CN103409371A - 一种利用微流芯片捕获肿瘤细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用微流芯片捕获肿瘤细胞的方法，包括：配制细胞液步骤：将含有肿瘤细胞的样品配制为磷酸盐缓冲液；预冲洗步骤：用不含肿瘤细胞的磷酸盐溶液对注射管路进行预冲洗；肿瘤细胞捕获步骤：将配制好的细胞液以90～110ul/h的流速通过注射管路至微流芯片，并将肿瘤细胞捕获在微流芯片内。根据本发明的利用微流芯片捕获肿瘤细胞的方法能够有效捕获和分选肿瘤细胞，捕获的肿瘤细胞具有良好的活性，并且在捕获肿瘤细胞后能够对肿瘤细胞进行直接分析。

Description

一种利用微流芯片捕获肿瘤细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种捕获肿瘤细胞的方法，尤其涉及一种利用微流芯片捕获肿瘤细胞的方法。

背景技术

循环肿瘤细胞通常是指来自于原发肿瘤组织，经脱落和浸染而进入人体外周血的细胞，在循环细胞转移过程中能够在不同的组织上寄居，并且可以在许多转移后的固相肿瘤上发现，因而循环肿瘤细胞可以作为早期肿瘤诊断的重要标志。另外循环肿瘤细胞在肿瘤的转移和复发中也起到重要作用。因此，对于循环肿瘤细胞生理机制的研究具有非常重要的意义。然而循环肿瘤细胞的数目及其在人体外周血中的绝对浓度非常低，使得针对循环肿瘤细胞的研究变得非常困难，因此对循环肿瘤细胞的分选和捕获是一个重要的研究课题。

目前，常用的细胞分选技术是流式细胞术，但是该技术使用的设备昂贵、体积庞大、需要专业人员进行操作，而且细胞的用量较大，难以在实验室和医院普及推广。微流芯片技术具有微型化、集成化、自动化和细胞试剂用量少、污染风险低等优点。近期，在微流芯片中使用较多的肿瘤细胞捕获方法是利用针对某些肿瘤细胞中上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的特异性表达进行特异性分选。该方法先对基底材料进行特定的表面处理使之具有纳米结构，然后进行表面化学修饰将Anti-EpCAM抗体偶联到基底上来捕获肿瘤细胞。但是EpCAM作为一种上皮细胞表面标记物，在不同类型的肿瘤细胞中的表达程度不同，其使用受到肿瘤细胞种类的限制。另外，对于基底的化学修饰步骤繁琐耗时，增加了不确定因素干扰试验的成功率。另外还有通过操控声表面波的驻波，利用声辐射力来直接操控肿瘤细胞进行分选和捕获；采用介电泳的方法，利用电介质粒子在不均匀电场中受力的不同对细胞进行分选和捕获，但是这些方法都不可避免的对细胞活性产生不良影响。

目前，现有利用微流芯片捕获肿瘤细胞的方法，首先捕获肿瘤细胞效果不太好，另外在捕获肿瘤细胞后缺乏在芯片上对细胞进行分析的能力，需要转移至离心管后才能进行后续试验，该转移过程不易做到并且会造成大量细胞损失，因此存在着难以克服的缺陷。

发明内容

为此，本发明提出了一种可以解决上述问题或至少部分解决上述问题的一种利用微流芯片捕获肿瘤细胞的方法，包括：

配制细胞液步骤：将含有肿瘤细胞的样品配制为磷酸盐缓冲液；

预冲洗步骤：用不含肿瘤细胞的磷酸盐溶液对注射管路进行预冲洗；

肿瘤细胞捕获步骤：将配制好的细胞液以90～110ul/h的流速通过注射管路至微流芯片，并将肿瘤细胞捕获在微流芯片内。

根据本发明微流芯片捕获肿瘤细胞的方法能够有效的分选肿瘤细胞，捕获的肿瘤细胞具有良好的活性，并且在捕获肿瘤细胞后能够对其进行直接分析。

可选地，根据本发明的方法，还包括：

观测和记录步骤:对芯片中的捕获结果进行观测和记录。

可选地，根据本发明的方法，还包括：

仪器清洗步骤，观测完成后用去离子水和乙醇对所述注射管路进行冲洗。

可选地，根据本发明的方法，其中在配制细胞液步骤，将含有肿瘤细胞的样品用细胞计数板计数，对所述样品进行离心去除上层清液后配制成磷酸盐缓冲液。

可选地，根据本发明的方法，其中磷酸盐缓冲液的浓度为0.09～0.11mol/L。

可选地，根据本发明的方法，其中配制细胞液的肿瘤细胞浓度为7000-13000个/mL。

可选地，根据本发明的方法，其中所述注射管路包括依次连接的：注射泵、注射器和导管，通过所述导管连接至所述微流芯片。

根据本发明的方法，其中所述导管优选聚四氟乙烯材料，聚四氟乙烯材料耐腐蚀，不易与缓冲液发生反应，不会影响肿瘤细胞的捕获和后期观测。

可选地，根据本发明的方法，其中所述微流芯片包括基片和盖片，所述基片包括：凹陷部、环绕所述凹陷部的隔挡部、以及与所述隔挡部连接的第一通道，所述隔挡部的顶端与所述盖片间隔一定距离，所述一定距离大于血细胞的直径并小于肿瘤细胞的直径。

可选地，根据本发明的方法，所述基片进一步地包括第二通道，所述第二通道与所述第一通道连接，使通道之间相互连通。

可选地，根据本发明的方法，其中在肿瘤细胞捕获步骤，将所述肿瘤细胞捕获在所述微流芯片的凹陷部。

根据本发明微流芯片，隔挡部顶端与盖片间隔一定距离，所述一定距离即能使小尺寸细胞顺利通过，而使大尺寸肿瘤细胞留在凹陷部里面，因此起到捕获大尺寸细胞的效果，所述一定距离优选大于6～8um并小于15～25um，凹陷部底部距离盖片优选30μm，隔挡部的高度优选20μm，隔挡部顶端与盖片的距离优选10μm。细胞液是通过在盖片上设置的入口注入，入口优选在正对凹陷部中心位置的盖片上。细胞液通过注射管路进入芯片凹陷部，通过注射压力和速度使小细胞从凹陷部流出，经过隔挡部和盖片之间的通道、第一通道至出口。隔挡部优选圆环形、椭圆型环形。凹陷部中设置有微柱阵列，微柱阵列顶端与盖片连接，可以起到支撑作用，并有效避免因细胞液的流速等原因使盖片和隔挡部顶端的距离发生微小的变化，可以保持凹陷部以及隔挡部顶端与盖片之间距离的均匀恒定性，从而保持细胞捕获的稳定性。基片上包括至少一个第一通道。第一通道穿过第二通道至盖片上的出口。在基片上设置多条第一通道，可以加速捕获细胞的速度，并设置了与各个第一通道相连的环形第二通道，将输出的小细胞汇集在第二环形通道中，通过少量几条穿过第二通道的第一通道至盖片上的出口，进行集中收集，便于后续的检测和各种实验。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。其中在附图中，参考数字之后的字母标记指示多个相同的部件，当泛指这些部件时，将省略其最后的字母标记。在附图中：

图1示出了根据本发明一种实施方式的利用微流芯片捕获肿瘤细胞方法的流程图；

图2示出了根据本发明一种实施方式的微流芯片基片截面示意图；

图3示出了根据本发明一种实施方式的微流芯片截面示意图；

图4示出了根据本发明一种实施方式的微流芯片基片示意图；

图5示出了根据本发明一种实施方式的微流芯片示意图；

图6示出了根据本发明一种实施方式的方法捕获肿瘤细胞原理图；

图7示出了利用本发明方法对MCF-7乳腺癌细胞的捕获效果图；

图8示出了利用本发明方法对MCF-7乳腺癌细胞的捕获效果图；

图9示出了捕获到MCF-7乳腺癌细胞悬浮液的FDA/PI染色效果图；

图10示出了利用微流芯片对肿瘤细胞和血细胞的分选效果图；

其中附图标记所示为：

微流芯片1000；

基片1100、凹陷部1101、隔挡部1102、第一通道1103、第二通道1104、盖片1200、入口1201和出口1202。

具体实施方式

本发明提供了许多可应用的创造性概念，该创造性概念可大量的体现于具体的上下文中。在下述本发明实施方式中描述的实施例仅作为本发明的具体实现方式的示例性说明，而不构成对本发明范围的限制。下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步描述。

根据图1示出的本发明一个实施方式利用微流芯片捕获肿瘤的方法，微流芯片包括基片1100和盖片1200，基片1100包括：凹陷部1101、环绕凹陷部1101的隔挡部1102、以及与隔挡部1102连接的第一通道1103，隔挡部1102的顶端与盖片1200间隔一定距离，一定距离大于血细胞的直径并小于肿瘤细胞的直径。微流芯片捕获肿瘤细胞的方法首先进入配置细胞液步骤S1100：将测定肿瘤细胞数量的样品离心后，配置为一定肿瘤细胞浓度的磷酸盐缓冲液；之后进入预冲洗步骤S1200：将芯片固定在显微镜载物台上，用磷酸盐溶液依次通过注射泵、注射器、导管和芯片对注射管路进行预冲洗；然后进入肿瘤细胞捕获步骤S1300：将配置好的细胞液以90～110ul/h的流速依次通过注射泵、注射器和导管至芯片后，将肿瘤细胞捕获在芯片的凹陷部1101内；接下来进入观测和记录步骤S1400:对芯片中的捕获结果进行观测和记录；最后进入仪器清洗步骤S1500，观测完成后用去离子水和乙醇对注射泵、注射器、导管和芯片进行冲洗，至此步骤S1500结束，肿瘤细胞的捕获完成。

根据本发明微流芯片肿瘤细胞的捕获方法，肿瘤细胞包括MCF-7乳腺癌细胞，导管优选聚四氟乙烯导管。在芯片中隔挡部1102优选环形，隔挡部1102上优选设置有出口，出口优选圆形出口。凹陷部1101中优选设置有微柱阵列，微柱阵列的顶端与盖片1200连接。基片1100上优选包括至少一个第一通道1103。基片1100上优选地包括第二通道1104，第二通道1104与第一通道1103连接，使通道之间相互连通，第二通道1104优选环形。第一通道1103穿过第二通道1104至设置在盖片1200上的出口1202，隔挡部1102的顶端与盖片1200间隔的距离优选大于6～8um并小于15～25um，磷酸盐缓冲液的浓度优选0.09～0.11mol/L，肿瘤细胞浓度优选7000-13000个/mL。

本发明微流芯片捕获肿瘤细胞的方法涉及参数较多，因此具体的实施例仅作为对本发明实现方式的示例性说明，而不构成对本发明保护范围的限制。下面将以本发明提供的微流芯片捕获肿瘤细胞方法的具体操作过程作为实施例进行进一步描述。

根据本发明微流芯片制备方法的工艺参数，设计出以下实施例对本发明进行示例性说明。

实施例1

利用如图5示出的微流芯片对肿瘤细胞进行捕获，所述微流芯片如图3所示包括基片1100和盖片1200，其中所述基片1100如图2和图4所示包括：凹陷部1101、环绕凹陷部1101的隔挡部1102、以及与隔挡部1102连接的第一通道1103，隔挡部1102的顶端与盖片1200间隔一定距离，一定距离大于血细胞的直径并小于肿瘤细胞的直径，隔挡部1102的顶端与盖片1200间隔的距离优选大于6～8um并小于15～25um。其中如图4所示隔挡部1102为环形，隔挡部1102上设置有出口，出口为圆形。凹陷部1101中设置有微柱阵列，微柱阵列的顶端与盖片1200连接。基片1100上包括一组第一通道1103。基片1100上包括第二通道1104，第二通道1104与第一通道1103连接，使通道之间相互连通，第二通道1104为环形。第一通道1103穿过第二通道1104至设置在盖片1200上的出口1202。微流芯片捕获MCF-7乳腺癌细胞的方法首先进入配置细胞液步骤S1100：将测定MCF-7乳腺癌细胞数量的样品离心后，配置为一定肿瘤细胞浓度的磷酸盐缓冲液，其中所述MCF-7乳腺癌细胞细胞的数量是通过细胞计数板进行统计的，肿瘤细胞浓度优选7000个/mL；之后进入预冲洗步骤S1200：将芯片固定在显微镜载物台上，用磷酸盐溶液依次通过注射泵、注射器、导管和芯片对注射管路进行预冲洗，磷酸盐缓冲液的浓度为0.09mol/L，；然后进入肿瘤细胞捕获步骤S1300：将配置好的细胞液以90ul/h的流速依次通过注射泵、注射器和导管至芯片后，将肿瘤细胞捕获在芯片的凹陷部1101内；接下来进入观测和记录步骤S1400:对芯片中的捕获结果进行观测和记录（如拍照）；最后进入仪器清洗步骤S1500，观测完成后用去离子水和乙醇对注射泵、注射器、导管和芯片进行冲洗，至此步骤S1500结束，肿瘤细胞的捕获完成。

实施例2

利用如图5示出的微流芯片对肿瘤细胞进行捕获，所述微流芯片如图3所示包括基片1100和盖片1200，其中所述基片1100如图2和图3所示包括：凹陷部1101、环绕凹陷部1101的隔挡部1102、以及与隔挡部1102连接的第一通道1103，隔挡部1102的顶端与盖片1200间隔一定距离，一定距离大于血细胞的直径并小于肿瘤细胞的直径，隔挡部1102的顶端与盖片1200间隔的距离优选大于6～8um并小于15～25um。其中如图4所示隔挡部1102为环形，隔挡部1102上设置有出口，出口为圆形。凹陷部1101中设置有微柱阵列，微柱阵列的顶端与盖片1200连接。基片1100上包括一组第一通道1103。基片1100上包括第二通道1104，第二通道1104与第一通道1103连接，使通道之间相互连通，第二通道1104为环形。第一通道1103穿过第二通道1104至设置在盖片1200上的出口1202。微流芯片捕获MCF-7乳腺癌细胞的方法首先进入配置细胞液步骤S1100：将测定MCF-7乳腺癌细胞数量的样品离心后，配置为一定肿瘤细胞浓度的磷酸盐缓冲液，其中所述MCF-7乳腺癌细胞细胞的数量是通过细胞计数板进行统计的，肿瘤细胞浓度为13000个/mL；之后进入预冲洗步骤S1200：将芯片固定在显微镜载物台上，用磷酸盐溶液依次通过注射泵、注射器、导管和芯片对注射管路进行预冲洗，磷酸盐缓冲液的浓度为0.11mol/L；然后进入肿瘤细胞捕获步骤S1300：将配置好的细胞液以110ul/h的流速依次通过注射泵、注射器和导管至芯片后，将肿瘤细胞捕获在芯片的凹陷部1101内；接下来进入观测和记录步骤S1400:对芯片中的捕获结果进行观测和记录（如拍照）；最后进入仪器清洗步骤S1500，观测完成后用去离子水和乙醇对注射泵、注射器、导管和芯片进行冲洗，至此步骤S1500结束，肿瘤细胞的捕获完成。

实施例3

利用如图5示出的微流芯片对肿瘤细胞进行捕获，所述微流芯片如图3所示包括基片1100和盖片1200，其中所述基片1100如图2和图3所示包括：凹陷部1101、环绕凹陷部1101的隔挡部1102、以及与隔挡部1102连接的第一通道1103，隔挡部1102的顶端与盖片1200间隔一定距离，一定距离大于血细胞的直径并小于肿瘤细胞的直径。其中如图4所示隔挡部1102为环形，隔挡部1102上设置有出口，出口为圆形。凹陷部1101中设置有微柱阵列，微柱阵列的顶端与盖片1200连接。基片1100上包括一组第一通道1103。基片1100上包括第二通道1104，第二通道1104与第一通道1103连接，使通道之间相互连通，第二通道1104为环形。第一通道1103穿过第二通道1104至设置在盖片1200上的出口1202。微流芯片捕获MCF-7乳腺癌细胞的方法首先进入配置细胞液步骤S1100：将测定MCF-7乳腺癌细胞数量的样品离心后，配置为一定肿瘤细胞浓度的磷酸盐缓冲液，其中所述MCF-7乳腺癌细胞细胞的数量是通过细胞计数板进行统计的，肿瘤细胞浓度优选10000个/mL；之后进入预冲洗步骤S1200：将芯片固定在显微镜载物台上，用磷酸盐溶液依次通过注射泵、注射器、导管和芯片对注射管路进行预冲洗，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，；然后进入肿瘤细胞捕获步骤S1300：将配置好的细胞液以100ul/h的流速依次通过注射泵、注射器和导管至芯片后，将肿瘤细胞捕获在芯片的凹陷部1101内；接下来进入观测和记录步骤S1400:对芯片中的捕获结果进行观测和记录（如拍照）；最后进入仪器清洗步骤S1500，观测完成后用去离子水和乙醇对注射泵、注射器、导管和芯片进行冲洗，至此步骤S1500结束，肿瘤细胞的捕获完成。

根据本发明实施例1-3中微流芯片捕获肿瘤细胞的方法，能够简便有效地捕获悬浮于磷酸盐缓冲溶液中的肿瘤细胞，同时芯片的透明玻璃基底便于对捕获的细胞进行实时原位观测；被捕获的细胞可保持良好的活性，被捕获与固定在芯片中的细胞可进行一系列后续实验；制备得到的微流芯片对不同尺寸的细胞能够进行有效分选。

通过图6示出的肿瘤细胞的捕获原理图也可以看出，直径较大的细胞被捕获到凹陷部1101，直径较小的血细胞则从沟道1103流出。

另外，对实施例3利用微流芯片捕获肿瘤细胞的方法得到的MCF-7乳腺癌肿瘤细胞进行了记录（如图7和图8所示），并对捕获得到的肿瘤细胞进行了染色实验（如图9所示），另外还对细胞分选过程进行了详细的记录（如图10所示）

通过图7和图8示出的捕获效果图可以看出，大分子的MCF-7乳腺癌细胞被阻挡在凹陷部1101内被捕获，小分子的细胞流出。

通过图9示出的对捕获得到的MCF-7乳腺癌细胞悬浮液进行FDA/PI染色的图片中可以看出，捕获得到的肿瘤细胞发射出强烈的黄绿色且只有极少数的橘红色，表明其具有良好的活性。

通过图10可以直观地看出肿瘤细胞被捕获，而红细胞快速地通过捕获区并溜走，说明根据本发明的捕获方法对不同尺寸的细胞具有良好的分选作用。

应该注意的是，上述实施例对本发明进行说明而不是对本发明进行限制，并且本领域技术人员在不脱离所附权利要求范围的情况下可设计出替换实施例。在权利要求中，不应将位于括号之间的任何参考符号构造成对权利要求的限制。单词“包含”不排除存在未列在权利要求中的元件或步骤。

Claims (10)

1.一种利用微流芯片捕获肿瘤细胞的方法，包括：

配制细胞液步骤（S1100）：将含有肿瘤细胞的样品配制为磷酸盐缓冲液；

预冲洗步骤（S1200）：用不含肿瘤细胞的磷酸盐溶液对注射管路进行预冲洗；

肿瘤细胞捕获步骤（S1300）：将配制好的细胞液以90～110ul/h的流速注射入微流芯片，并将肿瘤细胞捕获在微流芯片内。

2.根据权利要求1的方法，还包括：

观测和记录步骤（S1400）:对芯片中的捕获结果进行观测和记录。

3.根据权利要求2的方法，还包括：

仪器清洗步骤(S1500)，观测完成后用去离子水和乙醇对所述注射管路进行冲洗。

4.根据权利要求1的方法，其中在配制细胞液步骤（S1100），将含有肿瘤细胞的样品用细胞计数板计数，对所述样品进行离心去除上层清液后配制成磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1的方法，其中磷酸盐缓冲液的浓度为0.09～0.11mol/L。

6.根据权利要求1的方法，其中配制细胞液的肿瘤细胞浓度为7000-13000个/mL。

7.根据权利要求1的方法，其中所述注射管路包括依次连接的：注射泵、注射器和导管，通过所述导管连接至所述微流芯片。

8.根据权利要求1-7任一方法，其中所述微流芯片包括基片（1100）和盖片（1200），所述基片（1100）包括：凹陷部（1101）、环绕所述凹陷部（1101）的隔挡部（1102）、以及与所述隔挡部（1102）连接的第一通道（1103），所述隔挡部（1102）的顶端与所述盖片(1200)间隔一定距离，所述一定距离大于血细胞的直径并小于肿瘤细胞的直径。

9.根据权利要求8的方法，所述基片（1100)进一步地包括第二通道(1104)，所述第二通道(1104)与所述第一通道(1103)连接，使通道之间相互连通。

10.根据权利要求8的方法，其中在肿瘤细胞捕获步骤（S1300），将所述肿瘤细胞捕获在所述微流芯片的凹陷部（1101）。

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