ES2701188T3 - Conjugados anticuerpo-fármaco e inmunotoxinas - Google Patents

Conjugados anticuerpo-fármaco e inmunotoxinas Download PDF

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Klaus Pfizenmaier
Cristina Ferrer
Myriam Fabre
Laureano Simon
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Oncomatryx Biopharma SL
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Abstract

Un conjugado anticuerpo-farmaco que tiene la formula I: A-(L-D)p (I) o una sal o un solvato farmaceuticamente aceptables del mismo, en donde: A es un anticuerpo que se une de manera selectiva a la endoglina; L es un enlazador; p es de 1 a 10; y D es un farmaco que comprende una citolisina de formula IV:**Fórmula** en donde: R2 es H o alquilo C1-C4; R6 es alquilo C1-C6; R7 es alquilo C1-C6, CH2OR19 o CH2OCOR20, en donde R19 es alquilo, R20 es alquenilo C2-C6, fenilo o CH2- fenilo; R9 es alquilo C1-C6; R10 es H, OH, O-alquilo u O-acetilo; f es 1 o 2; R11 tiene la siguiente estructura**Fórmula** en donde R21 es H, OH, halogeno, NH2, alquiloxi, fenilo, alquilamino o dialquilamino; R16 es H o un grupo alquilo C1-C6; R17 esta unido directa o indirectamente al enlazador L; y q es 0, 1, 2 o 3.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados anticuerpo-fármaco e inmunotoxinas
Campo de la invención
La presente invención se refiere a conjugados anticuerpo-fármaco (CAF) e inmunotoxinas que se dirigen a la endoglina (ENG) y a su uso en medicina, por ejemplo, en el tratamiento de determinados cánceres.
Antecedentes de la invención
Los tumores epiteliales malignos son la causa principal de muertes humanas relacionadas con el cáncer. Estos tumores sólidos con frecuencia presentan reacciones estromales significativas tales como el denominado "estroma desmoplásico" o "estroma reactivo", que representa el 20-60 % de la masa tumoral total y se caracteriza por la existencia de grandes cantidades de células estromales y una matriz extracelular densa (MEC). Los estudios recientes han indicado las funciones promotoras de las células estromales, tal como se ejemplifica mediante las células vasculares, las células inmunitarias, los fibroblastos, los miofibroblastos, los adipocitos y las células precursoras que derivan de la médula ósea (1-6). En particular, a menudo se observa un número considerable de fibroblastos asociados al cáncer (FAC) en el estroma asociado al tumor de diversos cánceres humanos, incluyendo carcinomas de mama, de pulmón, de colon y de páncreas (14, 15). Interactuando de manera coordinada con los diferentes componentes del estroma, los FAC tienen la capacidad de promover la neoangiogénesis y el crecimiento tumoral; también se ha demostrado que los FAC son cruciales para el desarrollo de tumores agresivos y la invasión durante la progresión del cáncer (16-25); los FAC facilitan la difusión y la infiltración de células tumorales en órganos alejados, contribuyendo de este modo a la formación de metástasis. De manera importante, también se ha indicado la relevancia de las células estromales en el fracaso de la administración sistémica del fármaco a los tumores y al desarrollo de la resistencia al fármaco (7-11). La identificación de dianas celulares y moleculares que anulan las interacciones de células estromalescélulas tumorales y, por lo tanto, que atenúan la tumorigénesis es actualmente uno de los temas en oncología traslacional. De hecho, el direccionamiento al estroma peritumoral es una estrategia bastante nueva para tratar tumores metastásicos, que representan más del 90 % de la mortalidad de los pacientes de cáncer: solo unos pocos productos han obtenido la aprobación terapéutica hasta la fecha, siendo la mayoría de ellos fármacos antiangiogénicos (Avastin®; 26). La identificación y el direccionamiento hacia otras nuevas moléculas en el microambiente tumoral es, por lo tanto, esencial para aumentar la eficacia de las terapias convencionales en combinación con las estrategias terapéuticas basadas en el estroma, y representa una poderosa estrategia para el tratamiento del cáncer y de la metástasis (12, 13).
Los fármacos basados en anticuerpos monoclonales (MAb) representan una gran promesa en la lucha frente al cáncer. Esto se debe a que permiten que el tratamiento se dirija a nivel molecular de una forma precisa y específica. Estas ventajas, junto con su atractivo comercial (tienen cortos períodos de desarrollo, competencia restringida y son fácilmente exportables a otros tipos de cánceres una vez que se han aprobado), han empujado a muchas compañías farmacéuticas a invertir en el desarrollo de nuevas moléculas basadas en anticuerpos, así como en la concesión de licencias de nuevas moléculas o tecnologías de compañías de biotecnología.
Sin embargo, a pesar del éxito clínico de los anticuerpos terapéuticos, los MAb no marcados que se dirigen a los antígenos tumorales de superficie celular raramente presentan una eficacia suficiente por sí mismos. Para aumentar la baja actividad de los MAb, las nuevas estrategias se centran en unirlos a moléculas tóxicas. Las toxinas vegetales y bacterianas, así como pequeñas moléculas quimioterapéuticas pueden ser buenos candidatos, dado que son muy potentes y activos en muy pequeñas cantidades.
El campo de las inmunotoxinas (IT) y de los conjugados anticuerpo-fármaco (CAF) para el tratamiento del cáncer ha experimentado recientemente una creciente actividad de desarrollo por las compañías farmacéuticas, debido a los avances tecnológicos realizados durante los últimos años, centrados en resolver los problemas que inicialmente presentaban sobre inmunogenicidad, toxicidad indeseable, producción, semivida y resistencia.
Los inmunoconjugados están hechos de un anticuerpo recombinante humano, humanizado o quimérico, unido covalentemente a un fármaco citotóxico. La meta principal de tal estructura es unir el poder de los citotóxicos pequeños (300 a 1000 Da) y la alta especificidad de los MAb dirigidos al antígeno asociado al tumor (AAT).
El Ab (del inglés antibody, anticuerpo) debe ser muy selectivo para alcanzar el antígeno, cuya expresión debe estar restringida en células normales. El Ab también se debe internalizar de manera eficaz en las células cancerosas.
El agente citotóxico seleccionado como el resto efector debe eliminar las células solo tras la internalización y liberarse en el citoplasma celular. Las cargas útiles más comúnmente usadas en los CAF son fármacos que dañan el ADN tales como las caliqueamicinas, duocarmicinas o compuestos que se dirigen a los microtúbulos como auristatinas y matansinoides.
Los enlazadores de Ab-citotóxico se diseñan para que sean sistémicamente estables y para liberar el citotóxico en las células diana.
Los AAT normalmente son proteínas de membrana celular que se sobreexpresan en tejidos enfermos o que al menos se expresan lo suficiente como para facilitar la citotoxicidad activada por la internalización. Idealmente, el antígeno presenta una expresión restringida en tejidos normales con una expresión baja o ausente en los órganos vitales. Además, el antígeno tumoral se debe reconocer de manera selectiva y con alta afinidad por un Ab.
Los estudios recientes sugieren que los agentes terapéuticos diseñados para inhibir la vía de señalización de TGF-p en la interfase tumor-estroma podría evitar la progresión del cáncer, mejorando el pronóstico y el tratamiento. La familia del correceptor de TGF-p está surgiendo como una diana para los tratamientos de cáncer que actúa sobre el tumor o sobre su neovasculatura. La endoglina (ENG, CD105), una proteína accesoria del complejo de receptor de TGF-p de tipo II, es parte de esta familia y presenta las siguientes características:
Proteína de membrana homodímera de tipo I
Proteína asociada a la angiogénesis de superficie celular y neovascularización en muchos tipos de cánceres Sobreexpresada en las células de la microvasculatura del tumor, específicamente en áreas angiogénicas del tumor Sin expresión en endotelio de tejido normal
Niveles plasmáticos correlacionados con metástasis de mama
Internalización
Accesibilidad óptima del torrente sanguíneo
Se han documentado anticuerpos anti-ENG (por ejemplo, scFv) y se ha descrito su aplicación en estrategias de direccionamiento de estroma tumoral. La unión específica, la internalización celular y los efectos antitumorales de inmunoliposomas anti-ENG cargados con doxorrubicina se han documentado in vitro, usando células ENG+, e in vivo en ratones. Los conjugados dirigidos a ENG de anticuerpos anti-EMG y ricina o nigrina b natural se han evaluado en modelos de tumor de ratones (27-36).
El documento WO 2012/135517 A2 describe métodos para la preparación de conjugados anticuerpo-fármaco.
Ferreras et al., Toxins, 2011, Vol.3, pp. 420-441, describen el uso de las proteínas de inactivación de ribosoma de Sambucus en la construcción de inmunotoxinas y otros conjugados para la terapia del cáncer.
Challner, "Site-Specific Conjugation...", PharmTech 13 Nov. 213 (cita de internet) describe tecnologías de conjugación específicas de sitio.
El documento WO 2008/138561 A1 describe "derivados de tubulisina", que son moléculas citotóxicas y su uso para el tratamiento de cáncer y de otros trastornos.
Van Gorp et al., Eur, J. Biochem., Vol.237, pp. 505-513, describen la caracterización y la clonación molecular de la nigrina b, una proteína de inactivación de ribosoma de tipo 2 específica de GalNAc.
El documento WO 2010/126551 A1 describe la modificación de enlazadores que unen los fármacos a los agentes de unión celular, a enlazadores hidrófilos, dando como resultado una potencia mejorada en varios tipos de células cancerosas.
Gilabert-Oriol et al., Current Pharmaceutical Design, 2014, Vol. 20, N.° 42, pp. 6584-6643, describe inmunotoxinas construidas con proteínas de inactivación de ribosomas, y la mejora en la utilidad terapéutica de las mismas usando potenciadores de escape endosomal.
A pesar de estos avances, permanece una necesidad no cumplida de estrategias terapéuticas adicionales para el tratamiento de tumores, incluyendo tumores epiteliales, y de componentes para su uso en tales estrategias terapéuticas. La presente invención abarca estas y otras necesidades.
Breve descripción de la invención
En términos generales, la presente invención se refiere a conjugados anticuerpo anti-ENG - fármaco tal como se define en la reivindicación 1. En particular, los presentes inventores han descubierto que los anticuerpos anti-ENG tal como se describen en el presente documento, presentan una unión altamente específica y una internalización rápida y eficaz.
Los derivados de citolisina se conjugan de manera ventajosa con anticuerpos anti-ENG para su uso en el tratamiento de tumores.
En consecuencia, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco que tiene la fórmula I:
A-(L-D)p (I)
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
A es un anticuerpo que se une de manera selectiva a la endoglina;
L es un enlazador;
p es de 1 a 10; y
D es un fármaco que comprende una citolisina de fórmula IV:
Figure imgf000004_0001
en donde:
R(i) 2 *es H o alquilo C1-C4 ;
R6 es alquilo C1-C6 ;
R7 *es alquilo C1-C6 , CH2OR19 o CH2OCOR20 , en donde R19 es alquilo, R20 es alquenilo C2-C6 , fenilo o CH2-fenilo;
R9 es alquilo C1-C6 ;
R10 es H, OH, O-alquilo u O-acetilo;
f es 1 o 2;
R11 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000004_0002
en donde
R21 es H, OH, halógeno, NH2 , alquiloxi, fenilo, alquilamino o dialquilamino;
R16 es H o un grupo alquilo C1-C6 ;
R17 está unido directa o indirectamente al enlazador L; y
q es 0, 1,2 o 3.
En algunos casos, de acuerdo con esto y otros aspectos de la presente invención, A es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al mismo que se une de manera selectiva a una región extracelular de la endoglina humana. En casos particulares, A puede comprender las regiones determinantes de complementariedad 1-3 de la cadena pesada (CDRH1-3) y las regiones determinantes de complementariedad 1-3 de la cadena ligera (CDRL1-3) que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:
(i) CDRH1: la SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 7;
(ii) CDRH2: la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 8;
(iii) CDRH3: la SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 9;
(iv) CDRL1: la SEQ ID NO: 10 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 10;
(v) CDRL2: la SEQ ID NO: 11 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 11; y
(vi) CDRL3: la SEQ ID NO: 12 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 12.
En determinados casos, las CDRH1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 7-9, respectivamente, y las CDRL1-3 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 10-12, respectivamente.
En determinados casos, A comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, el 95 % o el 99 % de identidad con la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO: 5.
En determinados casos, A comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.
En determinados casos, A comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, el 95 % o el 99 % de identidad con la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO: 6. En particular, A puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
En determinados casos, A comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, el 95 % o el 99 % de identidad con la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO: 3. En particular, A puede comprender una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
En determinados casos, A comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, el 95 % o el 99 % de identidad con la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO: 4. En particular, A puede comprender una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
En determinados casos, A puede ser un anticuerpo anti-endoglina de unión competitiva que es estructuralmente diferente de las moléculas de anticuerpo anti-endoglina que se ejemplifican en el presente documento. Por ejemplo, A puede ser una molécula de anticuerpo anti-endoglina que compite con el anticuerpo IgG1 anti-endoglina humana, identificado en el presente documento como "A5", por la unión a endoglina humana recombinante inmovilizada. A5 tiene la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 3 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4.
En determinados casos, A es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo que se une de manera selectiva a una región extracelular de endoglina de murino. Los conjugados anticuerpo-fármaco que se dirigen a la endoglina de murino encuentran un uso particular en ensayos preclínicos, por ejemplo, empleo de modelos de murino bien caracterizados de diversos cánceres. En particular, A puede comprender las regiones determinantes de complementariedad 1-3 de la cadena pesada (CDRH1-3) y las regiones determinantes de complementariedad 1-3 de la cadena ligera (CDRL1-3) que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:
(i) CDRH1: la SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 19;
(ii) CDRH2: la SEQ ID NO: 20 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 20;
(iii) CDRH3: la SEQ ID NO: 21 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 21;
(iv) CDRL1: la SEQ ID NO: 22 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 22;
(v) CDRL2: la SEQ ID NO: 23 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 23; y
(vi) CDRL3: la SEQ ID NO: 24 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 24. Por ejemplo, las CDRH1-3 pueden comprender las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 19-21, respectivamente, y las CDRL1-3 pueden comprender las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 22-24, respectivamente.
En determinados casos, A comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, el 95 % o el 99 % de identidad con la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO: 17, por ejemplo, A puede comprender una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
En determinados casos, A comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, el 95 % o el 99 % de identidad con la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO: 18, por ejemplo, A puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
En determinados casos, A comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, el 95 % o el 99 % o incluso el 100 % de identidad con la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO: 15.
En determinados casos, A comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 %, el 95 % o el 99 % o incluso el 100 % de identidad con la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO: 16.
En determinados casos, A puede ser un anticuerpo anti-endoglina de unión competitiva que es estructuralmente diferente de las moléculas de anticuerpo anti-endoglina que se ejemplifican en el presente documento. Por ejemplo, A puede ser una molécula de anticuerpo anti-endoglina que compite con el anticuerpo IgG1 anti-endoglina de murino, identificado en el presente documento como "mE12", por la unión a la endoglina de murino recombinante inmovilizada. El mE12 tiene la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 16.
De acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención, D comprende una citolisina de fórmula IV:
Figure imgf000006_0001
en donde:
R2 H o es alquilo C1-C4 ;
R6 es alquilo C1-C6;
R7 es alquilo C1-C6 , CH2OR19 o CH2OCOR20, en donde R19 es alquilo, R20 es alquenilo C2-C6 , fenilo o CH2-fenilo; R9 es alquilo C1-C6;
R10 es H, OH, O-alquilo u O-acetilo;
f es 1 o 2;
R11 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000006_0002
en donde
R21 es H, OH, halógeno, NH2, alquiloxi, fenilo, alquilamino o dialquilamino;
R16 es H o un grupo alquilo C1-C6 ;
R17 está unido directa o indirectamente al enlazador L; y
q es 0, 1, 2 o 3.
En algunos casos, R17 es C(O)X, CONHNHX, OX, NHX o SX, en donde X es un enlace al enlazador L.
En algunos casos, el enlazador L puede comprender adicionalmente un espaciador.
En algunos casos, el espaciador tiene una longitud de cadena de 2 a 30 átomos.
En algunos casos, el espaciador comprende o consiste en un grupo alquileno (es decir, alquilo divalente) o heteroalquileno (es decir, heteroalquilo divalente). En algunos casos, el espaciador comprende o consiste en un grupo alquileno u oxialquileno.
En algunos casos, el espaciador comprende o consiste en un grupo -(CH2)n- o -(OCH2CH2V , en donde n > 1.
En algunos casos, el espaciador comprende o consiste en un grupo -(OCH2CH2V , en donde n > 1. En particular, n puede ser 1 a 15, 1 a 10, 1 a 6, o 2 a 5. Por ejemplo, n puede ser 3 o 4.
En algunos casos, el espaciador comprende entre una y seis unidades de etilenglicol, por ejemplo, un trietilenglicol. En algunos casos, el espaciador puede unirse directamente al grupo R17, o se puede unir al grupo R17 a través de un grupo puente.
En algunos casos, el espaciador se une al grupo R17 a través de un grupo puente -C(O)X, en donde X es un enlace a R17.
En algunos casos, R17 es CONHNHX y el espaciador está unido al grupo R17 a través de un grupo puente -C(O)X, en donde X representa la unión entre el espaciador y R17.
En algunos casos, R17 es CONHNHX y el espaciador es un -(OCH2CH2V unido a R17 a través de un grupo puente -C(O)X, en donde n = 2, 3 o 4.
En algunos casos, D comprende una citolisina que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000007_0001
En algunos casos, D comprende una citolisina que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000007_0002
En determinados casos, L comprende un grupo de unión para la unión a A y una porción escindible de proteasa. Por ejemplo, L puede comprender una unidad valina-citrulina. En particular, L puede comprender maleimidocaproil-valinacitrulina-p-aminobencilcarbamato.
En algunos casos, el doble enlace de la maleimida reacciona con un grupo tiol de un resto de cisteína del anticuerpo A para formar un enlace azufre-carbono con el fin de efectuar la unión del enlazador L al anticuerpo A.
En algunos casos, -L-D tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste en:
Figure imgf000008_0002
En determinados casos, -L-D puede tener la siguiente estructura:
Figure imgf000008_0001
De acuerdo con esto y otros aspectos de la presente invención, p puede, en algunos casos, estar en el intervalo de 1 a 5, por ejemplo, 1 a 4 o 1 a 3. En casos particulares, p puede ser 1 o 2. En casos particulares, p puede ser 3 o 4.
En un segundo aspecto de la presente invención se proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco tal como se define de acuerdo con el primer aspecto de la invención para su uso en medicina.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpo-fármaco tal como se define de acuerdo con el primer aspecto de la invención para su uso en un método de tratamiento de un tumor en un sujeto mamífero. En determinados casos, el conjugado anticuerpo-fármaco es para su uso en el tratamiento de una neoplasia sanguínea. En determinados casos, el conjugado anticuerpo-fármaco es para su uso en el tratamiento de un tumor sólido. En particular, el conjugado anticuerpo-fármaco puede ser para su uso en el tratamiento de un cáncer de páncreas, sarcoma de Ewing, cáncer de mama, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de vejiga o cáncer de colon.
En algunos casos, el conjugado anticuerpo-fármaco es para la administración simultánea, secuencial o separada con uno o más fármacos antitumorales. Los uno o más fármacos antitumorales comprenden un agente quimioterapéutico citotóxico o un agente anti-angiogénico o un agente inmunoterapéutico. En algunos casos, los uno o más fármacos antitumorales comprenden Gemcitabina, Abraxano bevacizumab, itraconazol, carboximidotriazol, una molécula anti-PD-1 o una molécula anti-PD-LI (por ejemplo, nivolumab o pembrolizumab).
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un conjugado anticuerpo-fármaco del primer aspecto de la invención para su uso en el tratamiento de una afección inflamatoria (por ejemplo, artritis reumatoide) o una enfermedad ocular (por ejemplo, retinopatía diabética, degeneración macular, tales como degeneración macular húmeda relacionada con la edad).
La presente invención incluye la combinación de los aspectos y rasgos preferidos descritos, exceptuando en donde tal combinación sea claramente inaceptable o se indique expresamente que tenga que evitarse. Estos y otros aspectos y realizaciones de la invención se describen con mayor detalle a continuación y con referencia a los ejemplos y figuras adjuntas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra los resultados de ELISA de mE12-IgG para la unión a ENG recombinante de ratón (aa 27­ 581). Se incluyó BSA recubierto como un control negativo. Se observó una unión dependiente de la concentración a la ENG de ratón;
La Figura 2 muestra el análisis de citometría de flujo de la unión de mE12-IgG a a) células B16 usando 50 |jg/ml de anticuerpo, b) células B16 usando 5 jg/m l de anticuerpo, y c) células HT1080 incluidas como control negativo. Zona sombreada: células solas, zona no sombreada: células incubadas con anticuerpo;
La Figura 3 muestra a) ELISA de unión de A5 IgG 1 a la ENG humana recombinante inmovilizada. b) Análisis de citometría de flujo de la unión de A5-IgG a células HT1080;
La Figura 4 muestra el perfil de MALDI-Tof de la cadena A de nigrina b recombinante. Masa observada (Da): 28546,55; Masa esperada (Da): 28546,09; Desviación de la masa: 0,5; Precisión de la masa: 16 ppm.
La Figura 5 muestra la actividad de la proteína inactivadora del ribosoma (RIP) de la cadena A de nigrina b recombinante (recNgA) probada en el lisado sin células de los reticulocitos (RRL, del inglés rabbit reticulocyte cellfree lysates) frente a la nigrina b natural (TS) (3a, 3b, 6c, 9c) representa diferentes formulaciones de recNgA
La Figura 6 muestra la citotoxicidad de recNgA probada en la línea celular HT1080-FAP a través del ensayo de viabilidad de cristal violeta (Nigrina natural - diamantes; cadena A de nigrina b recombinante - cuadrados)
La Figura 7 muestra la actividad de RIP de conjugados de recNgA en un ensayo de nigrina b natural: diamantes (♦); recNgA: cuadrados (■); conjugados de recNgA en HPS-124-37-1 (triángulos: ▲) HPS-124-37-2 (cruces: X)
La Figura 8 muestra la estructura general de conjugado de anticuerpo para un anticuerpo conjugado con citolisina a través de un enlazador vcPABA. La unión de la citolisina puede ser a través de Ri o R4 (identificada mediante flechas)
La Figura 9 muestra el análisis de la internalización de la IgG 1 anti-huENG A5 mediante la discriminación de células (n=10-30) mostrando solo la tinción de membrana (PM), la tinción de PM de intracelular, o solo la tinción intracelular.
La Figura 10 muestra el efecto citotóxico in vitro de los CAF en (A) tipo silvestre (TS) y (B) células HT1080 que expresan el antígeno (AG). La detención de la proliferación celular se evidenció a través de la tinción de cristal violeta tras una incubación de 72 horas de cada compuesto a un intervalo de concentración de 10-6 a 10-12M. Se usó citolisina parental TAM334 como control positivo para la citotoxicidad inespecífica.
La Figura 11 muestra el efecto de inhibición del crecimiento tumoral de inmunoconjugados de recNgA y citolisina.
(A) conjugados de recNgA, administrados como agente único (OMTX505) o en combinación con gemcitabina (OMTX505: GEM); (B) conjugados TAM471 (OMTX705-471) frente a TAM551 (OMTX705-551); (C) conjugados TAM471 (OMTX705-471) y TAM553 (OMTX705-553) frente aTAM558 (OMTX705-558). Vehículo y GEM (Gemcitabina): grupos de control negativo y positivo.
Descripción detallada de la invención
En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende que se definan tal como se indica a continuación.
Endoglina
Tal como se usa, "endoglina" puede ser una proteína de endoglina de cualquier especie de mamífero. En algunos casos, la endoglina es la endoglina humana (también conocida como CD105, ENG o END), cuya secuencia de aminoácidos se desvela en el N.° de registro de UniProt P17813 (Versión 154, con fecha de 13 de noviembre de 2013) (SEQ ID NO: 27). En algunos casos, una molécula que se une a la endoglina (por ejemplo, una molécula de anticuerpo o un conjugado del mismo) se puede unir a una región del dominio extracelular de endoglina. El dominio extracelular de la endoglina humana comprende los restos 26-561 de la proteína de endoglina humana de longitud completa. En algunos casos, la endoglina es la endoglina de murino (también conocida como CD105, antígeno MJ7/18, ENG o END), cuya secuencia de aminoácidos se desvela en el N.° de registro de UniProt Q63961 (Versión 104, con fecha de 13 de noviembre de 2013) (SEQ ID NO: 28). El dominio extracelular de la endoglina de murino comprende los restos 27-581 de la proteína de endoglina de murino de longitud completa.
Conjugado
Tal como se usa en el presente documento, "conjugado" incluye la estructura resultante formada mediante el enlace de moléculas, e incluye específicamente conjugados anticuerpo-fármaco (CAF) e inmunotoxinas (IT).
Se une selectivamente
Las expresiones se une selectivamente y unión selectiva se refieren a la unión de un anticuerpo o la unión de un fragmento del mismo, para una molécula predeterminada (por ejemplo, un antígeno) de una manera específica. Por ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de unión del mismo, se puede unir a la endoglina, por ejemplo, una porción extracelular de la misma, con una afinidad de al menos aproximadamente 1x107M-1, y se puede unir a la molécula predeterminada con una afinidad que es al menos dos veces mayor (por ejemplo, cinco veces o diez veces mayor) que su afinidad por la unión a una molécula que no sea la molécula predeterminada.
Molécula de anticuerpo
Tal como se usa en el presente documento con respecto a todos los aspectos de la invención, el término "anticuerpo" o "molécula de anticuerpo" incluye cualquier inmunoglobulina, bien natural o producida de forma sintética parcialmente o por completo. El término "anticuerpo" o "molécula de anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales (mAb) y anticuerpos policlonales (incluyendo antisueros policlonales). Los anticuerpos pueden estar intactos o ser fragmentos derivados de anticuerpos completos (véase a continuación). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos de origen no humano. "Anticuerpos monoclonales" son poblaciones homogéneas de anticuerpos altamente específicos dirigidos frente a un único sitio antigénico o "determinante" de la molécula diana. Los "anticuerpos policlonales" incluyen las poblaciones heterogéneas de anticuerpos que se dirigen frente a diferentes determinantes antigénicos de la molécula diana. El término "antisuero" o "antisueros" se refiere a suero sanguíneo que contiene anticuerpos obtenidos de animales inmunizados.
Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de unir antígenos. Por lo tanto, la referencia a anticuerpos en el presente documento y con referencia a los métodos, conjuntos y kits de la invención, abarca un anticuerpo completo y también abarca cualquier polipéptido o proteína que comprende un fragmento de unión de anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1 ; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VHy Ch1 ; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios Vl y Vh de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb que consiste en un dominio Vh; (v) las regiones CDR aisladas; (vi) los fragmentos F(ab')2 , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moléculas Fv monocatenarias (scFv), en las que un dominio Vh y un dominio Vl están unidos por un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno; (viii) dímeros Fv de cadena simple (WO 93/11161) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión génica (WO94/13804; 58). Las moléculas de Fv, scFv o diacuerpo se pueden estabilizar mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL. También se pueden preparar minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3.
En relación con una molécula de anticuerpo, La expresión "se une de manera selectiva" se puede usar en el presente documento para referirse a la situación en la que un miembro de un par de unión específica no presentará ninguna unión significativa a otras moléculas que no sean sus miembros de unión específica. La expresión también se puede aplicar cuando, por ejemplo, un sitio de unión a antígeno es específico para un epítopo particular que lo llevan una serie de antígenos, en cuyo caso, el miembro de unión específica que lleva el sitio de unión a antígeno será capaz de unirse a los diversos antígenos que llevan el epítopo.
En algunos casos, de acuerdo con la presente invención, el anticuerpo puede ser un anticuerpo completamente humano.
Agentes quimioterapéuticos citotóxicos
En algunos casos, de acuerdo con cualquier aspecto de la presente invención, el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención se puede administrar con, o para la administración con, (bien de manera simultánea, secuencial o por separado) otros fármacos antitumorales, incluyendo, pero sin limitación, un agente quimioterapéutico citotóxico o un agente antiangiogénico o un agente inmunoterapéutico.
Los agentes quimioterapéuticos citotóxicos son bien conocidos en la materia e incluyen agentes anticancerígenos tales como:
Agentes alquilantes que incluyen mostazas de nitrógeno tales como mecloretamina (HN2), ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán (L-sarcolisina) y clorambucil; 10 etileniminas y metilmelaminas tales como hexametilmelamina, tiotepa; sulfonatos de alquilo tales como busulfán; nitrosoureas tales como carmustina (BCNU), lomustina (CCNLJ), semustina (metil-CCN-U) y estreptozoeina (estreptozotocina); y
triacenos tales como decarbazina (DTIC;
dimetiltriazenoimidazolcarboxamida);
Antimetabolitos que incluyen análogos de ácido fólico tales como metotrexato (ametopterin); análogos de pirimidina tales como fluorouracil (5-fluorouracil; 5-FU), floxuridina (fluorodesoxiuridina; FUdR) y citarabina (citosina arabinósido); y análogos de purina e inhibidores relacionados tales como mercaptopurina (6-mercaptopurina; 6-MP), tioguanina (6-tioguanina; TG) y pentostatina (2'-desoxicoformicina). Productos naturales incluyendo alcaloides de la vinca tales como vinblastina (VLB) y vincristina; epipodofilotoxinas tales como etopósido y tenipósido; antibióticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorabicina (daunomicina; rubidomicina), doxorrubicina, bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina Q; enzimas tales como L-asparaginasa; y modificadores de la respuesta biológica tales como alfenomas de interferón. Agentes misceláneos que incluyen complejos de coordinación de platino tales como cisplatino (cis-DDP) y carboplatino; antracenediona tal como mitoxantrona y antbraciclina; urea sustituida tal como hidroxiurea; derivado de metil hidrazina tal como procarbazina (N-metilhidrazina, MIH); un supresor adrenocortical tal como mitotano (o, p'-DDD) y aminoglutetimida; taxol y análogos/derivados; y agonistas/antagonistas hormonales tales como flutamida y tamoxifeno. Un agente citotóxico adicional preferido es Gemcitabine (Gemzar®). Un agente citotóxico adicional preferido es Paclitaxel unido a albúmina sérica humana (Abraxane®).
Los agentes antiangiogénicos son bien conocidos en la materia e incluyen agentes anticancerígenos tales como bevacizumab, itraconazol y carboxiamidotriazol.
Los agentes inmunoterapéuticos son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) y anticuerpos anti-muerte programada-ligando 1 (PD-L1), incluyendo Nivolumab (MDX1106) y Pembrolizumab (MK-3475).
Composiciones farmacéuticas
Los conjugados anticuerpo-fármaco de la presente invención pueden estar comprendidos en composiciones farmacéuticas con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Un excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un compuesto o una combinación de compuestos que entra en una composición farmacéutica que no provoca reacciones secundarias y que permite, por ejemplo, la facilitación de la administración del conjugado anticuerpo-fármaco, un aumento en su duración y/o en su eficacia en el cuerpo o un aumento en su solubilidad en solución. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y se adaptarán por el experto en la materia en función del modo de administración del conjugado de anticuerpo-fármaco.
En algunas realizaciones, los conjugados anticuerpo-fármaco de la presente invención se pueden proporcionar en una forma liofilizada para la reconstitución antes de la administración. Por ejemplo, los conjugados anticuerpo-fármaco liofilizados se pueden reconstituir en agua estéril y mezclar con solución salina antes de la administración a un individuo.
Los conjugados anticuerpo-fármaco de la presente invención generalmente se administrarán en la forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además del conjugado anticuerpo fármaco. Por lo tanto, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, además del conjugado anticuerpofármaco, un excipiente farmacéuticamente aceptable, vehículo, un tampón, un estabilizador u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del conjugado anticuerpo-fármaco. La naturaleza precisa del transportador u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser por bolo, infusión, inyección o cualquier otra vía adecuada, tal como se analiza a continuación.
Para la administración intravenosa, por ejemplo, mediante inyección, la composición farmacéutica que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco puede estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable sin pirógeno y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la materia serán bien capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos, tales como inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactato. Los conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos se pueden emplear como se requiera incluyendo tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilo amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos, tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3'-pentanol; y mcresol); polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparaginas, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Sujeto
El sujeto puede ser un ser humano, un animal de compañía (por ejemplo, un perro o gato), un animal de laboratorio (por ejemplo, un ratón, una rata, un conejo, un cerdo o un primate no humano), un animal doméstico o de granja (por ejemplo, un cerdo, una vaca, un caballo o una oveja). Preferentemente, el sujeto es un ser humano. En algunos casos, el sujeto puede ser un ser humano diagnosticado de o clasificado como que está en riesgo de desarrollar un cáncer, por ejemplo, un tumor epitelial, un tumor sólido o una neoplasia sanguínea. En determinados casos, el sujeto puede ser un animal de laboratorio, por ejemplo, un modelo de ratón de un cáncer. En determinados casos, el sujeto puede ser un mamífero (por ejemplo, un ser humano) al que han diagnosticado de o clasificado como que está en riesgo de desarrollar una afección inflamatoria, tal como artrosis o artritis reumatoide (AR). En particular, el sujeto puede ser un ser humano que tiene artrosis o AR. En determinados casos, el sujeto puede ser un mamífero (por ejemplo, un ser humano) al que han diagnosticado de o clasificado como que está en riesgo de desarrollar una enfermedad ocular, tal como retinopatía diabética o degeneración macular.
Cáncer
Los conjugados anticuerpo anti-ENG - fármaco descritos en el presente documento encuentran su uso en el tratamiento de un tumor en un sujeto mamífero. El tumor puede ser un tumor sólido. En particular, el cáncer puede ser un cáncer de páncreas, cáncer de mama, melanoma, sarcoma de Ewing, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de vejiga o cáncer de colon.
Afección inflamatoria
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención puede ser para su uso en el tratamiento de una afección inflamatoria. Se ha documentado la expresión de ENG en artrosis y en artritis reumatoide. Véase, por ejemplo, Szekanecz, Z. et al. Clinical Immunology and Immunopathology, 1995, 76, 187-194, y Leask A et al., Arthritis & Rheumatism, 2002, 46, 1857-1865. Los presentes inventores creen que los conjugados anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento, son capaces de mejorar la artrosis, la artritis reumatoide y/o los síntomas de artrosis o de artritis reumatoide.
Enfermedad ocular
En algunos casos de acuerdo con la presente invención, el conjugado anticuerpo-fármaco de la invención puede ser para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular (por ejemplo, retinopatía diabética o degeneración macular, tal como degeneración macular relacionada con la edad). Se ha documentado la expresión de ENG en determinadas afecciones oculares, incluyendo la degeneración macular y la retinopatía. Véase, por ejemplo, Tsutomu Yasukawa et al., Curr Eye Res. 2000, 21, 952-961 y Abu El-Asrar AM et al., Mediators Inflamm. 2012,2012:697489, y Malik RA et al., J Cell Mol Med. 2005, 9:692-7. Los presentes inventores creen que los conjugados anticuerpo-fármaco descritos en el presente documento, son capaces de mejorar las enfermedades oculares y/o los síntomas de las mismas (incluyendo la retinopatía diabética o la degeneración macular, tal como degeneración macular relacionada con la edad). Lo siguiente se presenta a modo de ejemplo y no debe interpretarse como una limitación del alcance de las reivindicaciones.
Ejemplos
Ejemplo 1- Producción de anticuerpos anti-ENG
Los scFv anti-ENG de las bibliotecas de fago de anticuerpo sintético se han descrito anteriormente (29). Un scFv, dirigido frente a la región extracelular de la ENG humana, conocido como "A5" (29) y un scFv, dirigido frente a la región extracelular de la ENG de murino, conocido como "mE12" (31) se convirtieron en IgG de longitud completa para los posteriores estudios de caracterización y para la generación de inmunotoxinas y CAF. Todos los scFv se produjeron en E. coli y se purificaron mediante IMAC, las IgG se produjeron en células de mamífero (CHO) usando los vectores de expresión de Lonza GS pEE6.4 y pEE14.4 desarrollados para la producción de anticuerpos. Las características del material de partida de scFv se resumen en la Tabla 1.
Ta l 1: n i r ifi i l v r m m ri l r ida
Figure imgf000013_0001
Todos los scFv se produjeron de forma bacteriana en E. coli TG1 y se purificaron a partir de los extractos periplásmicos de cultivos de 1L mediante IMAC.
Los plásmidos que se corresponden con los anticuerpos de IgG1 de longitud completa se generaron y se transfectaron en células CHO para la producción de anticuerpos en el sistema de expresión en CHO de Lonza con rendimientos de aproximadamente 1 mg/l de cultivo celular (a escala de laboratorio). Los anticuerpos se purificaron a partir del sobrenadante de cultivo celular mediante cromatografía de proteína A. Las proteínas purificadas se caracterizaron mediante SDS-PAGE y cromatografía de exclusión de tamaño. La bioactividad se analizó mediante ELISA usando la ENG recombinante y la detección de los anticuerpos unidos con anticuerpos anti-IgG humana conjugada con HRP. La unión celular se analizó mediante citometría de flujo usando la célula B16 de ratón que expresa ENG.
Resultados:
Plásmidos generados (y secuenciados):
A5 IgG1: pEE14.4 A5-IgG1 OCMTX003p (IgG1 humana anti-huENG) mE12 IgG1: pEE14.4 mE12-IgG1 OCMTOO4p (IgG1 humana anti-muENG)
Ejemplo 2 - Caracterización de anticuerpos anti-ENG
Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada (HC, del inglés heavy chain) y de la cadena ligera (LC, del inglés light chain) de la IgG1 anti-ENG humana A5 (A5-IgG1), respectivamente se muestran a continuación:
A5-IgG1-HC anti-endoglina humana:
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMSWRQAPGKGLEWSAIYGSDGPTTYADSVKGRF
TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARyFYTAGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST
SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN
HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS
KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1)
aa 447
PM de la HC procesada 48.703
pI teórico 8,36
Posible sitio de glucosilación (doble subrayado): N297
Las mutaciones que llevan a una deficiencia en CCDA y CDC se muestran en negrita y en cursiva (véase también el documento WO 99/58572)
La secuencia de la señal se muestra recuadrada
El dominio VH está subrayado; CDRH1-H3 se muestran en negrita y subrayado curvo.
A5-IgG1-LC anti-endoglina humana:
Figure imgf000014_0001
DIELTQSPSSLSASVGDRVTITCBASOSISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYAA.SSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAPMgglFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 2)
aa 214
PM de la HC procesada 23.113
pI teórico 7,76
la secuencia de la señal está recuadrada
el dominio VL está subrayado; CDRL1-L3 se muestran en negrita y subrayado curvo.
A5-IgG1-HC - sin secuencia señal:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS Y M S WRQAPGKGLEWSAIYGSDGPTTYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARyFYTAGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 3)
A5-IgG1-LC - sin secuencia señal:
DIELTQSPSSLSASVGDRVTITCBASOSISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYAA.SSLOSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAPMCPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 4)
A5-VH:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYGSDGDTTYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVFYTAGFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 5) A5-VL:
DIELTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAPAKPPTFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO: 6)
A5-CDRH1:
SYAMS (SEQ ID NO: 7)
A5-CDRH2:
AIYGSDGDTTY (SEQ ID NO: 8)
A5-CDRH3:
VFYTAGFDY (SEQ ID NO: 9)
A5-CDRL1:
RASQSISSSLN (SEQ ID NO: 10)
A5-CDRL2:
AASSLQS (SEQ ID NO: 11)
A5-CDRL3:
QQAPAKPPT (SEQ ID NO: 12)
Los parámetros del A5-IgG completo son tal como sigue:
Longitud total de la IgG de longitud completa (aa): 1.322
Masa molecular calculada de la IgG de longitud completa: 143.577
Coeficiente de extinción calculado de la IgG de longitud completa: 195.440
Abs al 0,1 % (=1 g/l) 1,361
pl teórico: 8,36
posible sitio de glucosilación: N297
mE12-IgG1-HC anti-endoglina de murino:
METDTLLLWVLLLWVPGSTG EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSXg^ WRQAPGK GL VWSRINSDGSSTSYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGTWyMSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYMSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13)
aa 446
PM de la HC procesada 48.574
pI calculado 8,88
Posible sitio de glucosilación (doble subrayado): N297
Las mutaciones que llevan a una deficiencia en CCDA y CDC se muestran en negrita y en cursiva
La secuencia de la señal se muestra recuadrada
El dominio VH está subrayado
mE12-IgG1-LC anti-endoglina de murino:
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SSELIQ DPAVSVALGQTVRIT CQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGK^RPSGIPDRFSGSSSGN
TASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGTVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLI
SDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEK
TVAPTECS (SEQ ID NO: 14)
aa 212
PM (procesado) 22.516
pI calculado 6,69
La secuencia de la señal se muestra recuadrada
el dominio VL está subrayado
mE12-IgG1-HC - sin secuencia señal:
EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSX g ^ WRQAPGKGLVWSRINSDGSSTSYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGTWyMSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS
GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH
KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYKSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 15)
mE12-IgG1-LC - sin secuencia señal:
SSELIQ DPAVSVALGQTVRIT CQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGK^RPSGIPDRFSGSSSGN TASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGTVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLI SDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEK TVAPTECS (SEQ ID NO: 16)
mE12-VH:
EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLVWVSRINSDGSSTSYADSVKGRF
TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARATGTWVMSWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 17)
mE12-VL:
SSELIQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGN
TASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGTVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 18)
mE12-CDRH1:
SYGMH (SEQ ID NO: 19)
mE12-CDRH2:
RINSDGSSTSYADSVKG (SEQ ID NO: 20)
mE12-CDRH3:
ATGTWVMS (SEQ ID NO: 21)
mE12-CDRL1:
QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO: 22)
mE12-CDRL2:
GKNNRPS (SEQ ID NO: 23)
mE12-CDRL3:
NSRDSSGTV (SEQ ID NO: 24)
Los anticuerpos purificados anti-muENG mE12 y anti-huENG A5 se analizaron en ELISA para la unión a ENG recombinante y usando el análisis de citometría de flujo (FACS). Se muestran los resultados de afinidad para las IgG1 mE12 anti-muENG (Figuras 1 y 2) y A5 anti-huENG (Figura 3), y se resumen en la Tabla 2. La Figura 1 muestra la unión dependiente de la concentración de mE12-IgG a la ENG recombinante de ratón (aa 27-581), pero no al control negativo (BSA). La Figura 2 muestra el análisis de la citometría de flujo de la unión de mE12-IgG a a) células B16 usando 50 pg/ml de anticuerpo, b) células B16 usando 5 pg/ml de anticuerpo y c) células HT1080 incluidas como control negativo. La Figura 3 demuestra la unión dependiente de la concentración de A5-IgG a la ENG humana mediante a) ELISA y b) análisis de citometría de flujo.
Para la ampliación, las construcciones de anticuerpos se clonaron en vectores dobles de GS (pEE14.4). Los plásmidos de ADN se transformaron, se amplificaron y se transfectaron de manera transitoria en células CHOK1SV para la evaluación de la expresión a un volumen de 200 ml. En una segunda etapa, los anticuerpos se expresaron de manera transitoria en cultivos a gran escala de 5-10 l. El sobrenadante de cultivo aclarado se purificó usando la cromatografía de proteína A de una etapa. El análisis de calidad del producto mediante SE-HPLC, SDS-PAGE y LAL se llevó a cabo usando material purificado a una concentración de 1 mg/ml, junto a un anticuerpo humano interno como una muestra de control.
Las muestras de proteína purificadas se filtraron a través de un filtro de 0,2 |jm y se analizaron mediante cromatogramas de SE-HPLC. La mE12-IgG se purificó a >98,8 %. La A5-IgG se purificó a >90 %. Los niveles de endotoxina fueron < 0,5 UE/mg.
Todas las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras (datos no mostrados).
Las proteínas purificadas A5-IgG y mE12-IgG se caracterizaron mediante SDS-PAGE y cromatografía de exclusión de tamaño. La bioactividad se analizó mediante ELISA, usando la ENG recombinante de ratón/humano y la detección de los anticuerpos unidos con anticuerpos anti-IgG humana conjugada con HRP. La unión celular se analizó mediante citometría de flujo, usando HT1080 positivo en ENG y eEnd2 de ratón que expresan ENG. Los puntos de fusión se determinaron mediante dispersión de luz dinámica usando un zetasizer nano. Las afinidades se determinaron mediante QCM usando un Attana A100. El estudio de internalización se realizó mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia indirecta en células permeabilizadas, detectando los anticuerpos unidos e internalizados con un anticuerpo secundario marcado con FITC.
Los anticuerpos purificados IgG 1 de longitud completa se produjeron con éxito tanto a escala de laboratorio como a gran escala, para la generación de inmunoconjugados. Un resumen de las propiedades del anticuerpo se muestra en la Tabla 2. Los anticuerpos conservaron su especificidad, tal como se muestra mediante ELISA y los experimentos de citometría de flujo. Las afinidades, tal como se determina mediante QCM, fueron comparables con las de los anticuerpos parentales. Las mediciones de QCM indicaron la contribución de los efectos de avidez a la unión de alta afinidad. La estabilidad térmica difirió entre las diferentes IgG (64-72 °C).
Los estudios de internalización preliminares indican una rápida internalización celular para A5-IgG rente a células que expresan la ENG humana. De hecho, en 30 minutos, casi el 90 % de la A5-IgG se encuentra en las células HT1080.
T l 2: R m n l r i l n i r
Figure imgf000017_0001
La Figura 9 muestra la internalización de la IgG 1 anti-huENG A5.
Ejemplo comparativo 3 - cadena A de Nigrina b
Con el fin de evitar los efectos secundarios de la toxina libre que se podría liberar en el torrente sanguíneo y para reducir la posible inmunogenicidad de la toxina RIP, tal como se describe ampliamente con la ricina, el dominio enzimático de la nigrina b, la cadena A, se clonó y se expresó en las bacterias. Los presentes inventores hipotetizaron que, si la cadena A producida en las bacterias era capaz de conservar su actividad, no sería capaz de entrar en las células, salvo que se conjugue con una molécula de vehículo, tal como un anticuerpo.
Producción
La cadena A de la nigrina b se sintetizó teniendo en cuenta la optimización por codón para la expresión de bacterias y el gen sintetizado se clonó en dos vectores diferentes, Nigrin_pET30b-3 y Nigrin_pET33b-1 (marcaje de His /-) para la expresión en dos cepas diferentes de E. coli, E. coli BLR(DE3) y E. coli HMS174(DE3). Se usaron diferentes medios de cultivo para comprobar las diferentes condiciones de expresión. El proceso de purificación se estableció usando la cromatografía Capto Q y SP de Sefarosa de alto rendimiento. La cadena A de la nigrina b recombinante purificada (recNgA) se formuló a 5 mg/ml en PBS 1X a pH 7,4, DTT 0,5 mM, glicerol al 10 %. Los niveles de endotoxina fueron <1 UE/mg de nigrina y la pureza fue de > 99 % en forma monomérica.
La secuenciación de N-terminal de Eldman reveló que el extremo N-terminal de recNgA se correspondió con la secuencia esperada.
Secuencia de aminoácidos de cadena A de nigrina b recombinante:
MIDYPSVSFNLDGAKSATYRDFLSNLRKTVATGTYEVNGLPVLRRESEVQVKSRFVLVPLTNYNGNTV
TLAVDVTNLYWAFSGNANSYFFKDATEVQKSNLFVGTKQNTLSFTGNYDNLETAANTRRESIELGPS
PLDGAITSLYHGDSVARSLLWIQMVSEAARFRYIEQEVRRSLQQATSFTPNALMLSMENNWSSMSLE
IQQAGNNVSPFFGTVQLLNYDHTHRLVDNFEELYKITGIAILLFRCSSPSND (SEQ ID NO: 25)
La cadena A de nigrina b recombinante tiene las siguientes características:
Número de aminoácidos: 256
Peso molecular: 28546,0
pI teórico: 5,45
La secuencia de nucleótidos que codifica la cadena A de nigrina b es tal como sigue:
atagactatc cctccgtctc cttcaacttg gatggagcca agtcggctac atacagggac ttcctcagca acctgcgaaa aacagtggca actggcacct atgaagtaaa cggtttacca gtactgaggc gcgaaagtga agtacaggtc aagagtcggt tcgttctcgt ccctctcacc aattacaatg gaaacaccgt cacgttggca gtagatgtga ccaaccttta cgtggtggct tttagtggaa atgcaaactc ctactttttc aaggacgcta cggaagttca aaagagtaat ttattcgttg gcaccaagca aaatacgtta tccttcacgg gtaattatga caaccttgag actgcggcga atactaggag ggagtctatc gaactgggac ccagtccgct agatggagcc attacaagtt tgtatcatgg tgatagcgta gcccgatctc tccttgtggt aattcagatg gtctcggaag cggcaaggtt cagatacatt gagcaagaag tgcgccgaag cctacagcag gctacaagct tcacaccaaa tgctttgatg ctgagcatgg agaacaactg gtcgtctatg tccttggaga tccagcaggc gggaaataat gtatcaccct tctttgggac cgttcagctt ctaaattacg atcacactca ccgcctagtt gacaactttg aggaactcta taagattacg gggatagcaa ttcttctctt ccgttgctcc tcaccaagca atgat (SEQ ID NO: 26)
Materiales
- Construcción genética de Nigrina pET30b-3.
- Escherichia coli (Migula) Castellani y Palmers BLR(DE3)
- Medios de cultivo: medio autoinducido (AIM, del inglés auto induced médium)
- Tampón de cultivo de extracción: Glicina/NaOH 10 mM, Leupeptina 1 |jg/ml, Pepstatina 1 |jg/ml, pH 9,5.
- Tampón de sobrenadante de extracción Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM, MgCl2 2 mM, leupeptina 1 jgm l-1, pepstatina 1 jgm l-1, lisozima 0,1 mgml-1, pH 8,0.
- Solución de diálisis: Ácido cítrico/NaOH 25 mM a pH 5,0. -Capto Q FPLC: Tampón de equilibrado A: Glicina/NaOH 50 mM a pH 9,5. Tampón de elución B: Glicina/NaOH 50 mM a pH 9,5, NaCl 1 M.
- Fracciones agrupadas de la etapa de Capto Q (+ 80 ml de extracción).
- SP Sefarosa HP FPLC: Tampón de equilibrado A: Ácido cítrico 25 mM a pH 4,0. Tampón de elución B: Ácido cítrico 25 mM a pH 4,0, NaCI 1 M.
Métodos
E. coli BLR (DE3) que mantiene la expresión de Nigrina pET30b-3 cultivada en 1 litro de formato de medio autoinducible (AIM) con 30 jg m l-1 de Kanamicina. La expresión de la proteína se desencadenó mediante la activación de la lactosa y el agotamiento de la glucosa después de aproximadamente 3-4 horas de crecimiento. Después, la temperatura se redujo a 20 °C durante una duración de toda la noche.
Para la extracción, cada sedimento celular se resuspendió inicialmente en 80 ml de tampón de extracción por litro de cultivo, y se realizaron 3 ciclos de desintegración de 7 minutos a 1100-110 Bar tras 30 minutos de incubación a 8 °C bajo agitación. Después se sometió el extracto a 60 minutos de centrifugación a 15.900 g, a 8 °C. El sobrenadante fue el material de partida de la purificación.
Capto Q FPLC: 160 ml de producto extraído del cultivo 81 se cargaron en 160 ml de Capto Q y se equilibraron usando 4CV de tampón de equilibrado y se lavó con 15CV de tampón de equilibrado. La elución se llevó a cabo en tres etapas: 15CV a 1,5mS/cm (7,6 %B); 20CV a 23,8 mS/cm (18,9 %B); 20CV 100 %B.
La diálisis se realizó en las siguientes condiciones: se sometieron a diálisis 650 ml del producto en 4x5l baños en ácido cítrico/NaOH 25 mM a pH 5,0, valor de corte 6-8000Da. Factor de diálisis ~ 3500, <24 h. Tras la diálisis, una centrifugación de 30 minutos a 20.500 g y a 8 °C permitió separar la fracción soluble de la insoluble. Se realizó el SDS-PAGE sobre el total y las fracciones solubles tanto antes como después de la diálisis (10 j l cargado en SDS-PAGE). El eluyente se sometió a diálisis en PBS a pH 7,4 y se filtró a 9=0,22 jm usando filtros de 2x20cm2 EKV.
SP Sefarosa HP: Se cargaron 610 ml de mezcla dializada de Capto Q en ácido cítrico 25 mM a pH 5,0 en 240 ml de SP Sefarosa de alto rendimiento con 4CV de tampón de equilibrado y se lavó con 15CV de tampón de equilibrado y se eluyó a un gradiente de 25Cv al 20 % de B; etapa de 4CV del 100 % de B.
Las fracciones mezcladas de la etapa de SP Sefarosa HP se sometieron a diálisis en PBS a pH 7,4, DTT 0,5 mM (5x4l baños, fracciones agrupadas de 950 ml a 0,97 mg/ml). El valor de corte fue 6-8000 Da, el factor de diálisis fue de ~3130, tiempo > 24 h. Después, una centrifugación de 30 min a 20,55 g y 8 °C permitió separar la fracción soluble de la insoluble. Después se añadió glicerol al 10 %.
Finalmente se sometió a diálisis al eluyente en PBS a pH 7,4 (5 baños ~3100) y se filtró a 9=0,2 jm , después, el lote recNg b A se congeló de manera instantánea a -80 °C. Más tarde, se llevó a cabo un SEC en un Semi-Preparative S200 Superdex.
La cromatografía de exclusión por tamaño y el análisis de espectrometría de masas demostró el estado monomérico y de purificación de la cadena A de nigrina b recombinante obtenida (recNgA) (Figura 4).
Se realizaron estudios de estabilidad para evaluar el efecto del pH y de la temperatura sobre la propia proteína de cadena A de nigrina b y su actividad. La recNgA es estable a un pH que varía de 5 a 9, y en presencia o no de glicerol (del 10 al 45 %) (datos no mostrados).
Actividad
Se evaluó la actividad de la proteína inactivadora del ribosoma (RIP, del inglés nbosome-inactivating protein) de la cadena A de nigrina b en lisado sin células de los reticulocitos de conejo: el valor de CI50 obtenido fue similar a la nigrina b natural y en un intervalo de 2,5 a 25 pM (véase la Figura 5). Por tanto, la cadena A de nigrina b, expresado como una proteína recombinante en bacterias, mantiene su actividad enzimática, sosteniendo que la glucosilación no se requiere para la actividad de RIP de la cadena A de la nigrina b.
RecNgA conserva su actividad en lisados sin células de reticulocitos de conejo si se almacena congelado a (-80 °C) y por debajo de 3 ciclos de congelación descongelación (no mostrado).
La actividad citotóxica de recNgA se ensayó en cultivos celulares a través de un ensayo de viabilidad basado en cristal violeta. recNgA, que carece de la cadena B para la translocación en células, presenta una actividad de 100 a 1000 menos tóxica que la nigrina b natural, tal como se muestra en la Figura 6. La nigrina b natural presentó una CI50==2x10-8M (similar a los datos publicados previamente, véase 37), mientras que recNgA mostró una C|50==2x10-6M.
Los estudios publicados previamente mostraron que la nigrina b natural presenta una mayor actividad de RIP que la ricina en el ensayo de r Rl , mientras que es mucho menos tóxico (30-10.000 veces, aproximadamente) en células o in vivo (véanse los valores de CI50 y DL50 en la Tabla 3).
Al retirar la cadena B, la cadena A de ricina pierde actividad tanto en el ensayo de RRL como en el ensayo de citotoxicidad. Inesperadamente, la cadena A de la nigrina b, generada por primera vez en esta presente invención, solo pierde actividad en el ensayo de citotoxicidad celular, mientras que incluso aumentó en el ensayo de RRL con respecto a la Nigrina b natural. Estos datos sugerían que, en el caso de la ricina, la retirada de la cadena B estaba afectando no solo a la unión y a la translocación de la cadena A, sino también a su actividad de RIP, aunque este no fue el caso para la cadena A de la nigrina b, que conserva e incluso aumenta su actividad de RRL con respecto a su contraparte natural. Como resultado, la cadena A de la nigrina b es 50 veces más activa que la cadena A de la ricina en RRL.
Por consiguiente, tras la conjugación, los conjugación, los conjugados anticuerpo de cadena A de la nigrina b - fármaco presentan una mayor actividad citotóxica (CI50 en un intervalo de pM) que los conjugados de anticuerpo de cadena A de la ricina - conjugados de los fármacos (intervalo de nM)(no mostrado).
Tabla 3: Datos de actividad in vitro e in v í v o para la ricina y la nigrina b (natural y cadena A).
Lisado de CI50 de células DL50 de ratón
conejo HeLa (pgkg- 1)
CI50 (pM) (pM)
27.600,00 (20­
Nigrina b 30 2300 nM; línea 12.000,00
celular dpt)
Cadena A 750.000. 00
(HT1080-FAP)
de la 6, 5 ND
nigrina b 300.000. 00
(HT1080)
Ricina 100 0,67
Figure imgf000020_0001
Cadena A 260.000,00 _
de ricina 500
(linfocitos T)
(Datos propios de los inventores de la cadena de nigrina b de la cadena A; véase también Ferreras J.M. et al., Toxins, 3:420, 2011; Svinth M. et al., BBRC, 249: 637, 1998)
Ejemplo comparativo 4 - Conjugación de la cadena A de la nigrina b con anticuerpos anti-ENG
Para los inmunoconjugados que contienen RIP para presentar una citotoxicidad máxima, la RIP se debe liberar desde el vehículo de direccionamiento en forma completamente activa, que requiere evitar el impedimento estérico (38). El enlace disulfuro es el único tipo de enlace que se ajusta a este criterio (39, 40). Esta unión permite la conjugación usando reactivos para la introducción de grupos sulfhidrilo libres tales como N-succinimidil 3(2-piridil-ditiopropionato) (SPDP) y 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a (2-piridil-ditio)tolueno (SMPT). Las inmunotoxinas que consisten en mAb unidos de manera covalente a toxinas mediante enlazadores disulfuro impedidos, a menudo etiquetados como inmunotoxinas de segunda generación, son estables, de larga duración y presentan una potente citotoxicidad para las células diana (41).
El SPDP ya se ha usado en la preparación de las inmunotoxinas (IT) que contienen nigrina b (36, 42). Además, el SMPT protege el enlace disulfuro del ataque por aniones tiolato, mejorando la estabilidad in vivo del enlace (43, 44).
Material
- Cadena A de nigrina b recombinante en PBS, a pH 7,4, con glicerol al 10 %, DTT 0,5 mM, 4,92 gl-1, almacenado a 5 °C.
- 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzoico)
- Columnas desaladoras GE PD MiniTrap G-10.
- Filtros Minisart estériles de 0,2 |jm y 28 mm.
- Estación de trabajo Sciclone a Lh 3000.
- Placa de Sarstedt Microtest de 96 pocillos, de fondo plano, n° de ref 82.1581.
Métodos
El ditiotreitol (DTT, reactivo de Cleland) es un agente redox que se usará para liberar los grupos tiol presentes en la muestra de proteína. Una vez que se han liberado dichos grupos y, por lo tanto, están disponibles para reaccionar, se añadirá 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzoico) (reactivo de Ellman). El puente disulfuro del reactivo de Ellman se escindirá y las 2 moléculas resultantes de tio-nitrobenzoato (TNB) atacarán a la proteína en los sitios del grupo tiol. Para titular las TNB, se tomarán valores de absorbancia a A=412nm, una longitud de onda a la que no se absorbe DTT, representando la concentración de los grupos tiol. La proporción de esto con la concentración de la proteína tomada de su absorbancia a A=280 producirá el número de grupos tiol libres por molécula de proteína.
La titulación de tiol directa se realizó tal como sigue:
se disolvieron 204 j l de A de recNg b en 796 j l de fosfato 20 mM, NaCl 250 mM, EDTA 1 mM a pH 7,0 (tampón de ensayo) (1,0033 gl-1=concentración final). El reactivo de Ellman se disolvió en fosfato 0,2 M a 3 gl-1. Para ambos tampones, se añadieron fosfato de sodio monobásico y dibásico en una proporción de masa de 1,61 a 1. Se ajustó el pH a temperatura ambiente y se filtraron los tampones. Se prepararon 100 ml de tampón de Ellman y 500 ml de tampón de ensayo. El reactivo de Ellman se resuspendió por completo en lugar de pesarse.
La muestra de recNgA se incubó en presencia de DTT 4,8 mM a temperatura ambiente durante 30 min. La muestra de recNgbA después se purificó en la columna, y se tomaron alícuotas de los 10 ml primeros del eluyente (V=0,5 ml). Se tomó la A280 de las alícuotas y se mezclaron las dos más concentradas. Se tomó de nuevo la A280. Se añadieron 10 |jl de 3 gl-1 de DTNB y se midió la A412 después de 2 min (n=1), usando Ellman diluido en tampón de ensayo en la misma concentración como un blanco (nb=3). Las lecturas pertenecían al intervalo lineal de 0,1-3 UA. Las soluciones de proteínas se pipetearon justo debajo del menisco después de agitar vorticialmente. Se pipetearon 100 j l por pocillo. Los resultados de este estudio muestran que el grupo tiol que pertenece al único resto de cisteína de recNgA está libre y disponible para la reacción, sin que esté bloqueado por su estructura terciaria. Esto permitirá que recNgbA se conjugue usando un enlazador que requiere un enlace disulfuro intercaternario impedido.
Está bien establecido que los inmunoconjugados que contienen proteínas de activación de ribosomas presentan la máxima citotoxicidad solo cuando la molécula de toxina se libera desde el vehículo de direccionamiento en una forma completamente activa. La separación de la molécula de RIP del vehículo se requiere para evitar el impedimento estérico y para permitir una translocación eficaz de la toxina al citoplasma (38). Actualmente, el enlace disulfuro es el único tipo de enlace que parece que se ajusta a este criterio (40).
El acoplamiento de las dos macromoléculas de proteína diferentes, que da como resultado la formación de heterodímeros, requiere que se modifique cada proteína antes de mezclarlas para que reaccionen. En el caso de las cadenas A de las RlP de tipo 2, la modificación se limita a la escisión reductiva del resto de cisteína natural que enlaza las cadenas activa (A) y de unión (B) de la molécula.
Para moléculas de IgG, esto no es posible, ya que los restos de cisteína están implicados en el mantenimiento de la estructura terciaria y/o cuaternaria de la proteína, de manera que no es posible reducirlos sin pérdida de las funciones específicas de la proteína. Por otra parte, presumiblemente, algunos de los restos de cisteína no son estéricamente accesibles, tal como se demostró mediante los 10 grupos tioles por inmunoglobulina que se tenían que generar para una conjugación óptima con una RIP activada (45).
Por estas razones, en la mayoría de las moléculas de IgG, los grupos tiol se insertan químicamente usando reactivos heterobifuncionales, y se han desarrollado varios métodos con el fin de generar heteroconjugados que evitan o que reducen al mínimo la formación de homopolímeros. En la mayoría de los casos, los reactivos usados para introducir grupos tiol reaccionan con los grupos amino, formando enlaces amida o amidina. Los grupos amino son reactivos, abundantes y, en un modo limitado para la mayoría de las proteínas, reemplazables. Es decir, se puede modificar un número limitado de grupos amino sin reducir la actividad biológica de la proteína (40).
Los reactivos más comúnmente usados para la introducción de grupos sulfhidrilo libres son N-succinimidil 3(2-piridilditiopropionato) (SPDP) y 4-succinimidiloxicarbonil-a-metil-a (2-piridil-ditio)tolueno (SMPT), que introducen grupos 2-piridil disulfuro en la proteína haciéndolos reaccionar con los grupos amino para formar amidas neutras y metil 4-mercaptobutirimidato (2-iminotiolano. Reactivo de Traut) que introduce grupos mercaptobutirimidoil, que reaccionan para formar amidinas cargadas, conservando de este modo la carga positiva del aminoácido derivatizado (40;44).
SPDP y SMPT introducen un enlace disulfuro impedido, mientras que el -SH de 2-iminotiolano se debe proteger haciéndolo reaccionar con ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (reactivo de Ellman).
La reacción con el reactivo de Ellman también se usa para medir rápidamente los grupos sulfhidrilo de la proteína (45, 46).
SMPT tiene un grupo metilo y un anillo de benceno unido al átomo de carbono adyacente al enlace disulfuro que lo protege del ataque por aniones de tiolato, mejorando por lo tanto la estabilidad in vivo del enlace (43, 44).
Según estos datos, las proteínas IgG se pueden modificar con SMPT, que no afecta de manera significativa a la propiedad de unión a antígeno de las moléculas en las siguientes condiciones, incluso si cambian la carga de la proteína en el sitio de la reacción.
En un estudio, los presentes inventores investigaron la conjugación de las IgG1 con recNgA, usando 2 proporciones molares de recNgA:mAb diferentes de 2,5 y 3,5, tras la derivatización, usando una proporción molar de SMPT:mAb de 6, tras los protocolos de conjugación (véase 40). La purificación se realizó mediante cromatografía por exclusión de tamaño en Sephacryl S200 (véase 41).
En las condiciones descritas, la inmunotoxina es predominantemente una mezcla de anticuerpo enlazado a una o dos moléculas de toxina, con la presencia de componentes de alto peso molecular (IgG enlazada a varias proteínas RIP), así como RIP libres y poliméricas (diméricas en el caso de recNgA) y anticuerpos libres. Por tanto, se piensa que una purificación cuidadosa es deseable para obtener un producto puro.
Ensayo de actividad in vitro
El ensayo de actividad sobre conjugados preparados tal como se describe anteriormente se realizó a través de la evaluación de la actividad de RIP en el ensayo de lisado sin células de reticulocitos de conejo (RRL). Los resultados se presentan en la Figura 7.
Los valores de CI50 obtenidos para la nigrina b o la recNgA estaban en el intervalo de 2,5 pM y aquellos para los conjugados fueron similares y en el intervalo de 1-0,5 pM, incluso mayores que el control positivo de la nigrina b natural, demostrando que la conjugación de anticuerpo no afectó a la actividad enzimática de recNgA.
Ejemplo 5 - Conjugación de citolisinas con anticuerpos anti-ENG
Las citolisinas empleadas para los estudios de conjugación se eligieron de la estructura general mostrada anteriormente (fórmula IV). Estas estructuras presentan actividad frente a las diferentes líneas de células cancerosas (intervalo de nM a pM).
Se pueden usar diversos sistemas de enlazadores y unirlos bien a la posición R2 o a la R17 de la molécula.
El esquema general de los conjugados de anticuerpo de citolisina-fármaco, incluyendo el enlazador de vcPABA y el anticuerpo anti-ENG, se muestra en la Figura 8 (en la estructura representada en la Figura 8, el sitio de unión de la citolisina al enlazador vcPABA es en la posición Ri o R4 - el sistema de numeración de Ri y de R4 usado en la Figura 11 difiere del sistema de numeración del grupo R usado, por ejemplo, en las reivindicaciones; se pretende que Ri de la Figura 11 se corresponda con R2 en las reivindicaciones y que R4 de la Figura 11 se corresponda con R17 de las reivindicaciones).
El enlazador escindible de proteasa vcPABA (valina-citrulina-PABC) se ha usado previamente en la molécula de CAF Brentuximab Vedotina, desarrollada por Seattle Genetics y Takeda, y recientemente aprobada por la FDA y EMEA como Adcetris® (2011, y nov. 2012, respectivamente). En este CAF, el vcPABA se ha acoplado en su NH2 libre a maleimida caproil para la conjugación basada en tiol en mAb (anticuerpo anti-CD30 cAC10). Por otro lado, vcPABA se ha conjugado a través de su COOH con el fármaco citotóxico Auristatina de Seattle Genetics (MMAE). (véase 48) Los presentes inventores han usado este enlazador (maleimida caproil-vcPABA) para conjugar anticuerpos anti-ENG a través de la reacción basada en tiol con maleimida caproil y, en el otro extremo, a las moléculas citotóxicas de citolisina a través de su piperidina cíclica con vcPABA (posiciones Ri o R4 de la citolisina mostradas en la Figura 8). Síntesis de Maleimido-val-cit-PABOCO-Tubulisina/Citolisina-TAM461:
Figure imgf000022_0001
TAM461 (Tubulisina/Citolisina): 30,0 mg (0,041 mmol)
DMF: 3 ml
TAM465 (Enlazador): 35 mg (0,045 mmol)
HOBt: 1,4 mg
DIPEA: 10 Ml
TAM461 y TAM465 se disolvieron en DMF anhidro en condiciones secas y la solución resultante se trató con HOBt y DIPEA. La reacción se agitó a TA durante 18 h. La mezcla de reacción se concentró y el aceite resultante se purificó mediante cromatografía de columna usando metanol al 2-6 %: DCM para dar 35 mg (el 64 %) de TAM467 como un sólido blanco. ESI-MS: m/z = 1371 [M+H].
Síntesis de Maleimido-val-cit-PABOCO-Tubulisina/Citolisina-TAM470:
Figure imgf000023_0001
TAM470 (Tubulisina/Citolisina): 0,07 mmol
DMF: 5 ml
TAM466 (Enlazador): 50 mg (0,065 mmol)
HOBt: 2,4 mg
DIPEA: 18 Ml
TAM470 y TAM466 se disolvieron en DMF anhidro en condiciones secas y la solución resultante se trató con HOBt y DIPEA. La reacción se agitó a TA durante 18h y después se analizó con t Lc , que indica la finalización de la reacción, La mezcla de reacción se concentró y el aceite resultante se purificó mediante cromatografía de columna usando metanol al 4-12 %: DCM para dar 56 mg de TAM471 (rendimiento: 62 %). ESI-MS: 1384.6 [M+1].
Se realiza un ensayo de la actividad in vitro. La actividad funcional se evalúa a través del ensayo de inhibición de microtúbulos, mientras que la actividad citotóxica se determina a través del ensayo de viabilidad de cristal violeta.
Generación de derivados de citolisina-enlazador
Se sintetizaron diferentes derivados de citolisina-enlazador de acuerdo con la estructura general presentada en la Figura 11, en donde el enlazador vcPABA se añadió bien en la posición R1 (TAM467, TAM551) o R4 (TAM471, TAM553, TAM558), solo o con espaciador de etilenglicol (EG; n=1 a 3), o sustituidos por grupos etilenglicol (n=3) (TAM552). Las respectivas estructuras químicas se presentan en la Tabla 4.
Tabla 4: Estructura uímica de derivados de citolisina-enlazador
Figure imgf000024_0002
La actividad de inhibición de microtúbulos y la actividad citotóxica de cada nuevo derivado se evaluaron a través del ensayo de inhibición de la polimerización de tubulina (TPI; kit de ensayo de polimerización de tubulina; citoesqueleto, N.° de cat. BK011P), y la detención de la proliferación celular en células HT1080 (CPA; cristal violeta). Se calculó la CI50 y los resultados se presentan en la Tabla 5.
Tabla 5: Actividad de inhibición de microtúbulos y actividad de citotoxicidad celular de derivados de i li in - nl z r.' ND: N rmin ^
Figure imgf000024_0001
La actividad in vitro de la citolisina parenteral TAM334 está dentro del mismo intervalo de otras cargas usadas actualmente para la generación de conjugados anticuerpo-fármaco tales como auristatinas (MMAE) o maitansinoides (DM1-DM4). Tal como se esperaba y se describió previamente para otros compuestos de la familia de la Tubulisina A, tras la adición del enlazador, la actividad citotóxica celular de las citolisinas se redujo con respecto al compuesto parental TAM334. Además, el derivado de TAM467 estaba presentando la actividad significativamente más baja en ambos ensayos. Todos los derivados se usaron en conjugación para generar moléculas de CAF y se evaluaron de manera comparativa tanto in vitro como in vivo para seleccionar el derivado citolisina-enlazador más activo.
Conjugación y caracterización química de los CAF
Cada uno de los derivados recién generados se conjugó con los anticuerpos humanos IgG1 monoclonales siguiendo un método de conjugación no específico de sitio sobre restos de cisteína. Para este objetivo, se redujo un lote de anticuerpos y se hizo reaccionar con cada uno de los derivados. Se probaron diferentes proporciones de TCEP para alcanzar el DAR óptimo de 3-4, menos del 10 % de anticuerpo libre y fármaco. Las condiciones de conjugación óptima fueron tal como siguen: TCEP=2,5 y 3,57 de niveles de tiol de Ellmann. Los conjugados anticuerpo-fármaco se purificaron después en G25 Sephadex y se analizaron mediante cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) para determinar su pureza, así como la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) y la cromatografía de fase inversa de líquido polimérico (PLRP) para determinar el DAR, el contenido de anticuerpo libre y el perfil de distribución de diferentes especies de CAF (0-8 fármacos/mAb). El contenido de fármaco libre se evaluó mediante el método de detección de UV a 280nm. Los resultados del análisis químico se determinaron (no mostrado) y las características de los CAF se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6: Resumen de las características uímicas de las diferentes moléculas de CAF
Figure imgf000025_0001
Los diversos fármacos produjeron diferentes niveles de agregación. De manera específica, el CAF HPS157-039-002 (TAM551) mostró los niveles de agregación más altos ya a DAR=3,08, dejando el 22,4 % de anticuerpo sin conjugar. Una conjugación preliminar con TAM467 también mostró alto nivel de agregación: a DAR 3,27, la pureza de SEC ya era solo del 67 % con el 16 % del fármaco libre (datos no mostrados). Estos datos estaban sugiriendo que el enlazador vcPABA en la posición R1 no era óptima para este tipo de moléculas de citolisina.
Evaluación in vitro de conjugados anticuerpo de citolisina-fármaco
Las moléculas de CAF de citolisina se evaluaron de forma comparativa in vitro mediante el ensayo de detención de la proliferación (tinción de cristal violeta). Los resultados se presentan en la Figura 10 y los valores de CI50 en la Tabla 7.
Tabla 7: Valor I ni n l n n i n l r liferación (nM)
Figure imgf000025_0002
La localización del enlazador vcPABA solo en la posición R1 (CAF-551) generó conjugados de anticuerpo-fármaco con mucha menos actividad citotóxica in vitro con respecto a la posición R4 (CAF-471) (Figura 10; Tabla 7). Además, el aumento en el número de grupos etilenglicol como espaciador para el enlazador vcPABA en la posición R4 (CAF-471 (n=0) frente a CAF-553 (n=1) y CAF-558 (n=3)) demostró que aumenta la actividad citotóxica específica de antígeno in vitro (Figura 10). De hecho, mientras que CAF-471 y c AF-553 presentaron una actividad citotóxica baja y no específica de antígeno (intervalo de CI50 de 10 nM y 100 nM, respectivamente) sin diferencias entre las células HT1080 de tipo silvestre (TS) y las que presentan el antígeno (AG), CAF-558 presentó una actividad citotóxica específica de intervalo de 1 nM con una proporción de 500 entre las células HT1080 AG y TS.
Ejemplo 6 - Evaluación in vivo del efecto antitumoral de conjugados anticuerpo-fármaco
Ambos tipos de inmunoconjugados, conjugados de recNgA- y citolisina-anticuerpo, se evaluaron para su efecto antitumoral in vivo en un modelo de ratón de xenoinjerto derivado de paciente para cáncer de páncreas (PAXF-736) seleccionado previamente para la expresión del antígeno.
Los estudios del intervalo de la dosis se realizaron para definir la dosis máxima tolerada para su uso en estudios de eficacia (no mostrado). Para los inmunoconjugados de recNgA, se descubrió una dosis tolerada más alta de 0,5 mg/kg, mientras que los conjugados de anticuerpo de lisina, independientemente del derivado usado, se administraron a dosis de 2,5 mg/kg hasta 20 mg/kg, sin ninguna pérdida de peso o efecto tóxico.
Después se administraron los inmunoconjugados una vez a la semana por vía intraperitoneal durante 5 semanas. El volumen tumoral y el peso corporal se midieron cada 2-3 días. Los ratones PDX tratados con vehículo y tratados con Gemcitabina (150 mg/kg) se usaron como grupos de control negativo y de control positivo, respectivamente. Los resultados se muestran en la figura 11.
Los inmunoconjugados de recNgA (OMTX505) presentaron una alta eficacia antitumoral in vivo (60 %) a una dosis de 0,5 mg/kg en modelos de murino PDX de cáncer de páncreas (Figura 11A). Cuando se combinaba con gemcitabina, incluso mostraba el 100 % de la inhibición del crecimiento tumoral y la regresión del tumor.
De acuerdo con los resultados in vitro (véase la Figura 10 y la Tabla 7), la localización del enlazador vcPABA solo en la posición R1 (OMTX705-551) generó conjugados anticuerpo-fármaco sin actividad antitumoral in vivo (Figura 11B). Apoyando los datos in vitro, el aumento en el número de grupos de etilenglicol como espaciador para el enlazador vcPABA en la posición R4 (OMTX705-471 (n=0) frente a OMTX705-553 (n=l) y OMTX705-558 (n=3)) demostró aumentar el efecto antitumoral in vivo (Figura 11C). OMTX705-471 y OMTX705-553 no mostraron ningún efecto antitumoral in vivo, mientras que OMTX705-558 presentó un efecto de inhibición del crecimiento tumoral del 40 % a una dosis de 2,5 mg/kg en un modelo de ratón de PDX para cáncer de páncreas.
A partir de estos datos, las moléculas de recNgA y TAM558 se seleccionaron como las mejores cargas para los conjugados anticuerpo anti-ENG-fármaco.
Ejemplo 7 - Modelos de sarcoma de Ewing
La plasticidad de las células tumorales permite que determinados tipos de células tumorales altamente malignas se desdiferencien y se involucren en un fenotipo plástico multipotente de tipo embrionario, que les permite 'adaptarse' durante la progresión tumoral y escapar de las estrategias terapéuticas convencionales. Un estudio reciente demostró que la expresión de ENG se correlaciona con la plasticidad de las células tumorales en el sarcoma de Ewing, y que se asocia de manera significativa con una peor supervivencia de los pacientes de sarcoma de Ewing. El sarcoma de Ewing con niveles reducidos de ENG mostró un crecimiento tumoral reducido in vivo. Este estudio, por lo tanto, delinea un papel importante de ENG en la plasticidad de células tumorales y la progresión de tumores agresivos (51).
Los presentes inventores hipotetizan el potencial terapéutico de anticuerpos monoclonales anti-ENG, IT y FAC, en el tratamiento de sarcoma de Ewing.
Se han desarrollado 14 modelos de líneas celulares de sarcoma de Ewing para estudios in vitro, y sus correspondientes modelos de xenoinjerto, para la selección sistemática y la caracterización de moléculas terapéuticas para el tratamiento de sarcoma de Ewing. Se ha confirmado la expresión de ENG en las 14 líneas celulares, y todas las muestras de pacientes humanos de sarcoma de Ewing (n=10) que se han examinado.
Las realizaciones específicas descritas en el presente documento se ofrecen a modo de ejemplo, no a modo de limitación. Todos los subtítulos en el presente documento se incluyen solo por comodidad, y no deben interpretarse como que limitan la divulgación de ninguna manera.
Referencias
1. Weinberg, R.A., et al., Garland science, Taylor & Francis Group LLC, New York, NY, USA, 2007
2. Nieman, K.M., et al., Nat. Med., 2011, 17: 1498-1503
3. Joyce, J.A., et al., Nat. Rev. Cancer, 2009, 9: 239-252
4. Hanahan, D., et al., Cancer Cell, 2012, 21: 309-322
5. Gupta, G.P., et al., Cell, 2006: 127: 679-695
6. Valastyan, S., et al., Cell, 2011, 147: 275-292
7. Meads, M.B, et al., Nat. Rev. Cancer, 2009, 9: 665-674

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado anticuerpo-fármaco que tiene la fórmula I:
A-(L-D)p (I)
o una sal o un solvato farmacéuticamente aceptables del mismo, en donde:
A es un anticuerpo que se une de manera selectiva a la endoglina;
L es un enlazador;
p es de 1 a 10; y
D es un fármaco que comprende una citolisina de fórmula IV:
Figure imgf000056_0001
en donde:
R(i) 2 *es H o alquilo C1-C4 ;
R6 es alquilo C1-C6 ;
R7 *es alquilo C1-C6 , CH2OR19 o CH2OCOR20 , en donde R19 es alquilo, R20 es alquenilo C2-C6 , fenilo o CH2-fenilo;
R9 es alquilo C1-C6 ;
R10 es H, OH, O-alquilo u O-acetilo;
f es 1 o 2;
R11 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000056_0002
en donde
R21 es H, OH, halógeno, NH2 , alquiloxi, fenilo, alquilamino o dialquilamino;
R16 es H o un grupo alquilo C1-C6 ;
R17 está unido directa o indirectamente al enlazador L; y
q es 0, 1, 2 o 3.
2. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde A comprende las regiones determinantes de complementariedad 1-3 de la cadena pesada (CDRH1-3) y las regiones determinantes de complementariedad 1-3 de la cadena ligera (CDRL1-3) que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:
(i) CDRH1: la SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 7;
(ii) CDRH2: la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 8;
(iii) CDRH3: la SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 9;
(iv) CDRL1: la SEQ ID NO: 10 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 10;
(v) CDRL2: la SEQ ID NO: 11 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 11; y
(vi) CDRL3: la SEQ ID NO: 12 o una variante de la misma que tiene hasta 1 o 2 sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO: 12.
3. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 2, en donde A comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
4. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 2, en donde A comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
5. El conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde R17 es C(O)X, CONHNHX, OX, NHX o Sx , en donde X es un enlace al enlazador L.
6. El conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el enlazador L comprende además un espaciador.
7. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 6, en donde el espaciador tiene una longitud de cadena de 2 a 30 átomos.
8. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 6 o de la reivindicación 7, en donde el espaciador comprende o consiste en un grupo -(CH2)n- o -(OCH2CH2V , en donde n = 1 a 10.
9. El conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el espaciador está directamente unido al grupo R17, o se une al grupo R17 a través de un grupo puente.
10. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 9, en donde el espaciador se une al grupo R17 a través de un grupo puente -C(O)X, en donde X es un enlace a R17.
11. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 1, en donde D comprende una citolisina que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000057_0001
12. El conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde L comprende un grupo de unión para la unión a A y una porción escindible de proteasa.
13. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 12, en donde L comprende maleimidocaproil-valina-citrulinap-aminobencilcarbamato.
14. El conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde -L-D tiene una estructura seleccionada del grupo que consiste en:
Figure imgf000058_0001
15. Un conjugado anticuerpo-fármaco tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en medicina.
16. Un conjugado anticuerpo-fármaco tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso en un método de tratamiento de un tumor en un sujeto mamífero.
17. El conjugado anticuerpo-fármaco para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicho conjugado anticuerpo-fármaco es para la administración simultánea, secuencial o separada con uno o más otros fármacos antitumorales.
18. El conjugado anticuerpo-fármaco para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dichos uno o más otros fármacos antitumorales comprenden un agente quimioterapéutico citotóxico o un agente anti-angiogénico o un agente inmunoterapéutico.
19. El conjugado anticuerpo-fármaco para su uso de acuerdo con la reivindicación 18, en donde dichos uno o más otros fármacos antitumorales comprenden Gemcitabina, Abraxano bevacizumab, itraconazol, carboximidotriazol, una molécula anti-PD-1 o una molécula anti-PD-LI.
20. El conjugado anticuerpo-fármaco para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha molécula anti-PD-1 o una molécula anti-PD-LI comprende nivolumab o pembrolizumab.
21. El conjugado anticuerpo-fármaco para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en donde el tumor es una neoplasia sanguínea, cáncer de páncreas, sarcoma de Ewing, cáncer de mama, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de vejiga o cáncer de colon.
22. El conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para su uso en un método de tratamiento de una afección inflamatoria o de una enfermedad ocular.
23. El conjugado anticuerpo-fármaco para su uso de acuerdo con la reivindicación 22, en donde:
dicha afección inflamatoria es artritis reumatoide; y/o
dicha enfermedad ocular es retinopatía diabética o degeneración macular.
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