JP2017506234A - 抗体−薬物複合体及び免疫毒素 - Google Patents

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Abstract

本発明は、式（Ｉ）：Ａ−（Ｌ−Ｄ）Ｐ（Ｉ）（式中、Ａは、エンドグリンに選択的に結合する抗体であり；Ｌはリンカーであり；Ｄは、細胞溶解素又はニグリン−ｂのＡ鎖を含む薬物であり；ｐは１〜１０である）を有する複合体、特に、抗体−薬物複合体及び免疫毒素又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、並びに腫瘍の治療におけるかかる複合体の使用に関する。かかる複合体を生成する方法及びかかる方法で使用するための成分を開示する。【選択図】なし

Description

本発明は、エンドグリン（ＥＮＧ）を標的とする抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）及び免疫毒素、並びに医薬、例えば、特定の癌の治療におけるそれらの使用に関する。
悪性上皮性腫瘍は、人間の死の癌に関連する主な原因である。これらの固形腫瘍は、しばしば、全腫瘍質量の２０％〜６０％を占め、大量の間質細胞及び密な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の存在によって特徴づけられる、いわゆる「線維形成性間質」または「反応性間質」などの著しい間質反応を示す。最近の研究によって、血管細胞、免疫細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、脂肪細胞及び骨髄由来前駆細胞によって例示されるように、間質細胞の腫瘍促進の役割が示された（１〜６）。具体的には、かなりの数の癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）が、しばしば、乳癌、肺癌、結腸癌、及び膵臓癌（１４、１５）を含む様々なヒト癌の腫瘍関連間質内に観察される。間質の異なる構成要素と協調して相互作用するので、ＣＡＦは、血管新生及び腫瘍の成長を促進する能力を有する。ＣＡＦはまた、癌の進行中の攻撃的な腫瘍及び腫瘍侵襲性の発達に重要なものとして示されている（１６〜２５）。ＣＡＦは、離れた器官における腫瘍細胞の拡散及び浸潤を促進するので、転移形成に寄与している。重要なことには、腫瘍への全身薬物送達の失敗及び薬物耐性の発現と間質細胞の関連も示されている（７〜１１）。間質−腫瘍細胞の相互作用を抑止することによって、腫瘍形成を減衰させる細胞及び分子標的の同定が、近年、トランスレーショナル腫瘍学における最も重要な課題の１つである。実際に、腫瘍周囲間質を標的とすることは、がん患者の死亡率の９０％超にのぼる転移性腫瘍を治療するためのかなり新しい戦略である。いくつかの製品のみがこれまでに治療承認を得ており、それらのほとんどは抗血管新生薬である（アバスチン（登録商標）；２６）。次いで、腫瘍微小環境内の他の新規分子を同定し、標的化することが、間質ベースの治療法と組み合わせた従来の治療の有効性を増大させるのに不可欠であり、癌及び転移の治療のための強力な方法を表す（１２、１３）。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ベースの薬物は、癌との闘いで非常に期待されている。理由は、それらの薬物が正確かつ特別な方法で、治療を分子レベルで標的化するのを可能にするからである。これらの利点は、それらの商業的な魅力（短い開発期間、制限された能力とそれらが承認された後、他の癌の種類に容易に利用可能であること）と共に、多くの製薬会社が新しい抗体ベースの分子の開発、及びバイオテクノロジー企業からの新しい分子又は技術のインライセンスに多額の投資を行うことを後押ししてきた。
しかしながら、治療抗体の臨床的成功にもかかわらず、細胞表面の腫瘍抗原を標的とするネイキッドＭＡｂは、それ自体で十分な効果をほとんど示さない。ＭＡｂの低活性を増大させるために、新たな戦略は、毒性分子へのそれらの結合に焦点を当てている。非常に強力で、極少量で活性があるために、植物及び細菌の毒素並びに小さな化学療法分子が良好な候補であり得る。
癌の治療のための免疫毒素（ＩＴ）及び抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）の分野は、免疫原性、望ましくない毒性、生成、半減期及び抵抗についての、製薬企業が最初に提示した問題の解決を目的として、過去数年間に行われた技術進歩により、近年、製薬企業による開発活動の成長を経験している。
免疫複合体は、細胞傷害薬と共有結合したヒトの抗体、ヒト化又はキメラ組換え抗体で作られている。このような構造の主な目的は、低分子（３００〜１０００Ｄａ）で細胞傷害性の能力と腫瘍関連抗原標的化（ＴＡＡ）ＭＡｂの高い特異性を組み合わせることである。
Ａｂは、抗原に到達するのに非常に選択的でなければならず、その発現は正常細胞内において制限されなければならない。Ａｂはまた、癌細胞内に効率的に内部移行しなければならない。
エフェクター部分として選択された細胞傷害薬は、内部移行及び細胞質への放出後にのみ細胞を死滅させなければならない。ＡＤＣの中で最も一般的に使用されるペイロードは、カリケアマイシン類、デュオカルマイシン類などのＤＮＡ損傷薬、又はアウリスタチン類及びマイタンシノイド類のような微小管標的化合物である。
Ａｂ−細胞傷害性リンカーは、全身的に安定であり、標的細胞内で細胞傷害薬を放出するように設計されている。
ＴＡＡは、しばしば疾患組織で過剰発現しているか、又は少なくとも内部移行によって活性化される細胞傷害を促進するのに十分に発現している細胞膜タンパク質である。理想的には、この抗原は、正常組織における発現は制限されており、重要な臓器においてほとんど発現していないか又は全く発現していない。その上、この腫瘍抗原は、Ａｂによって選択的かつ高親和性で認識されなければならない。
最近の研究から、腫瘍間質間期でＴＧＦ−βシグナル伝達経路を阻害するように設計された治療薬が、癌の進行を防ぎ、予後および治療を改善することができることが示唆される。ＴＧＦ−β共役受容体ファミリーは、腫瘍またはその新生血管構造に作用する癌治療の標的として浮上している。ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体複合体のアクセサリータンパク質であるエンドグリン（ＥＮＧ、ＣＤ１０５）は、このファミリーの一員であり、以下の特徴を示す：
・Ｉ型ホモ二量体の膜タンパク質
・多くの癌の種類における細胞表面の血管新生及び血管新生関連タンパク質
・腫瘍の微小血管系細胞、特に、腫瘍の血管新生領域での過剰発現
・正常組織の内皮では発現しないこと
・乳転移に関連する血漿レベル
・内部移行
・血流からの最適な利便性
抗ＥＮＧ抗体（例えば、ｓｃＦｖ）について報告されており、腫瘍間質標的化方法におけるそれらの適用について説明されている。ドキソルビシン添加抗ＥＮＧ免疫リポソームの特異的結合、細胞内移行及び抗腫瘍効果は、ＥＮＧ＋細胞を用いてインビトロで、及びマウスにおいてインビボで報告されている。抗ＥＮＧ抗体およびリシン又は天然ニグリンｂのＥＮＧ標的化複合体は、マウス腫瘍モデルで評価されている（２７〜３６）。
これらの進歩にもかかわらず、上皮腫瘍を含む腫瘍の治療のためのさらなる治療戦略の必要性、及びそのような治療戦略で使用するための成分の必要性は未だ満たされていない。本発明は、これら及び他の必要性に取り組むものである。
概して、本発明は、抗ＥＮＧ抗体、それらの複合体及び抗体複合体戦略で使用するために最適化されたペイロードに関する。具体的には、本発明者らは、本明細書に記載の抗ＥＮＧ抗体が高度に特異的な結合、及び迅速かつ効率的な内部移行を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、ニグリンｂのＡ鎖を単離し、それが、細菌宿主細胞中で生成でき、さらにモノクローナル抗体と複合化させた時に、ニグリン−ｂのＢ鎖の非存在下で細胞内に移行する能力を保持し、細胞傷害活性を示すことを見出した。本明細書に記載のニグリン−ｂのＡ鎖及び／又は細胞溶解素誘導体は、腫瘍の治療に使用するための抗ＥＮＧ抗体と都合よく複合化される。
したがって、第１の態様において、本発明は、式Ｉ：
Ａ−（Ｌ−Ｄ）Ｐ（Ｉ）
（式中、
Ａは、エンドグリンに選択的に結合する抗体であり；
Ｌはリンカーであり；
Ｄは、細胞溶解素又はニグリン−ｂのＡ鎖を含む薬物であり；
ｐは１〜１０である）
を有する複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を提供する。
本発明のこの及び他の態様によるいくつかの場合において、Ａは、ヒトエンドグリンの細胞外領域に選択的に結合するモノクローナル抗体又はその結合断片である。特定の場合において、Ａは、以下のアミノ酸配列：
（ｉ）ＣＤＲＨ１：配列番号７、又は配列番号７の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｉ）ＣＤＲＨ２：配列番号８、又は配列番号８の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｉｉ）ＣＤＲＨ３：配列番号９、又は配列番号９の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｖ）ＣＤＲＬ１：配列番号１０、又は配列番号１０の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｖ）ＣＤＲＬ２：配列番号１１、又は配列番号１１の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｖｉ）ＣＤＲＬ３：配列番号１２、又は配列番号１２の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体、
を有する重鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＨ１〜３）及び軽鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＬ１〜３）を含み得る。
特定の場合において、ＣＤＲＨ１〜３は、それぞれ配列番号７〜９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ１〜３は、それぞれ配列番号１０〜１２のアミノ酸配列を含む。
特定の場合において、Ａは、配列番号５の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
特定の場合において、Ａは、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
特定の場合において、Ａは、配列番号６の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。具体的には、Ａは、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。
特定の場合において、Ａは、配列番号３の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。具体的には、Ａは、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
特定の場合において、Ａは、配列番号４の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。具体的には、Ａは、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。
特定の場合において、Ａは、本明細書に例示する抗エンドグリン抗体分子と構造的に異なる競合的結合抗エンドグリン抗体であり得る。例えば、Ａは、固定化組換えヒトエンドグリンへの結合について、「Ａ５」として本明細書で特定される抗ヒトエンドグリンＩｇＧ１抗体と競合する抗エンドグリン抗体分子であり得る。Ａ５は、配列番号３の重鎖アミノ酸配列及び配列番号４の軽鎖アミノ酸配列を有する。
特定の場合において、Ａは、マウスエンドグリンの細胞外領域に選択的に結合するモノクローナル抗体又はその結合断片である。マウスエンドグリンを標的化する複合体は、例えば、様々な癌の十分に特徴づけられたマウスモデルを用いる前臨床試験で特に使用されている。具体的には、Ａは、以下のアミノ酸配列：
（ｉ）ＣＤＲＨ１：配列番号１９、又は配列番号１９の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｉ）ＣＤＲＨ２：配列番号２０、又は配列番号２０の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｉｉ）ＣＤＲＨ３：配列番号２１、又は配列番号２１の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｖ）ＣＤＲＬ１：配列番号２２、又は配列番号２２の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｖ）ＣＤＲＬ２：配列番号２３、又は配列番号２３の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｖｉ）ＣＤＲＬ３：配列番号２４、又は配列番号２４の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体、
を有する重鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＨ１〜３）及び軽鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＬ１〜３）を含み得る。例えば、ＣＤＲＨ１〜３は、それぞれ配列番号１９〜２１のアミノ酸配列を含み得、ＣＤＲＬ１〜３は、それぞれ配列番号２２〜２４のアミノ酸配列を含み得る。
特定の場合において、Ａは、配列番号１７の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、例えば、Ａは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得る。
特定の場合において、Ａは、配列番号１８の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、例えば、Ａは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。
特定の場合において、Ａは、配列番号１５の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％さらには１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
特定の場合において、Ａは、配列番号１６の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％さらには１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
特定の場合において、Ａは、本明細書に例示する抗エンドグリン抗体分子とは構造的に異なる競合結合抗エンドグリン抗体であり得る。例えば、Ａは、固定化された組換えマウスエンドグリンとの結合について、「ｍＥ１２」として本明細書で同定された抗マウスエンドグリンＩｇＧ１抗体と競合する抗エンドグリン抗体分子であり得る。ｍＥ１２は、配列番号１５の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１６の軽鎖アミノ酸配列を有する。
本発明のこの及び他の態様によれば、Ｄは細胞溶解素であり得る。この細胞溶解素は、いくつかの場合において、ＷＯ ２００８／１３８５６１に開示された化合物であり得、この特許公開の全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる（その中に開示される化合物はツブリシン（ＴｕｂｕｌｙＳｉｎｅ）誘導体とも呼ばれる）。この細胞溶解素は、ＷＯ ２００８／１３８５６１に記載のように合成してよい。特定の場合において、この細胞溶解素は、ＷＯ ２００８／１３８５６１の式Ｉ又は式ＩＶで定義されるとおりであり得る。特定の場合において、この細胞溶解素は、式ＩＶ：
（式中、
Ｒ２は、（ｉ）リンカーＬに直接又は間接的に結合しているか、又は（ｉｉ）Ｈであるか、もしくはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり;
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２ＯＲ１９又はＣＨ２ＯＣＯＲ２０であり、式中、Ｒ１９はアルキルであり、Ｒ２０はＣ２〜Ｃ６アルケニル、フェニル、又はＣＨ２−フェニルであり；
Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル又はＯ−アセチルであり；
ｆは１又は２であり；
Ｒ１１は、以下の構造：
（式中、
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、アルキルオキシ、フェニル、アルキルアミノ又はジアルキルアミノであり；
Ｒ１６は、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６−アルキル基であり；
Ｒ１７は、（ｉ）リンカーＬに直接又は間接的に結合しているか、又は（ｉｉ）ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１８、ＣＯＮＨＮＨ２、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、又は必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル又はヘテロシクロアルキルの基であり、式中、Ｒ１８は、必要に応じて置換されたアルキル、ヘテロアルキル、又はヘテロシクロアルキルの基であり；かつ
ｑは０、１、２又は３である）を有し、その中の用語「必要に応じて置換された」は、１個又は複数個のＨ原子がＦ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ又はＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２もしくはＮＯ２で置換することができる基に関し、用語「必要に応じて置換された」は、さらに、非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ９ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ９ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキル又はＣ２〜Ｃ１１ヘテロアラルキルの基で排他的に又は追加的に置換することができる基に関する）
のものであり得る。
いくつかの場合において、Ｒ２はリンカーＬとの結合である。
いくつかの場合において、Ｒ１７は、Ｃ（Ｏ）Ｘ、ＣＯＮＨＮＨＸ、ＯＸ、ＮＨＸ又はＳＸであり、ＸはリンカーＬとの結合である。
いくつかの場合において、リンカーＬは、さらにスペーサーを含み得る。
いくつかの場合において、スペーサーは２〜３０個の原子の鎖長を有する。
いくつかの場合において、スペーサーは、アルキレン（すなわち、二価アルキル）基もしくはヘテロアルキレン（すなわち、二価ヘテロアルキル）基を含むか、又はそれらからなる。いくつかの場合において、スペーサーは、アルキレン基もしくはオキシアルキレン基を含むか、又はそれらからなる。
いくつかの場合において、スペーサーは、基−（ＣＨ２）ｎ−もしくは−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−を含むか、又はそれらからなり、式中、ｎは１以上である。
いくつかの場合において、スペーサーは、基−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−を含むか、又はそれらからなり、式中、ｎは１以上である。具体的には、ｎは、１〜１５、１〜１０、１〜６、又は２〜５であり得る。例えば、ｎは、３又は４であり得る。
いくつかの場合において、スペースは、１〜６個のエチレングリコール単位、例えば、トリエチレングリコールを含む。
いくつかの場合において、スペーサーは、基Ｒ１７に直接結合しているか、又は架橋基を介して基Ｒ１７に結合していてよい。
いくつかの場合において、スペーサーは、−Ｃ（Ｏ）Ｘ架橋基を介して基Ｒ１７に結合しており、ＸはＲ１７との結合である。
いくつかの場合において、Ｒ１７はＣＯＮＨＮＨＸであり、スペーサーは−Ｃ（Ｏ）Ｘ架橋基を介して基Ｒ１７に結合しており、ＸはスペーサーとＲ１７の間の結合を表す。
いくつかの場合において、Ｒ１７はＣＯＮＨＮＨＸであり、スペーサーは−Ｃ（Ｏ）Ｘ架橋基を介してＲ１７に結合した−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎ＝２、３又は４である。
いくつかの場合において、Ｄは、以下の構造：
を有する細胞溶解素を含む。
いくつかの場合において、Ｄは、以下の構造：
を有する細胞溶解素を含む。
特定の場合において、Ｌは、Ａとの結合のための結合基及びプロテアーゼ切断可能な部分を含む。例えば、Ｌは、バリン−シトルリン単位を含み得る。具体的には、Ｌは、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメートを含み得る。
いくつかの場合において、マレイミドの二重結合は、抗体ＡにリンカーＬを連結するために、抗体Ａのシステイン残基のチオール基と反応して、硫黄−炭素結合を形成する。
いくつかの場合において、−Ｌ−Ｄは、以下のものからなる群から選択される構造：
を有する。
特定の場合において、−Ｌ−Ｄは、以下の構造：
を有し得る。
特定の場合において、−Ｌ−Ｄは、以下の構造：
を有し得る。
本発明のこの及び他の態様によると、ｐは、いくつかの場合において、１〜５、例えば、１〜４、又は１〜３の範囲にあり得る。特定の場合において、ｐは１又は２であり得る。特定の場合において、ｐは３又は４であり得る。
本発明のこの及び他の態様によると、Ｄは、ニグリン−ｂのＡ鎖であり得る。好ましくは、ニグリン−ｂのＡ鎖は、ニグリン−ｂのＢ鎖を含まない。ニグリン−ｂのＡ鎖は、配列番号２５の配列を含むか、又はそれからなり得る。
特定の場合において、ニグリン−ｂのＡ鎖は、例えば、細菌宿主細胞内で組換え生成されるか、又はされていてよい。本発明者らは、驚くべきことに、ニグリン−ｂのＡ鎖が細菌宿主細胞内で組換え生成された場合のように、天然のグリコシル化が無いか又は変更されたにもかかわらず、ニグリン−ｂのＡ鎖がその活性（例えば、細胞傷害性及び／又はリボソーム阻害活性）を保持していることを見出した。
本発明の複合体が、毒性ペイロード（すなわち、Ｄ）としてニグリン−ｂのＡ鎖を含む場合に、Ｌは、単にＡ上の硫黄原子とＤ上の硫黄原子の間のジスルフィド結合であり得る。したがって、Ｌは、結合、例えば、ジスルフィド結合を含むか、又はそれからなり得る。
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に従って定義され、医薬において使用するための複合体を提供する。
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に従って定義され、哺乳動物対象の腫瘍の治療方法で使用するための複合体を提供する。特定の場合において、該複合体は、血液腫瘍の治療に使用するためのものである。他の場合において、該複合体は、固形腫瘍の治療に使用するためのものである。具体的には、該複合体は、膵臓癌、ユーイング肉腫、乳癌、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、卵巣癌、膀胱癌又は結腸癌の治療に使用するためのものであり得る。
いくつかの場合において、該複合体は、１種以上の他の抗腫瘍薬と同時投与、逐次投与又は別々の投与のためのものである。１種以上の他の抗腫瘍薬は、細胞傷害性化学療法剤又は抗血管新生剤又は免疫療法剤を含む。いくつかの場合において、１種以上の他の抗腫瘍薬は、ゲムシタビン、アブラキサン、ベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、抗ＰＤ−１分子又は抗ＰＤ−Ｌ１分子（例えば、ニボルマブ又はペムブロリズマブ）を含む。
第４の態様において、本発明は、哺乳動物対象の腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本発明の第１の態様に従って定義される治療有効量の複合体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの場合において、本方法は、血液腫瘍の治療のためのものであり得る。他の場合において、本方法は、固形腫瘍を治療するためのものであり得る。具体的には、本方法は、膵臓癌、ユーイング肉腫、乳癌、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、卵巣癌、膀胱癌又は結腸癌を治療するためのものであり得る。
第５の態様において、本発明は、抗体−薬物複合体の調製における細胞溶解素の使用を提供し、その抗体は、エンドグリン特異的抗体、例えば、本発明の第８の態様によるエンドグリン特異的抗体である。いくつかの場合において、この細胞溶解素は、本発明の第１の態様によって定義される通りのものであり得る。いくつかの場合において、この使用は、本発明の第１の態様に従って定義される抗体−薬物複合体の調製における細胞溶解素の使用であり得る。
第６の態様において、ニグリン−ｂのＢ鎖を含まない、単離したニグリン−ｂのＡ鎖を提供する。ニグリン−ｂのＡ鎖のアミノ酸配列は、配列番号２５の配列を含むか、又はそれからなり得る。
第７の態様において、本発明は、免疫毒素の調製における、本発明の第６の態様による単離したニグリン−ｂのＡ鎖の使用を提供する。いくつかの場合において、この免疫毒素は、前記単離したニグリン−ｂのＡ鎖と複合化されるか、かつ／又は結合したモノクローナル抗体を含む。いくつかの場合において、この免疫毒素は、エンドグリンに選択的に結合するモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体などの抗体を含む。いくつかの場合において、この免疫毒素は、本発明の第８の態様による抗体を含む。
第８の態様において、本発明は、
（ｉ）ヒトエンドグリンに選択的に結合し、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むか、又は
（ｉｉ）マウスエンドグリンに選択的に結合し、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、
モノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体を提供する。
第９の態様において、本発明は、医薬において使用するための本発明の第８の態様の抗体を提供する。
第１０の態様において、本発明は、炎症状態（例えば、関節リウマチ）又は眼疾患（例えば、糖尿病性網膜症もしくは湿式加齢黄斑変性（ｗｅｔ ａｇｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）などの黄斑変性症）の治療に使用するための、本発明の第１の態様の複合体又は本発明の第８の態様の抗体を提供する。
第１１の態様において、本発明は、哺乳動物対象における炎症状態（例えば、関節リウマチ）又は眼疾患（例えば、糖尿病性網膜症もしくは湿式加齢黄斑変性（ｗｅｔ ａｇｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）などの黄斑変性症）の治療法であって、それを必要としている対象に、本発明の第１の態様の治療有効量の複合体又は本発明の第８の態様の治療有効量の抗体を投与することを含む方法を提供する。
第１２の態様において、本発明は、抗体−薬物複合体又は免疫毒素の調製における、本発明の第８の態様によるモノクローナル抗体の使用を提供する。
第１３の態様において、本発明は、配列番号１〜６、１３〜１８及び２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの場合において、このポリヌクレオチドは、配列番号２６の核酸配列を含み得る。
第１４の態様において、本発明は、
（ａ）少なくとも１個のスルフヒドリル基を導入するために、エンドグリンに選択的に結合する抗体を誘導体化すること；かつ
（ｂ）抗体とニグリン−ｂのＡ鎖の間でジスルフィド結合の形成を可能にする条件下で、ニグリン−ｂのＡ鎖（ニグリンｂのＢ鎖を含まない）上の適切な残基（例えば、システインアミノ酸）と誘導体化抗体を反応させ、それにより複合体を生成すること、を含む、本発明の第１の態様による複合体の生成法を提供する。この方法は、さらに該複合体の精製及び／又は単離の工程（ｃ）を含み得る。
いくつかの場合において、工程（ａ）は、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−ジチオプロオピオネート）（ＳＰＤＰ）又はメチル−４−メルカプトブチルイミデートと本抗体を反応させることを含み得る。
第１５の態様において、本発明は、
（ａ）エンドグリンに選択的に結合する抗体を、チオール基を介してリンカーに連結すること；かつ
（ｂ）細胞溶解素分子上の適切な基を介してこのリンカーに細胞溶解素を連結すること、を含む、本発明の第１の態様による複合体の生成方法を提供する。いくつかの場合において、細胞溶解素は、位置Ｒ２又は位置Ｒ１７を介してリンカーと連結している。工程（ａ）及び（ｂ）は、いずれの順序でも実行することができる。任意のさらなるステップ（ｃ）において、この方法は、該複合体の精製及び／又は単離を含み得る。
本発明は、かかる組み合わせが明確に許されないか、又ははっきりと回避すると記載されている場合を除き、記載の態様及び好ましい特徴の組み合わせを含む。本発明のこれらの及びさらなる態様並びに実施形態は、以下で、添付の実施例及び図面を参照してさらに詳細に説明する。
組換えマウスＥＮＧ（ａａ２７〜５８１）への結合についてのｍＥ１２−ＩｇＧのＥＬＩＳＡの結果を示す。コーティングＢＳＡを陰性対照として含めた。マウスＥＮＧへの濃度依存的な結合が観察された。 ａ）５０μｇ／ｍｌの抗体を用いたＢ１６細胞、ｂ）５μｇ／ｍｌの抗体を用いたＢ１６細胞、及びｃ）陰性対照として含めたＨＴ１０８０細胞へのｍＥ１２−ＩｇＧの結合のフローサイトメトリー分析を示す。斜線部分：細胞のみ、斜線でない部分：抗体とインキュベートした細胞。 ａ）固定化した組換えヒトＥＮＧへのＡ５ ＩｇＧ１の結合のＥＬＩＳＡを示す。ｂ）ＨＴ１０８０細胞へのＡ５−ＩｇＧの結合のフローサイトメトリー分析を示す。 組換えニグリン−ｂのＡ鎖のＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆプロファイルを示す。観察された質量（Ｄａ）：２８５４６．５５；予想質量（Ｄａ）：２８５４６．０９；質量偏差：０．５；質量精度：１６ｐｐｍ。 ウサギ網状赤血球の無細胞溶解物（ＲＲＬ）中で試験した、ｒｅｃＮｇＡの異なる製剤を表す組換えニグリン−ｂのＡ鎖（ｒｅｃＮｇＡ）（３ａ、３ｂ、６ｃ、９ｃ）対ネイティブ（ＷＴ）ニグリン−ｂのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）活性を示すグラフである。 クリスタルバイオレット生存率アッセイによりＨＴ１０８０−ＦＡＰ細胞株で試験したｒｅｃＮｇＡの細胞傷害を示すグラフである（天然ニグリン−菱形；組換えニグリン−ｂのＡ鎖−四角）。 ＲＲＬアッセイにおけるｒｅｃＮｇＡ複合体のＲＩＰ活性を示す。天然ニグリンｂ：菱形（◆）；ｒｅｃＮｇＡ：四角（■）；ｒｅｃＮｇＡ−複合体ＨＳＰ−１２４−３７−１（三角：▲）ＨＳＰ−１２４−３７−２（クロス：Ｘ）。 ｖｃＰＡＢＡリンカーを介した細胞溶解素複合化抗体の一般的な抗体複合体の構造を示す。細胞溶解素の結合は、Ｒ１又はＲ４（矢印によって識別される）を介してよい。 膜のみの染色（ＰＭ）、ＰＭ及び細胞内染色、又は細胞内のみの染色を示す細胞（ｎ＝１０〜３０）の区別によるＡ５抗ｈｕＥＮＧ ＩｇＧ１内部移行の分析を示す。 （Ａ）野生型（ＷＴ）及び（Ｂ）抗原（ＡＧ）発現ＨＴ１０８０細胞上での細胞溶解素ＡＤＣのインビトロでの細胞傷害性効果を示す。１０−６〜１０−１２Ｍの濃度範囲の各化合物の７２時間インキュベーション後にクリスタルバイオレット染色により細胞増殖停止を明らかにした。親ＴＡＭ３３４細胞溶解素を非特異的細胞傷害の陽性対照として使用した。 ｒｅｃＮｇＡ及び細胞溶解素免疫複合体の腫瘍増殖阻害効果を示す。（Ａ）単剤として投与したｒｅｃＮｇＡ複合体（ＯＭＴＸ５０５）、又はゲムシタビンと組み合わせて投与したｒｅｃＮｇＡ複合体（ＯＭＴＸ５０５：ＧＥＭ）；（Ｂ）ＴＡＭ４７１（ＯＭＴＸ７０５−４７１）対ＴＡＭ５５１（ＯＭＴＸ７０５−５５１）複合体；（Ｃ）ＴＡＭ４７１（ＯＭＴＸ７０５−４７１及びＴＡＭ５５３（ＯＭＴＸ７０５−５５３）対ＴＡＭ５５８（ＯＭＴＸ７０５−５５８）複合体。ビヒクル及びＧＥＭ（ゲムシタビン）：陰性対照群及び陽性対照群。
発明を実行するための形態
本発明の説明において、以下の用語が使用され、以下に示すように定義されることが意図される。
エンドグリン
本明細書で使用するエンドグリンは、任意の哺乳動物種のエンドグリンタンパク質であり得る。いくつかの場合において、エンドグリンは、ヒトエンドグリン（ＣＤ１０５、ＥＮＧ又はＥＮＤとしても知られている）であり、そのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１７８１３（バージョン１５４、２０１３年１１月１３日付）で開示されている（配列番号２７）。いくつかの場合において、エンドグリンに結合する分子（例えば、抗体分子又はその複合体）は、エンドグリンの細胞外ドメイン領域に結合することができる。ヒトエンドグリンの細胞外ドメインは、全長ヒトエンドグリンタンパク質の残基２６〜５６１を含む。いくつかの場合において、エンドグリンは、マウスエンドグリン（ＣＤ１０５、ＭＪ７／１８抗原、ＥＮＧ又はＥＮＤとしても知られている）であり、そのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ６３９６１（バージョン１０４、２０１３年１１月１３日付）で開示されている（配列番号２８）。マウスエンドグリンの細胞外ドメインは、全長マウスエンドグリンタンパク質の残基２７〜５８１を含む。
複合体
本明細書で使用する「複合体」は、連結分子により形成された結果の構造を含み、具体的には、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）及び免疫毒素（ＩＴ）を含む。
選択的に結合する
選択的に結合する及び選択的結合という用語は、特定の方法で所定の分子（例えば、抗原）に、抗体、又はその結合断片の結合を指す。例えば、抗体又はその結合断片は、少なくとも約１×１０７Ｍ−１の親和性で、エンドグリン、例えば、その細胞外部分に結合することができ、所定の分子以外の分子への結合の親和性よりも少なくとも２倍高い（例えば、５倍又は１０倍高い）親和性で所定の分子に結合することができる。
抗体分子
本発明の全ての態様に関連して本明細書で使用する場合、用語「抗体」又は「抗体分子」は、天然又は部分的もしくは完全に合成により生成された任意の免疫グロブリンを含む。用語「抗体」又は「抗体分子」は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びポリクローナル抗体（ポリクローナル抗血清を含む）を含む。抗体は、無傷であるか、又は完全抗体由来の断片であり得る（下記を参照されたい）。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又は非ヒト起源の抗体であり得る。「モノクローナル抗体」は、標的分子の単一の抗原部位又は「決定基」に対して作られた均質な、高度に特異的な抗体集団である。「ポリクローナル抗体」は、標的分子の異なる抗原決定基に対して作られた不均質な抗体集団を含む。用語「抗血清（ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）」又は「抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）」は、免疫化した動物から得られた抗体を含む血清を指す。
全抗体の断片は、抗原に結合する機能を果たすことができることが示されている。したがって、本明細書に記載の抗体への言及は、本発明の方法、アレイ及びキットを参照して、完全抗体を包含し、抗体結合断片を含む任意のポリペプチド又はタンパク質も包含する。結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；（ｖ）単離したＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、２つのドメインが抗原結合部位を形成するように会合することを可能にするペプチドリンカーによって連結している単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＷＯ ９３／１１１６１）及び（ｉｘ）「ダイアボディ」、遺伝子融合によって構築された多価断片又は多特異性断片（ＷＯ９４／１３８０４；５８）が挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化され得る。ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディも作製することができる。
抗体分子に関連して、用語「選択的に結合する」は、特異的結合対の一方のメンバーが、その特異的結合パートナー（複数可）以外の分子へのいかなる有意な結合も示さない状況を指すために本明細書で使用され得る。この用語は、例えば、抗原結合部位がいくつかの抗原によって保有される特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、そのような場合には、抗原結合部位を保有する特異的結合メンバーは、エピトープを保有する様々な抗原に結合することができる。
本発明によるいくつかの場合において、抗体は完全ヒト抗体であり得る。
細胞傷害性化学療法剤
本発明の任意の態様によるいくつかの場合において、本発明の複合体は、細胞傷害性化学療法剤もしくは抗血管新生剤もしくは免疫療法剤を含むが、これらに限定されない他の抗腫瘍薬と共に投与するか、又は他の抗腫瘍薬と共に投与（同時、逐次もしくは別々の投与）するためのものであり得る。
細胞傷害性化学療法剤は、当技術分野で周知であり、以下のものなどの抗癌薬を含む：メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）及びクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタードを含むアルキル化剤；ヘキサメチルメラミン、チオテパなどの１０種のエチレンイミン類及びメチルメラミン類；ブスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＬＪ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮ−Ｕ）及びストレプトゾエイン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｅｉｎ）（ストレプトゾトシン）などのニトロソ尿素；並びに、デカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド）などのトリアゼン類；メトトレキサート（アメトプテリン）などの葉酸類似体を含む代謝拮抗剤；フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦＵｄＲ）及びシタラビン（シトシンアラビノシド）などのピリミジン類似体；並びにプリン類似体及びメルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）及びペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン）などの関連阻害剤。ビンブラスチン（ＶＬＢ）及びビンクリスチンなどのビンカアルカロイド類；エトポシド及びテニポシドなどのエピポドフィロトキシン類；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン（マイトマイシンＱ）などの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；並びにインターフェロンアルフェノム（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈｅｎｏｍｅ）などの生体応答修飾物質を含む天然物。シスプラチン（シス−ＤＤＰ）及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ミトキサントロン及びアントラサイクリンなどのアントラセンジオン；ヒドロキシ尿素などの置換尿素；プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）などのメチルヒドラジン誘導体；並びに、ミトタン（ｏ、Ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤；タキソール及び類似体／誘導体；並びにフルタミド及びタモキシフェンなどのホルモンアゴニスト／アンタゴニストを含む種々の薬剤。さらに好ましい細胞傷害薬は、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））である。さらに好ましい細胞傷害性剤は、ヒト血清アルブミンに結合したパクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））である。
抗血管新生剤は、当該技術分野において周知であり、ベバシズマブ、イトラコナゾール、及びカルボキシアミドトリアゾールなどの抗癌剤を含む。
免疫療法剤は、当該技術分野で周知であり、例えば、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）及びペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）を含む抗−プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）抗体及び抗プログラムデスリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体を含む。
医薬組成物
本発明の複合体は、薬学的に許容される賦形剤と共に医薬組成物中に含まれてもよい。
薬学的に許容される賦形剤は、副反応を誘発せず、例えば、該複合体の投与の促進、体内でのその存続期間及び／もしくは有効性の増加、又は溶液中でのその溶解度の増加を可能にする医薬組成物中に入っている化合物又は化合物の組み合わせであり得る。これらの薬学的に許容されるビヒクルは、周知であり、該複合体の投与様式に応じて当業者によって適合される。
いくつかの実施形態において、本発明の複合体は、投与前に再構成するために凍結乾燥形態で提供されてもよい。例えば、凍結乾燥複合体は、個体に投与する前に滅菌水で再構成し、生理食塩水と混合してよい。
本発明の複合体は、通常、該複合体に加えて少なくとも１種類の成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。したがって、医薬組成物は、該複合体に加えて、当業者に周知の薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は他の材料を含んでもよい。かかる材料は非毒性であるべきであり、該複合体の有効性を妨げるべきでない。担体又は他の材料の正確な性質は投与経路に依存し、投与経路は、以下に説明するように、ボーラス、点滴、注射又は他の任意の適切な経路であり得る。
例えば、注射による静脈内投与では、該複合体を含む医薬組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。当関連業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを用いて適切な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸類；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛タンパク質複合体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、プルロニック（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を使用してよい。
対象
対象は、ヒト、コンパニオン動物（例えば、イヌ又はネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタもしくは非ヒト霊長類）、家畜又は農場動物（例えば、ブタ、ウシ、馬もしくは羊）であり得る。好ましくは、対象はヒトである。いくつかの場合において、対象は、癌、例えば、上皮性腫瘍、固形腫瘍又は血液腫瘍と診断され得るか、又はそれを発症するリスクがあると分類されたヒトであり得る。特定の場合において、対象は、実験動物、例えば、癌のマウスモデルであり得る。特定の場合において、対象は、変形性関節症又は関節リウマチ（ＲＡ）などの炎症状態と診断されるか、又はそれを発症するリスクがあると分類された哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。具体的には、対象は、変形性関節症又はＲＡを有するヒトであり得る。特定の場合において、対象は、糖尿病性網膜症又は黄斑変性症などの眼疾患と診断されるか、又はそれを発症するリスクがあると分類された哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。
癌
本明細書に記載の抗ＥＮＧ複合体は、哺乳動物対象の腫瘍の治療で使用される。腫瘍は固形腫瘍であり得る。具体的には、腫瘍は、膵臓癌、ユーイング肉腫、乳癌、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、卵巣癌、膀胱癌又は結腸癌であり得る。
炎症状態
本発明によるいくつかの場合において、抗ＥＮＧ抗体又は抗体薬物複合体は、炎症状態の治療に使用するためのものであり得る。ＥＮＧ発現は、変形性関節症又は関節リウマチで報告されている。例えば、Ｓｚｅｋａｎｅｃｚ，Ｚ．らのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９５，７６，１８７−１９４、及びＬｅａｓｋ ＡらのＡｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，２００２，４６，１８５７−１８６５を参照されたい。本発明者らは、本明細書に記載の抗ＥＮＧ抗体、及び／又は本明細書に記載のその複合体が、変形性関節症、関節リウマチ及び／又は変形性関節症もしくは関節リウマチの症状を改善することができると考えている。
眼疾患
本発明によるいくつかの場合において、抗ＥＮＧ抗体又は抗体薬物複合体は、眼疾患（例えば、糖尿病性網膜症又は加齢性黄斑変性などの黄斑変性）の治療に使用するためのものであり得る。ＥＮＧ発現は、黄斑変性症及び網膜症を含む特定の眼の病状で報告されている。例えば、Ｔｓｕｔｏｍｕ ＹａｓｕｋａｗａらのＣｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２０００，２１，９５２−９６１、及びＡｂｕ Ｅｌ−Ａｓｒａｒ ＡＭらのＭｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ．２０１２，２０１２：６９７４８９、並びにＭａｌｉｋ ＲＡらのＪ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００５，９：６９２−７を参照されたい。本発明者らは、本明細書に記載の抗ＥＮＧ抗体、及び／又は本明細書に記載のその複合体が、眼疾患及び／又はその症状（糖尿病性網膜症又は加齢性黄斑変性などの黄斑変性を含む）を改善することができると考えている。
以下は、例として提示されるものであり、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例
実施例１−抗ＥＮＧ抗体の生成
合成抗体ファージライブラリから単離された抗ＥＮＧのｓｃＦｖについては以前に記載されている（２９）。「Ａ５」として知られるヒトＥＮＧの細胞外領域に対する１種類のｓｃＦｖ（２９）及び「ｍＥ１２」として知られるマウスＥＮＧの細胞外領域に対する１種類のｓｃＦｖ（３１）を、その後の特性評価研究並びに免疫毒素及びＡＤＣの作製のために全長ＩｇＧに変換した。全てのｓｃＦｖを大腸菌内で生成し、ＩＭＡＣにより精製し、抗体生成のために開発されたＬｏｎｚａ社製ＧＳ発現ベクターのｐＥＥ６．４及びｐＥＥ１４．４を用いて、ＩｇＧを哺乳動物細胞（ＣＨＯ）内で生成した。ｓｃＦｖ出発物質の特徴を表１にまとめる。
全てのｓｃＦｖを大腸菌ＴＧ１で細菌生成し、ＩＭＡＣによって１Ｌ培養物のペリプラズム抽出物から精製した。
全長ＩｇＧ１抗体に対応するプラスミドを作製し、Ｌｏｎｚａ社製ＣＨＯ発現系での抗体生成のためにＣＨＯ細胞内にトランスフェクトし、細胞培養物の収率は約１ｍｇ／Ｌであった（実験室規模）。抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって特徴づけた。生物活性を、組換えＥＮＧ及びＨＲＰ−複合化抗ヒトＩｇＧ抗体と結合した抗体の検出を用いて、ＥＬＩＳＡによって分析した。細胞結合を、ＥＮＧ発現マウスＢ１６細胞を用いてフローサイトメトリーによって分析した。
結果：
作製（及び配列決定）したプラスミド：
Ａ５ ＩｇＧ１：ｐＥＥ１４．４ Ａ５−ＩｇＧ１ ＯＣＭＴＸ００３ｐ（ヒト抗ｈｕＥＮＧ ＩｇＧ１）
ｍＥ１２ ＩｇＧ１：ｐＥＥ１４．４ ｍＥ１２−ＩｇＧ１ ＯＣＭＴＸ００４ｐ（ヒト抗ｍｕＥＮＧ ＩｇＧ１）
実施例２−抗ＥＮＧ抗体の特徴
抗ヒトＥＮＧ ＩｇＧ１ Ａ５（Ａ５−ＩｇＧ１）の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す：
抗ヒトエンドグリン Ａ５−ＩｇＧ１−ＨＣ：
ａａ ４４７
プロセシングしたＨＣのＭＷ ４８，７０３
理論上のｐＩ ８．３６
潜在的なグリコシル化部位（二重下線）：Ｎ２９７
ＡＤＣＣ及びＣＤＣの欠乏につながる変異を太字イタリック体で示す（ＷＯ ９９／５８５７２も参照されたい）。
シグナル配列を四角で示す。
ＶＨドメインに下線を引き；ＣＤＲＨ１−Ｈ３を太字の波線で示す。
抗ヒトエンドグリン Ａ５−ＩｇＧ１−ＬＣ：
ａａ ２１４
プロセシングしたＨＣのＭＷ ２３，１１３
理論上のｐＩ ７．７６
シグナル配列を四角で示す。
ＶＬドメインに下線を引き；ＣＤＲＬ１−Ｌ３を太字の波線で示す。
Ａ５−ＩｇＧ１−ＨＣ−シグナル配列なし：
Ａ５−ＩｇＧ１−ＬＣ−シグナル配列なし：
Ａ５−ＶＨ：
Ａ５−ＶＬ：
Ａ５−ＣＤＲＨ１：
ＳＹＡＭＳ（配列番号７）
Ａ５−ＣＤＲＨ２：
ＡＩＹＧＳＤＧＤＴＴＹ（配列番号８）
Ａ５−ＣＤＲＨ３：
ＶＦＹＴＡＧＦＤＹ（配列番号９）
Ａ５−ＣＤＲＬ１：
ＲＡＳＱＳＩＳＳＳＬＮ（配列番号１０）
Ａ５−ＣＤＲＬ２：
ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１１）
Ａ５−ＣＤＲＬ３：
ＱＱＡＰＡＫＰＰＴ（配列番号１２）
完全Ａ５−ＩｇＧのパラメータは以下のとおりである：
全長ＩｇＧ（ａａ）の全長：１，３３２
全長ＩｇＧの計算した分子量：１４３，５７７
全長ＩｇＧの計算された吸光係数：１９５，４４０
Ａｂｓ ０．１％（＝１ｇ／ｌ）１．３６１
理論上のｐＩ：８．３６
潜在的なグリコシル化部位：Ｎ２９７
抗マウスエンドグリンｍＥ１２−ＩｇＧ１−ＨＣ：
ａａ ４４６
プロセシングしたＨＣのＭＷ ４８，５７４
理論上のｐＩ ８．８８
潜在的なグリコシル化部位（二重下線）：Ｎ２９７
ＡＤＣＣ及びＣＤＣの欠乏につながる変異を太字イタリック体で示す。
シグナル配列を四角で示す。
ＶＨドメインに下線が引いてある。
抗マウスエンドグリンｍＥ１２−ＩｇＧ１−ＬＣ：
ａａ ２１２
（プロセシングした）ＭＷ ２２，５１６
理論上のｐＩ ６．６９
シグナル配列を四角で示す。
ＶＬドメインに下線が引いてある。
ｍＥ１２−ＩｇＧ１−ＨＣ−シグナル配列なし：
ｍＥ１２−ＩｇＧ１−ＬＣ−シグナル配列なし：
ｍＥ１２−ＶＨ：
ｍＥ１２−ＶＬ：
ｍＥ１２−ＣＤＲＨ１：
ＳＹＧＭＨ（配列番号１９）
ｍＥ１２−ＣＤＲＨ２：
ＲＩＮＳＤＧＳＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２０）
ｍＥ１２−ＣＤＲＨ３：
ＡＴＧＴＷＶＭＳ（配列番号２１）
ｍＥ１２−ＣＤＲＬ１：
ＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳ（配列番号２２）
ｍＥ１２−ＣＤＲＬ２：
ＧＫＮＮＲＰＳ（配列番号２３）
ｍＥ１２−ＣＤＲＬ３：
ＮＳＲＤＳＳＧＴＶ（配列番号２４）
精製した抗ｍｕＥＮＧ ｍＥ１２及び抗ｈｕＥＮＧ Ａ５抗体を、組換えＥＮＧへの結合について、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）を用いてＥＬＩＳＡで分析した。ｍＥ１２抗ｍｕＥＮＧ（図１及び図２）並びにＡ５ 抗ｈｕＥＮＧ ＩｇＧ１（図３）の親和性の結果を示し、表２にまとめる。図１は、ｍＥ１２−ＩｇＧが陰性対照（ＢＳＡ）には結合しないが、組換えマウスＥＮＧ（ａａ２７〜５８１）に濃度依存的に結合することを示す。図２は、ａ）５０μｇ／ｍｌの抗体を用いたＢ１６細胞、ｂ）５μｇ／ｍｌの抗体を用いたＢ１６細胞、及びｃ）陰性対照として含めたＨＴ１０８０細胞へのｍＥ１２−ＩｇＧの結合のフローサイトメトリー分析を示す。図３は、ａ）ＥＬＩＳＡ及びｂ）フローサイトメトリー分析によるヒトＥＮＧへのＡ５−ＩｇＧの濃度依存的な結合を示す。
スケールアップのために、抗体構築物をＧＳ二重ベクター（ｐＥＥ１４．４）にクローニングした。ＤＮＡプラスミドを形質転換して、増幅し、２００ｍＬの容積での発現評価のためにＣＨＯＫ１ＳＶ細胞に一過的にトランスフェクトした。第２段階では、抗体を５〜１０Ｌの大規模培養で一過的に発現させた。清澄化培養上清を、一段階プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。対照試料として研究室内のヒト抗体と共に、１ｍｇ／ｍｌの濃度で精製物質を使用して、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＬＡＬを介した生成物の品質分析を行った。
精製タンパク質試料を、０．２μｍフィルターを通して濾過し、ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムにより分析した。ｍＥ１２−ＩｇＧを＞９８．８％まで精製した。Ａ５−ＩｇＧを＞９０％まで精製した。エンドトキシンレベルは＜０．５ＥＵ／ｍｇであった。
全ての精製タンパク質を、還元及び非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（データは示さず）。
精製タンパク質Ａ５−ＩｇＧ及びｍＥ１２−ＩｇＧをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって特徴づけた。生物活性を、組換えマウス／ヒトＥＮＧ及びＨＲＰ−複合化抗ヒトＩｇＧ抗体と結合した抗体の検出を用いて、ＥＬＩＳＡにより分析した。細胞結合を、ＥＮＧ陽性ＨＴ１０８０及びＥＮＧ発現マウスｅＥｎｄ２を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。融点を、ゼータサイザーナノを用いた動的光散乱によって測定した。親和性を、Ａｔｔａｎａ Ａ１００を用いるＱＣＭにより決定した。内部移行研究を、ＦＩＴＣ標識二次抗体と結合し、内部移行した抗体を検出するために、透過性細胞上での間接免疫蛍光共焦点顕微鏡法により行った。
全長ＩｇＧ１精製した抗体を、免疫複合体の作製のために、実験室規模及び大規模の両方で首尾よく生成した。抗体特性の概要を表２に示す。ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー実験によって示されるとおり、これらの抗体はその特異性を保持していた。ＱＣＭによって決定されるとおり、親和性は、親抗体のものと同等であった。ＱＣＭ測定は、高親和性結合に対するアビディティー効果の寄与を示した。熱的安定性は、異なるＩｇＧ間で異なっていた（６４〜７２℃）。
予備的な内部移行研究により、ヒトＥＮＧを発現する細胞に対するＡ５−ＩｇＧの急速な内部移行が示されている。実際に、３０分以内に、Ａ５−ＩｇＧのほとんど９０％がＨＴ１０８０細胞内に見られる。
γ１＊＝ＡＤＣＣ及びＣＤＣの欠損（Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３参照されたい）。
図９は、抗ｈｕＥＮＧ Ａ５ ＩｇＧ１の内部移行を示す。
実施例３−ニグリン−ｂのＡ鎖
血流中に放出することができた遊離毒素の副作用を回避し、ＲＩＰ毒素の潜在的な免疫原性を低減するために、リシンと共に広範に説明したとおり、ニグリン−ｂのＡ鎖の酵素ドメインをクローニングし、細菌内で発現させた。本発明者らは、細菌内で生成したＡ鎖がその活性を保持することができたならば、抗体などのビヒクル分子と複合化しない限り、細胞の中に入ることができないという仮説を立てた。
生成
ニグリン−ｂのＡ鎖を、細菌発現のためにコドン最適化を考慮して合成し、合成した遺伝子を、２つの異なる大腸菌株である大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）及び大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）での発現のために、２つの異なるベクターのニグリン＿ｐＥＴ３０ｂ−３及びニグリン＿ｐＥＴ３３ｂ−１（＋／− ＨｉＳタグ）にクローニングした。異なる培地を用いて、異なる発現状態を確認した。Ｃａｐｔｏ Ｑクロマトグラフィー及びＳＰセファロース高性能を用いて、精製方法を確立した。精製した組換えニグリン−ｂのＡ鎖（ｒｅｃＮｇＡ）を１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５ｍＭのＤＴＴ、１０％グリセロール中５ｍｇ／ｍｌで製剤化した。ニグリンのエンドトキシンレベルは＜１ＥＵ／ｍｇであり、純度は単量体型で＞９９％であった。
エドマンＮ末端配列決定により、ｒｅｃＮｇＡのＮ末端は期待される配列と一致することが明らかになった。
組換えニグリン−ｂのＡ鎖のアミノ酸配列：
MIDYPSVSFNLDGAKSATYRDFLSNLRKTVATGTYEVNGLPVLRRESEVQVKSRFVLVPLTNYNGNTVTLAVDVTNLYVVAFSGNANSYFFKDATEVQKSNLFVGTKQNTLSFTGNYDNLETAANTRRESIELGPSPLDGAITSLYHGDSVARSLLVVIQMVSEAARFRYIEQEVRRSLQQATSFTPNALMLSMENNWSSMSLEIQQAGNNVSPFFGTVQLLNYDHTHRLVDNFEELYKITGIAILLFRCSSPSND（配列番号２５）
組換えニグリン−ｂのＡ鎖は以下の特徴を有する：
アミノ酸の数：２５６
分子量：２８５４６．０
理論上のｐＩ：５．４５
組換えニグリン−ｂのＡ鎖をコードするヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
atagactatc cctccgtctc cttcaacttg gatggagcca agtcggctac atacagggac ttcctcagca acctgcgaaa aacagtggca actggcacct atgaagtaaa cggtttacca gtactgaggc gcgaaagtga agtacaggtc aagagtcggt tcgttctcgt ccctctcacc aattacaatg gaaacaccgt cacgttggca gtagatgtga ccaaccttta cgtggtggct tttagtggaa atgcaaactc ctactttttc aaggacgcta cggaagttca aaagagtaat ttattcgttg gcaccaagca aaatacgtta tccttcacgg gtaattatga caaccttgag actgcggcga atactaggag ggagtctatc gaactgggac ccagtccgct agatggagcc attacaagtt tgtatcatgg tgatagcgta gcccgatctc tccttgtggt aattcagatg gtctcggaag cggcaaggtt cagatacatt gagcaagaag tgcgccgaag cctacagcag gctacaagct tcacaccaaa tgctttgatg ctgagcatgg agaacaactg gtcgtctatg tccttggaga tccagcaggc gggaaataat gtatcaccct tctttgggac cgttcagctt ctaaattacg atcacactca ccgcctagtt gacaactttg aggaactcta taagattacg gggatagcaa ttcttctctt ccgttgctcc tcaccaagca atgat（配列番号２６）
材料
−ニグリン＿ｐＥＴ３０ｂ−３遺伝子構築物
−大腸菌（Ｍｉｇｕｌａ）Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒｓ ＢＬＲ（ＤＥ３）
−培地：自己誘導培地（ＡＩＭ）
−抽出培養緩衝液：１０ｍＭのグリシン／ＮａＯＨ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプスタチン、ｐＨ９．５
−抽出上清緩衝液：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１μｇｍｌ−１のロイペプチン、１μｇｍｌ−１のペプスタチン、０．１ｍｇｍｌ−１のリゾチーム、ｐＨ８．０
−透析容液：２５ｍＭのクエン酸／ＮａＯＨ、ｐＨ５．０−Ｃａｐｔｏ Ｑ ＦＰＬＣ：平衡緩衝液Ａ：５０ｍＭのグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ９．５、溶出緩衝液Ｂ：５０ｍＭのグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ９．５、１ＭのＮａＣｌ
−Ｃａｐｔｏ Ｑ工程からプールした画分（＋８０ｍｌ抽出）
−ＳＰセファロースＨＰ ＦＰＬＣ：平衡緩衝液Ａ：２５ｍＭのクエン酸、ｐＨ４．０、溶出緩衝液Ｂ：２５ｍＭのクエン酸、ｐＨ４．０、１ＭのＮａＣｌ
方法
ニグリン＿ｐＥＴ３０ｂ−３発現を保持する大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を、３０μｇｍｌ−１のカナマイシンと共に自己誘導培地（ＡＩＭ）の１Ｌ形式で培養した。タンパク質発現は、増殖の約３〜４時間後に乳糖活性化及びグルコース枯渇によって引き起こされた。その後、温度を一晩中２０℃に下げた。抽出のために、各細胞ペレットを最初に培養物１リットル当たり抽出緩衝液８０ｍｌ中に再懸濁し、振盪しながら８℃でインキュベーションを３０分行った後に、１１００〜１１０バールでの７分の分解を３サイクル行った。その後、この抽出物を、１５，９００ｇ、８℃で６０分間の遠心分離を行った。上清は精製の出発物質であった。Ｃａｐｔｏ Ｑ ＦＰＬＣ：８１個の培養物からの抽出生成物１６０ｍｌを、１６０ｍｌのＣａｐｔｏ Ｑに添加し、平衡緩衝液４ＣＶを用いて平衡化し、平衡緩衝液１５ＣＶで洗浄した。溶出は３段階で行った：１．５ｍＳ／ｃｍで１５ＣＶ（７．６％ Ｂ）；２３．８ｍＳ／ｃｍで２０ＣＶ（１８．９％ Ｂ）；２０ＣＶ １００％ Ｂ。
透析を以下の条件で行った：生成物６５０ｍｌを、２５ｍＭのクエン酸／ＮａＯＨ、ｐＨ５．０中４×５Ｌバス、カットオフ６〜８０００Ｄａで透析した。透析係数、約３５００、＜２４時間。透析後、２０，５００ｇ、８℃で３０分間遠心分離し、不溶性画分と可溶性画分を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、透析前後の両方の全画分及び可溶性画分で行った（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に１０μｌをロードした）。溶出液をＰＢＳ ｐＨ７．４の中で透析し、２×２０ｃｍ２ ＥＫＶフィルターを使用して、φ＝０．２２μｍでろ過した。
ＳＰセファロースＨＰ：２５ｍＭのクエン酸、ｐＨ５．０中のＣａｐｔｏ Ｑ透析プール６１０ｍｌを、平衡化緩衝４ＣＶと共に２４０ｍｌのＳＰセファロース高性能にロードし、平衡緩衝液１５ＣＶで洗浄し、２０％Ｂまで２５Ｃｖ勾配；１００％Ｂの４ＣＶ工程で溶出した。ＳＰセファロースＨＰ工程からプールした画分を、ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．５ｍＭのＤＴＴ（５×４Ｌバス、０．９７ｍｇ／ｍｌで９５０ｍＬのプール画分）中で透析した。カットオフは６〜８０００Ｄａであり、透析係数は約３１３０であり、時間＞２４時間であった。その後、３０分、２０，５５ｇ、８℃で遠心分離し、不溶性画分と可溶性画分を分離した。その後、１０％グリセロールを添加した。
最後に、溶離液をＰＢＳ ｐＨ７．４（５バス、約３１００）中で透析し、φ＝０．２μｍで濾過し、次いで、ｒｅｃＮｇ ｂ Ａバッチを−８０℃で瞬間凍結した。その後、セミ分取Ｓ２００スーパーデックスでのＳＥＣを行った。
サイズ排除クロマトグラフィー及び質量分析により、得られた組換えニグリン−ｂのＡ鎖（ｒｅｃＮｇＡ）のモノマーの精製状態が実証された（図４）。
安定性研究を行い、ニグリン−ｂのＡ鎖タンパク質自体及びその活性に対するｐＨ及び温度の影響を評価した。ｒｅｃＮｇＡは、グリセロール（１０〜４５％）の有無に関わらず、５〜９の範囲のｐＨで安定である（データ示さず）。
活性
組換えニグリン−ｂのＡ鎖のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）活性を、ウサギ網状赤血球の無細胞溶解物中で試験した：得られたＩＣ５０値は、天然ニグリン−ｂに類似しており、２．５〜２５ｐＭの範囲内であった（図５を参照されたい）。したがって、ニグリン−ｂのＡ鎖を細菌中で組換えタンパク質として発現させると、その酵素活性を維持していることから、グリコシル化がニグリン−ｂのＡ鎖のＲＩＰ活性に必要とされないことが示唆される。
（−８０℃）で凍結保存し、３回未満の凍結融解サイクルを行った場合に、ＲｅｃＮｇＡは、ウサギ網状赤血球の無細胞溶解物中でその活性を保持している（図示せず）。
ｒｅｃＮｇＡの細胞傷害活性を、クリスタルバイオレットに基づく生存率アッセイによって細胞培養で試験した。図６に示すとおり、細胞内に移行するためのＢ鎖を欠くｒｅｃＮｇＡは、天然ニグリン−ｂよりも１００〜１０００低い毒性活性を示す。天然ニグリン−ｂは、約２×１０−８ＭのＩＣ５０（以前公開したデータと類似している；３７を参照されたい）を示したが、ｒｅｃＮｇＡは約２×１０−６ＭのＩＣ５０を示した。
以前に発表された研究は、天然ニグリンｂがＲＲＬアッセイにおいてリシンよりも高いＲＩＰ活性を示すが、細胞内又はインビボでは毒性がはるかいに低い（約３０〜１０，０００倍）（表３のＩＣ５０及びＬＤ５０値を参照されたい）。
Ｂ鎖の除去の際に、リシンＡ鎖はＲＲＬアッセイ及び細胞傷害性アッセイの両方で活性を失う。意外なことに、本発明で最初に作製したニグリンｂのＡ鎖のみが細胞傷害性アッセイで活性を失うが、天然ニグリンＢに関するＲＲＬアッセイでは活性はさらに増加した。これらのデータから、リシンの場合では、Ｂ鎖の除去がＡ鎖の結合及び移行だけでなく、そのＲＩＰ活性にも影響を与えるが、その天然対応物に関してそのＲＲＬ活性を保持し、さらに増加させるニグリンｂのＡ鎖についてはこの場合に当てはまらないことが示唆された。結果として、ニグリンｂのＡ鎖はＲＲＬにおいてリシンＡ鎖よりも５０倍活性が高い。
その結果として、複合化の際に、ニグリンｂのＡ鎖複合体は、リシンＡ鎖複合体（ｎＭ範囲）よりも高い細胞傷害活性（ピコモル範囲内のＩＣ５０）を示す（示さず）。
（発明者ら自身のデータ−ニグリンｂのＡ鎖；Ｆｅｒｒｅｒａｓ Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｎｓ，３：４２０，２０１１；Ｓｖｉｎｔｈ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，２４９：６３７，１９９８も参照されたい）
実施例４−ニグリン−ｂのＡ鎖の抗ＥＮＧ抗体との複合化
最大細胞傷害を示すＲＩＰを含む免疫複合体については、ＲＩＰは、立体障害を回避することが必要である完全活性型で標的ビヒクルから放出されなければならない（３８）。ジスルフィド結合は、この基準に適合する連結の唯一の種類である（３９、４０）。この結合は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオプロピオネート）（ＳＰＤＰ）及び４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）などの遊離スルフヒドリル基を導入するための試薬を用いた複合化を可能にする。立体障害ジスルフィドリンカーによって毒素に共有結合したｍＡｂからなる免疫毒素は、第２世代の免疫毒素として標識される場合が多く、安定しており、長寿命で、標的細胞に対する強力な細胞傷害を示す（４１）。
ＳＰＤＰは、ニグリン−ｂを含む免疫毒素（ＩＴ）の作製にすでに使用されている（３６、４２）。さらに、ＳＭＰＴは、チオラート陰イオンによる攻撃からジスルフィド結合を保護し、連結のインビボ安定性を向上させる（４３、４４）。
材料
−５℃で保存されている、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１０％グリセロール、０．５ｍＭのＤＴＴ、４．９２ｇｌ−１中の組換えニグリンｂのＡ鎖
−５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）
−ＧＥ ＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−１０脱塩カラム
−０．２μｍ ２８ｍｍの無菌のＭｉｎｉｓａｒｔ社製フィルター
−Ｓｃｉｃｌｏｎｅ社製ＡＬＨ ３０００ワークステーション
−Ｓａｒｓｔｅｄｔ社製マイクロテストプレート９６ウェル平底、参照番号８２．１５８１
方法
ジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｃｌｅｌａｎｄの試薬）は、タンパク質試料中に存在するチオール基を遊離するために使用される還元剤である。前記基が解放されると、反応に利用可能になるので、５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（エルマン試薬）を添加する。エルマン試薬ジスルフィド架橋が切断されると、生じる２つのチオニトロ安息香酸分子（ＴＮＢ）は、チオール基の部位でタンパク質に結合する。ＴＮＢを滴定するために、ＤＴＴが吸収されず、チオール基の濃度をレンダリングする波長であるλ＝４１２ｎｍで吸光度の値を測定する。これらの割合と、λ＝２８０でその吸光度から測定されるタンパク質の濃度から、タンパク質分子あたりの遊離チオール基の数が得られる。
直接チオール滴定を以下のように行った：
ｒｅｃＮｇ ｂ Ａ２０４μｌを２０ｍＭのリン酸、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ７．０（アッセイ緩衝液）７９６μｌに溶解した（１．００３３ｇｌ−１＝最終濃度）。エルマン試薬を、３ｇｌ−１で０．２Ｍのリン酸に溶解した。両方の緩衝液について、一塩基性と二塩基性のリン酸ナトリウムを１．６１：１の質量比で添加した。ｐＨを室温で調整し、緩衝液を濾過した。エルマン緩衝液１００ｍｌ及びアッセイ緩衝液５００ｍｌを調製した。エルマン試薬を、秤量よりむしろ完全に再懸濁させた。ｒｅｃＮｇＡ試料を、３０分間室温で４．８ｍＭのＤＴＴの存在下でインキュベートした。次いで、ｒｅｃＮｇｂ Ａ試料をカラム内で精製し、溶離液の最初の１０ｍｌを一定分量取った（Ｖ＝０．５ｍｌ）。アリコートのＡ２８０を取得し、最も濃縮した２つのアリコートを混合した。Ａ２８０を再び取得した。３ｇｌ_１のＤＴＮＢ１０μｌを添加し、ブランクとして同じ濃度でアッセイ緩衝液中に希釈したエルマン（ｎｂ＝３）を使用して、２分後にＡ４１２を測定した（ｎ＝１）。読み取り値は０．１〜３ＡＵの線形範囲に属していた。タンパク質溶液を、ボルテックス後に、メニスカスの右下にピペットで移した。１ウェル当たり１００μｌをピペットで移した。この研究結果から、ｒｅｃＮｇＡの単一システイン残基に属するチオール基が遊離しており、その三次構造によってブロックされていないので反応に利用可能であることが示される。これは、ｒｅｃＮｇｂ Ａが立体障害鎖間ジスルフィド結合を必要とするリンカーを用いて複合化されるのを可能にする。
毒素分子が完全に活性型で標的化ビヒクルから放出された場合にのみ、リボソーム不活性化タンパク質を含有する免疫複合体は最大細胞傷害を示すことが十分に確立されている。ＲＩＰ分子と担体の分離は、立体障害を回避し、細胞質への毒素の効果的な移行を可能にするのに必要とされる（３８）。現時点では、ジスルフィド結合は、これらの基準に適合するように思われる連結の唯一の種類である（４０）。
ヘテロ二量体形成につながる２つの異なるタンパク質の巨大分子の結合は、それぞれのタンパク質が混合されて、反応する前に修飾されることが必要である。２型のＲＩＰのＡ鎖の場合には、修飾は、分子の活性のある鎖（Ａ）及び結合鎖（Ｂ）を結ぶ天然システイン残基の還元的開裂に限定される。
ＩｇＧ分子の場合には、システイン残基がタンパク質の三次及び／又は四次構造の維持に関与しているので修飾できず、その結果、特定のタンパク質の機能を失うことなく、システイン残基を還元することはできない。さらに、おそらくシステイン残基のいくつかは、活性化ＲＩＰとの最適複合化のために作製されなければならない、免疫グロブリン当たり１０個のチオール基によって実証されたように、立体的にアクセスできない（４５）。
これらの理由から、ほとんどのＩｇＧ分子において、チオール基はヘテロ二官能性試薬を使用して化学的に挿入され、いくつかの方法が、ホモポリマーの形成を回避するか、又は最小限に低減するヘテロ複合体を作製するために開発されてきた。ほとんどの場合、チオール基を導入するために使用される試薬は、アミノ基と反応して、アミド又はアミジン結合を形成する。アミノ基は、反応性があり、豊富で、ほとんどのタンパク質について限定された方法で消費される。すなわち、限定された数のアミノ基は、タンパク質の生物学的活性を減少させることなく改変することができる（４０）。
遊離スルフヒドリル基を導入するための最も一般的に使用される試薬は、アミノ基と反応して中性アミドを形成することによってタンパク質に２−ピリジルジスルフィド基を導入するＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−ジチオプロピオネート）（ＳＰＤＰ）及び４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、並びにメルカプトブチルイミドイル（ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙｒｉｍｉｄｏｙｌ）基を導入して、反応し、荷電アミジン類を形成することによって、誘導体化アミノ酸の正電荷を保存するメチル−４−メルカプトブチルイミデート（２−イミノチオラン、トラウトの試薬）である（４０；４４）。
ＳＰＤＰ及びＳＭＰＴは、立体障害ジスルフィド結合を導入するが、２−イミノチオラン−ＳＨは、５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（エルマン試薬）と反応することにより保護されなければならない。エルマン試薬との反応も、タンパク質のスルフヒドリル基の迅速な測定のために使用される（４５、４６）。
ＳＭＰＴは、チオレートアニオンによる攻撃から保護するジスルフィド結合に隣接する炭素原子に結合しているメチル基及びベンゼン環を有することによって、連結のインビボ安定性を改善する（４３、４４）。
これらのデータに基づいて、ＩｇＧタンパク質は、反応部位でタンパク質の電荷を変更する場合であっても、以下の条件で分子の抗原結合特性に著しく影響を与えないＳＭＰＴで修飾することができる。
一研究において、本発明者らは、複合化プロトコルに従って、２．５及び３．５の２つの異なるｒｅｃＮｇＡ：ｍＡｂモル比を用い、誘導体化後は、６のＳＭＰＴ：ｍＡｂモル比を用いて、ＩｇＧ１とｒｅｃＮｇＡとの複合化を調べた（４０を参照されたい）。精製は、セファクリルＳ２００上のサイズ排除クロマトグラフィーにより行った（４１を参照されたい）。
記載の条件下では、免疫毒素は、高分子量成分（いくつかのＲＩＰタンパク質に連結したＩｇＧ）だけでなく、遊離ＲＩＰ及びポリマーＲＩＰ（ｒｅｃＮｇＡの場合には二量体）並びに遊離抗体の存在と共に、主に、１つ又は２つの毒素分子に連結した抗体の混合物である。したがって、慎重な精製が、純粋な生成物を取得するのに望ましいと考えられる。
インビトロ活性試験
ウサギ網状赤血球無細胞溶解物（ＲＲＬ）アッセイにおけるＲＩＰ活性の評価を通して、上記のように調製した複合体の活性試験を行った。結果を図７に示す。
天然ニグリンｂ又はｒｅｃＮｇＡについて得られたＩＣ５０値は２．５ｐＭ範囲内にあり、複合体のＩＣ５０値は同じであり、１〜０．５ｐＭ範囲内にあり、天然ニグリン−ｂ陽性対照よりもさらに高いことから、抗体複合化はｒｅｃＮｇＡの酵素活性に影響を与えないことが示された。
実施例５−抗ＥＮＧ抗体との細胞溶解素の複合化
複合化研究のために用いる細胞溶解素を、上記の一般構造（式ＩＶ）から選択した。これらの構造は、異なる癌細胞株に対する活性を示す（ｐＭ〜ｎＭ範囲）。
様々なリンカーシステムを使用して、分子のＲ２又はＲ１７位のいずれかに結合させることができる。
ｖｃＰＡＢＡリンカー及び抗ＥＮＧ抗体を含む細胞溶解素複合体の一般的な概要を図８に示す（図８に示す構造において、ｖｃＰＡＢＡリンカーへの細胞溶解素の付着部位は、位置Ｒ１又はＲ４であり、図１１で用いたＲ１又はＲ４ナンバリングシステムは、例えば、特許請求の範囲で使用されるＲ基のナンバリングシステムとは異なり、図１１のＲ１は、特許請求の範囲のＲ２に相当し、図１１のＲ４は、特許請求の範囲のＲ１７に相当する）。
ｖｃＰＡＢＡ（バリン−シトルリン−ＰＡＢＣ）プロテアーゼ切断可能リンカーは、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社と武田社が開発したＡＤＣ分子ブレンツキシマブベドチンで以前に使用されており、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）としてＦＤＡ及びＥＭＥＡによって最近承認された（それぞれ２０１１年、及び２０１２年１１月）。このＡＤＣにおいて、ｖｃＰＡＢＡは、ｍＡｂ（ｃＡＣ１０ 抗ＣＤ３０抗体）上のチオールベースの複合化のためにマレイミドカプロイルにその遊離ＮＨ２で結合している）。他の側では、ｖｃＰＡＢＡは、そのＣＯＯＨを介してＳｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社のアウリスタチン細胞傷害薬（ＭＭＡＥ）と複合化されている（４８を参照されたい）。
本発明者らは、このリンカー（マレイミドカプロイル−ｖｃＰＡＢＡ）を使用して、マレイミドカプロイルとのチオール系反応を介して抗ＥＮＧ抗体を、もう一方の端で、ｖｃＰＡＢＡと共にそのサイクリックピペリジンを介して細胞溶解素の細胞傷害分子と複合化した（図８に示す細胞溶解素のＲ１又はＲ４位）。
マレイミド−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＯＣＯ−チューブリシン／細胞溶解素−ＴＡＭ４６１の合成：
ＴＡＭ４６１（ツブリシン／細胞溶解素）：３０．０ｍｇ（０．０４１ミリモル）
ＤＭＦ：３ｍＬ
ＴＡＭ４６５（リンカー）：３５ｍｇ（０．０４５ミリモル）
ＨＯＢｔ：１．４ｍｇ
ＤＩＰＥＡ：１０μＬ
ＴＡＭ４６１及びＴＡＭ４６５を乾燥条件下で無水ＤＭＦに溶解し、得られた溶液をＨＯＢｔ及びＤＩＰＥＡで処理した。反応物を１８時間室温で攪拌した。この反応混合物を濃縮し、得られた油状物を、２〜６％のメタノール：ＤＣＭを用いてカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色の固体としてＴＡＭ４６７を３５ｍｇ（６４％）得た。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１３７１［Ｍ＋Ｈ］。
マレイミド−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＯＣＱ−ツブリシン／細胞溶解素−ＴＡＭ４７０の合成：
ＴＡＭ４７０（ツブリシン／細胞溶解素）：０．０７ミリモル
ＤＭＦ：５ｍＬ
ＴＡＭ４６６（リンカー）：５０ｍｇ（０．０６５ミリモル）
ＨＯＢｔ：２．４ｍｇ
ＤＩＰＥＡ：１８μｌ
ＴＡＭ４７０及びＴＡＭ４６６を乾燥条件下で、無水ＤＭＦに溶解し、得られた溶液をＨＯＢｔ及びＤＩＰＥＡで処理した。反応物を１８時間室温で撹拌し、次いで、ＴＬＣで分析することにより、反応の完了が示された。この反応混合物を濃縮し、得られた油状物を、４〜１２％メタノール：ＤＣＭを用いてカラムクロマトグラフィーで精製し、ＴＡＭ４７１を５６ｍｇ（収率：６２％）得た。ＥＳＩ−ＭＳ：１３８４．６［Ｍ＋１］。
インビトロ活性試験を行った。機能的活性は微小管阻害アッセイで評価し、細胞傷害活性はクリスタルバイオレット生存率アッセイにより決定する。
細胞溶解素リンカー誘導体の作製
異なる細胞溶解素リンカー誘導体を図１１に示した一般構造に従って合成し、ｖｃＰＡＢＡリンカーを、単独で又はエチレングリコールスペーサー（ＥＧ；ｎ＝１〜３）を用いて、位置Ｒ１（ＴＡＭ４６７、ＴＡＭ５５１）もしくはＲ４（ＴＡＭ４７１、ＴＡＭ５５３、ＴＡＭ５５８）のいずれかに付加するか、又はエチレングリコール基（ｎ＝３）で置換した（ＴＡＭ５５２）。それぞれの化学構造を表４に示す。
各新規誘導体の微小管阻害活性及び細胞傷害活性を、チューブリン重合阻害アッセイ（ＴＰＩ；チューブリン重合アッセイキット；細胞骨格、カタログ番号ＢＫ０１１Ｐ）、及びＨＴ１０８０細胞の細胞増殖停止（ＣＰＡ；クリスタルバイオレット）により評価した。ＩＣ５０を計算し、結果を表５に示す。
親の細胞溶解素ＴＡＭ３３４のインビトロ活性は、アウリスタチン（ＭＭＡＥ）又はメイタンシノイド（ＤＭ１−ＤＭ４）などの抗体−薬物複合体の作製に現在使用されている他のペイロードと同じ範囲内にある。ツブリシンＡファミリーの他の化合物について予想され、以前に記載されているように、リンカーを添加すると、細胞溶解素の細胞傷害活性は、親化合物ＴＡＭ３３４に対して減少した。さらに、ＴＡＭ４６７誘導体は、両方のアッセイにおいて最低の活性を有意に示した。全ての誘導体を複合化に使用して、ＡＤＣ分子を作製し、インビトロ及びインビボの両方で比較して評価し、最も活性のある細胞溶解素−リンカー誘導体を選択した。
ＡＤＣの複合化及び化学的特性
新たに作製した誘導体のそれぞれを、システイン残基の非部位特異的複合化方法に従って、モノクローナルＩｇＧ１ヒト抗体と複合化した。この目的のために、抗体の１つのバッチを減らして、誘導体のそれぞれと反応させた。最適ＤＡＲが３〜４に達し、遊離抗体及び薬物が１０％未満になるように、異なるＴＣＥＰ比を試験した。最適複合化条件は以下の通りであった：ＴＣＥＰ＝２．５及び３．５７チオールレベルエルマン。次いで、複合体をＧ２５セファデックス上で精製し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析して、その純度を決定し、並びに疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及びポリマー液体逆相クロマトグラフィー（ＰＬＲＰ）により、異なるＡＤＣ種（０〜８種の薬物／ｍＡｂ）のＤＡＲ、遊離抗体含有量及び分布プロファイルを決定した。遊離薬物の含有量を２８０ｎｍでＵＶ検出法により評価した。化学分析の結果を決定し（データ示さず）、かつＡＤＣの生化学的特性を表６に示す。
様々な薬物が、異なるレベルの凝集をもたらした。具体的には、ＡＤＣ ＨＰＳ１５７−０３９−００２（ＴＡＭ５５１）が、ＤＡＲ＝３．０８で既に最高レベルの凝集を示し、非複合化抗体が２２．４％残った。ＴＡＭ４６７との予備複合化でも、高いレベルの凝集が示され：ＤＡＲ３．２７で、ＳＥＣ純度は既に６７％のみであり、遊離薬物は１６％であった（データ示さず）。これらのデータから、位置Ｒ１でのｖｃＰＡＢＡリンカーがこの種の細胞溶解素分子に最適ではないことが示唆された。
細胞溶解素複合体のインビトロ評価
細胞溶解素ＡＤＣ分子を、増殖停止アッセイ（クリスタルバイオレット染色）によりインビトロで比較して評価した。結果を図１０に示し、表７にＩＣ５０値を示す。
ｖｃＰＡＢＡリンカーのみをＲ１位（ＡＤＣ−５５１）に位置付けて、作製した複合体は、Ｒ４位（ＡＤＣ−４７１）の場合と比較してインビトロで細胞傷害活性がはるかに低かった（図１０；表７）。さらに、Ｒ４位におけるｖｃＰＡＢＡリンカーに対するスペーサーとしてのエチレングリコール基の数を増加させると（ＡＤＣ−４７１（ｎ＝０）対ＡＤＣ−５５３（ｎ＝１）及びＡＤＣ−５５８（ｎ＝３））、インビトロで抗原特異的細胞傷害活性が増加することが示された（図１０）。実際に、ＡＤＣ−４７１及びＡＤＣ−５５３は抗原特異的細胞傷害活性をほとんど又は全く示さず（それぞれ、１０ｎＭ及び１００ｎＭのＩＣ５０範囲）、野生型（ＷＴ）と抗原（ＡＧ）発現ＨＴ１０８０細胞との間で差異は無いが、ＡＤＣ−５５８は、１ｎＭ範囲の特異的細胞傷害活性を示し、ＡＧとＷＴのＨＴ１０８０細胞間の特異性の割合は５００であった。
実施例６−複合体のインビボ抗腫瘍効果の評価
ｒｅｃＮｇＡ複合体と細胞溶解素複合体の両方の種類の免疫複合体を、以前に抗原発現について選択された膵臓癌患者由来の異種移植片マウスモデル（ＰＡＸＦ−７３６）において、インビボでの抗腫瘍効果について評価した。
効力研究で使用すべき最大耐量を定義するために、用量範囲研究を行った（データ示さず）。ｒｅｃＮｇＡ免疫複合体については、０．５ｍｇ／ｋｇの最大用量が観察されたが、使用した誘導体に関係なく、細胞溶解素複合体は、２．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇまでの用量の投与で、体重減少も毒性効果も示さなかった。
次いで、免疫複合体を５週間にわたって、週に１回腹腔内投与した。腫瘍体積及び体重を２〜３日毎に測定した。ビヒクル処置及びゲムシタビン治療（１５０ｍｇ／ｋｇ）ＰＤＸマウスを、それそれ陰性対照群及び陽性対照群として用いた。結果を図１１に示す。
ｒｅｃＮｇＡ免疫複合体（ＯＭＴＸ５０５）は、膵臓癌ＰＤＸマウスモデルにおいて０．５ｍｇ／ｋｇの用量で高いインビボ抗腫瘍効果（６０％）を示した(図１１Ａを参照)。ゲムシタビンと組み合わせた場合には、さらに１００％の腫瘍増殖阻害及び腫瘍退縮を示した。
インビトロの結果（図１０及び表７を参照されたい）によると、ｖｃＰＡＢＡリンカーのみをＲ１位（ＯＭＴＸ７０５−５５１）に位置付けて、作製した複合体は、インビボで抗腫瘍活性を示さなかった（図１１Ｂ）。
Ｒ４位におけるｖｃＰＡＢＡリンカーに対するスペーサーとしてのエチレングリコール基の数を増加させると（ＯＭＴＸ７０５−４７１（ｎ＝０）対ＯＭＴＸ７０５−５５３（ｎ＝１）及びＯＭＴＸ７０５−５５８（ｎ＝３））、インビボでの抗腫瘍効果が増加することが示され（図１１Ｃ）、インビトロのデータを裏付けている。ＯＭＴＸ７０５−４７１及びＯＭＴＸ７０５−５５３はインビボで抗腫瘍効果を全く示さなかったが、ＯＭＴＸ７０５−５５８は、膵臓癌ＰＤＸマウスモデルにおいて２．５ｍｇ／ｋｇの用量で４０％の腫瘍増殖阻害効果を示した。
これらのデータから、ｒｅｃＮｇＡ及びＴＡＭ５５８分子を、抗ＥＮＧ複合体の最高のペイロードとして選択した。
実施例７−ユーイング肉腫モデル
腫瘍細胞可塑性により、特定の種類の高悪性腫瘍細胞が脱分化して、可塑性で多能性の胚様表現型になるのが可能になり、腫瘍進行中にそれらの細胞が「適応」して、従来の治療方法をエスケープするのが可能になる。最近の研究により、ＥＮＧ発現がユーイング肉腫における腫瘍細胞の可塑性と相関し、ユーイング肉腫患者の生存率の低さと著しく関連することが実証された。ＥＮＧレベルが低下したユーイング肉腫では、インビボで腫瘍増殖が低下することが示された。したがって、この研究から、腫瘍細胞の可塑性及び侵襲性腫瘍の進行にＥＮＧが重要な役割を果たしていることが示される（５１）。
本発明者らは、ユーイング肉腫の治療における抗ＥＮＧモノクローナル抗体、ＩＴ及びＡＤＣの治療的可能性を仮定する。
インビトロ研究のためにユーイング肉腫の１４種類の細胞株モデルを開発し、並びにユーイング肉腫の治療のための治療分子のスクリーニング及び特徴付けのためにそれらの対応する異種移植モデルを開発した。ＥＮＧ発現を全１４種類の細胞株、及び調べた全てのヒトのユーイング肉腫患者試料（ｎ＝１０）で確認した。
本明細書で引用した全ての参考文献は、各個々の刊行物又は特許もしくは特許出願が参照によりその全体が具体的かつ個々に組み込まれることが示されるのと同程度に、その全体が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の具体的な実施形態は、限定するものではなく、例として提供される。本明細書の任意のサブタイトルは、便宜上含まれており、決して本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。

Claims (91)

  1. 式Ｉ：
    Ａ−（Ｌ−Ｄ）Ｐ（Ｉ）
    （式中、
    Ａは、エンドグリンに選択的に結合する抗体であり；
    Ｌはリンカーであり；
    Ｄは、細胞溶解素又はニグリン−ｂのＡ鎖を含む薬物であり；
    ｐは１〜１０である）
    を有する複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
  2. Ａが、ヒトエンドグリンの細胞外領域に選択的に結合するモノクローナル抗体又はその結合断片である、請求項１に記載の複合体。
  3. Ａが、以下のアミノ酸配列：
    （ｉ）ＣＤＲＨ１：配列番号７、又は配列番号７の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
    （ｉｉ）ＣＤＲＨ２：配列番号８、又は配列番号８の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
    （ｉｉｉ）ＣＤＲＨ３：配列番号９、又は配列番号９の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
    （ｉｖ）ＣＤＲＬ１：配列番号１０、又は配列番号１０の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
    （ｖ）ＣＤＲＬ２：配列番号１１、又は配列番号１１の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
    （ｖｉ）ＣＤＲＬ３：配列番号１２、又は配列番号１２の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体、
    を有する重鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＨ１〜３）及び軽鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＬ１〜３）を含む、請求項２に記載の複合体。
  4. ＣＤＲＨ１〜３が、それぞれ配列番号７〜９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ１〜３が、それぞれ配列番号１０〜１２のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の複合体。
  5. Ａが、配列番号５の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
  6. Ａが、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項５に記載の複合体。
  7. Ａが、配列番号６の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
  8. Ａが、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項７に記載の複合体。
  9. Ａが、配列番号３の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体。
  10. Ａが、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項９に記載の複合体。
  11. Ａが、配列番号４の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
  12. Ａが、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１１に記載の複合体。
  13. Ａが、固定化した組換えヒトエンドグリンへの結合について、配列番号３の重鎖アミノ酸配列及び配列番号４の軽鎖アミノ酸配列を有する抗ヒトエンドグリンＩｇＧ１抗体と競合する、請求項１又は請求項２に記載の複合体。
  14. Ａが、マウスエンドグリンの細胞外領域に選択的に結合するモノクローナル抗体又はその結合断片である、請求項１に記載の複合体。
  15. Ａが、以下のアミノ酸配列：
    （ｉ）ＣＤＲＨ１：配列番号１９、又は配列番号１９の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
    （ｉｉ）ＣＤＲＨ２：配列番号２０、又は配列番号２０の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
    （ｉｉｉ）ＣＤＲＨ３：配列番号２１、又は配列番号２１の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
    （ｉｖ）ＣＤＲＬ１：配列番号２２、又は配列番号２２の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
    （ｖ）ＣＤＲＬ２：配列番号２３、又は配列番号２３の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
    （ｖｉ）ＣＤＲＬ３：配列番号２４、又は配列番号２４の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体、
    を有する重鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＨ１〜３）及び軽鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＬ１〜３）を含む、請求項１４に記載の複合体。
  16. ＣＤＲＨ１〜３が、それぞれ配列番号１９〜２１のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ１〜３が、それぞれ配列番号２２〜２４のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の複合体。
  17. Ａが、配列番号１７の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の複合体。
  18. Ａが、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１７に記載の複合体。
  19. Ａが、配列番号１８の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の複合体。
  20. Ａが、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１９に記載の複合体。
  21. Ａが、配列番号１５の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の複合体。
  22. Ａが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項２１に記載の複合体。
  23. Ａが、配列番号１６の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の複合体。
  24. Ａが、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２３に記載の複合体。
  25. Ａが、固定化した組換えマウスエンドグリンへの結合について、配列番号１５の重鎖アミノ酸配列及び配列番号１６の軽鎖アミノ酸配列を有する抗マウスエンドグリンＩｇＧ１抗体と競合する、請求項１又は請求項１４に記載の複合体。
  26. Ｄが、式ＩＶ：
    （式中、
    Ｒ２は、（ｉ）リンカーＬに直接又は間接的に結合しているか、又は（ｉｉ）Ｈであるか、もしくはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
    Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり;
    Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２ＯＲ１９又はＣＨ２ＯＣＯＲ２０であり、式中、Ｒ１９はアルキルであり、Ｒ２０はＣ２〜Ｃ６アルケニル、フェニル、又はＣＨ２−フェニルであり；
    Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
    Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル又はＯ−アセチルであり；
    ｆは１又は２であり；
    Ｒ１１は、以下の構造：
    （式中、
    Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、アルキルオキシ、フェニル、アルキルアミノ又はジアルキルアミノであり；
    Ｒ１６は、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６−アルキル基であり；
    Ｒ１７は、（ｉ）リンカーＬに直接又は間接的に結合しているか、又は（ｉｉ）ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１８、ＣＯＮＨＮＨ２、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、又は必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル又はヘテロシクロアルキルの基であり、式中、Ｒ１８は、必要に応じて置換されたアルキル、ヘテロアルキル、又はヘテロシクロアルキルの基であり；かつ
    ｑは０、１、２又は３である）を有し、その中の用語「必要に応じて置換された」が、１個又は複数個のＨ原子がＦ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ又はＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２もしくはＮＯ２で置換することができる基に関し、用語「必要に応じて置換された」が、さらに、非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ９ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ９ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキル又はＣ２〜Ｃ１１ヘテロアラルキルの基で排他的に又は追加的に置換することができる基に関する）
    の細胞溶解素である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の複合体。
  27. Ｒ２がリンカーＬとの結合である、請求項２６に記載の複合体。
  28. Ｒ１７が、Ｃ（Ｏ）Ｘ、ＣＯＮＨＮＨＸ、ＯＸ、ＮＨＸ又はＳＸであり、ＸがリンカーＬとの結合である、請求項２６に記載の複合体。
  29. リンカーＬが、さらにスペーサーを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の複合体。
  30. 前記スペーサーが２〜３０個の原子の鎖長を有する、請求項２９に記載の複合体。
  31. 前記スペーサーが、アルキレン（すなわち、二価アルキル）基もしくはヘテロアルキレン（すなわち、二価ヘテロアルキル）基を含むか、又はそれらからなる、請求項２９又は請求項３０に記載の複合体。
  32. 前記スペーサーが、アルキレン基もしくはオキシアルキレン基を含むか、又はそれらからなる、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の複合体。
  33. 前記スペーサーが、基−（ＣＨ２）ｎ−もしくは−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−を含むか、又はそれらからなり、式中、ｎは１以上である、請求項３２に記載の複合体。
  34. 前記スペーサーが、基−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−を含むか、又はそれらからなり、式中、ｎは１以上である、請求項３３に記載の複合体。
  35. ｎが、１〜１５、１〜１０、１〜６、又は２〜５である、請求項３３又は請求項３４に記載の複合体。
  36. ｎが、３又は４である、請求項３５に記載の複合体。
  37. 前記スペーサーが、基Ｒ１７に直接結合しているか、又は架橋基を介して基Ｒ１７に結合している、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の複合体。
  38. 前記スペーサーが、−Ｃ（Ｏ）Ｘ架橋基を介して基Ｒ１７に結合しており、ＸがＲ１７との結合である、請求項３７に記載の複合体。
  39. Ｒ１７がＣＯＮＨＮＨＸであり、前記スペーサーが、−Ｃ（Ｏ）Ｘ架橋基を介して基Ｒ１７に結合しており、ＸがスペーサーとＲ１７の間の結合を表す、請求項３８に記載の複合体。
  40. Ｒ１７がＣＯＮＨＮＨＸであり、前記スペーサーが、−Ｃ（Ｏ）Ｘ架橋基を介して基Ｒ１７に結合した−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎ＝２、３又は４である、請求項３９に記載の複合体。
  41. Ｄが、以下の構造：
    を有する細胞溶解素を含む、請求項２６に記載の複合体。
  42. Ｄが、以下の構造：
    を有する細胞溶解素を含む、請求項２６に記載の複合体。
  43. Ｌが、Ａとの結合のための結合基及びプロテアーゼ切断可能な部分を含む、請求項２６〜４２のいずれか一項に記載の複合体。
  44. Ｌが、バリン−シトルリン単位を含む、請求項４３に記載の複合体。
  45. Ｌが、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメートを含む、請求項４４に記載の複合体。
  46. マレイミドの二重結合が、抗体ＡへのリンカーＬの連結を達成するために、抗体Ａのシステイン残基のチオール基と反応して、硫黄−炭素結合を形成する、請求項４５に記載の複合体。
  47. −Ｌ−Ｄが、
    からなる群から選択される構造を有する、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の複合体。
  48. −Ｌ−Ｄが、以下の構造：
    を有する、請求項４７に記載の複合体。
  49. −Ｌ−Ｄが、以下の構造：
    を有する、請求項２６に記載の複合体。
  50. −Ｌ−Ｄが、以下の構造：
    を有する、請求項２６に記載の複合体。
  51. ｐが、１、２、３、４又は５である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の複合体。
  52. Ｄが、ニグリン−ｂのＢ鎖を含まないニグリン−ｂのＡ鎖である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の複合体。
  53. 前記ニグリン−ｂのＡ鎖のアミノ酸配列が、配列番号２５の配列を含むか又はそれからなる、請求項５２に記載の複合体。
  54. 前記ニグリン−ｂのＡ鎖が、細菌宿主細胞中で組換え生成される、請求項５２又は請求項５３に記載の複合体。
  55. Ｌが、ジスルフィド結合を含むか、又はジスルフィド結合である、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の複合体。
  56. ｐが１〜５である、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の複合体。
  57. 医薬で使用するための、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の複合体。
  58. 哺乳動物対象の腫瘍の治療方法で使用するための、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の複合体。
  59. 前記複合体が、１種以上の他の抗腫瘍薬と同時投与、逐次投与又は別々の投与のためのものである、請求項５８に記載の使用のための複合体。
  60. 前記１種以上の他の抗腫瘍薬が、細胞傷害性化学療法剤又は抗血管新生剤又は免疫療法剤を含む、請求項５９に記載の使用のための複合体。
  61. 前記１種以上の他の抗腫瘍薬が、ゲムシタビン、アブラキサン、ベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、抗ＰＤ−１分子又は抗ＰＤ−Ｌ１分子を含む、請求項６０に記載の使用のための複合体。
  62. 前記抗ＰＤ−１分子又は抗ＰＤ−Ｌ１分子がニボルマブ又はペンブロリズマブを含む、請求項６１に記載の使用のための複合体。
  63. 前記腫瘍が血液腫瘍である、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
  64. 前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項５８〜６２のいずれか一項に記載の使用のための複合体。
  65. 前記治療が膵臓癌、ユーイング肉腫、乳癌、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、卵巣癌、膀胱癌又は結腸癌の治療である、請求項６４に記載の使用のための複合体。
  66. 哺乳動物対象の腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の治療有効量の複合体を投与することを含む方法。
  67. 前記複合体が、１種以上の他の抗腫瘍薬と同時に、連続して又は別々に投与される、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記１種以上の他の抗腫瘍薬が、細胞傷害性化学療法剤又は抗血管新生剤又は免疫療法剤を含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記１種以上の他の抗腫瘍薬が、ゲムシタビン、アブラキサン、ベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、抗ＰＤ−１分子又は抗ＰＤ−Ｌ１分子を含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記抗ＰＤ−１分子又は抗ＰＤ−Ｌ１分子がニボルマブ又はペンブロリズマブを含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記腫瘍が血液腫瘍である、請求項６６〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項６６〜７０のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記腫瘍が、膵臓癌、ユーイング肉腫、乳癌、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、卵巣癌、膀胱癌又は結腸癌の腫瘍である、請求項７２に記載の方法。
  74. エンドグリン特異的抗体を含む抗体−薬物複合体の調製における、請求項２６〜５１のいずれか一項に記載の細胞溶解素の使用。
  75. 前記エンドグリン特異的抗体が、請求項２〜２５のいずれか一項に記載のものである、請求項７４に記載の使用。
  76. 前記ニグリン−ｂのＢ鎖を含まない、単離したニグリン−ｂのＡ鎖。
  77. 前記ニグリン−ｂのＡ鎖のアミノ酸配列が、配列番号２５の配列を含むか、又はそれからなる、請求項７６に記載の単離したニグリン−ｂのＡ鎖。
  78. 免疫毒素の調製における、請求項７６又は請求項７７に記載の単離したニグリン−ｂのＡ鎖の使用。
  79. 前記免疫毒素がエンドグリン特異的抗体を含む、請求項７８に記載の使用。
  80. 前記エンドグリン特異的抗体が、請求項２〜２５のいずれか一項に記載のものである、請求項７９に記載の使用。
  81. （ｉ）選択的にヒトエンドグリンに結合し、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むか、又は
    （ｉｉ）選択的にマウスエンドグリンに結合し、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、
    ヒトモノクローナル抗体。
  82. 医薬において使用するための、請求項８１に記載の抗体。
  83. 炎症状態又は眼疾患の治療法で使用するための、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の複合体又は請求項８１に記載の抗体。
  84. 哺乳動物対象における炎症状態又は眼疾患の治療法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の治療有効量の複合体又は請求項８１に一項に記載の治療有効量の抗体を投与することを含む方法。
  85. 前記炎症状態が関節リウマチであり；かつ／又は
    前記眼疾患が糖尿病性網膜症又は黄斑変性症である、
    請求項８３に記載の使用のための複合体もしくは抗体又は請求項８４に記載の方法。
  86. 抗体−薬物複合体又は免疫毒素の調製における、請求項８１に記載のモノクローナル抗体の使用。
  87. 配列番号１〜６、１３〜１８及び２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞。
  88. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号２６の核酸配列を含む、請求項８７に記載の宿主細胞。
  89. 請求項５２〜５６のいずれか一項に記載の複合体の生成プロセスであって、
    （ａ）少なくとも１個のスルフヒドリル基を導入するために、エンドグリンに選択的に結合する抗体を誘導体化すること；かつ
    （ｂ）前記抗体と前記ニグリン−ｂのＡ鎖の間でジスルフィド結合の形成を可能にする条件下で、前記誘導体化抗体とニグリン−ｂのＡ鎖を反応させ、それにより前記複合体を生成すること；並びに
    （ｃ）必要に応じて、前記複合体を精製し、かつ／又は単離すること
    を含む方法。
  90. 工程（ａ）が、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−ジチオプロピオネート）（ＳＰＤＰ）又はメチル−４−メルカプトブチルイミデートと前記抗体を反応させることを含む、請求項８９に記載のプロセス。
  91. 請求項２６〜５１のいずれか一項に記載の複合体の生成プロセスであって、
    （ａ）エンドグリンに選択的に結合する抗体を、チオール基を介して前記リンカーに連結すること；かつ
    （ｂ）前記リンカーに前記細胞溶解素を連結すること；並びに
    （ｃ）必要に応じて、前記複合体を精製し、かつ／又は単離すること
    を含み、工程（ａ）及び（ｂ）は、いずれの順序でも実行することができるプロセス。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017214419A (ja) * 2017-08-18 2017-12-07 学校法人関西医科大学 白血病改善剤
WO2019031615A1 (ja) * 2017-08-10 2019-02-14 大日本住友製薬株式会社 ヘミアスタリン誘導体及びこれらの抗体薬物複合体
WO2019031614A1 (ja) * 2017-08-10 2019-02-14 大日本住友製薬株式会社 ヘミアスタリン誘導体を含む抗体薬物複合体

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017537084A (ja) 2014-11-12 2017-12-14 トラコン ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッド 抗エンドグリン抗体及びその用途
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
US11229708B2 (en) 2015-12-04 2022-01-25 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
WO2018187158A1 (en) * 2017-04-07 2018-10-11 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy of cancer with anti-endoglin antibodies and anti-programmed death receptor agents
WO2018222882A1 (en) * 2017-06-01 2018-12-06 Health Research, Inc. Strong potentiation of immune checkpoint blockade therapy of cancer by combination with endoglin-targeting therapy
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
WO2024081820A1 (en) 2022-10-13 2024-04-18 Sana Biotechnology, Inc. Viral particles targeting hematopoietic stem cells

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008138561A1 (en) * 2007-05-10 2008-11-20 R & D Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysine derivatives
JP2010521485A (ja) * 2007-03-14 2010-06-24 エンドサイト，インコーポレイテッド 結合性リガンドが結合したツブリシンの薬剤送達結合体

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5776427A (en) * 1992-03-05 1998-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US7097836B1 (en) * 2002-10-23 2006-08-29 Health Research, Inc. Method for increasing the efficacy of anti-tumor agents by anti-endoglin antibody
US8221753B2 (en) * 2009-09-30 2012-07-17 Tracon Pharmaceuticals, Inc. Endoglin antibodies
CN102596922A (zh) 2009-10-06 2012-07-18 免疫基因公司 有效的缀合物和亲水性连接体
MY171008A (en) * 2011-03-29 2019-09-23 Immunogen Inc Preparation of maytansinoid antibody conjugates by a one-step process
US9255595B2 (en) * 2011-04-29 2016-02-09 Bae Systems Information And Electronic Systems Integration Inc. Optical dome bezel
AU2012348017A1 (en) 2011-12-05 2014-07-03 Igenica Biotherapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods
HUE048574T2 (hu) 2012-07-12 2020-08-28 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Sejthez kötõdõ molekulák citotoxikus szerekkel képzett konjugátumai
WO2015113760A1 (en) 2014-01-28 2015-08-06 Tube Pharmaceuticals Gmbh Cytotoxic tubulysin compounds for conjugation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010521485A (ja) * 2007-03-14 2010-06-24 エンドサイト，インコーポレイテッド 結合性リガンドが結合したツブリシンの薬剤送達結合体
WO2008138561A1 (en) * 2007-05-10 2008-11-20 R & D Biopharmaceuticals Gmbh Tubulysine derivatives

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL COMMUNICATION, vol. 317, JPN6019001205, 2004, pages 515 - 521, ISSN: 0003959672 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019031615A1 (ja) * 2017-08-10 2019-02-14 大日本住友製薬株式会社 ヘミアスタリン誘導体及びこれらの抗体薬物複合体
WO2019031614A1 (ja) * 2017-08-10 2019-02-14 大日本住友製薬株式会社 ヘミアスタリン誘導体を含む抗体薬物複合体
JPWO2019031614A1 (ja) * 2017-08-10 2020-07-16 大日本住友製薬株式会社 ヘミアスタリン誘導体を含む抗体薬物複合体
JPWO2019031615A1 (ja) * 2017-08-10 2020-07-16 大日本住友製薬株式会社 ヘミアスタリン誘導体及びこれらの抗体薬物複合体
JP2023038189A (ja) * 2017-08-10 2023-03-16 住友ファーマ株式会社 ヘミアスタリン誘導体を含む抗体薬物複合体
US11795195B2 (en) 2017-08-10 2023-10-24 Sumitomo Pharma Co., Ltd. Antibody-drug conjugates including hemiasterlin derivative
JP2017214419A (ja) * 2017-08-18 2017-12-07 学校法人関西医科大学 白血病改善剤
WO2019035241A1 (ja) * 2017-08-18 2019-02-21 学校法人関西医科大学 白血病改善剤

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