KR20170005045A

KR20170005045A - 낭창성 신염을 치료하기 위한 진세노사이드 m1의 용도

Info

Publication number: KR20170005045A
Application number: KR1020167033770A
Authority: KR
Inventors: 시우-롱 리; 위-치에 리; 안 첸; 쿠오-펑 화; 슈크-만 카
Original assignee: 시우-롱 리
Priority date: 2014-05-02
Filing date: 2015-05-04
Publication date: 2017-01-11
Also published as: US9844560B2; US20170049792A1; EP3137089A1; TWI672143B; WO2015165422A1; ES2704027T3; JP2017514897A; TW201613610A; JP6696972B2; CN106573009A; KR102402139B1; EP3137089A4; DK3137089T3; CN106573009B; EP3137089B1

Abstract

본 발명은 대상체를 치료하기 위한 유효량의 진세노사이드 M1을 상기 대상체에게 투여함을 포함하는, 낭창성 신염을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 대상체에서 낭창성 신염을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한 진세노사이드 M1의 용도를 제공한다.

Description

낭창성 신염을 치료하기 위한 진세노사이드 M1의 용도{USE OF GINSENOSIDE M1 FOR TREATING LUPUS NEPHRITIS}

본 발명은 낭창성신염을 치료하기 위한 진세노사이드 M1의 신규 용도에 관한 것이다.

낭창성 신염은 전신 홍반성 낭창(SLE)을 갖는 환자의 서브집단에 존재하고 상당한 이환율 및 사망율과 관련된 SLE의 가장 중증의 합병증 중 하나이다. 전신 홍반성 낭창(SLE)은 자가항체 생산 및 비정상적 세포 면역력으로 인해 다중 기관 손상을 포함하는 자가면역 장애이다. 최종 단계 신부전의 누적된 위험은 특히 중증의 낭창성 신염을 갖는 환자에서 높고 상기 신염의 조직병리학은 처음에 세계 보건 기구 분류 1982에 의해 카테고리 III, 카테고리 IV 및 카테고리 Vc 및 Vd로서 정의되었다. 낭창성 신염의 발병 또는 진행에 대한 정확한 메카니즘은 명확하지 않다. 낭창성 신염에 대한 명확한 치료는 없다. 낭창성 신염에 대한 현재 치료요법은 코르티코스테로이드와 다른 세포독성제 또는 면역조절제의 다양한 조합이지만 많은 이들 중 다수는 다양한 부작용을 갖는다.

인삼의 주요 활성 성분인 진세노사이드는 다양한 약리학적 활성, 예를 들어, 항종양, 항당뇨, 피로예방, 항알레르기 및 항산화제 활성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 진세노사이드는 4개의 환에 정렬된 17개 탄소 원자를 갖는 고난(gonane) 스테로이드 핵으로 구성된 기본 구조를 공유한다. 진세노사이드는 체내에서 금속화되어 있고 다수의 최근 연구는 천연적으로 존재하는 진세노사이드 보다는 차라리 진세노사이드 대사물이 체내에 용이하게 흡수되고 활성 성분으로서 작용함을 시사한다. 이들 중에서, 진세노사이드 M1은 인간 장 세균에 의해 지페노사이드(gypenoside) 경로를 통해 프로토파낙사디올형 진세노사이드 중 하나의 대사물로서 공지되어 있다. 지금까지, 어떠한 선행 문헌도 낭창성 신염의 치료에서 진세노사이드 M1의 효과를 보고하지 않는다.

발명의 요약

본 발명에서, 예상치 않게 진세노사이드 M1이 낭창성 신염의 증상을 완화시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 낭창성 신염의 치료를 위한 새로운 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 치료학적 유효량의 진세노사이드 M1을 대상체로 투여함을 포함하는 낭창성 신염 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 방법은 (1) 사구체에서: 고유 세포 증식, 크레슨트, 호중구 침윤 및 피브리노이드 괴사; 및 (2) 세뇨관 간질성 격실에서: 간질(특히 사구체 주변) 단핵 백혈구 염증 및 단백질성 주형을 갖는 관형 위축으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 대상체에서 낭창성 신염의 하나 이상의 증상을 김소시키는데 효과적이다. 또한, 본 발명의 방법은 대상체에서 단백뇨 또는 혈뇨를 감소시키거나 혈청 우레아 질소 수준 또는 혈청 크레아틴 수준을 저하시키는데 효과적이다.

일부 양태에서, 진세노사이드 M1은, 코르티코스테로이드 (예를 들어, 프레드니솔론), 비-스테로이드 소염 약물(NSAID), 세포독성 약물 (예를 들어, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 및 아자티오프린), 면역억제제 (예를 들어, 사이클로스포린 및 마이코페놀레이트 모페닐), 및 혈관확장제 (예를 들어, 안지오텐신-전환-효소 억제제 (ACE 억제제)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 낭창성 신염을 치료하기 위한 하나 이상의 치료학적 제제와 병용하여 투여된다.

낭창성 신염을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한 진세노사이드 M1의 용도가 또한 제공된다.

본 발명의 하나 이상의 양태의 세부 사항은 하기에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 여러 양태의 하기의 상세한 설명 및 또한 첨부된 특허청구범위로부터 자명해질 것이다.

본 발명을 설명할 목적으로, 도면 양태에서 나타낸다. 그러나 본 발명은 나타낸 바람직한 양태로 제한되지 않는 것으로 이해되어야만 한다. 도면에서:
도 1은 마우스에서 뇨 단백질, 혈뇨 및 신장 기능의 평가를 보여준다. (A) 뇨 알부민/크레아티닌 비율, (B) 혈뇨 수준, (C) 혈액 우레아 질소 (BUN) 수준, (D) 혈청 크레아티닌. 각각의 막대는 평균±SE. *p<0.05 및 **p<0.01, 및 ***p<0.005를 나타낸다. 상기 기호 "#"는 "검출 가능하지 않음"을 의미한다. 기호 "ns"는 "유의적이지 않음"을 의미한다.
도 2는 (A) H&E 염색에 의한 신장 조직병리학적 평가 (본래의 배율, 각각 ×400), 및 (B) 스코어링 (반-정량 분석)을 보여준다. 각각의 막대는 평균±SE을 나타낸다. ***p<0.005는 통계학적 유의성을 나타낸다. 기호 "#"는 "검출가능하지 않음"을 의미한다 . 기호 "ns"는 "유의적이지 않음"을 의미한다 .
도 3은 마우스에서 혈청 항-dsDNA 항체 수준을 보여준다. 각각의 막대는 평균±SE. *p<0.05， **p<0.01， ***p<0.005를 나타낸다.
도 4는 (A) 마우스의 신장 조직에서 슈퍼옥사이드 음이온 수준, (B) 신장 동일계 ROS 생성 (본래의 배율은 각각 ×400이다), 및 (C) 양성-염색된 핵의 %의 반-정량 분석을 보여준다. 각각의 막대는 평균±SE. **p<0.01，***p<0.005를 나타낸다.
도 5는 염증성 사이토킨의 혈청 수준을 보여준다. (A) IFN-γ, (B) MCP-1, (C) IL-12 p70, (D) IL-6, (E) TNF-α 및 (F) IL-10. 각각의 막대는 평균±SE. *p<0.05， **p<0.01， ***p<0.005를 나타낸다. 기호 "#"는 "검출가능하지 않음"을 의미한다. 기호 "ns"는 "유의적이지 않음"을 의미한다.
도 6은 마우스의 비장세포에서 T 세포 증식을 보여준다. 각각의 막대는 평균 ±SE. *p<0.05， **p<0.01， ***p<0.005를 나타낸다. 기호 "ns"는 "유의적이지 않음"을 의미한다.
도 7은 TLR7의 mRNA 수준을 보여준다. 각각의 막대는 평균±SE. *p<0.05， **p<0.01을 나타낸다.

달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 하기의 용어는 달리 특정되지 않는 경우 이들에 부여된 의미를 갖는다.

부정관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 언급한다. 예를 들어, "요소(an element)"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.

본 발명에서, 진세노사이드 M1이 NZB/W F1 낭창-성향 마우스로 투여됨에 의해 낭창성 신염의 발병을 예방할 수 있음이 예상치 않게 밝혀졌다. 특히, 낭창성 신염을 갖는 동물이 (1) 사구체에서: 고유 세포 증식, 크레슨트, 호중구 침윤 및 피브리노이드 괴사； 또는 (2) 세뇨관 간질성 격실에서: 간질 (특히 주변-사구체) 단핵 백혈구 염증 및 단백질성 주형을 갖는 관형 위축, 또는 단백뇨 또는 혈뇨, 또는 상승된 혈청 우레아 질소 수준 또는 혈청 크레아티닌 수준을 포함하는 다양한 증상을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 방법은 낭창성 신염을 갖는 환자에서 진세노사이드 M1을 투여함에 의해 상기 증상들 중 어느 하나를 개선시키는데 효과적이다.

진세노사이드 M1, 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올은 당업계에 공지된 사포닌 대사물 중 하나이다. 진세노사이드 M1의 화학적 구조는 다음과 같다:

진세노사이드 M1은 인간 장 세균에 의해 지페노사이드 경로를 통한 프로토파낙사디올형 진세노사이드의 하나의 대사물로서 공지되어 있다. 진세노사이드 M1은 섭취 후 혈액 또는 뇨에서 발견될 수 있다. 진세노사이드 M1은 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된 타이완 특허 출원 번호 제094116005호 (I280982) 및 미국 특허 제7,932,057호에서와 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 진균류 발효를 통해 인삼 식물로부터 제조될 수 있다. 특정 양태에서, 진세노사이드 M1을 제조하기 위한 인삼 식물은 아랄리아세아(Araliaceae)과, 파낙스(Panax) 속, 예를 들어, 피. 진셍(P. ginseng) 및 피. 슈도-진셍(P. pseudo-ginseng) (또한, 산퀴(Sanqi)로서 명명됨)을 포함한다. 일반적으로, 진세노사이드 M1의 제조 방법은 (a) 인삼 식물 물질(예를 들어, 잎 또는 줄기)의 분말을 제공하는 단계； (b) 인삼 식물 물질을 발효시키기 위한 진균류를 제공하는 단계(여기서, 상기 발효 온도는 20 내지 50℃ 범위이고, 상기 발효 습도는 70 내지 100％ 범위이고, pH 값은 4.0 내지 6.0 범위이고, 상기 발효 기간은 5 내지 15일 범위이다); (c) 상기 발효 생성물을 추출하고 수거하는 단계；및 (d) 상기 발효 생성물로부터 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올을 단리시키는 단계를 포함한다.

진세노사이드 M1이 본 발명에서 "단리된" 또는 "정제된"으로서 기재되는 경우, 절대적으로 단리되거나 정제된 것으로서가 아닌 상대적으로 단리되거나 정제된 것으로서 이해되어야만 한다. 예를 들어, 정제된 진세노사이드 M1은 이의 천연 존재 형태와 비교하여 보다 정제된 것을 언급한다. 하나의 양태에서, 정제된 진세노사이드 M1을 포함하는 제제는 총 제제의 50％ 초과, 60％ 초과, 70％ 초과, 80％ 초과, 90％ 초과, 또는 100％ (w/w)의 양으로 진세노사이드 M1을 포함할 수 있다. 특정 숫자가 본원에서 비율 또는 용량을 보여주기 위해 사용되는 경우, 상기 숫자는 일반적으로 10% 초과 및 미만의 범위 또는 구체적으로 상기 숫자의 5% 초과 및 미만의 범위 내의 것을 포함하는 것으로 이해되어야만 한다.

본 발명은 낭창성 신염 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 유효량의 진세노사이드 M1을 투여함을 포함하는 낭창성 신염을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 또한 낭창성 신염 치료를 필요로 하는 대상체에서 낭창성 신염 치료용 약물을 제조하기 위한 진세노사이드 M1의 용도가 제공된다. 본 발명의 약물은 (1) 사구체에서: 고유 세포 증식, 크레슨트, 호중구 침윤 및 피브리노이드 괴사； 및 (2) 세뇨관 간질성 격실에서: 간질(특히. 사구체 주변) 단핵 백혈구 염증 및 단백질성 캐스트를 갖는 관형 위축으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 대상체에서 낭창성 신염의 하나 이상의 증상을 감소시키는데 효과적이다. 또한, 본 발명의 약물은 대상체에서 단백뇨 또는 혈뇨를 감소시키거나 혈청 우레아 질소 수준 또는 혈청 크레아티닌 수준을 저하시키는데 효과적이다.

본원에 사용된 용어 "개체" 또는 "대상체"는 인간 및 애완 동물(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 또는 연구실 동물(예를 들어, 랫트, 마우스, 기니아 피그 등)과 같은 비-인간 동물을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는"은 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 장애, 상기 장애의 증상 또는 병태 또는 상기 장애의 진행을 앓는 대상체에게 상기 장애, 상기 장애의 증상 또는 병태, 상기 장애에 의해 유도된 불구 또는 상기 장애의 진행을 치유(cure), 치유(heal), 완화, 경감, 변화, 치료, 개선, 향상 또는 영향을 줄 목적으로 적용 또는 투여함을 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 유효량"은 처리된 대상체에서 치료학적 효과를 부여하기 위한 활성 성분의 양을 언급한다. 예를 들어, 낭창성 신염을 치료하기 위한 유효량은 낭창성 신염을 갖는 대상체에서, (1) 사구체에서: 고유 세포 증식, 크레슨트, 호중구 침윤 및 피브리노이드 괴사； 또는 (2) 세뇨관 간질성 격실에서: 간질(특히 주변 사구체) 단핵 백혈구 염증 및 단백질성 캐스트를 갖는 관형 위축, 또는 단백질뇨 또는 혈뇨, 또는 비정상적으로 상승된 혈청 우레아 질소 질소 수준 또는 혈청 크레아티닌 수준과 같은 하나 이상의 증상 또는 병태를 억제, 개선, 완화 또는 감소시킬 수 있는 양이다. 상기 증상은 다양한 질환 진행 관련 지수를 기준으로 하는 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 뇨 단백질, 혈액 우레아 질소 또는 혈청 크레아티닌의 양을 분석하거나 신장 섹션을 분석함에 의해 결정되고 평가될 수 있다. 상기 치료학적 유효량은 투여 경로 및 횟수, 상기 약제를 투여 받는 개체의 체중 및 종, 및 투여 목적과 같은 다양한 이유에 따라 변화할 수 있다. 당업자는 각각의 경우에 본원의 개시 내용, 확립된 방법 및 이들 자신의 경험을 기준으로 용량을 결정할 수 있다. 예를 들어, 특정 양태에서, 본 발명에 사용되는 진세노사이드 M1의 경구 용량은 매일 10 내지 1, 000 mg/kg이다. 일부 예에서, 본 발명에 사용되는 진세노사이드 M1의 경구 용량은 하루 100 내지 300 mg/kg, 하루 50 내지 150 mg/kg, 하루 25 내지 100 mg/kg, 하루 10 내지 50 mg/kg, 또는 하루 5 내지 30 mg/kg이다. 추가로, 본 발명의 일부 양태에서, 진세노사이드 M1은 특정 기간 동안, 예를 들어, 적어도 15일, 1개월 또는 2개월 이상 동안 매일 주기적으로 투여된다.

본 발명에 따라, 진세노사이드 M1은 낭창성 신염을 치료하기 위한 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 치료학적 유효량의 활성 성분은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 전달 및 흡수 목적을 위해 적당한 형태의 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 투여 방식에 따라, 본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게 약 0.1중량% 내지 약 100중량%의 활성 성분을 포함하고, 여기서, 중량%는 전체 조성물의 중량을 기준으로 계산된다.

본원에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는"은 상기 담체가 상기 조성물 내에 활성 성분과 상용될 수 있고 바람직하게 상기 활성 성분을 안정화시킬 수 있고 치료 받은 개체에게 안전한 것임을 의미한다. 상기 담체는 활성 성분에 대한 희석제, 비히클, 부형제 또는 매트릭스일 수 있다. 적당한 부형제의 일부 예는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르보스, 만노스, 전분, 아라비아 검, 인산칼슘, 알기네이트, 트라가칸트 검, 겔라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스, 멸균수, 시럽, 및 메틸셀룰로스를 포함한다. 상기 조성물은 추가로 윤활제, 예를 들어, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일; 습윤화제; 유화제 및 현탁제; 방부제, 예를 들어, 메틸 및 프로필 하이드록시벤조에이트; 감미제; 및 향제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자에게 투여 후 활성 성분의 신속하거나 연속적이거나 지연된 방출 효과를 제공할 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 조성물의 형태는 정제, 환제, 분말, 로젠지, 패킷, 트로키제, 엘릭시르제, 현탁제, 로션, 용제, 시럽, 연질 및 경질 겔라틴 캡슐제, 좌제, 멸균된 주사 유체 및 팩키징된 분말일 수 있다.

본 발명의 조성물은 임의의 생리학적으로 허용되는 경로, 예를 들어, 경구, 비경구(예를 들어, 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내), 경피, 좌제 및 비강내 방법을 통해 전달될 수 있다. 비경구 투여에 관하여, 바람직하게 혈액과 등장성이 되도록 하기에 충분한 염 또는 글루코스와 같은 다른 물질을 포함할 수 있는 멸균수 용액 형태로 사용된다. 상기 수용액은 요구되는 만큼 적당히 완충(바람직하게 3 내지 9의 완충값으로)될 수 있다. 멸균 조건하에 적당한 비경구 조성물의 제조는 당업자에게 널리 공지된 표준 약리학적 기술을 사용하여 성취될 수 있고 기타 다른 창조적 연구가 요구되지 않는다.

본 발명에 따라, 진세노사이드 M1 또는 활성 성분으로서 진세노사이드 M1을 포함하는 조성물은 낭창성 신염을 갖는 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 진세노사이드 M1 또는 활성 성분으로서 진세노사이드 M1을 포함하는 조성물은 낭창성 신염을 앓는 개체 또는 낭창성 신염을 앓을 위험에 처한 개체에게 투여되어 상기 질환의 발병을 예방하거나 증상을 개선시키거나 상기 증상의 악화를 지연시킬 수 있다.

추가로, 본 발명에 따라, 진세노사이드 M1 또는 활성 성분으로서 진세노사이드 M1을 포함하는 조성물은 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니솔론), 비-스테로이드 소염 약물(NSAID), 세포독성 약물(예를 들어, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 및 아자티오프린), 면역억제제(예를 들어, 사이클로스포린 및 마이코페놀레이트 모페틸), 및 혈관확장제(예를 들어, 안지오텐신-전환 효소 억제제(ACE 억제제))를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 약제학적 치료와 같은 기존의 치료학적 방법 또는 약물과 병용하여 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 병용하여 사용되는 약물 또는 치료학적 방법은 동시에(병행하여) 또는 연속적으로 사용될 수 있다. 약물이 병용하여 사용되는 경우, 상기 약물은 동일한 조성으로 혼합될 수 있거나 별도의 캡슐제, 환제, 정제 및 주사제와 같은 별도의 상이한 조성으로 혼입될 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 설명되고 이것은 제한 보다는 입증을 목적으로 제공된다.

실시예

1. 재료 및 방법

1.1 동물 모델 및 실험 프로토콜

암컷 NZB/W F1 마우스는 기관(Jackson Lab)으로부터 구입하였다. 모든 동물 실험은 기관(Institutional Animal Care and Use Committee of The National Defense Medical Center, Taiwan)의 윤리적 승인으로 수행되었고 NIH 지침(NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 윤리적 규정에 따라 수행되었다.

가중된 중증의 낭창성 신염(ASLN) 마우스 모델은 문헌[참조: Shui et al., 2007 [51]]에 기재된 바와 같이 리포폴리사카라이드(LPS, 20mg/kg 체중)(Sigma, NO, USA)의 주간 2회 복강내 주사함에 의해 8주령의 암컷 NZB/W F1 마우스에서 확립하였다. ASLN 유도를 위해 LPS를 제1 투여한지 2일 후에, 마우스는 각각 6마리 초과의 마우스의 2개 그룹으로 나누고 마우스가 희생될 때까지 경구 위관영양법을 통해 진세노사이드 M1 또는 비히클(정상 식염수)를 매일 투여하였다. 정상 식염수를 투여받은 8주령의 NZB/W F1 암컷 마우스(자가항체 생산 개시 전)는 정상 대조군으로서 사용하였다. 모든 마우스는 질환 유도 후 5주째에 죽였다. 비장, 신피질 조직, 혈액 및 뇨의 조직 표본을 지정된 시간에 수거하고 분석 전에 적절히 저장하였다.

1.2 진세노사이드 M1

진세노사이드 M1인 20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사디올은 문헌[참조: 타이완 특허 출원 번호 제094116005호 (I280982) 및 미국 특허 제7,932,057호]에 기재된 것들과 같이 당업계에 공지된 방법에 의해 제조하였다.

1.3 뇨 단백질 및 신장 기능의 분석

뇨 샘플은 대사 케이지에 매주 수거하고 뇨 단백질 수준을 측정하고 혈청 샘플을 수거하여 문헌[참조: Ka, S.M. et al. Decoy receptor 3 ameliorates an autoimmune crescentic glomerulonephritis model in mice. J Am Soc Nephrol 18: 2473-2485；2007)]에 이전에 기재된 바와 같이 혈액 우레아 질소(BUN) 및 크레아티딘(Cr)의 혈청 수준을 측정하였다 .

1.4 병리학적 평가

신장 조직은 포르말린 고정시키고 파라핀에 매립하고 섹션(3 μm)을 제조하고 이전에 기재된 바와 같이 신장 조직병리학 분석을 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색시켰다. 정량적 분석은 광학 현미경(Olympus BX51, Reflected Fluorescence System, Japan)에 의해 수행하였다. 신장 병리학의 검사 및 스코어링은 병리학자에 의해 맹검 방식으로 수행하고 신장 병변의 중증도를 스코어링하였다. 증식, 호중구 침윤, 크레슨트 형성, 피브리노이드 괴사 및 주변 사구체 염증을 보여주는 사구체의 %는 적어도 100개의 무작위 샘플화된 사구체로부터 계산하였다.

1.5 혈청 항-dsDNA 항체의 측정

항-dsDNA 항체의 혈청 수준은 제조업자의 지침에 따라 항-마우스 dsDNA 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA) 키트(Alpha Diagnostic, TX, USA)를 사용하여 측정하였다. 450nm에서 흡광도는 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다(Bio-Tek, VT, USA).

1.6 T 세포 활성화 분석

마우스 기원의 비장세포는 이전에 기재한 바와 같이 제조하였고 이어서 4℃에서 이전에 0.25 μg/ml의 항-마우스 CD3 (145-2C11) 항체(BD Biosciences)로 밤새 피복된 96-웰 평저 미세적정 플레이트에서 웰(2.5×10⁵ 세포/웰)에서 3중으로 배양하였다. 48시간 후, 상기 배양물에 1㎕의 ³H-메틸 티미딘(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)을 펄싱시키고 16 내지 18시간 후 수거하고 혼입된 ³H-메틸 티미딘을 이전에 기재된 바와 같이 탑 카운트(Top Count)(Packard, PerkinElmer, Boston, MA)를 사용하여 측정하였다.

1.7 반응성 산소 종(ROS)의 측정

신장 동일계 슈퍼옥사이드 음이온 생성을 디하이드로에티듐(DHE) 표지화에 의해 측정하였다. 형광성 이미지는 신장 횡단면 당 총 핵내 양성 핵의 %를 계수함에 의해 정량하였다. 혈청 및 신장 조직에서 슈퍼옥사이드 음이온 수준은 이전에 기재된 바와 같이 측정하고 상기 결과는 밀리그램 무수 중량 당 15분 당 반응성 발광 단위(RLU)로 나타낸다(즉, RLU/15 min/mg 무수 중량).

1.8 혈청 사이토킨 검출

혈청에서 IFN-γ, MCP-1, IL-12 p70, IL-6, TNF-α 및 IL-10의 수준은 표준 프로토콜에 따른 BD 세포측정 비드 어레이 마우스 염증 키트 (BD Biosciences)에 이어서 유동 세포측정(BD Biosciences)을 사용함에 의해 검출하였다.

1.9 실시간 PCR

신피질 RNA를 제조업자의 지침에 따라 TRIzol 시약(Invitrogen)을 사용하여 추출하고, 실시간 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하여 톨(Toll)형 수용체 (TLR) 7 유전자 발현을 측정하였다. 실시간 정량은 제조업자의 지침에 따라 Bio-Rad iCycler iQ 시스템을 사용하여 수행하였다. 증폭은 2^- ^ΔCt 방법을 사용한 GAPDH에 대한 값으로 표준화하였다.

1.10 통계학적 분석

상기 결과는 평균 ± SEM으로서 제공한다. 2개의 그룹 간의 비교는 스튜던트t 시험(Student's t test)을 사용하여 수행하였다. <0.05의 p 값은 통계학적으로 유의적인 것으로 고려되었다 .

2. 결과

2.1 진세노사이드 M1 개선된 낭창성 신염

단백뇨를 검출하기 위해, 마우스의 정상 대조군 그룹과 비교한 결과 마우스의 ASLN 그룹은 상당히 증가된 단백뇨(도 1a) 및 혈뇨(도 1b) (p<0.005)를 보여주었다. 마우스의 ASLN 그룹과 비교하여, 단백뇨 및 혈뇨의 정도는 마우스의 ASLN+LCHK168 그룹에서 상당히 감소하였다. LCHK168로 처리된 마우스에서 신장 기능의 보호를 검출하기 위해, 마우스의 정상 대조군 그룹과 비교한 결과, 마우스의 ASLN 그룹은 상당히 증가된 BUN(도 1c) 및 혈청 크레아티닌(도 1d) (p<0.05)을 보여주었다. 마우스의 ASLN 그룹과 비교하여, BUN 및 크레아티닌의 혈청 수준은 마우스의 ASLN+LCHK168 그룹(p<0.05)에서 상당히 감소하였다.

추가로, 광학 현미경은 비히클로 처리된 질환-제어 ASLN 마우스 (ASLN+비히클 마우스)에서 신경세포 침윤, 사구체 크레슨트형 형성 및 관형 간질(특히, 주변 사구체) 염증, 관형 위축 및 단백질성 캐스트 및 피브리노이드 괴사를 포함하는 중증의 신장 병변을 보여주었다(도 2). 대조적으로, 상기 신장 병변은 ASLN+M1 마우스에서 상당히 감소하였지만(모두 p<0.005) (도 2), 약간의 사구체 증식은 존재하였다.

2.2 혈청 자가항체 수준의 측정

신장에서 자가항체 유도된 면역 복합체 침적이 낭창성 신염의 1차 원인인 것으로 고려되기 때문에, 본원 발명자는 혈청에서 항-dsDNA 자가항체 수준을 측정하였다. 도 3에 보여지는바와 같이, 혈청 항-dsDNA 항체 수준은 정상의 대조군 마우스에서 보다 마우스의 ASLN 그룹에서 상당히 높았다. 이어서, 마우스의 ASLN 그룹과 비교하여, dsDNA의 혈청 수준은 마우스의 ASLN+LCHK168 그룹(p<0.01)에서 상당히 감소하였다.

2.3 진세노사이드 M1 감소된 신장 ROS 생성

정상 대조군 마우스와 비교하여, 마우스의 ASLN 그룹은 3주 정도의 초기에 상당히 증가된 발현 신장 ROS 생성을 보여주었고 마우스의 ASLN 그룹에서 5주째에 급격히 증가하였다. 마우스의 ASLN 그룹과 비교하여, 신장 ROS 생성의 발현은 마우스의 ASLN+LCHK168 그룹(p<0.01)에서 상당히 감소하였다(도 4a).

신장에서 국소 ROS 생성을 보다 구체적으로 검출하기 위해, 신장 조직에서 ROS 생성의 동일계 검출은 DHE 검정을 사용하여 수행하였다. 도 4b 및 4c에 나타낸 바와 같이, DHE 형광성은 정상 마우스 신장에서 낮지만 3주째에 ASLN 대조군 마우스의 신장에서 상당히 증가하고 심지어 5주째에 추가로 증진되었고 따라서 이는 동일계 ROS 생성이 정상 대조군 마우스에 비교하여 마우스의 ASLN 그룹에서 증가되었음을 지적한다. 대조적으로, 매우 낮은 DHE 형광 강도는 3주 및 5주째 둘다에서 ASLN+LCHK168 처리 그룹에서 나타났다.

2.4 LCHK168을 사용한 혈청 염증 사이토킨 발현의 억제

마우스에서 인터페론-γ (IFN-γ), 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1), IL-12 p70, IL-6, TNFα, 및 IL-10의 혈청 수준을 측정하였다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ의 혈청 수준은 3주 정도의 초기에 상당히 증가하였고 마우스의 ASLN 그룹에서 5주째에 급격히 증가하였다. 마우스의 ASLN 그룹과 비교하여, IFN-γ의 발현은 마우스의 ASLN+LCHK168 그룹(p<0.01)에서 상당히 감소하였다. 이어서, 도 5b 내지 5f에 나타낸 바와 같이, MCP-1, IL-12 p70, IL-6, TNFα, 및 IL-10의 혈청 수준은 3주 정도의 초기에 상당히 증가하였고 마우스의 ASLN 그룹에서 5주째에 급격히 증가하였다. 마우스의 ASLN 그룹과 비교하여, MCP-1, IL-12 p70, IL-6, TNFα, 및 IL-10의 발현은 마우스의 ASLN+LCHK168 그룹(p<0.005)에서 상당히 감소하였다.

2.5 진세노사이드 M1 억제된 T 세포의 증식

정상 대조군 그룹과 비교하여, 마우스의 ASLN 그룹은 3주 정도의 초기에 비장세포에서 T 세포의 상당히 증가된 증식을 보여었고 마우스의 ASLN 그룹에서 5주째에 급격히 증가하였다. 마우스의 ASLN 그룹과 비교하여, 비장 세포에서 T 세포의 증식은 마우스의 ASLN+LCHK168 그룹(p<0.01)에서 상당히 감소하였다(도 6).

2.6 톨형 수용체 7 mRNA 생성의 억제

실시간 RT-PCR의 결과는 도 7에 나타낸 바와 같이 증가된 신장 TLR7 mRNA 수준을 입증하였고, TLR7의 mRNA 수준은 마우스의 ASLN 그룹(p<0.005)에서 상당히 증가하였다. 마우스의 ASLN 그룹과 비교하여, TLR7의 mRNA 수준은 마우스의 ASLN+LCHK168 그룹(p<0.01)에서 상당히 감소하였다.

요약컨대, 본원 발명자의 연구는 진세노사이드 M1이 낭창성 신염의 발병을 예방하는데 효과적임을 보여준다. 모든 이들 발견은 진세노사이드 M이 낭창성 신염의 치료를 위해 후보 신규 약물로 개발될 수 있음을 시사한다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자는 추가의 설명 필요 없이 본원의 기재를 토대로 본원 발명을 가장 광범위하게 활용할 수 있는 것으로 사료된다. 따라서, 제공된 바와 같은 기재 및 특허청구범위는 임의의 방식으로 본 발명의 범위로 제한하는 것 대신 입증 목적인 것으로 이해되어야만 한다.

Claims

치료학적 유효량의 진세노사이드 M1을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는 낭창성 신염을 치료하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법이 (1) 사구체에서: 고유 세포 증식, 크레슨트, 호중구 침윤 및 피브리노이드 괴사; 및 (2) 세뇨관 간질성 격실에서: 간질 단핵 백혈구 염증 및 단백질성 주형을 갖는 관형 위축으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 낭창성 신염의 하나 이상의 증상을 김소시키거나 완화시키는데 효과적인, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체에서 주변 사구체 단핵 백혈구 염증을 감소시키는데 효과적인, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체에서 단백뇨 또는 혈뇨를 감소시키거나 혈청 우레아 질소 수준 또는 혈청 크레아티닌 수준을 저하시키는데 효과적인, 방법.
제 1항에 있어서, 상기 진세노사이드 M1이 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 세포독성 약물, 면역억제제 및 혈관확장제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 낭창성 신염을 치료하기 위한 하나 이상의 치료학적 제제와 병용하여 투여되는, 방법.
낭창성 신염 치료를 필요로 하는 대상체에서 낭창성 신염 치료용 약물을 제조하기 위한 진세노사이드 M1의 용도.
제 6항에 있어서, 상기 약물이 상기 대상체에서 (1) 사구체에서: 고유 세포 증식, 크레슨트, 호중구 침윤 및 피브리노이드 괴사; 및 (2) 세뇨관 간질성 격실에서: 간질 단핵 백혈구 염증 및 단백질성 주형을 갖는 관형 위축으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 낭창성 신염의 하나 이상의 증상을 김소시키거나 완화시키는데 효과적인, 용도.
제 6항에 있어서, 상기 약물이 상기 대상체에서 주변 사구체 단핵 백혈구 염증을 감소시키는데 효과적인, 용도.
제 6항에 있어서, 상기 약물이 상기 대상체에서 단백뇨 또는 혈뇨를 감소시키거나 혈청 우레아 질소 수준 또는 혈청 크레아티닌 수준을 저하시키는데 효과적인, 용도.
제 6항에 있어서, 상기 약물이 코르티코스테로이드, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 세포독성 약물, 면역억제제 및 혈관확장제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 낭창성 신염을 치료하기 위한 하나 이상의 치료학적 제제와 병용하여 투여되는, 용도.