JP2017504337A - 単一細胞ピペットハンドル及び単一細胞ピペットチップを備える単一細胞ピペット組立体 - Google Patents

Abstract

個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送するための装置において、当該装置は単一細胞ピペットチップを備えており、当該単一細胞ピペットチップは、遠位端を有する構造と、構造内に形成されているＹ字形状マイクロチャネルであって、基部マイクロチャネル、第１分岐マイクロチャネル、及び第２分岐マイクロチャネル、を備えていて、基部マイクロチャネルは構造の遠位端へ延びており、第１分岐マイクロチャネルは第１圧力チャネルへ接続可能であり、第２分岐マイクロチャネルは第２圧力チャネルへ接続可能であり、単一細胞トラップが基部マイクロチャネルの中に、基部マイクロチャネルと第１分岐マイクロチャネル及び第２分岐マイクロチャネルとの収束点より遠位に配置されている、Ｙ字形状マイクロチャネルと、を備えている、単一細胞ピペットチップを備えている装置。【選択図】図１

Description

係属中先行特許出願の参照
本特許出願は、２０１４年１月２８日にザ・メソジスト・ホスピタル、リードン・チンらによって「単一細胞ピペット（ＳＣＰ）及び単一細胞ピペットチップ（ＳＣＰ−ＴＩＰ）」として出願されている係属中の先行米国仮特許出願第６１／９３２，４９３号（弁理士整理番号ＭＥＴＨＯＤＩＳＴ−９ ＰＲＯＶ）の恩典を主張し、同特許出願をこれにより参考文献としてここに援用する。

本発明は、概括的には細胞操作に、より厳密には個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送することに関する。

現在の生物学的研究及び臨床細胞分析は、個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所（例えば、一般的な９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレート、細胞培養皿、バイアル、顕微鏡スライド、など）へ移送することを頻繁に要する。理想的には、その様な単離及び移送は、十分に制御され、高効率で、操作が単純、実施が高速、そして安価であるべきだ。しかしながら、様々な理由で、これまでのところ利用できる手法で完全に満足のゆくものは１つもない。

而して、個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送するための新しい手法が必要とされている。

米国仮特許出願第６１／９３２，４９３号

本発明は、個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送するための新しい手法を提供する。
より厳密には、本発明は、個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送するための新規性のある単一細胞ピペット組立体を提供する。

発明の１つの好適な形態では、単一細胞ピペット組立体が、単一細胞ピペットハンドルと、単一細胞ピペットチップと、を備えている。単一細胞ピペットハンドルは、第１圧力チャネル及び第２圧力チャネルを備えている。単一細胞ピペットチップは、基部マイクロチャネルと、第１分岐マイクロチャネルと、第２分岐マイクロチャネルと、を有するＹ字形状マイクロチャネルを備えている。基部マイクロチャネルは、単一細胞ピペットチップの遠位端へ延びている。Ｙ字形状マイクロチャネルの第１分岐マイクロチャネルは、単一細胞ピペットハンドルの第１圧力チャネルへ接続されている。Ｙ字形状マイクロチャネルの第２分岐マイクロチャネルは、単一細胞ピペットハンドルの第２圧力チャネルへ接続されている。単一細胞トラップが、Ｙ字形状マイクロチャネルの基部マイクロチャネルの中の、基部マイクロチャネルと第１分岐マイクロチャネル及び第２分岐マイクロチャネルとの収束部より遠位に配置されている。

上記の構築に因り、基部マイクロチャネル、第１分岐マイクロチャネル、及び第２分岐マイクロチャネルにプライマ溶液で呼び水を差し、基部マイクロチャネルを細胞のスラリーの中に配置し、陰圧を第１圧力チャネルヘ印加すると、細胞のスラリーが基部マイクロチャネルの中へ、そして第１分岐マイクロチャネルの中へと引き上げられてゆき、スラリーからの単一細胞が単一細胞トラップに捕捉される。次に、基部マイクロチャネルを洗浄溶液の中に配置し、陰圧を第１圧力チャネルヘ印加すると、その結果、洗浄溶液が細胞のスラリーを基部マイクロチャネルから外へ洗い流し、単一細胞トラップに捕捉された細胞が留まることになる。その後、単一細胞トラップに捕捉されている単一細胞を所望場所へ移送しようとするとき、陽圧を第２圧力チャネルへ印加すると、その結果、プライマ溶液が第２分岐マイクロチャネルを通って基部マイクロチャネルに入り、次いで単一細胞ピペットチップの遠位端から外へと洗い流され、それにより、捕捉されている細胞を単一細胞トラップから出し基部マイクロチャネルを通し次いで単一細胞ピペットチップの遠位端から外へと洗い流す。

本発明の１つの好適な形態では、個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送するための装置において、当該装置は、
単一細胞ピペットチップを備えており、当該単一細胞ピペットチップは、
遠位端を有する構造と、
前記構造内に形成されているＹ字形状マイクロチャネルであって、基部マイクロチャネル、第１分岐マイクロチャネル、及び第２分岐マイクロチャネル、を備えていて、前記基部マイクロチャネルは前記構造の遠位端へ延びており、前記第１分岐マイクロチャネルは第１圧力チャネルへ接続可能であり、前記第２分岐マイクロチャネルは第２圧力チャネルへ接続可能であり、単一細胞トラップが前記基部マイクロチャネルの中に、当該基部マイクロチャネルと前記第１分岐マイクロチャネル及び前記第２分岐マイクロチャネルとの収束部より遠位に配置されている、Ｙ字形状マイクロチャネルと、
を備えている、
単一細胞ピペットチップを備えている装置が提供されている。

発明の別の好適な形態では、個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送するための方法において、
単一細胞ピペットチップを提供する段階であって、当該単一細胞ピペットチップは、
遠位端を有する構造と、
前記構造内に形成されているＹ字形状マイクロチャネルであって、基部マイクロチャネル、第１分岐マイクロチャネル、及び第２分岐マイクロチャネル、を備えていて、前記基部マイクロチャネルは前記構造の遠位端へ延びており、前記第１分岐マイクロチャネルは第１圧力チャネルへ接続可能であり、前記第２分岐マイクロチャネルは第２圧力チャネルへ接続可能であり、単一細胞トラップが前記基部マイクロチャネルの中に、当該基部マイクロチャネルと前記第１分岐マイクロチャネル及び前記第２分岐マイクロチャネルとの収束部より遠位に配置されている、Ｙ字形状マイクロチャネルと、
を備えている、単一細胞ピペットチップを提供する段階と、
前記基部マイクロチャネル、前記第１分岐マイクロチャネル、及び前記第２分岐マイクロチャネルにプライマ溶液で呼び水を差す段階と、
前記基部マイクロチャネルを細胞のスラリーの中に位置付ける段階と、
陰圧を前記１分岐マイクロチャネル及び前記基部マイクロチャネルへ印加して、細胞のスラリーを前記基部マイクロチャネルの中へ、そして前記第１分岐マイクロチャネルの中へと引き上げて、スラリーからの単一細胞が前記単一細胞トラップに捕捉されるようにする段階と、
前記基部マイクロチャネルを洗浄溶液の中に位置付ける段階と、
陰圧を前記第１分岐マイクロチャネル及び前記基部マイクロチャネルへ印加して、前記洗浄溶液が細胞のスラリーを前記基部マイクロチャネルから外へ洗い流し、前記単一細胞トラップに捕捉された細胞が留まるようにする段階と、
その後、前記単一細胞トラップに捕捉されている単一細胞を所望場所へ移送しようとするとき、陽圧を前記第２圧力チャネルへ印加して、前記プライマ溶液が前記第２分岐マイクロチャネルを通って前記基部マイクロチャネルへ入り次いで前記単一細胞ピペットチップの遠位端から外へ洗い流されるようにし、それにより、捕捉されている細胞を前記単一細胞トラップから出し前記基部マイクロチャネルを通し次いで単一細胞ピペットチップの前記遠位端から外へと洗い流す段階と、
を備えている方法、が提供されている。

本発明のこれら及び他の目的及び特徴は、次に続く本発明の好適な実施形態の詳細な説明が添付図面と併せて考察されることによってより十分に開示され、なおいっそう明らかになってゆくことであり、添付図面中、同様の符号は同様の部分を指す。

本発明により形成された新規性のある単一細胞ピペット組立体を示す概略図であり、単一細胞ピペット組立体は単一細胞ピペットハンドルと単一細胞ピペットチップを備えている。 図１の新規性のある単一細胞ピペット組立体の単一細胞ピペットハンドルを示す概略図である。 図１の新規性のある単一細胞ピペット組立体の単一細胞ピペットハンドルを、図１の新規性のある単一細胞ピペット組立体の単一細胞ピペットチップへ接続するための接続管を示す概略図である。 単一細胞ピペットチップ内に配置されている単一細胞トラップを含め、図１の新規性のある単一細胞ピペット組立体の単一細胞ピペットチップの詳細を示している概略図である。 単一細胞ピペットチップ内に配置されている単一細胞トラップを含め、図１の新規性のある単一細胞ピペット組立体の単一細胞ピペットチップの詳細を示している概略図である。 図５に示されている単一細胞トラップの更なる詳細を示す概略図である。 図５に示されている単一細胞トラップの更なる詳細を示す概略図であり、単一細胞トラップが捕捉された細胞を保持しているところを示している。 図５に示されている単一細胞トラップの更なる詳細を示す概略図であり、単一細胞トラップが捕捉された細胞を解放しているところを示している。 どの様に、細胞のスラリーが単一細胞ピペットチップの単一細胞トラップを流れ過ぎてゆき、個別細胞が単一細胞トラップに捕捉され、その後に個別細胞が単一細胞トラップから解放されるかを示す概略図の１つである。 図９Ａと共に、どの様に細胞のスラリーが単一細胞ピペットチップの単一細胞トラップを流れ過ぎてゆき、個別細胞が単一細胞トラップに捕捉され、その後に個別細胞が単一細胞トラップから解放されるかを示す概略図である。 図９Ａ−図９Ｂと共に、どの様に細胞のスラリーが単一細胞ピペットチップの単一細胞トラップを流れ過ぎてゆき、個別細胞が単一細胞トラップに捕捉され、その後に個別細胞が単一細胞トラップから解放されるかを示す概略図である。 図９Ａ−図９Ｃと共に、どの様に細胞のスラリーが単一細胞ピペットチップの単一細胞トラップを流れ過ぎてゆき、個別細胞が単一細胞トラップに捕捉され、その後に個別細胞が単一細胞トラップから解放されるかを示す概略図である。 単一細胞ピペットチップの基部マイクロチャネルを、単一細胞トラップによる単一細胞の捕捉を実現し易くするように構成する場合の様々なやり方を示す概略図である。 単一細胞トラップによる単一細胞捕捉の簡略モデルを示す概略図である。 様々な流体抵抗定量Ｒ_ｃ／Ｒ_ｂの下での単一細胞捕捉効率を示すグラフである。 様々な吸引時間及び細胞濃度の下での単一細胞捕捉効率を示すグラフである。 様々な迂回経路幅に係る単一細胞捕捉効率を示す表である。 様々な迂回経路長さに係る単一細胞捕捉効率を示す表である。 どの様に、図１の新規性のある単一細胞ピペット組立体を使用して個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送することができるかを示す概略図の１つである。 図１１と共に、どの様に単一細胞ピペット組立体を使用して個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送することができるかを示す概略図である。 図１１−図１２と共に、どの様に単一細胞ピペット組立体を使用して個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送することができるかを示す概略図である。 図１１−図１３と共に、どの様に単一細胞ピペット組立体を使用して個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送することができるかを示す概略図である。 図１１−図１４と共に、どの様に単一細胞ピペット組立体を使用して個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送することができるかを示す概略図である。 図１１−図１５と共に、どの様に単一細胞ピペット組立体を使用して個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送することができるかを示す概略図である。 図１１−図１６と共に、どの様に単一細胞ピペット組立体を使用して個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送することができるかを示す概略図である。 図１１−図１７と共に、どの様に単一細胞ピペット組立体を使用して個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送することができるかを示す概略図である。 図１１−図１８と共に、どの様に単一細胞ピペット組立体を使用して個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送することができるかを示す概略図である。 個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送する単一細胞ピペット組立体の修正された形態を示していることを別にして図１１と同様の概略図である。 個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送する単一細胞ピペット組立体の修正された形態を示していることを別にして図１２と同様の概略図である。 個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送する単一細胞ピペット組立体の修正された形態を示していることを別にして図１３と同様の概略図である。 個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送する単一細胞ピペット組立体の修正された形態を示していることを別にして図１４と同様の概略図である。 個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送する単一細胞ピペット組立体の修正された形態を示していることを別にして図１５と同様の概略図である。 個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送する単一細胞ピペット組立体の修正された形態を示していることを別にして図１６と同様の概略図である。 個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送する単一細胞ピペット組立体の修正された形態を示していることを別にして図１７と同様の概略図である。 個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送する単一細胞ピペット組立体の修正された形態を示していることを別にして図１８と同様の概略図である。 個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送する単一細胞ピペット組立体の修正された形態を示していることを別にして図１９と同様の概略図である。 単一細胞ピペットチップが複数の単一細胞トラップを備えている、単一細胞ピペット組立体の別の新規性のある形態を示す概略図である。 単一細胞ピペット組立体が複数の単一細胞ピペットチップを備えている、単一細胞ピペット組立体の別の新規性のある形態を示す概略図である。 単一細胞ピペットハンドルの修正された形態を示していることを別にして図２９と同様の概略図である。 単一細胞ピペット組立体が複数の単一細胞ピペットチップを備えている、単一細胞ピペット組立体の別の新規性のある形態を示す概略図である。 単一細胞ピペットハンドルの修正された形態を示していることを別にして図３１と同様の概略図である。 本発明により形成された単一細胞ピペットチップの別の形態を示す概略図であり、単一細胞ピペットチップの本体は、単一細胞トラップを各々備える複数のＹ字形状マイクロチャネルを備えており、更に複数のＹ字形状マイクロチャネルは、共通の遠位端入口／出口を共有している。 どの様に、Ｙ字形状マイクロチャネルの単一細胞トラップに捕捉された細胞がＹ字形状マイクロチャネルからの解放に先立って培養されるかを示す概略図である。

本発明は、個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送するための新しい手法を提供している。
より厳密には、本発明は、個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送するための新規性のある単一細胞ピペット組立体の提供及び使用を備えている。

これより図１−図５を見て、発明の１つの好適な形態では、単一細胞ピペット組立体５が提供されている。単一細胞ピペット組立体５は、単一細胞ピペットハンドル１０と、単一細胞ピペットチップ１５と、を備えている。単一細胞ピペットハンドル１０及び単一細胞ピペットチップ１５は、使用に先立って使用者によって組み立てられる別々の要素として形成されているのが好適であるが、それらは、更に、所望であれば単一の一体部材として形成されていてもよい。本発明の解釈上、単一細胞ピペットハンドル１０及び単一細胞ピペットチップ１５は使用に先立って使用者によって組み立てられる別々の要素として形成されているという文脈で論じられる。

単一細胞ピペットハンドル１０は、本体２０、第１圧力チャネル２５、及び第２圧力チャネル３０を備えている。発明の１つの好適な形態では、第１圧力チャネル２５は、本体２０を通って延びていて第１接続管４０と連通している第１通路３５を備え、第２圧力チャネル３０は、本体２０を通って延びていて第２接続管５０と連通している第２通路４５を備えている。発明の１つの好適な形態では、第１プランジャー５５が第１通路３５内に可動に配置されていて、第１通路３５内での第１プランジャー５５の運動が陽圧又は陰圧を第１接続管４０へ印加するようになっており、また第２プランジャー６０が第２通路４５内に可動に配置されていて、第２通路４５内での第２プランジャー６０の運動が陽圧又は陰圧を第２接続管５０へ印加するようになっている。理解しておくべきこととして、単一細胞ピペットハンドル１０は、第１の機構（例えば第１プランジャー５５）を動かすことによって作動させる陰圧チャネル（例えば第１圧力チャネル２５）及び第２の機構（例えば第２プランジャー６０）を動かすことによって作動させる陽圧チャネル（例えば第２圧力チャネル３０）の提供について、所望であれば、当技術でよく知られている類の従来の空気置換式ピペット（ＡＤＰ：Ａｉｒ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｐｉｐｅｔｔｅ）を備えていてもよい。同じく理解しておくべきこととして、第１接続管４０及び第２接続管５０は、単一細胞ピペットハンドル１０の本体２０から脱着可能であるのが好適であり、そうすれば第１接続管４０及び第２接続管５０を使用後に廃棄することができる（又は、所望であれば次の再使用に備えて適切に清浄化及び滅菌することができる）。

単一細胞ピペットチップ１５は、Ｙ字形状マイクロチャネル７０が中に形成されている本体６５を備えている。本体６５は、遠位先端７５を備えている。Ｙ字形状マイクロチャネル７０は、基部マイクロチャネル８０、第１分岐マイクロチャネル８５、及び第２分岐マイクロチャネル９０、を備えており、基部マイクロチャネル８０と第１分岐マイクロチャネル８５と第２分岐マイクロチャネル９０は収束点９５に収束している。基部マイクロチャネル８０は、収束点９５から遠位先端７５へ延びている。第１分岐マイクロチャネル８５は、収束点９５から第１連結部１００へ延び、そこで第１分岐マイクロチャネル８５は第１接続管４０へ接続する。第２分岐マイクロチャネル９０は、収束点９５から第２連結部１０５へ延び、そこで第２分岐マイクロチャネル９０は第２接続管５０へ接続する。

単一細胞トラップ１１０が、基部マイクロチャネル８０の中に、収束点９５より遠位に配置されている。以下に論じられている様に、単一細胞トラップ１１０は、単一細胞が細胞群から捕捉され、それにより細胞群から単離され、そしてその後、所望場所への移送のために選択的に解放されることを可能にさせる。

より詳しくは、これより図５−図８を見て、単一細胞トラップ１１０は基部マイクロチャネル８０の中に「島」として配置されていて、それにより基部マイクロチャネルを幅広経路１１５と幅狭経路１２０に分割している。幅広経路１１５は、細胞及び流体を通過させることができるサイズである。幅狭経路１２０は、流体だけを通過させるサイズである。単一細胞トラップ１１０は、流れ転向部１３０及び溜め１３５を備える本体１２５を備えている。流れ転向部１３０は、基部マイクロチャネル８０の側壁から間隔を空けられていて、単一細胞トラップ１１０を通り過ぎてゆく流れを幅広経路１１５か又は幅狭経路１２０のどちらかへ転向させる。溜め１３５は、本体１２５の遠位側で流れ転向部１３０の外側（且つ流れ転向部１３０の最遠位部分より近位）に配置されており、流れ転向部１３０及び基部マイクロチャネル８０の側壁と一体で１つの個別細胞のための座を提供する。

発明の１つの好適な形態では、単一細胞ピペットチップ１５は、５ｍｍの長さ及び３００μｍの遠位先端幅を有していてもよい。基部マイクロチャネル８０は４０μｍの幅を有し、幅広経路１１５は２２μｍの幅、幅狭経路１２０は３μｍの幅を有し、流れ転向部１３０は６μｍの幅を有し、溜め１３５は１２μｍの幅及び１０μｍの深さを有していてもよい。

単一細胞ピペットチップ１５は、先ず単一細胞ピペットチップをＣＡＤソフトウェアで設計し、次いで単一細胞ピペットチップをフォトリソグラフィ技法及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）成形技法を使用して製作することによって提供されるのが好適である。

以上の構築に因り、これより図９Ａ−図９Ｄを見て、細胞Ｃのスラリーが基部マイクロチャネル８０を近位方向に（即ち、遠位先端７５から収束点９５へ向かって）通るとき、流れ転向部１３０が、流れの一部に幅広経路１１５を通行してゆくように、そして流れの一部に幅狭経路１２０を通行してゆくように仕向ける。注目すべきは、スラリー中の細胞Ｃが単一細胞トラップ１１０の流れ転向部１３０に出合うと、細胞Ｃの殆どは幅広経路１１５を辿り単一細胞トラップ１１０をやり過ごす、ということである。図９Ａ−図９Ｄを見られたし。とはいえ、場合に依っては、単一細胞Ｃは単一細胞トラップ１１０の溜め１３５の中へ転向されることになる。図９Ｃを見られたし。細胞Ｃはそれらが幅広経路１１５を通って進もうとする際に幅広経路１１５内で流れ転向部１３０に隣接して集塊化することがあり、この細胞集塊化は単一細胞が溜め１３５の中へ転向されるのを支援する、ということに注目されたい。その後、今度は図９Ｄを見て、捕捉された細胞Ｃは、流体を基部マイクロチャネル８０を通して遠位方向に流すことによって（即ち、流体を収束点９５から遠位先端７５へ流すことによって）、単一細胞トラップ１１０から選択的に解放されることになる（例えば所望場所への移送のため）。

単一細胞トラップ１１０の周りには２つの潜在的流れ経路である捕捉経路（即ち幅狭経路１２０）と迂回経路（即ち幅広経路１１５）があることに注目されたい。流れプロファイルシミュレーションは、迂回経路（即ち幅広経路１１５）に沿った流量は捕捉経路（即ち幅狭経路１２０）に沿った流量よりはるかに大きいことを示しており、単一細胞は捕捉経路に沿って流れるより迂回経路に沿って流れる方を好み、それにより概して捕捉失敗という結果になる、ということが示唆される。単一細胞捕捉は、細胞濃度が約１０^５細胞／ｍｌより低い場合にはたまにしか起こらないことが判明している。また一方、細胞濃度が約１０^６細胞／ｍｌより高い場合、迂回経路（即ち幅広経路１１５）が他の細胞によって占められる頻度はこのレベルではより高くなることから、単一細胞捕捉はより度々起こり得る。言い換えれば、この高い濃度レベルでは、細胞が迂回経路（即ち幅広経路１１５）を通って進もうとする際に、細胞は迂回経路（即ち幅広経路１１５）の中で集塊化する可能性がより高くなり、この細胞集塊化は単一細胞が単一細胞トラップ１１０の溜め１３５の中へ転向されるのを支援することになる。

単一細胞捕捉効率に影響を与え得る要因は、流体抵抗比、吸引時間、及び細胞濃度を含む様々な要因が特定されている。実験結果は、迂回経路（即ち幅広経路１１５）の幅が捕捉されるべき細胞の直径より大凡１．６７倍広いときに最も高い捕捉効率が達成されることを明らかにしている。捕捉経路に沿った流体抵抗（Ｒ_ｃ）の迂回経路に沿った流体抵抗（Ｒ_ｂ）に対する比の減少も同様に単一細胞トラップ１１０による単一細胞捕捉の公算を増加させることができる。言い換えれば、今度は図１０を見て、幅広経路１１５の長さを幅狭経路１２０に対比して増加させ、それにより幅広経路１１５の流体抵抗Ｒ_ｂを幅狭経路１２０の流体抵抗Ｒ_ｃに対比して増加させることによって、単一細胞捕捉の公算を増加させることができる。

より長い吸引時間が単一細胞捕捉効率改善に有益であることも判明している。
捕捉経路に沿った流体抵抗の迂回経路に沿った流体抵抗に対する比（Ｒ_ｃ／Ｒ_ｂ）が３６で、吸引時間が５秒、そして細胞懸濁液が１０^７／ｍＬの濃度を有しているとき、単一細胞捕捉効率は９６．７％にも達し得る。

限定するわけではないが更なる実施例として、図１０Ａは単一細胞トラップ１１０による単一細胞捕捉の簡略モデルを示し、図１０Ｂは様々な流体抵抗定量Ｒ_ｃ／Ｒ_ｂの下での単一細胞捕捉効率を示し、図１０Ｃは様々な吸引時間及び細胞濃度の下での単一細胞捕捉効率を示し、図１０Ｄは様々な迂回経路幅に係る単一細胞捕捉効率を示し、図１０Ｅは様々な迂回経路長さに係る単一細胞捕捉効率を示している。

図１１−図１９は、どの様に単一細胞ピペット組立体５を使用して個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送することができるかを示している。
より詳しくは、１つの好適な使用の方法では、先ず、第１接続管４０及び第２接続管５０が単体細胞ピペットハンドル１０の本体２０へ事前に取り付けられていない場合、最初にそれら接続管を第１接続管４０が第１圧力チャネル２５と流体連通し第２接続管５０が第２圧力チャネル３０と流体連通するように単体細胞ピペットハンドル１０へ取り付ける。図１１及び図１２を見られたし。第１接続管４０が第１圧力チャネル２５と流体連通し、第２接続管５０が第２圧力チャネル３０と流体連通しているとき、第１接続管４０は事実上第１圧力チャネル２５の延長部を構成し、第２接続管５０は事実上第２圧力チャネル３０の延長部を構成していることが理解されるであろう。

次いで、第１接続管４０及び第２接続管５０にプライマ溶液で呼び水を差すが、それは、即ち、第１接続管４０及び第２接続管５０の遠位端をプライマ溶液１４０の中に位置付け、次いで第１プランジャー５５を第１通路３５内で第２プランジャー６０を第２通路４５内で後退させることによって行われる。図１３を見られたし。プライマ流体は単一細胞ピペットハンドル１０の本体２０の第１通路３５と第２通路４５のどちらにも引き入れられないことに留意されたい。結果として、単一細胞ピペットハンドル１０の本体２０の第１通路３５と第２通路４５は非汚染である。次いで、第１接続管４０及び第２接続管５０の遠位端をプライマ溶液１４０から引き出す。図１４を見られたし。

次に、第１接続管４０を単一細胞ピペットチップ１５の第１連結部１００へ接続し、第２接続管５０を単一細胞ピペットチップ１５の第２連結部１０５へ接続することによって、単一細胞ピペットチップ１５を単一細胞ピペットハンドル１０へ取り付ける。図１５を見られたし。次いで、単一細胞ピペットチップ１５の中のＹ字形状マイクロチャネル７０に、第１接続管４０及び第２接続管５０中のプライマ溶液を使用して呼び水を差し、即ち、第１プランジャー５５を第１通路３５内で第２プランジャー６０を第２通路４５内で前進させることによって行われる。図１６を見られたし。第１プランジャー５５を第１通路３５内で、少なくとも幾らかのプライマ溶液を単一細胞ピペットチップ１５の遠位端から外へ射出する程度に前進させ、また第２プランジャー６０を第２通路４５内で、少なくとも幾らかのプライマ溶液を単一細胞ピペットチップ１５の遠位端から外へ射出する程度に前進させ、それにより確実にＹ字形状マイクロチャネル７０がプライマ溶液で充満されるようにするのが好適である。

次に、単一細胞ピペット１５の遠位先端７５を細胞のスラリー１４５の中に配置し、陰圧を第１圧力チャネル２５へ印加し、即ち第１プランジャー５５を第１通路３５内で後退させることによって陰圧を印加し、それにより細胞のスラリーを近位方向に基部マイクロチャネル８０の中へそして第１分岐マイクロチャネル８５の中へと引き上げる。図１７を見られたし。この行為は、スラリーからの単一細胞が例えば図９Ａ−図９Ｃに示されている方式で単一細胞トラップ１１０に捕捉されるように仕向ける。プライマ溶液１４０、細胞のスラリー１４５は、どちらも、単一細胞ピペットハンドル１０の本体２０の第１通路３５にも第２通路４５にも引き入れられないことに留意されたい。結果として、単一細胞ピペットハンドル１０の本体２０の第１通路３５及び第２通路４５は非汚染に保たれる。次いで、単一細胞ピペット１５の遠位先端７５を細胞のスラリー１４５から引き出し、洗浄溶液１５０の中に位置付ける。陰圧を第１圧力チャネル２５へ印加し、即ち第１プランジャー５５を第１通路４５内で後退させることによって陰圧を印加すると、洗浄溶液が細胞のスラリーを基部マイクロチャネル８０から外へ洗い流し、単一細胞トラップ１０には捕捉された細胞が留まったままになる。図１８を見られたし。この場合も同様に、プライマ溶液１４０、細胞のスラリー１４５、洗浄溶液１５０は、どれも、単一細胞ピペットハンドル１０の本体２０の第１通路３５にも第２通路４５にも引き入れられないことに留意されたい。結果として、単一細胞ピペットハンドル１０の本体２０の第１通路３５及び第２通路４５は非汚染に保たれる。

その後、単一細胞トラップ１１０の中に捕捉されている単一細胞を所望場所へ移送しようとするとき、陽圧を第２圧力チャネル３０へ印加し、即ち第２プランジャー６０を遠位方向に第２通路４５を通して前進させることによって陽圧を印加すると、その結果、第２接続管５０の中のプライマ溶液が、第２分岐マイクロチャネル９０を通って基部マイクロチャネル８０へ入り、次いで単一細胞ピペットチップ１５の遠位先端７５から外へと洗い流され、それにより、捕捉されている細胞を（例えば図９Ｄに示されている方式で）単一細胞トラップ１１０から外へ、而して単一細胞ピペットチップ１５の遠位先端７５から外へ、そして適切な受け器（又は支持体）１５５（例えば、一般的な９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレート、細胞培養皿、バイアル、顕微鏡スライド、など）の中へ（又は上へ）と洗い流す。

プロセス全体は１０秒以内で完了させることができる。
而して、単一細胞ピペット組立体５を使用して単一細胞を細胞懸濁液から直接得ることができるということが分かるであろう。単一細胞ピペット組立体５は、操作の単純さ、効率の高さ、及び低いコストを特徴とする。

単一細胞ピペット組立体５は単一細胞トラップ１１０によって捕捉される個別細胞に害を与えないので、単一細胞ピペット組立体５は生きている単一細胞の単離及び移送に使用できる、ということは注目に値する。

同様に注目に値することとして、本発明に係り、単一細胞の単離及び移送は、空気置換式ピペット（ＡＤＰ）を用いて液体を移送するのに使用される操作と概ね同様の操作を使用して行われ、それにより操作上の訓練及びコストが格段に最小化される。

単一細胞ピペット組立体５は、上記プロセスを繰り返すことによって追加の個別細胞を単離し移送するのに使用することができる。これに関し理解しておくべきこととして、細胞試料同士間の相互汚染を回避するのが望ましい場合、第１接続管４０、第２接続管５０、及び単一細胞ピペットチップ１５を単一細胞ピペットハンドル１０の本体２０から取り外し、取り換えるようにしてもよい。プライマ溶液１４０、細胞のスラリー１４５、及び洗浄溶液１５０は、単一細胞ピペットハンドル１０の本体２０の第１通路３５又は第２通路４５の中へ決して引き上げられることがないため、単一細胞ピペットハンドル１０の本体２０の第１通路３５及び第２通路４５は非汚染に保たれることに留意されたい。而して、第１接続管４０、第２接続管５０、及び単一細胞ピペットチップ１５を、細胞試料間で取り換えることにより、同じ単一細胞ピペットハンドル１０を再使用することができるにもかかわらず相互汚染は防止される。

図１−図１９に示されている単一細胞ピペット組立体５は、陽圧又は陰圧を第１圧力チャネル２５及び第２圧力チャネル３０へそれぞれ印加するための第１プランジャー５５及び第２プランジャー６０を備えている。とはいえ、所望であれば、陽圧又は陰圧を第１圧力チャネル２５及び第２圧力チャネル３０へそれぞれ印加するための他の手段が提供されていてもよい。限定するわけではないが一例として、これより図２０−図２８を見て、第１ねじ駆動部５５及び第２ねじ駆動部６０が、陽圧又は陰圧を第１圧力チャネル２５及び第２圧力チャネル３０へそれぞれ印加するために提供されていてもよい。

所望であれば、単一細胞ピペットハンドル１０は、陽圧及び陰圧を単一細胞ピペットチップ１５の第１連結部１００へ印加することのできる第１圧力チャネルと陽圧及び陰圧を単一細胞ピペットチップ１５の第２連結部１０５へ印加することができる第２圧力チャネルとを備える代わりの加圧／減圧装置、例えば適切な多チャネル加圧／減圧源、と置き換えられてもよい。

本発明の別の形態では、単一細胞ピペット組立体５は、１つより多い細胞を単一細胞ピペット組立体のサイクル１回毎に単離及び移送するように構成することもできる。より詳しくは、Ｎ個の細胞を単一細胞ピペット組立体５のサイクル１回毎に移送することが所望される場合、Ｎ個の単一細胞トラップ１１０を単一細胞ピペットチップ１５の基部マイクロチャネル８０の中に配置させる。結果として、単一細胞ピペット組立体５のサイクル１回毎にＮ個の細胞が捕捉され移送される。図２８Ａを見られたし。

更に、所望であれば、単一細胞ピペット組立体５は、複数の単一細胞ピペットチップ１５を単一細胞ピペットハンドル１０へ取り付けるように構成されてもよく、そうすれば、単一細胞ピペット組立体５は、複数の細胞をそれら細胞を互いから空間的に分離させた状態で同時に捕捉し、次いで同時に移送することができる。この状況では、単一細胞ピペットハンドル１０は、第１接続管４０と第２接続管５０の複数対を受け入れるように、また第１接続管４０と第２接続管５０の各対について第１接続管４０を第１圧力チャネル２５へ第２接続管５０を第２圧力チャネル３０へそれぞれ接続するように、構成されている。図２９−図３２を見られたし。

図２９及び図３０では、単一細胞ピペット組立体５は、単一細胞ピペットハンドル１０へ取り付けられた４つの単一細胞ピペットチップ１５を（端面図で見て）直線状の構成に配列させて備えており、図３１及び図３２では、単一細胞ピペット組立体５は、単一細胞ピペットハンドル１０へ取り付けられた８つの単一細胞ピペットチップ１５を（端面図で見て）直線状の構成に配列させて備えている。

より多い又はより少ない単一細胞ピペットチップ１５が単一細胞ピペットハンドル１０へ取り付けられていてもよいものと理解しておきたい。
同じく、単一細胞ピペットハンドル１０へ取り付けられている複数の単一細胞ピペットチップ１５は、（端面図で見て）直線状以外の構成に配列されていてもよいものと理解しておきたい。限定するわけではないが一例として、（単一細胞ピペットハンドル１０へ取り付けられている）複数の単一細胞ピペットチップ１５は、（端面図で見て）二次行列構成、例えば８ｘ１２行列構成又は１６ｘ２４行列構成など、に配列されていてもよい。限定するわけではないが更なる例として、複数の単一細胞ピペットチップ１５は、（端面図で見て）円形構成に配列されていてもよい。

所望であれば、複数の単一細胞ピペットチップ１５は、単体構築物を形成するように互いへ固着されていてもよいし又は互いと一体に形成されていてもよい。
これより図３３を見て、本発明の更に別の好適な形態では、複数のＹ字形状マイクロチャネル７０が中に形成されている本体６５を備える単一細胞ピペットチップ１５が提供されており、複数のＹ字形状マイクロチャネル７０は共通の遠位端入口／出口を共有している。より詳しくは、本発明のこの形態では、本体６５は、遠位先端に通じる中央開口部１６０（図３３に図示されていないが、図４及び図５に示されている遠位先端７５に類似）を有している。以上に論じられている様に、各Ｙ字形状マイクロチャネル７０は、基部マイクロチャネル８０、第１分岐マイクロチャネル８５、及び第２分岐マイクロチャネル９０を備えており、基部マイクロチャネル８０と第１分岐マイクロチャネル８５と第２分岐マイクロチャネル９０は収束点９５で収束している。基部マイクロチャネル８０は、収束点９５から中央開口部１６０へ、次いで遠位先端７５へと延びている。第１分岐マイクロチャネル８５は、収束点９５から第１連結部１００へ延びており、第１連結部１００は、単一細胞ピペットハンドル１０の第１圧力チャネル２５へ（又は陽圧／陰圧源を提供している別の第１の圧力チャネルへ）接続するように構成されている。第２分岐マイクロチャネル９０は、収束点９５から第２連結部１０５へ延びており、第２連結部１０５は、単一細胞ピペットハンドル１０の第２圧力チャネル３０へ（又は陽圧／陰圧源を提供している別の第２の圧力チャネルへ）接続するように構成されている。この場合も同様に、単一細胞トラップ１１０（図３３には縮尺が理由で概略的に示されている）が、各基部マイクロチャネル８０の中に、収束点９５より遠位に配置されている。以上に論じられている様に、各単一細胞トラップ１１０が複数のＹ字形状マイクロチャネル７０及び適切な方式（順次式を含む）で作動する適切な陽圧／陰圧源と連携して働くことで、単一細胞が細胞群から捕捉され、それにより細胞群から単離され、その後所望場所への移送のために選択的に解放されることを可能にさせる。

而して、図３３に示されている単一細胞ピペットチップ１５は、単体構築物として一体に取り付けられてはいるが共通の遠位端入口／出口を共有するように修正されている複数の単一細胞ピペットチップ１５から成る等価物を提供していることが分かるであろう。

図３３に示されている単一細胞ピペットチップ１５は、単一の遠位先端（図３３には示されていないが、図４及び図５に示されている遠位先端７５に類似）及び単一の中央開口部１６５を単一細胞ピペットチップ１５に提供されているＹ字形状マイクロチャネル７０の各々のための遠位端入口／出口として使用することができるので、極めて好都合であろう。而して、所望であれば、前述の呼び水を差す段階（プライマ溶液１４０を用いる）、単一細胞捕捉段階（細胞のスラリー１４５及び単一細胞トラップ１１０を用いる）、及び洗浄段階（洗浄溶液１５０を用いる）は、単一細胞ピペットチップ１５の本体６５内のＹ字形状マイクロチャネル７０の各々について、プライマ溶液１４０の共通の供給源、細胞のスラリー１４５の共通の供給源、及び／又は洗浄溶液１５０の共通の供給源を使用して同時に行うようにし、次いで、上述の細胞解放段階（プライマ溶液１４０を用いての洗い流しによる）は、Ｙ字形状マイクロチャネル７０の各々について個別に（即ち、第２連結部１０５の各々へ一度に１つずつ選択的に陽圧を印加することによって）行うようにすることもできる。

更に、細胞が単一細胞トラップ１１０に捕捉された後であって細胞が単一細胞トラップ１１０から解放される前に当該細胞を培養することが実施可能である。限定するわけではないが一例として、図３３に示されている単一細胞ピペットチップに係り、個別細胞を個々のＹ字形状マイクロチャネル７０の単一細胞トラップ１１０に着座させた後、当該細胞を培養（例えば１時間から３時間）し、その後にＹ字形状マイクロチャネル７０の単一細胞トラップ１１０から解放させてもよい。図３４を見られたし。本発明のこの形態では、トリプシンが培養された細胞の単一細胞トラップ１１０からの解放を容易にすることができことから、プライマ溶液１４０はトリプシンを備えているのが望ましい。

好適な実施形態の修正形
本発明の特質を解説するためにここに説明され示されている諸部分の詳細事項、材料、工程、及び配列における多くの追加の変更が、当業者によって、なおも本発明の原理及び範囲内に留まりながらになされ得るものと理解されたい。

５ 単一細胞ピペット組立体
１０ 単一細胞ピペットハンドル
１５ 単一細胞ピペットチップ
２０ 単一細胞ピペットハンドルの本体
２５ 第１圧力チャネル
３０ 第２圧力チャネル
３５ 第１通路
４０ 第１接続管
４５ 第２通路
５０ 第２接続管
５５ 第１プランジャー（第１ねじ駆動部）
６０ 第２プランジャー（第２ねじ駆動部）
６５ 単一細胞ピペットチップの本体
７０ Ｙ字形状マイクロチャネル
７５ 単一細胞ピペットチップの遠位先端
８０ 基部マイクロチャネル
８５ 第１分岐マイクロチャネル
９０ 第２分岐マイクロチャネル
９５ 収束点
１００ 第１連結部
１０５ 第２連結部
１１０ 単一細胞トラップ
１１５ 幅広経路
１２０ 幅狭経路
１３０ 流れ転向部
１３５ 溜め
１４０ プライマ溶液
１４５ 細胞のスラリー
１５０ 洗浄溶液
１５５ 受け器
１６０ 中央開口部
Ｃ 細胞

Claims (33)

1. 個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送するための装置において、当該装置は、
   単一細胞ピペットチップを備えており、当該単一細胞ピペットチップは、
   遠位端を有する構造と、
   前記構造内に形成されているＹ字形状マイクロチャネルであって、基部マイクロチャネル、第１分岐マイクロチャネル、及び第２分岐マイクロチャネル、を備えていて、前記基部マイクロチャネルは前記構造の前記遠位端へ延びており、前記第１分岐マイクロチャネルは第１圧力チャネルへ接続可能であり、前記第２分岐マイクロチャネルは第２圧力チャネルへ接続可能であり、単一細胞トラップが前記基部マイクロチャネルの中に、当該基部マイクロチャネルと前記第１分岐マイクロチャネル及び前記第２分岐マイクロチャネルとの収束部より遠位に配置されている、Ｙ字形状マイクロチャネルと、
   を備えている、
   単一細胞ピペットチップを備えている装置。
2. 前記単一細胞トラップは、当該単一細胞トラップを通り過ぎてゆく流れを幅広経路又は幅狭経路の中へ転向するための流れ転向部を画定している本体を備えており、前記本体と前記構造は一体で、前記流れ転向部によって前記幅狭経路へ向けて転向された細胞を捕捉するための溜めを画定している、請求項１に記載の装置。
3. 前記単一細胞トラップの前記本体は細胞がそれを通過するのを防止するのに十分に小さい距離だけ前記構造から隔てられている、請求項２に記載の装置。
4. 前記幅広経路の幅は捕捉されるべき前記細胞の直径より大凡１．６７倍広い、請求項２に記載の装置。
5. 前記幅狭経路に沿った流体抵抗（Ｒ_ｃ）の前記幅広経路に沿った流体抵抗（Ｒ_ｂ）に対する比は３６である、請求項２に記載の装置。
6. 前記基部マイクロチャネルは複数の単一細胞トラップを備えており、更に、前記単一細胞トラップは、どれも、共通の方向に方向決めされている各自の流れ転向部を有している、請求項２に記載の装置。
7. 前記単一細胞ピペットチップの前記第１分岐マイクロチャネルへ接続可能な第１圧力チャネルと、前記単一細胞ピペットチップの前記第２分岐マイクロチャネルへ接続可能な第２圧力チャネルと、を備えている単一細胞ピペットハンドル、を更に備えている請求項１に記載の装置。
8. 前記単一細胞ピペットチップは前記単一細胞ピペットハンドルから分離可能である、請求項７に記載の装置。
9. 前記単一細胞ピペットハンドルの前記第１圧力チャネルは前記単一細胞ピペットチップの前記第１分岐マイクロチャネルへ第１接続管によって接続されており、前記単一細胞ピペットハンドルの前記第２圧力チャネルは前記単一細胞ピペットチップの前記第２分岐マイクロチャネルへ第２接続管によって接続されている、請求項７に記載の装置。
10. 前記第１接続管は前記単一細胞ピペットハンドルの前記第１圧力チャネル及び前記単一細胞ピペットチップの前記第１分岐マイクロチャネルへ脱着可能に接続されており、前記第２接続管は前記単一細胞ピペットハンドルの前記第２圧力チャネル及び前記単一細胞ピペットチップの前記第２分岐マイクロチャネルへ脱着可能に接続されている、請求項９に記載の装置。
11. 前記単一細胞ピペットチップは前記単一細胞ピペットハンドルと一体に形成されている、請求項７に記載の装置。
12. 単体構築物を形成するように互いへ取り付けられた複数の構造を備えている請求項１に記載の装置。
13. 前記複数の構造は互いへ固着されている、請求項１２に記載の装置。
14. 前記複数の構造は互いと一体に形成されている、請求項１２に記載の装置。
15. 前記構造は複数のＹ字形状マイクロチャネルを備えている、請求項１に記載の装置。
16. 前記複数のＹ字形状マイクロチャネルの各基部マイクロチャネルは、当該複数のＹ字形状マイクロチャネルのどの他の基部マイクロチャネルとも別々に終端している、請求項１５に記載の装置。
17. 前記複数のＹ字形状マイクロチャネルの各基部マイクロチャネルは、当該複数のＹ字形状マイクロチャネルのどの他の基部マイクロチャネルとも共通の遠位端入口／出口に終端している、請求項１５に記載の装置。
18. 個別細胞を細胞群から単離し、当該の単離された細胞を所望場所へ移送するための方法において、
    単一細胞ピペットチップを提供する段階であって、当該単一細胞ピペットチップは、
    遠位端を有する構造と、
    前記構造内に形成されているＹ字形状マイクロチャネルであって、基部マイクロチャネル、第１分岐マイクロチャネル、及び第２分岐マイクロチャネル、を備えていて、前記基部マイクロチャネルは前記構造の遠位端へ延びており、前記第１分岐マイクロチャネルは第１圧力チャネルへ接続可能であり、前記第２分岐マイクロチャネルは第２圧力チャネルへ接続可能であり、単一細胞トラップが前記基部マイクロチャネルの中に、当該基部マイクロチャネルと前記第１分岐マイクロチャネル及び前記第２分岐マイクロチャネルとの収束部より遠位に配置されている、Ｙ字形状マイクロチャネルと、
    を備えている、単一細胞ピペットチップを提供する段階と、
    前記基部マイクロチャネル、前記第１分岐マイクロチャネル、及び前記第２分岐マイクロチャネルにプライマ溶液で呼び水を差す段階と、
    前記基部マイクロチャネルを細胞のスラリーの中に位置付ける段階と、
    陰圧を前記１分岐マイクロチャネル及び前記基部マイクロチャネルへ印加して、前記細胞のスラリーを前記基部マイクロチャネルの中へ、そして前記第１分岐マイクロチャネルの中へと引き上げて、前記スラリーからの単一細胞が前記単一細胞トラップに捕捉されるようにする段階と、
    前記基部マイクロチャネルを洗浄溶液の中に位置付ける段階と、
    陰圧を前記第１分岐マイクロチャネル及び前記基部マイクロチャネルへ印加して、前記洗浄溶液が前記細胞のスラリーを前記基部マイクロチャネルから外へ洗い流し、前記単一細胞トラップに前記捕捉された細胞が留まるようにする段階と、
    その後、前記単一細胞トラップに捕捉されている前記単一細胞を所望場所へ移送しようとするとき、陽圧を前記第２圧力チャネルへ印加して、前記プライマ溶液が前記第２分岐マイクロチャネルを通って前記基部マイクロチャネルへ入り次いで前記単一細胞ピペットチップの遠位端から外へ洗い流されるようにし、それにより前記捕捉されている細胞を前記単一細胞トラップから出し前記基部マイクロチャネルを通し次いで単一細胞ピペットチップの前記遠位端から外へと洗い流す段階と、
    を備えている方法。
19. 前記単一細胞トラップは、当該単一細胞トラップを通り過ぎてゆく流れを幅広経路又は幅狭経路の中へ転向するための流れ転向部を画定している本体を備えており、前記本体と前記構造は一体で、前記流れ転向部によって前記幅狭経路へ向けて転向された細胞を捕捉するための溜めを画定している、請求項１８に記載の方法。
20. 前記単一細胞トラップの前記本体は細胞がそれを通過するのを防止するのに十分に小さい距離だけ前記構造から隔てられている、請求項１９に記載の方法。
21. 前記幅広経路の幅は捕捉されるべき前記細胞の直径より大凡１．６７倍広い、請求項１９に記載の方法。
22. 前記幅狭経路に沿った流体抵抗（Ｒｃ）の前記幅広経路に沿った流体抵抗（Ｒｂ）に対する比は３６である、請求項１９に記載の方法。
23. 前記懸濁液は、１０^５細胞／ｍＬより大きい濃度を有している、請求項１９に記載の方法。
24. 前記懸濁液は、大凡１０^７細胞／ｍＬの濃度を有している、請求項２３に記載の方法。
25. 前記細胞のスラリーは前記基部マイクロチャネルの中へそして前記第１分岐マイクロチャネルの中へ大凡５秒の期間に亘って引き上げられる、請求項１９に記載の方法。
26. 前記基部マイクロチャネルは複数の単一細胞トラップを備えており、更に、前記単一細胞トラップは、どれも、共通の方向に方向決めされている各自の流れ転向部を有している、請求項１９に記載の装置。
27. 前記単一細胞ピペットチップの前記第１分岐マイクロチャネルへ接続可能な第１圧力チャネルと、前記単一細胞ピペットチップの前記第２分岐マイクロチャネルへ接続可能な第２圧力チャネルと、を備えている単一細胞ピペットハンドル、を更に備えている請求項１８に記載の方法。
28. 前記単一細胞ピペットチップは前記単一細胞ピペットハンドルから分離可能である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記単一細胞ピペットハンドルの前記第１圧力チャネルは前記単一細胞ピペットチップの前記第１分岐マイクロチャネルへ第１接続管によって接続されており、前記単一細胞ピペットハンドルの前記第２圧力チャネルは前記単一細胞ピペットチップの前記第２分岐マイクロチャネルへ第２接続管によって接続されている、請求項２７に記載の方法。
30. 前記第１接続管は前記単一細胞ピペットハンドルの前記第１圧力チャネル及び前記単一細胞ピペットチップの前記第１分岐マイクロチャネルへ脱着可能に接続されており、前記第２接続管は前記単一細胞ピペットハンドルの前記第２圧力チャネル及び前記単一細胞ピペットチップの前記第２分岐マイクロチャネルへ脱着可能に接続されている、請求項２９に記載の方法。
31. 前記単一細胞ピペットチップは前記単一細胞ピペットハンドルと一体に形成されている、請求項２９に記載の方法。
32. 前記洗浄溶液が前記細胞のスラリーを前記基部マイクロチャネルから洗い流し、前記捕捉された細胞が前記単一細胞トラップに留った状態になった後で、当該捕捉された細胞が当該単一細胞トラップから外へ洗い流される前に、前記捕捉された細胞を培養する、請求項１８に記載の方法。
33. 前記プライマ溶液はトリプシンを備えている、請求項３２に記載の方法。