CN206751793U - 收集少量细胞的微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种收集少量细胞的微流控芯片，包括基片和盖片，基片上设有微流通道区，其一侧依次设有用于放置含细胞液体的细胞汇集区和驱动装置，另一侧设有废液汇集区，其中，所述微流通道区上间隔布置若干微流通道，该微流通道的横截面尺寸小于细胞，在驱动装置的作用下，细胞汇集区内的液体通过微流通道进入废液汇集区，细胞停留在细胞汇集区内。该微流控芯片不仅能够实现含细胞液体中少量细胞的高效收集，而且不会对细胞活性造成影响；更为突出的是，该微流控芯片可替代离心法来处理细胞，实现细胞收集与处理的全程连续操作，大幅度缩减了细胞收集与处理的时间，从而为生物学和医学研究及应用提供了便利。

Description

收集少量细胞的微流控芯片

技术领域

本实用新型属于生物技术工程及医学领域，涉及一种微流控芯片，尤其涉及一种收集细胞溶液以及人的体液(包括尿液、胸腔积液、腹水以及唾液等)中少量细胞的微流控芯片。

背景技术

细胞鉴定与检测是生物和医学研究及其应用领域的最基本内容之一。鉴定与检测细胞前，必须首先收集细胞，才能进行相应的处理(例如免疫荧光染色、显微镜计数以及流式细胞仪检测等)。目前，在生物学和医学研究与应用领域，普遍采用离心法(离心重力大约在100～300g之间)来收集溶液或人体液中的细胞。此外，对收集的细胞进行后续处理(例如免疫荧光染色等操作)时，离心法也几乎是唯一的方法对每一步处理后的细胞进行洗涤和重悬。然而，离心方法收集并处理细胞主要存在以下三个方面的问题：

(1)离心过程中极易丢失大量细胞。已有研究证实，每一次离心大约会损失7％数量的细胞。这一损失比例在离心大量细胞时对结果不会造成明显误差。然而，很多医学样品(例如唾液、胸腔积液、腹水、尿液)中存在的细胞数量往往极少(几千到几万个)；生物学研究与应用中很多具有特定生物学功能的细胞数量也很少(往往细胞数量比例仅有1％或以下)。因此，通过离心方法收集或处理细胞时，细胞数量损失将会非常明显。

(2)细胞收集与处理往往涉及多步离心，细胞损失率不仅叠加，而且耗时长(每一步大约耗费6分钟)，这一弊端在收集并处理少量细胞时更为突出。

(3)离心后细胞的活性降低，可能对检测与鉴定结果造成一定影响。

因此，亟待研究出一种能有效收集细胞的装置或方法来解决上述问题。

实用新型内容

实用新型目的：本实用新型旨在提供一种能高效分离并收集含细胞液体中的细胞的微流控芯片。

技术方案：本实用新型所述的微流控芯片，包括基片和盖片，基片上设有微流通道区，该微流通道区的一侧依次设有用于放置含细胞液体的细胞汇集区和驱动装置，另一侧设有废液汇集区，其中，所述微流通道区上间隔布置若干微流通道，该微流通道的横截面尺寸小于细胞，在驱动装置的作用下，细胞汇集区内的液体通过微流通道进入废液汇集区，细胞停留在细胞汇集区内。

进一步地，所述微流通道为槽型结构，其深度与宽度均为100～200nm，该尺寸远小于细胞直径，可限制细胞地通过。

所述细胞汇集区设有进样口和细胞收集口，可以将进样口与驱动装置连接，在驱动装置的作用下，含细胞液体从进样口进入细胞汇集区，液体从微流通道进入废液汇集区，细胞进入细胞收集口。所述废液汇集区设有废液出口。

同时，所述细胞汇集区的底部略高于微流通道的最低点，有利于含细胞液体中的液体向废液汇集区流动。

本实用新型中的含细胞液体包括细胞溶液和人的体液。其中，这里的体液为尿液、胸腔积液、腹水或唾液。

所述基片和盖片为玻璃或硅片。

有益效果：与现有技术相比，本实用新型的微流控芯片不仅能够实现含细胞液体中少量细胞的高效收集，而且不会对细胞活性造成影响；更为突出的是，该微流控芯片可替代离心法来处理细胞，实现细胞收集与处理的全程连续操作，大幅度缩减了细胞收集与处理的时间，从而为生物学和医学研究及应用提供了便利。

附图说明

图1为本实用新型的结构示意图；

图2为本实用新型的俯视图；

图3为本实用新型微流通道的局部放大图；

图4(a)为采用本实用新型的微流控芯片收集1mL含有1x10²/mL白细胞的PBS缓冲液在不同流速下通过微流控芯片时的细胞收集效率及细胞活性图；

图4(b)为采用离心法收集细胞收集1mL含有1x10²/mL白细胞的PBS缓冲液在不同转速下的细胞收集效率及细胞活性图。

图5(a)为采用本实用新型的微流控芯片在400μL/min流速下，1x10²白细胞在汇集区中连续经200μL PBS缓冲液洗涤10次后的细胞收集效率图；

图5(b)离心法多次洗涤细胞：1x10²白细胞在300g离心5min，重复10次后的细胞收集效率图。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型的技术方案作进一步说明。

如图1-2所示，本实用新型的微流控芯片包括基片1和位于其上方的盖片2，基片1上设有长条状的微流通道区3，该微流通道区3的左侧设有细胞汇集区4，该细胞汇集区4中放置含细胞液体，这里的含细胞液体指细胞溶液和人的体液，其中，人的体液为尿液、胸腔积液、腹水或唾液。同时，细胞汇集区两侧还分别引出进样口7和细胞收集口8，其中，进样口与驱动装置(图中未画出)相连接。微流通道区3的右侧设有废液汇集区5，其与废液出口9相接。微流通道区3上间隔布置若干微流通道6，其中，微流通道6为槽型结构，其深度与宽度均为100～200nm，该尺寸远远小于细胞直径，因此可以限制细胞的通过，参见图3。在驱动装置的作用下，细胞汇集区内的液体通过微流通道进入废液汇集区，细胞停留在细胞汇集区内。

本实用新型的微流控芯片是基于下列四个步骤实现的：

第一步：微流控芯片的设计：

①设计100纳米的微流通道，通道的一边连接细胞汇集液池，通道的另外一边连接废弃溶液的流出液池，以隔离细胞与多余的溶液。

②设计汇集液池中的液流，使之形成回流，以避免细胞堵塞微流通道。

第二步：微流控芯片的制作：

①基片上进出样口的制作：使用高速微电机，在芯片上打孔，孔的直径为1mm。

②基片上液流通道及液池(即汇集区)的制作：使用SU-8光刻胶掩膜，湿法腐蚀出深度为100纳米的液流通道和液池。

③基片上100纳米微流通道的刻蚀：使用SU-8光刻胶掩膜，光刻100微米深度的微流通道。

④基片与盖片接合：通过粘结剂，将基片与盖片接合。

第三步：微流控芯片在收集少量细胞中的参数确定：

①液流速度的确定：采用PBS缓冲液和人的白细胞配置成含有100个/mL的细胞溶液，在不同进样速度下，确定细胞的收集效率。

②细胞汇集液池可容纳细胞数量的确定：采用PBS缓冲液和人的白细胞配置成含有100、1000、10000以及100000个/mL的细胞溶液，在上述优化的速度下进样，确定细胞收集效率接近100％时细胞汇集液池最大可容纳的细胞数量。

第四步：微流控芯片在收集细胞溶液及临床样品中少量细胞上的效率检验：

使用上述微流控芯片分别在体外培养的细胞以及人的体液(包括胸腔积液、腹水以及尿液)中进行了效率验证。

实施例1：微流控芯片的参数优化

使用人的白细胞和PBS缓冲液配制成细胞溶液，通过以下试验确定了该微流控芯片在收集少量细胞上的效率。具体步骤为：

1、使用真空抗凝(EDTA)采血管收集健康者外周血1mL；

2、去除红细胞：采用红细胞裂解液(含154mM NH₄Cl、10mM KHCO₃以及0.1mM EDTA的超纯水溶液)去除其中的红细胞；

3、使用PBS缓冲液(pH,7.4)，将白细胞配制成1x10⁶/mL的细胞溶液；

4、使用PBS缓冲液(pH,7.4)，通过梯度稀释的方法，将上述白细胞溶液配置成1x10²/mL的白细胞溶液；

5、分别取上述配置成的1x10²/mL白细胞溶液各1mL，在不同流速下通过该微流控芯片，显微镜计数留在汇集液池中的细胞数量，选取最优的流速作为后续试验参数；与此同时，上述同样量的细胞溶液转入5mL离心管中，分别在100g、200g、300g、400g和500g离心5min，弃去上清，显微镜计数细胞数量，胎盘蓝染色鉴定细胞活性。

6、在上述选取的流速下，用200μL PBS缓冲液(pH,7.4)连续冲洗微流控芯片10次，显微镜计数每一次冲洗后留在汇集液池中的细胞数量，以确定在反复洗涤细胞的过程中，该微流控芯片保留细胞的效率。与此同时，同样量的细胞溶液转入5mL离心管中，在300g离心5min，弃去上清，并重复10次，显微镜计数细胞数量，胎盘蓝染色鉴定细胞活性。

7、使用PBS缓冲液(pH,7.4)，通过梯度稀释的方法，将上述1x10⁶/mL的白细胞溶液分别配置成1x10⁵/mL、1x10⁴/mL、1x10³/mL以及1x10²/mL的细胞溶液，分别取0.5、1mL和2mL，在上述选取的流速下通过微流控芯片，显微镜计数留在汇集液池的细胞数量，以确定该微流控芯片收集细胞的容量。

结果显示：(1)细胞溶液的流速在10～500μL/min之间时，该微流控芯片均能以近乎100％的效率收集溶液中的白细胞(图4(a))；同样的细胞溶液经离心法收集时，离心力越大，损失率越低，但细胞活性越低(图4(b))，这表明该微流控芯片能在短时间内近乎无损失收集溶液中的少量细胞，比离心法显著优越。(2)细胞在汇集区中并连续冲洗10次后，依然能近乎100％的保留在汇集区中(图5(a))，并且不会损伤细胞活性；但多次离心后，细胞数量损失明显，并且活性下降显著(图5(b))，这表明该微流控芯片在反复洗涤过程中近乎不损失细胞，比离心法洗涤细胞显著优越。(3)在选定的流速下，该微流控芯片最高可收集1x10⁵个白细胞，收集更多的细胞将堵塞微流通道。因此该微流控芯片仅适合于收集含有细胞数量较少的溶液。

实施例2：该微流控芯片在不同临床样品中的细胞收集效率

使用该微流控芯片，在400μL/min流速下，以肿瘤患者的胸腔积液、尿液和腹水为例，收集了其中的细胞，并与传统的离心法收集该样品中的细胞做了对比。具体步骤为：

1、使用无菌玻璃瓶收集患者适量的胸腔积液和尿液。

2、用吸管去除积液和尿液中的大块沉淀，并用100μm滤网进一步去除凝块。

3、样品用PBS缓冲液(含1mM EDTA，pH 7.4)按照1：1的比例稀释，制备成单细胞溶液。

4、分别取六份2mL上述溶液：一份在400μL/min流速下，通过该微流控芯片，收集到的细胞经胎盘蓝染色并计数；另外五份各放入一个5mL离心管，分别在100、200、300、400以及500g离心力下离心5min，收集到的细胞经胎盘蓝染色并计数。

结果显示，该微流控芯片比离心法收集到的细胞显著多，且耗时仅为离心法的1/3。胎盘蓝染色结果同时显示，使用该微流控芯片比离心法收集到的细胞的活性高(表1)。这表明该微流控芯片在收集人体液中的细胞上具有比离心法明显的优势。更为重要的是，生物学及临床样品中的细胞在收集到后，生物学和临床试验往往需要通过免疫荧光染色和体外培养等多项技术来鉴定细胞，这些过程涉及多步的细胞洗涤等流程。结合实施例1的结果，使用该微流控芯片将保证整个过程不损失细胞数量和活性，并且能大幅度缩短细胞处理的时间。

表1.该微流控芯片在不同临床样品中的细胞收集效率。

注：所有数据均为使用2mL经PBS缓冲液(含1mM EDTA，pH 7.4)按照1∶1的比例稀释制备的细胞溶液。

综上所述，本实用新型微流控芯片的优越性在于：该微流控芯片能近乎无损失地分离出溶液以及人的体液中存在的少量细胞，不会对细胞的活性造成损伤，并且能够在细胞后续处理过程中实现连续操作，极大缩短了处理细胞的时间，弥补了目前普遍使用的离心方法存在的技术缺陷。因此，本实用新型的微流控芯片突破了现有技术瓶颈，为生物学与医学相关研究和应用提供了技术便利。

Claims (8)

1.一种收集少量细胞的微流控芯片，其特征在于：包括基片(1)和盖片(2)，所述基片(1)上设有微流通道区(3)，该微流通道区(3)的一侧依次设有用于放置含细胞液体的细胞汇集区(4)和驱动装置，另一侧设有废液汇集区(5)，其中，所述微流通道区(3)上间隔布置若干微流通道(6)，该微流通道(6)的横截面尺寸小于细胞，在驱动装置的作用下，细胞汇集区(4)内的液体通过微流通道(6)进入废液汇集区(5)，细胞停留在细胞汇集区(4)内。

2.根据权利要求1所述收集少量细胞的微流控芯片，其特征在于：所述微流通道(6)为槽型结构，其深度与宽度均为100～200nm。

3.根据权利要求1所述收集少量细胞的微流控芯片，其特征在于：所述细胞汇集区(4)设有进样口(7)和细胞收集口(8)。

4.根据权利要求1所述收集少量细胞的微流控芯片，其特征在于：所述废液汇集区(5)设有废液出口(9)。

5.根据权利要求1所述收集少量细胞的微流控芯片，其特征在于：所述细胞汇集区(4)的底部略高于微流通道(6)的最低点。

6.根据权利要求1所述收集少量细胞的微流控芯片，其特征在于：所述含细胞液体包括细胞溶液和人的体液。

7.根据权利要求6所述收集少量细胞的微流控芯片，其特征在于：所述人的体液为尿液、胸腔积液、腹水或唾液。

8.根据权利要求1所述收集少量细胞的微流控芯片，其特征在于：所述基片(1)和盖片(2)为玻璃或硅片。