CN110514855A - 一种换液方法、换液板及其在细胞染色和颗粒洗涤中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种换液方法、换液板及其在细胞染色和颗粒洗涤中的用途，其中换液方法包括如下步骤，在换液板上，向至少一个样本槽中注入混合细胞悬液或颗粒悬液并静置，使所述混合细胞悬液中的细胞或颗粒悬液中的颗粒沉降；向与所述样本槽连接的第一洗液槽和第二洗液槽中连续注入缓冲液并从第二洗液孔和第一洗液孔中连续排出缓冲液。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种换液方法、换液板及其在细胞染色和颗粒洗涤中的用途。
背景技术
目前，人们常使用离心的方式进行换液，但是对例如细胞悬液或颗粒悬液进行离心操作时，受离心力和流体静压力的作用，细胞的活性、内部结构、转录模式等会受到一定的影响，如细胞回收率低、对初始细胞数量要求高、对细胞状态有不利影响、洗涤效果不稳定、与高通量自动化制样系统难以整合，因此使用离心洗涤法存在很大的局限性。例如在流式细胞检测中，需要反复离心，导致细胞状态变差及细胞丢失，不同人员进行操作会得到不同的结果。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种换液方法、换液板及其在细胞染色中的用途，利用重力沉降和流体扩散的规律来实现非离心式换液，能够对细胞处理轻柔，使细胞保持良好的状态。
为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供的一种换液板，包括：
板体；
至少一个换液单元，设置在所述板体上，所述换液单元包括样本槽和连接在所述样本槽两侧的第一洗液槽和第二洗液槽；及
分隔凸起，设置在所述样本槽与所述第一洗液槽之间以及所述样本槽与所述第二洗液槽之间，所述分隔凸起的高度小于第一洗液槽和第二洗液槽的深度。
在一实施例中，所述板体上设有换液区，所有的换液单元位于换液区内，所述板体上位于换液区外围设置有冷却保湿槽。
在一实施例中，所述样本槽的顶端分别与所述第一洗液槽和第二洗液槽通过喉口连通，所述喉口的宽度小于所述第一洗液槽的宽度、所述第二洗液槽的宽度及和所述样本槽的宽度。
在一实施例中，当所述换液单元的个数大于或等于两个时，在纵向方向上，每相邻两个所述换液单元平行且交错排列；在横向方向上，每个所述换液单元在同一水平线上。
在一实施例中，其中所述样本槽的深度为5mm-20mm。
在一实施例中，所述分隔凸起高出所述样本槽底面的高度为1mm-5mm。
在一实施例中，其中所述第一洗液槽与所述第二洗液槽的规格相同。
在一实施例中，其中所述第一洗液槽与所述第二洗液槽的深度为5mm-20mm。
本发明的目的还在于提供一种换液方法，包括以下步骤：
提供换液板，所述换液板包括：
板体；
至少一个换液单元，设置在所述板体上，所述换液单元包括样本槽和连接在所述样本槽两侧的第一洗液槽和第二洗液槽；及
分隔凸起，设置在所述样本槽与所述第一洗液槽之间以及所述样本槽与所述第二洗液槽之间，所述分隔凸起的高度小于第一洗液槽和第二洗液槽的深度；
在所述换液板上，向至少一个所述样本槽中注入混合细胞悬液或颗粒悬液并静置，使所述混合细胞悬液中的细胞或颗粒悬液中的颗粒沉降；
向连接在所述样本槽两端的第一洗液槽和第二洗液槽中各注入缓冲液至预定体积；
向所述第一洗液槽中注入第一缓冲液并从所述第二洗液槽中吸出所述第一缓冲液；
向所述第二洗液槽中注入第二缓冲液并从所述第一洗液槽中吸出所述第二缓冲液。
在一实施例中，所述换液方法还包括以下步骤：
从所述第一洗液槽中吸出所述第二缓冲液后，从所述第一洗液槽和第二洗液槽中各吸出200-250微升缓冲液。
在一实施例中，在所述换液方法中注入所述第一缓冲液的速度、吸出所述第一缓冲液的速度、注入所述第二缓冲液的速度以及吸出所述第二缓冲液的速度为0.01-10微升/秒。
在一实施例中，在所述换液方法中注入所述第一缓冲液的速度与吸出所述第一缓冲液的速度相同，注入所述第二缓冲液的速度与吸出所述第二缓冲液的速度相同。
在一实施例中，其中所述混合细胞悬液包括加入染色剂的细胞悬液。
在一实施例中，其中所述混合细胞悬液或颗粒悬液的体积为50-250微升。
在一实施例中，其中所述预定体积为200-250微升。
在一实施例中，其中所述缓冲液、第一缓冲液以及第二缓冲液为磷酸盐缓冲液。
本发明的目的还在于提供一种换液方法在细胞染色和颗粒洗涤中的用途，所述换液方法，包括以下步骤：
提供换液板，所述换液板包括：
板体；
至少一个换液单元，设置在所述板体上，所述换液单元包括样本槽和连接在所述样本槽两侧的第一洗液槽和第二洗液槽；及
分隔凸起，设置在所述样本槽与所述第一洗液槽之间以及所述样本槽与所述第二洗液槽之间，所述分隔凸起的高度小于第一洗液槽和第二洗液槽的深度；
在所述换液板上，向至少一个所述样本槽中注入混合细胞悬液或颗粒悬液并静置，使所述混合细胞悬液中的细胞或颗粒悬液中的颗粒沉降；
向连接在所述样本槽两端的第一洗液槽和第二洗液槽中各注入缓冲液至预定体积；
向所述第一洗液槽中注入第一缓冲液并从所述第二洗液槽中吸出所述第一缓冲液；
向所述第二洗液槽中注入第二缓冲液并从所述第一洗液槽中吸出所述第二缓冲液。
在一实施例中，所述细胞染色包括胞内细胞因子染色或流体表面抗原染色。
在一实施例中，所述细胞染色的步骤包括，
向细胞悬液中加入染色剂，获得所述混合细胞悬液；
使用所述换液方法对所述混合细胞悬液进行洗涤，获得洗涤后的混合细胞悬液；
检测所述洗涤后的混合细胞悬液中的光信号强度；
根据所述光信号强度，分析染色结果。
在一实施例中，所述染色剂包括用荧光标记的抗体。
本发明提供的换液板通过分隔凸起将换液单元内的样本槽底部、第一洗液槽底部和第二洗液槽底部隔断，使得样本细胞能够充分在样本槽了沉淀，并且避免在注液或排液过程中对沉淀的样本细胞产生干扰，避免样本细胞受到冲击悬浮或者随清洗液流动而被排出，同时洗液槽、样本槽、分隔凸起的结构配合形成供清洗液连续稳定流动的通道，使得样本细胞能够充分的进行物理换液清洗，保证了处理效果，避免损伤样本细胞。本发明提供的一种换液方法，包括以下步骤：在所述换液板上，向至少一个所述样本槽中注入混合细胞悬液或颗粒悬液并静置，使所述混合细胞悬液中的细胞或颗粒悬液中的颗粒沉降；向连接在所述样本槽两端的第一洗液槽和第二洗液槽中各注入缓冲液至预定体积；向所述第一洗液槽中注入第一缓冲液并从所述第二洗液槽中吸出所述第一缓冲液；向所述第二洗液槽中注入第二缓冲液并从所述第一洗液槽中吸出所述第二缓冲液。本发明利用重力沉降和流体扩散的规律来对细胞进行换液，有效提高细胞换液的效率。本发明还提供一种换液方法在细胞染色和颗粒洗涤中的用途，利用重力沉降和流体扩散的规律对特异性物质非离心式染色，细胞先在缓冲液中沉降，在缓冲液缓慢流动的过程中细胞由于其惯性基本保持不动，避免液体内的细胞被大量吸走，减少细胞损失，产生更高的细胞捕获和分选保留，缓冲液在样品槽中保持合适的流动速度，使得细胞能够连续不断的进行温和的洗涤，避免细胞损伤，缩短了工作流程和时间。使用本发明提供的换液方法细胞保留数量较使用传统的离心换液方法细胞保留数量更多，染色后检测结果稳定，并且便于自动化。本发明为对细胞进行特异性物质染色提供了新的染色方案和工具。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一实施例的方法流程示意图；
图2为本发明一实施例中换液板的结构示意图；
图3为本发明一实施例中换液单元的剖视图。
图4为本发明一实施例中不同换液方式对细胞存活率的影响示意图；
图5为本发明一实施例中不同换液方式对小鼠B淋巴细胞的影响示意图；
图6为本发明一实施例中不同换液方式对小鼠T淋巴细胞的影响示意图；
图7为本发明一实施例中不同换液方式对小鼠CD4T淋巴细胞的影响示意图；
图8为本发明一实施例中不同换液方式对小鼠CD8T淋巴细胞的影响示意图；
图9为本发明一实施例中不同换液方式对小鼠CD4T淋巴细胞、小鼠CD8T淋巴细胞、小鼠B淋巴细胞和自然杀伤细胞染色指数的影响；
图10为本发明一实施例中针对胞内细胞因子染色时不同换液方式对细胞存活率的影响示意图；
图11为本发明一实施例中不同换液方式对小鼠CD4T淋巴细胞阳性率的影响；
图12为本发明一实施例中不同换液方式对活细胞和死细胞存活率的影响示意图；
图13为本发明一实施例中针对小鼠T淋巴细胞和小鼠CD4T淋巴细胞，不同换液方式对用藻红蛋白标记的抗γ干扰素抗体阳性染色率的影响；
图14为本发明一实施例中针对小鼠T淋巴细胞和小鼠CD8T淋巴细胞，不同换液方式对用藻红蛋白标记的抗γ干扰素抗体阳性染色率的影响；
图15为本发明一实施例中细胞染色的流程示意图。
符号说明
1 板体
2 换液单元
21 样本槽
22 第一洗液槽
23 分隔凸起
24 第二洗液槽
25 喉口
3 冷却保湿槽
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，如出现术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等，其所指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，如出现术语“第一”、“第二”、仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。其中，术语“第一位置”和“第二位置”为两个不同的位置。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
请参阅图1至图3，图1为本发明一个实施例提供的一种换液方法，包括如下步骤：
S100、提供换液板；
S101、在所述换液板上，向至少一个所述样本槽21中注入混合细胞悬液或颗粒悬液并静置，使所述混合细胞悬液中的细胞或颗粒悬液中的颗粒沉降；
S102、向连接在所述样本槽21两端的第一洗液槽22和第二洗液槽24中各注入缓冲液至预定体积；
S103、向所述第一洗液槽22中注入第一缓冲液并从所述第二洗液槽24中吸出所述第一缓冲液；
S104、向所述第二洗液槽24中注入第二缓冲液并从所述第一洗液槽22中吸出所述第二缓冲液。
具体的，在S100步骤中，请参阅图2至图3，所述换液板包括板体1，至少一个换液单元2以及分隔凸起23。至少一个所述换液单元2设置在所述板体1上，所述换液单元2包括样本槽21和连接在所述样本槽21两侧的第一洗液槽22和第二洗液槽24；所述分隔凸起23设置在所述样本槽21与所述第一洗液槽22之间以及所述样本槽21与所述第二洗液槽24之间，所述分隔凸起23的高度小于第一洗液槽22和第二洗液槽24的深度，用于将所述样本槽21与所述第一洗液槽22之间以及所述样本槽21与所述第二洗液槽24之间隔开。所述分隔凸起23的高度指分隔凸起23的顶部距离所述第一洗液槽22底部或所述第二洗液槽24底部所在平面的高度，所述第一洗液槽22和第二洗液槽24的深度指第一洗液槽22顶部与所述第一洗液槽22底部之间的距离或者所述第二洗液槽24顶部与所述第二洗液槽24底部之间的距离，所述样本槽21的上部分别与所述第一洗液槽22和第二洗液槽24连通。
具体的，在S101步骤中，所述混合细胞悬液包括加入染色剂的细胞悬液。所述混合细胞悬液或颗粒悬液即样本的体积范围为50-250ul。所述染色剂包括用荧光标记的抗体。
具体的，在S102步骤中，其中所述缓冲液、第一缓冲液以及第二缓冲液为磷酸盐缓冲液。所述预定体积为200-250微升。
具体的，在S103步骤中，在所述换液方法中注入所述第一缓冲液的速度、吸出所述第一缓冲液的速度、注入所述第二缓冲液的速度以及吸出所述第二缓冲液的速度为0.01-10微升/秒。在所述换液方法中注入所述第一缓冲液的速度与吸出所述第一缓冲液的速度相同，注入所述第二缓冲液的速度与吸出所述第二缓冲液的速度相同。从所述第二洗液槽24中吸出所述第一缓冲液的体积包括与所述第一缓冲液等体积，也包括与所述第一缓冲液的体积不同。同理，从所述第一洗液槽22中吸出所述第二缓冲液的体积包括与所述第二缓冲液等体积，也包括与所述第二缓冲液的体积不同。
具体的，在S104步骤后即在从所述第一洗液槽22吸出所述第二缓冲液后，从所述第一洗液槽22和第二洗液槽24中各吸出200-250微升的废液。继续向所述第一洗液槽22和第二洗液槽24中分别注入所述缓冲液并静置，根据所述换液方法重复换液。
本发明所述的换液方法适用于细胞染色，请参阅图15，所述细胞染色的步骤包括：
S201、向细胞悬液中加入染色剂，获得所述混合细胞悬液；
S202、使用所述换液方法对所述混合细胞悬液进行洗涤，获得洗涤后的混合细胞悬液；
S203、检测所述洗涤后的混合细胞悬液中的光信号强度；
S204、根据所述光信号强度，分析染色结果。
具体的，在S201步骤中，所述染色剂包括用荧光标记的抗体。
将本发明的换液方法应用于胞内细胞因子染色或流体表面抗原染色为例，具体说明本发明。
在一实施例中，以小鼠淋巴细胞表面抗原染色为例，采用的是流式染色技术，所用细胞为小鼠脾脏淋巴细胞，将小鼠脾脏淋巴细胞经过裂解红细胞过后，加磷酸盐缓冲液PBS重悬后使用本发明进行后续操作，并最终上机检测。
小鼠用抗体例如为藻红蛋白标记的抗自然杀伤细胞抗体即PE-anti-NK1.1、藻红蛋白标记的抗CD45T淋巴细胞抗体即PE-Cy7-anti-CD45、别藻蓝蛋白标记的抗CD4T淋巴细胞抗体即APC-anti-CD4、用紫外/可见光区染料标记的抗B220细胞的抗体即BV510-anti-B220、抗γ干扰素抗体即IFN-γ抗体，荧光染料例如为4'，6-二脒基-2-苯基吲哚即DAPI。
染色步骤具体如下：
(1)对小鼠脾脏淋巴细胞进行孵育和染色
向小鼠脾脏淋巴细胞中加入磷酸盐缓冲液PBS调密度至1×105-1×107个/ml，获得细胞悬液，取800-900ul所述细胞悬液，按细胞悬液和抗体的体积比为1:180-200加入抗体，获得混合细胞悬液，其中，对于荧光染料DAPI是在染色方案完成后，上机检测前8-10分钟加入。
向换液板的每个样本槽中加入80-100μl的混合细胞悬液，使每孔有105-106个细胞，静置30-40分钟，使所述细胞沉降。
(2)多余抗体去除
(a)在换液板的每个换液单元2中的第一洗液槽22和第二洗液槽24中各加入200-250μl磷酸盐缓冲液PBS(分2次加入)，静置3-5分钟，使所述细胞沉降。
(b)用例如加样枪头吸取100-200ul PBS，按0.01-10微升/秒的速度向所述第一洗液槽22中匀速注入100-200ul PBS，从第二洗液槽24中同步吸出与所述缓冲液等体积的废液。
(c)用例如加样枪头吸取100-200ul PBS，0.01-10微升/秒的速度向所述第二洗液槽24中匀速注入100-200ul PBS，从第一洗液槽22中同步吸出与所述缓冲液等体积的废液。
(d)从所述第一洗液槽22和第二洗液槽24中各吸出液体100-200μl，并丢弃。
(e)向所述第一洗液槽22和第二洗液槽24中各注入液体100-200μl，静置3-5分钟。
重复步骤(b)-(e)1次。
重复步骤(b)-(d)1次。
最后从所述第一洗液槽22和第二洗液槽24中同时吸出液体100-200μl。
(3)染色完成并检测
收集换液板中的液体，体积补至200μl待测，用流式细胞仪检测细胞抗体染色结果，流式细胞仪是利用荧光信号强度来分析染色结果。
检测结果请参阅图4-图9，图4-图9显示了采用本发明的换液方法进行细胞抗体染色的结果，在图4-图9中，A为对照组，B为运用本发明的换液方法组，C为运用传统的离心换液方法组，图4-图9结果显示出，本实施例染色结果稳定且信噪比低。本实施例的结果表明，将本发明应用于流式检测技术，能克服离心式流式染色的缺陷，本方法能保留更多数量的细胞，染色结果更稳定且便于自动化。
为了比较离心换液方法和本发明换液方法对细胞存活率的影响，以没有进行换液且其他条件相同的细胞为对照，记为A组，比较两种换液方式下细胞的存活率，请参阅图4，结果显示两种换液方式对细胞存活率的影响有显著区别P<0.05，本发明的换液方法比离心换液方法能保存更多的活细胞。
请参阅图5至图8，研究传统的离心换液方法和本发明换液方法对不同白细胞群体CD4 T淋巴细胞即CD4+T细胞、CD8T淋巴细胞即CD8+T细胞，B淋巴细胞和自然杀伤细胞即NK细胞的比例影响。如图5-图8结果显示本发明换液方法制备的样本中的各细胞群体百分比与传统离心换液方法制备的样本均无显著差异P>0.05。
请参阅图9，研究不同换液方式对各荧光抗体染色指数(Staining Index)的影响。结果显示本发明换液方法制备的样本中，各荧光抗体的染色指数均显著高于传统的离心换液方法制备的样本P<0.05，说明本发明的换液方法有助于提升流式检测的灵敏度和准确性。
离心换液方法是目前流式染色中最常用的样本换液技术，用于去除体系中多余的荧光抗体，减少非特异信号产生。其不足之处在于细胞回收率低、对初始细胞数量要求高、对细胞状态有不利影响、换液效果不稳定、与高通量自动化制样系统难以整合。因此使用离心换液方法进行流式样本制备存在很大的局限性。由以上检测结果可知本发明的换液方法在细胞回收率、细胞活性和样本检测灵敏度上较离心换液方法有明显优势，在初始细胞量较少的情况下优势会更明显；且能保证细胞处于较好的状态。本发明换液方法的检测结果有更低的杂信号干扰，有更高的灵敏度和准确性，有利于后续的数据处理。
在另一个实施例中，以胞内细胞因子染色为例，所述胞内细胞因子从小鼠脾脏细胞中获得。
(I)细胞准备
将小鼠脾脏细胞放入完全细胞培养基中重悬，35-37℃孵育2-4小时，收集细胞，以500-600rpm的转速离心4-5分钟，用PBS重悬细胞使细胞处于悬浮状态获得细胞悬液，并用PBS调整细胞密度至4×107-4×108个/ml，将细胞悬液分为若干个50-60μl的样本，使每个样本的细胞数目达到2×105-2×106个。
(II)表面抗体孵育
将除IFN-γ外的抗体如PE-anti-NK1.1、PerCP-Cy5.5-anti-CD3、PE-Cy7-anti-CD45、APC-anti-CD4、异硫氰酸荧光素标记的抗小鼠CD8T淋巴细胞抗体即FITC-anti-mouse-CD8、BV510-anti-B220分别配置成两份抗体预混液，每个样本与抗体预混液等体积混合，转入换液板的至少一个样本槽21中，3-4℃孵育25-30分钟。以下所述的第一洗液槽22与第二洗液槽24均为连接在所述样本槽21两端的洗液槽。
(III)表面抗体染色后换液
(a1)用例如加样枪头吸取100-200ul PBS，按0.01-10微升/秒的速度向所述第一洗液槽22中匀速注入100-200ul PBS，从第二洗液槽24中同步吸出与所述缓冲液等体积的废液。
(b1)用例如加样枪头吸取100-200ul PBS，按0.01-10微升/秒的速度向所述第二洗液槽24中匀速注入100-200ul PBS，从第一洗液槽22中同步吸出与所述缓冲液等体积的废液。
(c1)从所述第一洗液槽22和所述第二洗液槽24中各吸出液体100-200μl并丢弃。
(d1)向所述第一洗液槽22和所述第二洗液槽24中各注入液体100-200μl。
(e1)静置3-5分钟。
重复步骤(a1)-(e1)1次。
重复步骤(a1)-(c1)1次。
最后从第一洗液槽22和所述第二洗液槽24中同步吸出液体100-200μl。
(IV)使样品固定通透
向所述第一洗液槽22和所述第二洗液槽24各注入100-200μl的固定破膜剂Fix/Perm，用例如加样枪头先吸取100-200ul固定破膜剂Fix/Perm，然后按0.01-10微升/秒的速度向所述第一洗液槽22内匀速注入100-200μl固定破膜剂Fix/Perm，从所述第二洗液槽24中同步吸出与所述固定破膜剂等体积的液体；按0.01-10微升/秒的速度向所述第二洗液槽24内匀速注入100-200μl固定破膜剂Fix/Perm，再从所述第一洗液槽22同步吸出等体积液体，静置5-10分钟。
(V)固定液中和
用例如加样枪头先吸取100-200ul 0.5mol/L甘氨酸，然后按0.01-10微升/秒的速度向所述第一洗液槽22内匀速注入100-200μl 0.5mol/L甘氨酸，从所述第二洗液槽24同步吸出等体积液体；按0.01-10微升/秒的速度向所述第二洗液槽24内匀速注入100-200μl0.5mol/L甘氨酸，从所述第一洗液槽22同步吸出等体积液体；从所述第一洗液槽22和所述第二洗液槽24各吸出100-200μl液体。
(VI)固定液中和后换液
向所述第一洗液槽22和所述第二洗液槽24各注入100-200μl的渗透液；用例如加样枪头先吸取100-200ul的渗透液，然后按0.01-10微升/秒的速度向所述第一洗液槽22内匀速注入100-200μl的渗透液，从所述第二洗液槽24同步吸出等体积液体；用加样枪头按0.01-10微升/秒的速度向所述第二洗液槽24内匀速注入100-200μl的渗透液，从所述第一洗液槽同步吸出等体积的液体；从所述第一洗液槽22和所述第二洗液槽24各吸出100-200μl的液体。
(VII)胞内因子抗体染色孵育
加入用藻红蛋白标记的抗γ干扰素抗体即PE-anti-IFN-γ抗体到换液板在3-4℃孵育20-30分钟。
(VIII)胞内未结合抗体的换液
在换液板的至少一个换液单元2中的第一洗液槽22和第二洗液槽24中各加入200-250μl渗透液，静置3-5分钟；用加样枪头先吸取100-200ul渗透液，然后按0.01-10微升/秒的速度向所述第一洗液槽22内匀速注入100-200μl渗透液，再从所述第二洗液槽24同步吸出等体积液体。
用加样枪头按0.01-10微升/秒的速度向所述第二洗液槽24内注入100-200μl渗透液，从所述第一洗液槽22同步吸出等体积液体；从所述第一洗液槽22和所述第二洗液槽24各吸出100-200μl液体。
从所述第一洗液槽22和所述第二洗液槽24各吸出液体100-200μl并丢弃。
向所述第一洗液槽22和所述第二洗液槽24各注入100-200μl的渗透液。
静置3-5分钟。
重复步骤(a1)-(e1)1次。
重复步骤(a1)-(c1)1次。
最后从所述第一洗液槽22和所述第二洗液槽24中同步吸出液体100-200μl。
(IX)染色完成并检测
收集换液板中的液体，体积补至200μl待测，用流式细胞仪检测。结果请参阅图10，图10显示出采用本发明的换液方法进行染色的结果，并展示在使用本发明的情况下对实验结果的影响，结果显示采用本发明的换液方法染色效率比传统的离心换液方法染色效率更高。
请参阅图11，图11表明利用本发明的换液法应用于染色领域，染色结果比利用传统的离心换液方法得到的结果更稳定。
请参阅图13-图14，图13为针对T淋巴细胞和CD4T淋巴细胞，不同换液方式对PE-anti-IFN-γ抗体阳性染色率色影响；图14为针对T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞，不同换液方式对PE-anti-IFN-γ抗体阳性染色率色影响，结果显示本发明的换液方法较传统的离心换液方法有优势。
由于流式染色过程中样本的死细胞因外形皱缩而变小，具有较低的前向散射FSC。结合图12，表明在换液过程中，较大的活细胞比较小的死细胞能更好地保存下来，本发明的换液方法相较于传统的离心换液方法有更高的活细胞比例。
本发明利用重力沉降和流体扩散的规律来对细胞特异性物质非离心式染色，细胞先在缓冲液中沉降，在缓冲液缓慢流动的过程中细胞由于其惯性基本保持不动，避免液体内的细胞被大量吸走，减少细胞损失，产生更高的细胞捕获和分选保留，缓冲液在样品槽中保持合适的流动速度，使得细胞能够连续不断的进行温和的洗涤，避免细胞损伤，缩短了工作流程和时间。实验结果表明，本发明的方法细胞保留数量较传统方法更多，染色后检测结果稳定，并且便于自动化。本发明为对细胞进行特异性物质染色提供了新的染色方案和工具。本发明的方法也适用于颗粒悬液的洗涤，例如蛋白颗粒、外泌体颗粒等。
本发明的换液方法不仅仅基于本发明所述的换液板才能实现，其它换液板也能实现本发明的换液方法。
请参阅图2至图3，本发明提供的一种换液板，包括：板体1，至少一个换液单元2以及分隔凸起23。至少一个所述换液单元2设置在所述板体1上，所述换液单元2包括样本槽21和连接在所述样本槽21两侧的第一洗液槽22和第二洗液槽24；所述分隔凸起23设置在所述样本槽21与所述第一洗液槽22之间以及所述样本槽21与所述第二洗液槽24之间，所述分隔凸起23的高度小于第一洗液槽22和第二洗液槽24的深度，用于将所述样本槽21与所述第一洗液槽22之间以及所述样本槽21与所述第二洗液槽24之间隔开。所述分隔凸起23的顶部低于第一洗液槽22和第二洗液槽24的顶部，使得样本槽21、第一洗液槽22和第二洗液槽24的顶部形成供清洗液流动的通道，清洗液在流动过程中完成细胞或颗粒悬液即样本细胞的清洗。所述样本槽21的上部分别与所述第一洗液槽和第二洗液槽24通过喉口25连通，所述喉口25的宽度小于所述第一洗液槽22的宽度、所述第二洗液槽24的宽度及所述样本槽21的宽度，通过喉口25有利于对清洗液进行缓冲，减少清洗液的冲击，避免干扰沉淀的样本细胞。样本槽21的深度范围为5-20mm，第一洗液槽22和第二洗液槽24深度范围为5-20mm，分隔凸起23高出所述样本槽21底面的高度为1mm-5mm。第一洗液槽22和第二洗液槽24的规格例如为相同规格。
请参阅图2，所述板体1上设有换液区，所有的换液单元2位于换液区内，所述板体上位于换液区外围设置有冷却保湿槽3。当所述换液单元2的个数大于或等于两个时，在纵向方向上，每相邻两个所述换液单元2平行且交错排列；在横向方向上，每个所述换液单元2在同一水平线上，这样排列使得结构布局紧凑，节省空间。
请参阅图3，本发明提供的换液板，当第一洗液槽22的底部与第二洗液槽24的底部的位置高于样本槽21的底部时，采用该结构设计，有利于减少第一洗液槽22的底部与第二洗液槽24底部的积液，便于吸取第一洗液槽22与第二洗液槽24内的清洗液，吸取更加干净。另外，第一洗液槽22的底部与第二洗液槽24的底部的位置还包括低于样本槽21的底部，当第一洗液槽22的底部与第二洗液槽24的底部位置低于样本槽21的底部时，有利于避免换液器在注入或吸取清洗液时触碰第一洗液槽22的底部与第二洗液槽24的底部。第一洗液槽22的底部与第二洗液槽24的底部的位置还包括与样本槽21的底部齐平。
本发明提供的换液板通过分隔凸起23将换液单元2内的样本槽21、第一洗液槽22和第二洗液槽24隔断，使得例如细胞或颗粒能够充分在样本槽中沉淀，并且避免在注液或排液过程中对沉淀的细胞或颗粒产生干扰，避免细胞或颗粒受到冲击悬浮或者随清洗液流动而被排出，同时洗液槽、样本槽、分隔凸起的结构配合形成供清洗液连续稳定流动的通道，使得样本细胞能够充分的进行物理换液清洗，保证了处理效果，避免损伤样本例如细胞。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (20)
1.一种换液板，其特征在于，包括：
板体；
至少一个换液单元，设置在所述板体上，所述换液单元包括样本槽和连接在所述样本槽两侧的第一洗液槽和第二洗液槽；及
分隔凸起，设置在所述样本槽与所述第一洗液槽之间以及所述样本槽与所述第二洗液槽之间，所述分隔凸起的高度小于第一洗液槽和第二洗液槽的深度。
2.根据权利要求1所述的一种换液板，其特征在于，所述板体上设有换液区，所有的换液单元位于换液区内，所述板体上位于换液区外围设置有冷却保湿槽。
3.根据权利要求1所述的一种换液板，其特征在于，所述样本槽的顶端分别与所述第一洗液槽和第二洗液槽通过喉口连通，所述喉口的宽度小于所述第一洗液槽的宽度、所述第二洗液槽的宽度及和所述样本槽的宽度。
4.根据权利要求1所述的一种换液板，其特征在于，当所述换液单元的个数大于或等于两个时，在纵向方向上，每相邻两个所述换液单元平行且交错排列；在横向方向上，每个所述换液单元在同一水平线上。
5.根据权利要求1所述的一种换液板，其特征在于，所述样本槽的深度为5mm-20mm。
6.根据权利要求1所述的一种换液板，其特征在于，所述分隔凸起高出所述样本槽底面的高度为1mm-5mm。
7.根据权利要求1所述的一种换液板，其特征在于，所述第一洗液槽与所述第二洗液槽的规格相同。
8.根据权利要求1所述的换液板，其特征在于，所述第一洗液槽和所述第二洗液槽的深度为5mm-20mm。
9.一种换液方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供换液板，所述换液板包括：
板体；
至少一个换液单元，设置在所述板体上，所述换液单元包括样本槽和连接在所述样本槽两侧的第一洗液槽和第二洗液槽；及
分隔凸起，设置在所述样本槽与所述第一洗液槽之间以及所述样本槽与所述第二洗液槽之间，所述分隔凸起的高度小于第一洗液槽和第二洗液槽的深度；
在所述换液板上，向至少一个所述样本槽中注入混合细胞悬液或颗粒悬液并静置，使所述混合细胞悬液中的细胞或颗粒悬液中的颗粒沉降；
向连接在所述样本槽两端的第一洗液槽和第二洗液槽中各注入缓冲液至预定体积；
向所述第一洗液槽中注入第一缓冲液并从所述第二洗液槽中吸出所述第一缓冲液；
向所述第二洗液槽中注入第二缓冲液并从所述第一洗液槽中吸出所述第二缓冲液。
10.根据权利要求9所述的一种换液方法，其特征在于，所述换液方法还包括以下步骤：
在从所述第一洗液槽吸出与所述第二缓冲液后，从所述第一洗液槽和第二洗液槽中各吸出200-250微升缓冲液。
11.根据权利要求9所述的一种换液方法，其特征在于，在所述换液方法中注入所述第一缓冲液的速度、吸出所述第一缓冲液的速度、注入所述第二缓冲液的速度以及吸出所述第二缓冲液的速度为0.01-10微升/秒。
12.根据权利要求9所述的一种换液方法，其特征在于，在所述换液方法中注入所述第一缓冲液的速度与吸出所述第一缓冲液的速度相同，注入所述第二缓冲液的速度与吸出所述第二缓冲液的速度相同。
13.根据权利要求9所述的一种换液方法，其特征在于，所述混合细胞悬液包括加入染色剂的细胞悬液。
14.根据权利要求9所述的一种换液方法，其特征在于，所述混合细胞悬液或颗粒悬液的体积为50-250微升。
15.根据权利要求9所述的一种换液方法，其特征在于，所述预定体积为200-250微升。
16.根据权利要求9所述的一种换液方法，其特征在于，所述缓冲液、第一缓冲液以及第二缓冲液为磷酸盐缓冲液。
17.一种换液方法在细胞染色和颗粒洗涤中的用途，其特征在于，所述换液方法包括以下步骤：
提供换液板，所述换液板包括：
板体；
至少一个换液单元，设置在所述板体上，所述换液单元包括样本槽和连接在所述样本槽两侧的第一洗液槽和第二洗液槽；及
分隔凸起，设置在所述样本槽与所述第一洗液槽之间以及所述样本槽与所述第二洗液槽之间，所述分隔凸起的高度小于第一洗液槽和第二洗液槽的深度；
在所述换液板上，向至少一个所述样本槽中注入混合细胞悬液或颗粒悬液并静置，使所述混合细胞悬液中的细胞或颗粒悬液中的颗粒沉降；
向连接在所述样本槽两端的第一洗液槽和第二洗液槽中各注入缓冲液至预定体积；
向所述第一洗液槽中注入第一缓冲液并从所述第二洗液槽中吸出所述第一缓冲液；
向所述第二洗液槽中注入第二缓冲液并从所述第一洗液槽中吸出所述第二缓冲液。
18.根据权利要求17所述的换液方法在细胞染色和颗粒洗涤中的用途，其特征在于，所述细胞染色包括胞内细胞因子染色或流体表面抗原染色。
19.根据权利要求17所述的换液方法在细胞染色和颗粒洗涤中的用途，其特征在于，所述细胞染色的步骤包括，
向所述细胞悬液中加入染色剂，获得所述混合细胞悬液；
使用所述换液方法对所述混合细胞悬液进行洗涤，获得洗涤后的混合细胞悬液；
检测所述洗涤后的混合细胞悬液中的光信号强度；
根据所述光信号强度，分析染色结果。
20.根据权利要求19所述的换液方法在细胞染色和颗粒洗涤中的用途，其特征在于，所述染色剂包括用荧光标记的抗体。
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