍ（ｐ＜０．００１）と測定された。Ａ１００群およびＶ２群の耳の腫れが有意に改善したことが分かった。皮膚の外観と耳の腫れは、Ａ１００群およびＶ２群の両方で改善した。

３．耳および皮膚の切片の観察および分析
屠殺したマウスの耳および皮膚を切片にし、ＨＥ染色に供した。感作群の皮膚と耳には、真皮層の肥厚現象が見られ、多くの好酸球が皮膚組織に浸潤していた。一方、Ａ１００群およびＶ２群では、皮膚と耳の腫れが減少し、好酸球の浸潤が減少した。

具体的には、好酸球は、喘息の肺およびアトピー性皮膚炎の皮膚部分などのアレルギー部分に蓄積する傾向があった。アレルギー部分に集まったこの好酸球のグループは、より多くの炎症性物質を放出し、より深刻な炎症を浸潤部分に引き起こす。したがって、好酸球の浸潤を抑えることができれば、アトピー性皮膚炎の症状は著しく改善される。Ａ１００群およびＶ２群では、皮膚および耳への好酸球の浸潤を著しく改善した、と結論付けることができる。

マウスの皮膚および耳の切片をトルイジンブルーでも染色し、肥満細胞を観察した。図４および図５に結果を示す。肥満細胞は、アレルギー反応を誘発するための重要な免疫細胞である。ＩｇＥ、アレルゲンおよび肥満細胞が交差結合すると、肥満細胞が活性化されて誘導され、ヒスタミンやロイコトリエンなどが放出され、組織にアレルギー反応を引き起こす。皮膚炎の患部に多数の活性化肥満細胞が浸潤すると、重度のアレルギーやかゆみが引き起こされる。実験において、感作群の皮膚や耳に肥満細胞の浸潤が多く（図４および図５参照）、Ｓ群に比べて肥満細胞数が減少傾向にあると、皮膚アレルギーの症状が大きく改善することが分かった。Ａ１００群の耳の切片は、Ｖ２群の耳および皮膚の切片と有意な差はないものの、肥満細胞の浸潤は減少した。

４．血液中の抗体の測定
図６、７および８に示すように、Ａ１００群およびＶ２群においてＩｇＥの産生が阻害されたが、Ａ１００群でのＩｇＥ産生に対する阻害は、Ｖ２群のものよりも大きかった（図８参照）。オバトジオリドと１’－アセトキシチャビコールアセテートの組成物（Ａ１００）、および、オバトジオリドとゼルンボンの組成物（Ｖ２）は、ＩｇＥ産生を阻害し、皮膚アレルギーの大幅な改善を示すと結論付けられる。

アトピー性皮膚炎とＴｈ２細胞の過剰な活性化は、互いに密接に関連していることも分かった。図７に示すように、Ａ１００群のＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＴＮＦ－αのレベルは、ＩＬ－４の減少において、対照群のレベルと有意に差があった（ｐ＜０．０５）。図７に示すように、ＡＲ００１ＤＳ１とＡＲ００１ＤＳ２を含む組成物は、ＩＬ－５およびＴＮＦ－αのレベルに影響を及ぼしたが、低下傾向が示された（図７参照）。Ｖ２群では、ＡＲ００１ＤＳ１とＡＲ００１ＤＳ３の組成物は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＴＮＦ－αのレベルを低下させる効果を示したが、有意ではなかった。

図６に示すように、ＡＲ００１ＤＳ１とＡＲ００１ＤＳ２を含む組成物（ＡＲ１００群）は、ＩｇＧ１を阻害し、ＩｇＧ２ａを促進する傾向があった。ＡＲ１００群と比較して、Ｖ２群における血中のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのレベルは有意に調節されなかった。

上記を考慮すると、ＡＲ００１ＤＳ１とＡＲ００１ＤＳ２の組成物は、ＩＬ－４およびＩｇＥのレベルに影響を及ぼし、これは、Ａ１００がＴｈ２細胞の活性を低下させ得ることを間接的に示した。Ａ１００群とＶ２群の両方で、ＴＮＦ－α（炎症マーカー）の発現が低下していることが分かった。

要約すると、ＡＲ００１ＤＳ１とＡＲ００１ＤＳ２の組成物、および、ＡＲ００１ＤＳ１とＡＲ００１ＤＳ３の組成物はどちらも、マウスのアトピー性皮膚炎の症状の改善に対して効果を有する。Ｔｈ２免疫細胞を減少させる役割には特に良くはないものの、ＡＲ００１ＤＳ１とＡＲ００２ＤＳ２の組成物で処置したＡＲ１００群では、血中のＩｇＥおよびＩＬ－４のレベルが低下していることが分かった。ＡＲ１００群および／またはＶ２群では、皮膚での好酸球および肥満細胞の浸潤が減少し、皮膚の腫れおよび炎症の改善を示すことが分かった。

実施例２乾癬動物実験
１．外観の観察および分析
マウスの皮膚の外観を観察し、ＡＲ１００群およびＡＲ１１２群において、乾癬を伴う患部の鱗屑および発赤が効果的に減少し、ＡＲ０００１ＤＳ１とＡＲ０００２ＤＳ３の組成物が、乾癬の症状の減少に対する有意な効果を与えることが分かった。

２．発赤のスコア
発赤の程度は、マウスの毎日の観察および記録に従ってスコア化された。図８Ａに皮膚の鱗屑の程度を示し、図８Ｂに発赤を示す。図８Ａおよび８Ｂのデータは、乾癬面積と重症度指数（ＰＡＳＩ）に基づいており、乾癬の鱗屑比、発赤、および鱗屑の程度は、０ポイント（なし）、１ポイント（軽度）、２ポイント（中度）、３ポイント（重度）、および４ポイント（非常に重度）で、スコア化し、実験の過程で毎日記録した。結果、ＡＲ１００群、ＡＲ１１１群、およびＡＲ１１２群は、乾癬の鱗屑および発赤の症状を効果的に低減でき、ＡＲ１１２群が最も効果的であることが示された。

血中の抗体の測定
細胞因子Ｔｈ１細胞（ＩＦＮ－γ）、Ｔｈ２細胞（ＩＬ－４）、Ｔｈ１７細胞（ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２）、Ｔｈ１７細胞（ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２）、および炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６）を、リアルタイムＰＣＲで分析し、乾癬の低減について、ＩＭＱ／基剤、ＩＭＱ／ＡＲ１００、ＩＭＱ／ＡＲ１１１、およびＩＭＱ／ＡＲ１１２を比較した。図９に示すように、ＩＭＱ／ＡＲ１００、ＩＭＱ／ＡＲ１１１、およびＩＭＱ／ＡＲ１１２の各群では、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１７、およびＩＬ－２２のｍＲＮＡ発現が低下した。ＩＭＱ／ＡＲ１１２群において、ＡＲ００１ＤＳ１およびＡＲ００１ＤＳ３を含む組成物によって乾癬が改善され得ると、結論付けられた。

４．脾腫の測定
ＩＭＱ誘発乾癬動物において、脾腫、リンパ器官の腫脹、またはリンパ組織の腫脹が誘発された。脾臓のサイズと重量は、実験において炎症の指標とみなされる。図１０に示すように、ＩＭＱ誘発乾癬動物において炎症を低減する効果は、炎症指標としてのマウスの脾臓サイズおよび脾臓重量に関して見られた。ＩＭＱ／ＡＲ１００、ＩＭＱ／ＡＲ１１１、およびＩＭＱ／ＡＲ１１２の各群では、ＩＭＱ誘発での脾腫の程度が著しく減少した。

５．リンパ球におけるサイトカイン発現の測定
ＩＭＱ／ＡＲ１００群、ＩＭＱ／ＡＲ１１１群、およびＩＭＱ／ＡＲ１１２群のリンパ球における、Ｔｈ１細胞（ＩＦＮ－γ）、Ｔｈ２細胞（ＩＬ－１）のサイトカイン発現を、フローサイトメトリーによって分析した。図１１に示すように、ＩＭＱ／ＡＲ１００、ＩＭＱ／ＡＲ１１１、およびＩＭＱ／ＡＲ１１２の各群では、Ｔｈ１７細胞の発現が低下し、ＡＲ００１ＤＳ１およびＡＲ００１ＤＳ２を含む組成物、および、ＡＲ００１ＤＳ１およびＡＲ００１ＤＳ３を含む組成物の効果は、統計的に有意な効果を与えることが分かった。

実施例３自己免疫性肝炎動物実験
自己免疫性肝炎（ＡＩＨ）は、肝細胞の炎症、壊死、および肝硬変傾向を特徴とする複雑な疾患である。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける植物レクチンコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘発急性肝炎は、ＡＩＨの一般的な動物モデルであり、ＡＲ００１ＤＳ１の抗肝炎効果を評価するためにこのモデルを実施した。ＡＩＨのステロイド系の標準治療剤の１つであるデキサメタゾン（Ｄｅｘ）をポジティブコントロールとして使用した。

マウスにおいてＣｏｎＡ誘発急性肝炎を誘導するために、１５ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡでマウスを処置した。血清ＧＯＴおよびＧＰＴレベルは、１５ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡ処置群において、偽対照と比較したときに、有意に増加した（ＧＯＴ：１４５０±４３３ｖｓ１４０±２３Ｕ／Ｌ；ＧＰＴ：１４３７±３９８ｖｓ７６±７Ｕ／Ｌ）。２０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡ治療群に関しては、血清ＧＯＴレベルは、有意に増加し（２２４９±５４９ｖｓ１４０±２３Ｕ／Ｌ）、血清ＧＰＴレベルは、有意差なしに増加した（２０３０±８３３ｖｓ７６±７Ｕ／Ｌ）。偽剤のマウスと処置なしのマウスの間に差は観察されなかった（ＧＯＴ：１４０±２３ｖｓ１３５±２０Ｕ／Ｌ；ＧＰＴ：７６±７ｖｓ８３±２Ｕ／Ｌ）。この研究では、Ｄｅｘをポジティブコントロールとして使用した。結果、Ｄｅｘは、ＣｏｎＡによって誘発されたＧＯＴの上昇を減少させたことが示された（１５ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡ：８０９±３３９ｖｓ１４５０±４３３Ｕ／Ｌ；２０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡ：１２６１±２８２ｖｓ２２４９±５４９Ｕ／Ｌ）。しかしながら、Ｄｅｘは、１５ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡによって誘発されるＧＰＴのレベルを低減（８９８±５１５ｖｓ１４３７±３９８Ｕ／Ｌ）したのみで、２０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡ群では低減しなかった（１９４０±４０３ｖｓ１４３７±３９８Ｕ／Ｌ）。さらに、ＣｏｎＡで処置したすべてのマウスで体重が減少した。

次に、肝臓組織の組織病理学的分析を行った。偽対照と比較して、１５ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡはどちらも、顕著な肝壊死を誘発した（スコア：１５ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡ、２．２±０．２ｖｓ０±０；２０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡ、２．２±０．７ｖｓ０±０、ｐ＜０．０５）。Ｄｅｘは、１５ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡ誘発後に組織病変のわずかな緩和を示したが（スコア１．６±０．６ｖｓ２．２±０．２）、２０ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡ処置群では、より重度の病変を引き起こした（スコア２．６±０．２ｖｓ２．２±０．２）。これらの結果に基づいて、さらなる研究のために１５ｍｇ／ｋｇのＣｏｎＡを選択した。

最終的に、５０ｍｇ／ｋｇのＡＲ１００ＤＳ１は、ＣｏｎＡによって増加したＧＰＴレベルを有意に減少させ（１０９±２５ｖｓ３６８±１０７Ｕ／Ｌ、ｐ＜０．０５）、ＧＯＴの上昇をわずかに改善した（２６１±４５ｖｓ４１０± ５６Ｕ／Ｌ）（図１２）。また、組織病理学的分析により、ＡＲ１００ＤＳ１は肝壊死を改善したことが示された（スコア０．２±０．２ｖｓ１．４±０．２、ｐ＜０．０５）（図１３）。

実施例４炎症性シグナル伝達に対するＡＲ－１００の拮抗作用
ＡＲ００１ＤＳ１は、マクロファージ放出ＩＬ－１βが重要な炎症的役割を担う痛風関節炎の動物モデルに対して治療効果を示したので、ホルボール－１２－ミリスタート－１３－アセテート（ＰＭＡ）活性化ＴＨＰ－１細胞におけるＩＬ－１β誘導に対するＡＲ００１ＤＳ１の効果を試験した。ＡＲ１００は、ＡＲ００１ＤＳ１およびＡＲ００１ＤＳ２で構成されていたため、ＴＨＰ－１細胞を２つの成分で個別に前処理した後、ＰＭＡ活性化を行った。Ｑ－ＰＣＲおよびイムノブロッティングにより、ＴＨＰ－１細胞をＡＲ００１ＤＳ１またはＡＲ００１ＤＳ２で前処理するとＩＬ－１βの発現が阻害されることが示された（図１４Ａ）。興味深いことに、ＴＨＰ－１細胞のＰＭＡによる活性化の後、ＴＨＰ－１細胞をＡＲ１００ＤＳ１で処理すると、ＩＬ－１βの発現が抑制されたが、ＡＲ００１ＤＳ２は、ＰＭＡ誘導ＩＬ－１βを抑制しなかった（図１４Ｂ）。これらのデータにより、ＡＲ００１ＤＳ１およびＡＲ００１ＤＳ２はどちらも、マクロファージにおける炎症性シグナル伝達の開始を抑制できることが示され、さらに、ＡＲ００１ＤＳ１は、活性化したマクロファージの炎症性シグナル伝達を阻害できることが示された。

実施例５炎症性サイトカインの効果
ＩＬ－１βに加えて、いくつかのサイトカインを炎症反応に加えた。ＡＲ００１ＤＳ１によって影響を受けるサイトカインネットワークを確認するために、Ｂｉｏ－ｐｌｅｘ分析を行って、ＰＭＡ処理ＴＨＰ－１細胞におけるヒトの２７サイトカインの発現に対するＡＲ００１ＤＳ１処理の効果をモニタリングした。ＰＭＡは、ＩＬ－１βを誘導したが、ＡＲ００１ＤＳ１処理はその発現を低減させたことが観察された。さらに、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）－αおよび－βなどのサイトカインは、ＰＭＡ誘導マクロファージの分化中に多く発現し、一方、ＡＲ００１ＤＳ１処理は、それらの発現を阻害した。図１５に示すように、ＩＬ－８、ＴＮＦ－αおよびＲＡＮＴＥＳなどの炎症性サイトカインの誘導もＡＲ００１ＤＳ１処理によって阻害された。これらのデータは、ＡＲ００１ＤＳ１が、マクロファージにおける炎症性サイトカインの発現を阻害できることを支持している。

実施例６
かなりの証拠が、アレルギー性疾患の病因における樹状細胞（ＤＣ）の役割を支持している。肥満細胞は、ＤＣとともに、アレルゲンおよびその他の環境由来物質と相互作用する最初の免疫細胞の１つである。したがって、この研究では、マウスのＲＢＬ－２Ｈ３（ＲＢＬ）細胞（肥満細胞株）およびＤＣを用いて、ＡＲ００１ＤＳ１が、肥満細胞および樹状細胞の免疫応答を抑制するか否かという問題を調べた。

図１６に示すように、抗原［ＤＮＰ－ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）］の刺激は、抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）ＩｇＥ感作ＲＢＬ細胞からのβ－ヘキソサミニダーゼの有意な放出を引き起こした。対照的に、ＡＲ００１ＤＳ１で処理した細胞では、β－ヘキソサミニダーゼの分泌は、用量依存的に有意に阻害された。

ＡＲ００１ＤＳ１がβ－ヘキソサミニダーゼの分泌を阻害できることを観察したため、ＡＲ００１ＤＳ１が、ＤＣにおいて、ＴＮＦ－αなどの他の分泌顆粒物のエキソサイトーシス調節を抑制するか否かを確かめることとした。図１７に示すように、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激は、ＴＮＦ－αの有意な分泌を誘導したが、抗酸化、抗増殖および抗炎症の特性を有する最も有名な植物性化学物質の１つであるケルセチンは、ＬＰＳで刺激したＤＣにおけるＴＮＦ－αの分泌を効果的に減少させた。驚くべきことに、ＡＲ００１ＤＳ１は、ケルセチンよりもＬＰＳ刺激ＤＣにおけるＴＮＦ－αの分泌に対して優れた阻害効果を示した。

本発明は、好ましい実施形態によって開示されているが、これは本発明を限定することを意図するものではない。当業者は、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、改変および修正を行うことが可能である。したがって、本発明の保護範囲は、続いて添付された特許請求の範囲によって定義されるものにより定められる。

Claims

オバトジオリド、１’－アセトキシチャビコールアセテート、ゼルンボンおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、アレルギー疾患の治療方法。
該化合物が医薬組成物で投与される、請求項１に記載の方法。
該化合物が、アニソメレス・インディカ、アルピニア・ガランガル、ジンジベル・ゼルンベットおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるハーブの抽出物を含む組成物で投与される、請求項１に記載の方法。
アレルギー疾患が、花粉症、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、喘息、乾癬、アナフィラキシー乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎または湿疹、自己免疫疾患、骨関節炎、アレルギー性鼻炎、脂漏性皮膚炎、乾癬性関節炎、およびウルシかぶれ、からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
アレルギー疾患がアレルギー性皮膚炎である、請求項４に記載の方法。
アレルギー性皮膚炎がアトピー性皮膚炎である、請求項５に記載の方法。
アレルギー性皮膚炎が乾癬である、請求項５に記載の方法。
アレルギー疾患が自己免疫疾患である、請求項４に記載の方法。
自己免疫性疾患が、自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、反射性交感神経性ジストロフィー、心筋梗塞後症候群、リウマチ性鼻炎、多発性硬化症、および心筋症からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
自己免疫性疾患が自己免疫性肝炎である、請求項８に記載の方法。