JP2017501212A - プロアポトーシス活性を有するｇｄ２−ｏ−アセチル化ガングリオシドに対する抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合する抗体またはその機能的断片であって、その抗体は、ａ）以下のアミノ酸配列：軽鎖ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＫＮＮＧＮＴＦＬ（配列番号１）、軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳ、軽鎖ＣＤＲ３：ＳＱＳＴＨＩＰＹＴ（配列番号２）を有する３つの軽鎖相補領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖と、ヒトカッパ（κ）ＣＬドメインを含む、免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖フレームワーク配列と、ｂ）以下のアミノ酸配列：重鎖ＣＤＲ１：ＥＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号３）、重鎖ＣＤＲ２：ＩＲＮＲＡＮＧＹＴＴ（配列番号４）、重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＶＳＮＷＡＦＤＹ（配列番号５）を有する３つの重鎖相補領域（ＣＤＲ）を含む重鎖と、免疫グロブリン重鎖由来の重鎖フレームワーク配列であって、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、ならびにＣＨ１と、他のヒトＩｇＧサブクラスに特有の軽鎖との間の対合を修復するように変異されるか、またはヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のような非ＩｇＧ１サブクラス由来のＣＨ１ドメインに置換される、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインを含む、重鎖フレームワーク配列とを含む、抗体ならびに療法におけるその使用に関する。【選択図】図１２

Description

本国際特許出願は、本明細書に参照として援用される、２０１３年１１月１１日に出願された欧州特許出願ＥＰ１３００５２９８．８の優先権を主張する。

本発明は、新規抗体およびがんの療法におけるそれらの使用を提供する。

神経外胚葉起源のがんは、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドを特異的に発現し、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドを標的とする治療抗体（ｍＡｂ ８Ｂ６）を投与でき、特に正常な細胞上、とりわけ末梢神経上でのこのがん抗原の発現の不在に起因して神経毒性を有さずに有益な効果を示すことが以前に実証されている。

抗ＯＡｃＧＤ２マウスＩｇＧ３、κ ｍＡｂ ８Ｂ６の有効な活性が非特許文献１に記載されている。この抗体はインビトロで効果的なＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を有し、また、プロアポトーシス活性も示す（非特許文献２）。この抗体は、細胞周期停止により培養中のＯＡｃＧＤ２陽性腫瘍細胞についての増殖の阻害に対応するアポトーシス経路によって細胞死およびインビトロでアポトーシスを誘導する。

ＯＡｃＧＤ２に対するｍＡｂ ８Ｂ６を用いて実施した受動免疫療法は、３つの動物モデルにおいてＯＡｃＧＤ２を発現する腫瘍の増殖を抑制するのに効果的である。ＮＫ細胞の溶解機能はｍＡｂ ８Ｂ６のインビボ活性の要件ではないことが実証された（非特許文献２）。

現在、ヒト化抗体を開発するために、本発明者らは、ｃ８Ｂ６（ＩｇＧ１、κ）と命名したヒト−マウスキメラ抗体を生成した。

このｃ８Ｂ６抗体は免疫応答性マウス腫瘍モデルにおけるものに匹敵するインビボ活性を示したが、マウスｍＡｂ ８Ｂ６と比較してプロアポトーシス活性の完全な損失がインビトロで観察された。したがって、ｍＡｂ ｃ８Ｂ６のプロアポトーシス活性の損失は、マウスＩｇＧ３とヒトＩｇＧ１との間で異なる特定の構造の損失を生じることが予測された。

したがって、ＩｇＧ１ヒトキメラ化は有用な治療を得るために行うことができないという結論が出された。

ＡＬＶＡＲＥＺ−ＲＵＥＤＡら、（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、ｖｏｌ．６（９）、ｐ：ｅ２５２２０、２０１１） ＣＯＣＨＯＮＮＥＡＵら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．、ｖｏｌ．３３３（２）、ｐ：１９４−２０４、２０１３

ここで、本発明者らは驚くべきことに、ｃ８Ｂ６のＣＨ１γ１における特定の変異またはＣＨ１γ３によるその置換がプロアポトーシス活性の回復を生じることを示した。したがって、ｃ８Ｂ６において、ヒトＩｇＧ１の軽鎖と重鎖との間の対合（ヒトＣＨ１γ１ドメインにおける１３３位近くのシステインの不在に起因して非定型）がこの抗体に対するプロアポトーシス活性の損失に関連しているようである。

それ故、得られる抗体は、ＩｇＧ１特性、すなわちＡＤＣＣ活性および長時間の半減期とプロアポトーシス活性の良好な組み合わせを含む。

したがって、本発明は、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドを認識する抗体またはその機能的断片であって、前記抗体は、
ａ）以下のアミノ酸配列：
ｉ）軽鎖ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＫＮＮＧＮＴＦＬ（配列番号１）、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳ、
ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３：ＳＱＳＴＨＩＰＹＴ（配列番号２）
を有する３つの軽鎖相補領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖と、
ヒトカッパ（κ）ＣＬドメインを含む、免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖フレームワーク配列と、
ｂ）以下のアミノ酸配列：
ｉ）重鎖ＣＤＲ１：ＥＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号３）、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２：ＩＲＮＲＡＮＧＹＴＴ（配列番号４）、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＶＳＮＷＡＦＤＹ（配列番号５）
を有する３つの重鎖相補領域（ＣＤＲ）を含む重鎖と、
免疫グロブリン重鎖由来の重鎖フレームワーク配列であって、
１）ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、ならびに
２）ＣＨ１と、他のＩｇＧサブクラスに特有の軽鎖との間の対合を修復するように変異されるか、またはヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４などの非ＩｇＧ１サブクラス由来のＣＨ１ドメインによって置換される、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインを含む、重鎖フレームワーク配列と
を含む、抗体に関する。

本発明はまた、このような抗体および薬学的に許容可能な担体の少なくとも１つを含む医薬組成物に関する。

さらに、本発明は、がんを治療する方法であって、少なくとも１つの前記抗体または少なくとも１つのその機能的断片を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に与えることを含む、方法に関する。

さらに、本発明は、がんを治療および／または予防するための医薬を製造するためのこのような抗体または少なくとも１つのその機能的断片の少なくとも１つの使用に関する。

最後に、本発明は、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体、その誘導体または機能的断片の治療効果を増加させる方法であって、ＣＨ１ドメインと、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＬドメインとの間の対合を修復するように前記抗体由来のヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させる工程、または前記ヒトＣＨ１γ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）もしくはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）由来のＣＨ１ドメインに置換する工程を含む、方法に関する。

ｃ８Ｂ６抗体の軽鎖および重鎖配列を示す。 ３０１．１４ａ抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。 ３０１．１４ｂ抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。 ３０１．１５抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。 ３０１．１６抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。 ３０１．１７抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。 ３０１．１８抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。 ３０１．１９抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。 ３０１．１５ｂ抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。 ３０１．２０抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。 ３０１．２１抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。 ヨウ化プロピジウムによる抗ＯａｃＧＤ２抗体の直接細胞毒性を示す。

第１の態様において、本発明は、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合する抗体またはその機能的断片であって、前記抗体は、
ａ）以下のアミノ酸配列：
ｉ）軽鎖ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＫＮＮＧＮＴＦＬ（配列番号１）、
ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳ、
ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３：ＳＱＳＴＨＩＰＹＴ（配列番号２）
を有する３つの軽鎖相補領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖と、
ヒトカッパ（κ）ＣＬドメインを含む、免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖フレームワーク配列と、
ｂ）以下のアミノ酸配列：
ｉ）重鎖ＣＤＲ１：ＥＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号３）、
ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２：ＩＲＮＲＡＮＧＹＴＴ（配列番号４）、
ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＶＳＮＷＡＦＤＹ（配列番号５）
を有する３つの重鎖相補領域（ＣＤＲ）を含む重鎖と、
免疫グロブリン重鎖由来の重鎖フレームワーク配列であって、
１）ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、ならびに
２）ＣＨ１と、他のＩｇＧサブクラスに特有の軽鎖との間のＩｇＧ対合を修復するように変異されるか、またはヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４などの非ＩｇＧ１サブクラス由来のＣＨ１ドメインによって置換される、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインを含む、重鎖フレームワーク配列と
を含む、抗体に関する。

前記抗体は、ＡＤＣＣ活性および半減期としてのＩｇＧ１特性も示しながら、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドを発現する細胞に対して修復されたプロアポトーシス活性を有する。

抗体は、４本のポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の同一の重（Ｈ）鎖（完全長の場合、約５０〜７０ｋＤａ）および２本の同一の軽（Ｌ）鎖（完全長の場合、約２５ｋＤａ）を含む四量体に対応する免疫グロブリン分子である。軽鎖はκおよびλと分類される。

重鎖はＩｇＧについてγと分類される。各々の重鎖は、Ｎ末端重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲと省略する）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジドメインと共に、ＩｇＧについて３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される。

各々の軽鎖は、Ｎ末端軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲと省略する）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域にさらに細分され得る。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの各々は、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配列している３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。アミノ酸の各ドメインへの割り当ては周知の慣習（ＩＭＧＴ、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ＬＥＦＲＡＮＣら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．２７、ｐ：２０９−２１２、１９９９）に従う。特定の抗原に結合する抗体の機能的能力は各々の軽／重鎖対の可変領域に依存し、大部分がＣＤＲによって決定される。

本明細書に使用される場合、「機能的断片」という用語は、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合し、ＣＨ１ドメインを含む抗体断片を指す。このような断片は当業者によって簡単に識別でき、一例として、Ｆ_ａｂ断片（例えばパパイン消化による）、Ｆ_ａｂ’断片（例えばペプシン消化および部分的還元による）、Ｆ（_ａｂ’）_２断片（例えばペプシン消化による）、Ｆ_ａｃｂ（例えばプラスミン消化による）を含み、また、Ｆ_ｄ（例えばペプシン消化、部分的還元および再凝集による）断片も本発明に包含される。

このような断片は、当該分野において公知であるおよび／または本明細書に記載される、酵素的切断、合成または組換え技術によって産生できる。抗体はまた、１つ以上の停止コドンが天然の停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使用して様々な切断型で産生できる。例えば、Ｆ（_ａｂ’）_２重鎖部分をコードする組み合わせ遺伝子は、重鎖のＣＨ_１ドメインおよび／またはヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計されてもよい。抗体の種々の部分は従来の技術によって化学的に一緒に結合されてもよいか、または遺伝子操作技術を使用して連続的なタンパク質として調製されてもよい。

「Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合する」という表現は、２×１０^−７Ｍ未満のＫ_Ｄを指す。

本明細書に使用される場合、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体自体を指す。モノクローナル抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であってもよい。

本発明に有用な抗体は、適切な特異性を有する典型的にマウスまたは他の非ヒト抗体の操作が、それらをヒト化形態に変換するために必要とされるので組換え的に産生される。抗体はグリコシル化されていても、されていなくてもよいが、グリコシル化抗体が好ましい。抗体は周知のようにジスルフィド結合により適切に架橋される。

好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はキメラ抗体である。「キメラ抗体」という表現は、マウス免疫グロブリン由来の可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域から構成される抗体を意味する。この改変は単にマウス定常領域をヒト定常領域に置換することからなり、それにより薬学的用途に許容可能であるように十分に低い免疫原性を有し得るヒト／マウスキメラが生じる。本発明に関して、前記キメラ抗体はヒト軽鎖および重鎖由来の定常領域を含む。このようなキメラ抗体を産生する多くの方法が既に報告されているので、当業者の一般的知識の一部を形成する（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと）。

別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はヒト化抗体である。

「ヒト化抗体」とは、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体の配列を変えることによってヒト抗体生殖細胞系列に由来するアミノ酸配列から部分的または完全になる抗体を意味する。抗体の可変領域および最終的にＣＤＲのこのヒト化は当該分野において現在周知である技術によってなされる。

一例として、英国特許出願２１８８６３８Ａ号および米国特許第５，５８５，０８９号は、置換される抗体の部分のみが相補性決定領域、すなわち「ＣＤＲ」である、組換え抗体が産生されるプロセスを開示している。ＣＤＲグラフト技術が、マウスＣＤＲならびにヒト可変領域フレームワークおよび定常領域からなる抗体を生成するために使用されている（例えば、ＲＩＥＣＨＭＡＮＮら、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．３３２、ｐ：３２３−３２７、１９８８を参照のこと）。これらの抗体はＦｃ依存性エフェクター機能に必要なヒト定常領域を保持するが、抗体に対して免疫反応を誘発する可能性はほとんどない。

一例として、可変領域のフレームワーク領域は対応するヒトフレームワーク領域によって置換され、非ヒトＣＤＲを実質的にインタクトなままにするか、またはさらにＣＤＲをヒトゲノムに由来する配列と置き換える。完全なヒト抗体は、免疫系がヒト免疫系に対応するように変化されている、遺伝子操作されたマウスにおいて産生される。上述のように、一本鎖形態を表す断片を含む、抗体の免疫学的に特異的な断片を利用することが、本発明の方法における使用に十分である。

再び、ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲを含み、存在する任意の定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち少なくとも約８５または９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である、抗体を指す。それ故、場合によりＣＤＲを除いて、ヒト化抗体の全ての部分は、１つ以上の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、ヒト化免疫グロブリンは典型的にキメラマウス可変領域／ヒト定常領域抗体を含まない。

ヒト化またはキメラ抗体はヒトの治療に使用するための非ヒト抗体より少なくとも３つの潜在的な利点を有する：
１）エフェクター部分はヒトであるので、それはヒト免疫系の他の部分と良好に相互作用できる（例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって標的細胞をより効果的に破壊する）。
２）ヒト免疫系はヒト化抗体のフレームワークまたはＣ領域を異種と認識するはずはないので、このような注射抗体に対する抗体反応は、全体に異種の非ヒト抗体または部分的に異種のキメラ抗体に対するより少ないはずである。
３）注射される非ヒト抗体は、ヒト循環においてヒト抗体の半減期より非常に短い半減期を有すると報告されている。注射されるヒト化抗体は、天然に存在するヒト抗体と本質的に同一である半減期を有し、与えられる投与頻度をより少なくできる。

一例として、ヒト化免疫グロブリンの設計は以下のように実施され得る：アミノ酸が以下のカテゴリーに入る場合、使用されるヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリン）のフレームワークアミノ酸は、ＣＤＲを与える非ヒト免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリン）由来のフレームワークアミノ酸と置き換えられる：（ａ）アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸はその位置においてヒト免疫グロブリンにとってまれであるが、ドナー免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸はその位置においてヒト免疫グロブリンに特有である；（ｂ）アミノ酸の位置はＣＤＲの１つに直接隣接する；または（ｃ）フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子は三次元免疫グロブリンモデルにおけるＣＤＲアミノ酸の任意の原子の約５〜６Å（中心間）内にある（ＱＵＥＥＮら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏｌ．８８、ｐ：２８６９、１９９１）。アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸およびドナー免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸の各々がその位置においてヒト免疫グロブリンにとってまれである場合、そのようなアミノ酸はその位置においてヒト免疫グロブリンに特有のアミノ酸と置き換えられる。

有益には、前記抗体は、アミノ酸配列の配列番号６を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および／またはアミノ酸配列の配列番号７を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。

ヒトカッパ（κ）ＣＬドメインは当業者に周知であり、例として配列番号８に対応する。

好ましくは、本発明の抗体はアミノ酸配列の配列番号９を有する軽鎖を有する。

ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインは当業者に周知であり、例として配列番号１０に対応する。

ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインは当業者に周知である。本明細書に使用される場合、「ＣＨ１と、他のＩｇＧサブクラスに特有の軽鎖との間の対合を修復するように変異されるＣＨ１ドメイン」とは、好ましくはＣＨ１配列の１３３または１３４位においてシステイン残基を提示するようにアミノ酸がシステイン残基に置換されているヒトＩｇＧ１由来のヒトＣＨ１ドメインを指す。定常領域の番号付けはＫａｂａｔら（１９９１、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎ°９１−３２４２、Ｎａｔｉｏｎａｌ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＡ）に記載されるＥＵインデックスのものである。例として、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインは配列番号２９に対応する。ＣＨ１と、他のＩｇＧサブクラスに特有の軽鎖との間の典型的なＩｇＧ対合を修復するように変異される場合、前記ＣＨ１ドメインは、１３３位におけるセリン残基がシステインに置換されているアミノ酸配列の配列番号１１、または１３４位におけるセリン残基がシステインに置換されているアミノ酸の配列番号３０に対応する。ＣＨ１配列の１３３または１３４位におけるシステイン残基は本発明の抗体の軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合を修復する。

ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインは当業者に周知である。例として、ヒトＩｇＧ２由来のＣＨ１ドメインは配列番号３１に対応し、ヒトＩｇＧ３由来のＣＨ１ドメインは配列番号１２に対応し、ヒトＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインは配列番号３２に対応する。

第１の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、その配列の１３３または１３４位においてシステイン残基を提示するヒトＩｇＧ１由来の変異ＣＨ１ドメインを含み、好ましくは前記ドメインは配列番号１１の配列を有する。

さらに好ましくは、前記抗体は、３０１．１４ａ、３０１．１４ｂ、３０１．１６および３０１．１８を含む群から選択される。

第２の好ましい実施形態によれば、本発明のキメラ抗体は、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインを含み、好ましくは前記ドメインは配列番号１２の配列などのＩｇＧ３由来のＣＨ１ドメインである。

さらに好ましくは、前記抗体は、３０１．１５、３０１．１５ｂ、３０１．１７および３０１．１９を含む群から選択される。

本発明のキメラ抗体はまた、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの誘導体由来のヒンジドメインを含む。

ヒトＩｇＧ１由来のヒンジドメインは当業者に周知であり、例として配列番号１３に対応する。ヒトＩｇＧ１由来のヒンジドメインの誘導体は典型的にヒンジドメインに対応し、ヒンジ配列の５番目の位置におけるシステイン残基は別の残基に置換されている。実際に、前記変異の結果、他のＩｇＧサブクラスに特有の構造の修復が生じる。このような誘導体の例として、配列番号１４を挙げることができる。

ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のヒンジドメインは当業者に周知であり、例としてＩｇＧ３について配列番号１５に対応する。ヒトＩｇＧ３の誘導体もまた、当業者に周知であり、例として配列番号１６〜１９、好ましくは配列番号１９に対応する。

第３の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はヒトＩｇＧ１またはその誘導体由来のヒンジドメインを含み、好ましくは前記ドメインは配列番号１３または配列番号１４の配列を有する。

さらに好ましくは、前記抗体は、３０１．１４ａ、３０１．１４ｂ、３０１．１５、３０１．１５ｂ、３０１．２０および３０１．２１を含む群から選択される。

第４の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの誘導体由来のヒンジドメインを含み、好ましくは前記ドメインはヒトＩｇＧ３由来であり、配列番号１５〜配列番号１９、最も好ましくは配列番号１５または配列番号１９からなる群から選択される配列を有する。

さらに好ましくは、前記抗体は、３０１．１６、３０１．１７、３０１．１８および３０１．１９を含む群から選択される。

第５の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、
１）配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖と、
２）
・配列番号１０の配列を有するヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、
・

を含むかまたはからなる群から選択されるヒトＣＨ１およびヒンジドメインに対応するアミノ酸配列
からなる重鎖とを含む。

さらに好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は３０１．１５、３０１．１８および３０１．１９の抗体の中から選択される。

実際に、これらの抗体は予想外に、元の抗体のものより高いプロアポトーシス活性を示す。

さらに好ましくは、本発明の抗体は３０１．１５の抗体である。

実際に、この抗体は元の抗体に関して結合共同性を示すもののみである。

好ましくは、その配列の１３３または１３４位においてシステイン残基を提示しているヒトＩｇＧ１由来の変異ＣＨ１ドメイン、またはヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインのいずれかによる本発明の抗体内のシステイン残基の導入は、別のシステイン残基に以前に連結された遊離チオール基を解放させない。

本発明の抗体は免疫複合体を包含する。

本明細書に使用される場合、「免疫複合体」という用語は、第２の分子、好ましくは細胞傷害剤または放射性同位体に結合した少なくとも１つのキメラ抗体またはその機能的断片を含む複合体分子を指す。好ましくは、前記抗体またはその機能的断片は共有結合により前記第２の分子に結合する。

一実施形態において、本発明の抗体は免疫複合体である。

特定の実施形態において、本発明の抗体は免疫複合体であり、前記免疫複合体は本発明の抗体またはその機能的断片と細胞傷害剤とを含む。

別の特定の実施形態において、本発明の抗体は免疫複合体であり、前記免疫複合体は本発明の抗体またはその機能的断片と放射性同位体とを含む。

第２の態様によれば、本発明は、療法に使用するための、本明細書に記載される少なくとも１つの抗体または少なくとも１つのその機能的断片と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。

前記組成物は、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドを発現するがんを治療するのに特に有用である。

前記組成物は、限定されないが、液剤、懸濁剤、凍結乾燥粉末、カプセル剤および錠剤を含む、患者への投与に適した任意の医薬形態であってもよい。

本発明の医薬組成物は、任意の薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または補助剤をさらに含んでもよい。

本発明の医薬組成物は、注射、例えば局所注射、経粘膜的投与、吸入、経口投与および所望の治療を達成するために当業者が適切であると判断する、より一般的な任意の形態であってもよい。

本発明の抗体は、意図する目的を達成するのに有効な量、および選択される投与経路に適した投薬量で前記医薬組成物に含まれる。

より具体的には、治療有効量は、がんを患っている対象の症状を予防、軽減または改善するのに有効な化合物の量を意味する。

意図する適用に応じて、本発明のキメラ抗体はさらなる構成要素をさらに含んでもよい。例として、本発明のキメラ抗体は免疫複合体に対応し得る。

本発明の第３の態様は、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドを発現するがんを治療する方法であって、本明細書に記載される少なくとも１つのキメラ抗体または少なくとも１つのその機能的断片を含む、本明細書に記載される医薬組成物を、それを必要とする患者に提供する工程を含む、方法に関する。

本明細書に使用される場合、「患者」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。

好ましくは、それを必要とする患者は、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドを発現するがんを患っている患者に対応する。

ＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドを発現する前記がんは、神経芽細胞腫、黒色腫、膠芽細胞腫、小細胞肺がん、乳がんおよびがん幹細胞がんを含む群から選択される。

本発明の第４の態様は、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド、その誘導体または機能的断片に特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体の治療効果を増加させる方法であって、ＣＨ１ドメインと、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＬドメインとの間の対合を修復するように前記抗体由来のヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させる工程、または前記ＣＨ１γ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）またはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）由来のＣＨ１ドメインに置換する工程を含む、方法に関する。

治療効果を増加させる前記方法は前記抗体のプロアポトーシス活性を増加させることを含む。

第１の好ましい実施形態において、本発明の方法は、ＣＨ１ドメインと、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＬドメインとの間の対合を修復するように、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体由来のＣＨ１ドメインを変異させる工程を含む。

ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインは当業者に周知である。

Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体由来のＣＨ１ドメインは図１に示され得る。

有益には、ＣＨ１ドメインと、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＬドメインとの間の対合を修復するように、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインを変異させる工程は、
ａ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインを含む核酸配列を単離する工程であって、前記核酸配列は好ましくは抗体の重鎖をコードする、工程と、
ｂ）コドンを変異させる工程、好ましくはアミノ酸残基システイン（Ｃ）をコードするように前記ＣＨ１ドメインの１３３位または１３４位をコードするコドンを変異させて、変異核酸配列を得る工程と、
ｃ）作動可能な発現エレメントを有する変異核酸配列を提供する工程と、
ｄ）適切な宿主中で抗体の軽鎖をコードする核酸配列と変異核酸を同時発現し、それによりＯ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合する変異ヒトＩｇＧ１抗体、誘導体または機能的断片を得る工程と、
ｅ）任意に、変異抗体、その誘導体または断片を単離する工程と
によって行われる。

第２の好ましい実施形態において、本発明の方法は、ヒトＩｇＧ１由来の前記ＣＨ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインに置換する工程を含む。

ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４由来のＣＨドメインは当業者に周知である。例として、ヒトＩｇＧ３由来のＣＨ１ドメインは配列番号１２に対応する。

有益には、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインに置換する工程は、
ａ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインを含む核酸配列であって、好ましくは抗体の重鎖をコードする、核酸配列を単離することと、
ｂ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド核酸に特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体の前記ＣＨ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインをコードする核酸配列に置換して、変異核酸配列を提供することと、
ｃ）前記変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供することと、
ｄ）適切な宿主中で前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列と前記変異核酸を同時発現し、それによりＯ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド、誘導体または機能的断片に特異的に結合する変異ヒトＩｇＧ１抗体を提供することと、
ｅ）任意に、変異抗体、その誘導体または断片を単離することと
によって行われる。

さらに好ましい実施形態において、本発明の方法は、ヒンジドメインと、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ２ドメインとの間の対合を修復するように、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体由来のヒンジＩｇＧ１ドメインを変異させる工程、または前記抗体のヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはそれらの誘導体由来のヒンジドメインに置換する工程をさらに含む。

ヒトＩｇＧ１由来のヒンジドメインは当業者に周知であり、例として配列番号１３に対応する。

本明細書に使用される場合、「ヒンジドメインと、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ２ドメインとの間の対合を修復するように、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体由来のヒンジドメインを変異させる」工程とは、ヒンジプロテイック（ｐｒｏｔｅｉｃ）配列の５番目の位置におけるシステイン残基が別の残基、好ましくはセリンに置換されている、前記抗体のヒトＩｇＧ１ヒンジドメインを指す。実際に、前記変異の結果、典型的なＩｇＧ構造の修復が生じる。このような誘導体の例として、配列番号１４を挙げることができる。

有益には、ヒンジと、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ２との間の対合を修復するように、前記抗体由来のヒトヒンジを変異させる工程は、
ａ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のヒンジドメインを含む核酸配列であって、好ましくは抗体の重鎖をコードする核酸配列を単離することと、
ｂ）別のアミノ酸残基、好ましくはセリン残基をコードするように前記ヒンジドメインの５位においてアミノ酸残基システイン（Ｃ）をコードするコドンを変異させて、変異核酸配列を提供することと、
ｃ）変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供することと、
ｄ）適切な宿主中で抗体の軽鎖をコードする核酸配列と変異核酸を同時発現し、それによりＯ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド、誘導体または機能的断片に特異的に結合する変異ヒトＩｇＧ１抗体を提供することと、
ｅ）任意に、変異抗体、その誘導体または断片を単離することと
によって行われる。

ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のヒンジドメインは当業者に周知であり、例としてＩｇＧ３について配列番号１５に対応する。ヒトＩｇＧ３の誘導体もまた、当業者に周知であり、例として配列番号１６〜１９、好ましくは配列番号１９に対応する。

さらに有益には、前記抗体のヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはそれらの誘導体由来のヒンジドメインに置換する工程が、
ａ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のヒンジドメインを含む核酸配列であって、好ましくは抗体の重鎖をコードする核酸配列を単離することと、
ｂ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド核酸配列に特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のヒンジドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４または誘導体由来のヒンジドメインをコードする核酸配列に置換して、変異核酸配列を提供することと、
ｃ）前記変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供することと、
ｄ）適切な宿主中で抗体の軽鎖をコードする核酸配列と変異核酸を同時発現し、それによりＯ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド、誘導体または機能的断片に特異的に結合する変異ヒトＩｇＧ１抗体を提供することと、
ｅ）任意に、変異抗体、その誘導体または断片を単離することと
によって行われる。

本発明の他の実施形態および利点は以下の非限定的な実施例に例示される。

１−インビトロでの抗ＯＡｃＧＤ２抗体のプロアポトーシス活性
最初の工程において、キメラ抗ＯＡｃＧＤ２抗体、ｃ８Ｂ６が、その定常領域をヒトＩｇＧ１、κの定常領域に置換することによって８Ｂ６から設計される。その配列は図１（配列番号２７および配列番号２８）に表される。

この抗体の構造は、軽鎖において２つの分子内ジスルフィド結合（Ｃｙｓ２３−Ｃｙｓ９３およびＣｙｓ１３９−Ｃｙｓ１９９）、および重鎖において４つの分子内ジスルフィド結合（Ｃｙｓ２２−Ｃｙｓ９８、Ｃｙｓ１４６−Ｃｙｓ２０２、Ｃｙｓ２６３−Ｃｙｓ３２３およびＣｙｓ３６９−Ｃｙｓ４２７）を含む。鎖内ジスルフィド結合に関与するシステイン残基はアスタリスク（＊）によって示される。構造全体は３つの分子間ジスルフィド結合によって安定化される：軽鎖は、軽鎖の最後のシステイン残基と上流ヒンジ領域のシステイン残基との間の１つのジスルフィド結合（Ｃｙｓ２１９−Ｃｙｓ２２２）によって重鎖に接続され、重鎖は中間ヒンジにおけるシステインを接続する２つのジスルフィド結合（Ｃｙｓ２２８−Ｃｙｓ２２８およびＣｙｓ２３１−Ｃｙｓ２３１）によって接続される。鎖間ジスルフィド結合に関与するシステイン残基は矢印（↑）によって示される。

８Ｂ６ ＬＣＶＲは、ヒトＩｇＧ１のＣＬドメインと融合するようにｐＥｖｉベクター内のクローニングしたＮｏｔＩ−ＫａｓＩである。

８Ｂ６ ＨＣＶＲドメインは、ヒトＩｇＧ１の重鎖の定常ドメインと融合するようにｐＥｖｉ’ベクター内のクローニングしたＮｏｔＩ−ＮｈｅＩである。

このように、ＣＨＯ Ｋ１細胞は両方のベクターによって共トランスフェクトされる。

トランスフェクション後、ＣＨＯ Ｋ１細胞を数日間、無血清培地中に維持する。

各日に、培養培地を収集し、−８０℃で凍結する。細胞生存率が７０〜８０％未満になるまで、新たな培地をトランスフェクト細胞に加える。

収集した培養培地をプールし、セファロースマトリクスに固定したプロテインＡを使用して抗体を精製する。

ＣＨＯにおけるｃ８Ｂ６の産生を、還元および非還元条件の両方の下で電気泳動によって分析した。非還元条件下で、ｃ８Ｂ６抗体は全抗体に対応する１５０ｋＤにて１つのバンドを示したという結果が示される。一方、還元条件下で、ＨＣについて５０ｋＤにおけるバンドおよびＬＣについて２５ｋＤにおけるバンドを観察した。ＳＵＰＥＲＤＥＸカラムでのゲル濾過により、１５０ｋＤに対応する１２．３ｍｌにて主要ピーク（純度９９．０％）を有するクロマトグラムプロファイルが示された。最後に、プロテインＡカラムでの精製後のキメラｃ８Ｂ６についての産生収量は上清の約３１５ｍｇ／Ｌであった。

その標的との抗体の結合を、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドを発現するＩＭＲ５細胞でのフローサイトメトリーによって確認した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合したヤギ抗ヒトＩｇＧによって結合が明らかになった。これらの実験により、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化に結合する、この抗体の機能性が確認された。

次いで、ｃ８Ｂ６抗体の直接細胞毒性をＭＴＴアッセイによって評価した。

これらのアッセイにおいて、１×１０^４ＩＭＲ５、ＳＵＭ１５９ＰＴまたはＨ１８７細胞を、９６ウェルマイクロプレートにおいて３７℃にて２４時間インキュベートする。８０〜０．１５μｇ／ｍＬの抗体を加え、３７℃にて２４時間インキュベートした。次いで５０μｇのＭＴＴを各ウェルに加え、３７℃にて少なくとも４時間インキュベートし、その後、細胞を１０％ＳＤＳで可溶化し、３７℃にてＯ．Ｎ．でインキュベートした。次いで吸光度を５７０および６５０ｎｍにて読み取った。６５０ｎｍにおける生成物の吸光度を５７０ｎｍにおける吸光度から差し引いて（Ａｂｓ５７０−Ａｂｓ６５０）、色素の全変換率を算出した。２０μｇのエトポシドで処理した細胞を有する４つの対照ウェルは、０％の生存率を考慮して吸光度についてのブランクを与える。生存率（％）の阻害は未処理の細胞と比較してパーセンテージとして表し、各値は四連で平均±ＳＥＭとして表す。

抗体ｃ８Ｂ６は、マウス定常ＩｇＧ３ドメインからヒトＩｇＧ１定常ドメインに移行するキメラ化工程後、８Ｂ６の直接細胞毒性を損失したという結果が示される。その上、抗体は親ＩｇＧ３ ８Ｂ６の共同性をさらに損失した。

最後に、キメラ化の異なる手段を試行する多くの実験は、少しのプロアポトーシス活性を回復するだけであり、結合の共同性は観察されなかった。

驚くべきことに、キメラ化についてのＣＨ１定常ドメインの特定の修飾の結果、プロアポトーシス活性について大きな変化を生じる。

これらの結果は、以前の構築物に基づいて設計した抗体３０１．１４ａ、３０１．１４ｂ、３０１．１５、３０１．１５ｂ、３０１．１６、３０１．１７、３０１．１８、３０１．１９、３０１．２０および３０１．２１で得た。

抗体３０１．１４ａは、図２（配列番号２０）に表されるようにヒトヒンジγ１ドメインを有する変異ヒトＣＨ１γ１（下線を引いた変異Ｓ１３３Ｃ）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。

抗体３０１．１４ｂは、図３（配列番号２１）に表されるように変異ヒトヒンジγ１ドメイン（システイン２２２のセリン残基による置換、Ｃ２２２Ｓに対応する下線を引いた変異）を有する変異ヒトＣＨ１γ１（下線を引いた変異Ｓ１３３Ｃ）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。

抗体３０１．１５は、図４（配列番号２２）に表されるようにヒトヒンジγ１ドメインを有するヒトＣＨ１γ３（その同類ＣＨ１γ１と置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。

抗体３０１．１５ｂは、図９（配列番号３４）に表されるように変異ヒトヒンジγ１ドメイン（システイン２２２のセリン残基による置換、Ｃ２２２Ｓに対応する下線を引いた変異）を有するヒトＣＨ１γ３（その同類ＣＨ１γ１と置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。

抗体３０１．１６は、図５（配列番号２３）に表されるようにヒトヒンジγ３ドメイン（その同類ヒンジγ１と置き換えている）を有する変異ヒトＣＨ１γ１（下線を引いた変異Ｓ１３３Ｃ）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。

抗体３０１．１７は、図６（配列番号２４）に表されるようにヒトヒンジγ３ドメイン（その同類ヒンジγ１を置き換えている）を有するヒトＣＨ１γ３（その同類ＣＨ１γ１を置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。

抗体３０１．１８は、図７（配列番号２５）に表されるように短縮された（１７アミノ酸）ヒトヒンジγ３ドメインを有する変異ヒトＣＨ１γ１（下線を引いた変異Ｓ１３３Ｃ）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。

抗体３０１．１９は、図８（配列番号２６）に表されるように短縮された（１７アミノ酸）ヒトヒンジγ３ドメインを有するヒトＣＨ１γ３（その同類ＣＨ１γ１を置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。

抗体３０１．２０は、図１０（配列番号３１）に表されるようにヒトヒンジγ１ドメインを有するヒトＣＨ１γ２（その同類ＣＨ１γ１を置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。

抗体３０１．２１は、図１１（配列番号３２）に表されるようにヒトヒンジγ１ドメインを有するヒトＣＨ１γ４（その同類ＣＨ１γ１を置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。

ｍｕＩｇＧ３対照はマウス８Ｂ６ ＩｇＧ３に対応し、ここでＣＨ１ ＩｇＧ３は配列番号３３に対応し、１３４位のシステイン残基はセリン残基に置換され、２２４位のセリン残基はシステイン残基に置換されている。

前記抗体のＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドへの結合を以前のように確認した。

次いで、前記抗体の潜在的なプロアポトーシス活性を以前に述べたように決定した。

結果を以下の表にまとめ、ここで溶解のパーセンテージは８０μｇ／ｍｌの抗体濃度について得たものである。

ＩＭＲ５細胞に対する抗ＯａｃＧＤ２ ３０１．１４ａ、３０１．１４ｂ、３０１．１５、３０１．１６、３０１．１７、３０１．１８および３０１．１９抗体の直接細胞毒性：

この結果により、予想外に、変異ヒトＣＨ１γ１またはヒトＣＨ１γ３を含むキメラ抗体がプロアポトーシス活性を有することが示され、このことは、直接細胞毒性の損失がヒトＩｇＧ１の構造に起因し得ることを意味する。さらに、これらの抗体の全ては開始抗体８Ｂ６のものより大きいＥＣ_５０を示す。

また、この結果により、最大溶解率％に関して、より高い細胞毒性効果を与えた構築物は、（ｉ）ヒトＣＨ１γ３およびヒトヒンジγ１の融合物（３０１．１５構築物）または（ｉｉ）ヒトＣＨ１ γ１（Ｓ１３３Ｃで変異）またはヒトＣＨ１γ３および短縮ヒトヒンジγ３の融合物（３０１．１８および３０１．１９構築物）に対応することが示される。最後のこれら２つに関して、元のｃ８Ｂ６と比較して親和性の増加が観察された。

最後に、さらに驚くべきことに、３０１．１５抗体は、修復した結合共同性に対応する競合曲線において集合プロファイルを示した唯一のものであった。

ＩＭＲ５、ＳＵＭ１５９ＰＴおよびＨ１８７細胞に対する抗ＯａｃＧＤ２ ３０１．１５ｂ、３０１．２０および３０１．２１抗体の直接細胞毒性：

この結果により、予想外に、ヒトＣＨ１γ２またはＣＨ１γ４を含むキメラ抗体は、ＩＭＲ５細胞に対してプロアポトーシス活性を有することが示され、このことは、直接細胞毒性の損失がヒトＩｇＧ１の構造に起因し得ることを意味する。さらに、ヒトＣＨ１γ３および変異ヒトヒンジγ１ドメイン（システイン２２２のセリン残基による置換（Ｃ２２２Ｓ）に対応する下線を引いた変異）を含むキメラ抗体はＩＭＲ５細胞に対してプロアポトーシス活性を有する。

また、この結果により、ヒトＣＨ１γ１（Ｓ１３３Ｃでの変異）および変異ヒトヒンジγ１ドメイン（システイン２２２のセリン残基による置換（Ｃ２２２Ｓ）に対応する下線を引いた変異）の融合物（３０１．１４ｂ構築物）またはヒトＣＨ１γ３およびヒトヒンジγ１の融合物（３０１．１５構築物）に対応する構築物は、ＳＵＭ１５９ＰＴおよびＨ１８７細胞の両方に対してプロアポトーシス活性を有することが示される。

異なる抗体の直接細胞毒性もまた、ヨウ化プロピジウムアッセイにより評価した。

このアッセイにおいて、１５００００ＩＭＲ５細胞を、３７℃にて２４時間、２４ウェルプレートに播種し、次いで３７℃にて２４時間、４０μｇ／ｍＬの各抗体で処理した。その後、死細胞をヨウ化プロピジウム（１２．５μｇ／ｍｌ）により標識した。全ての試料をＬＳＲＩＩ ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｍ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）においてフローサイトメトリーにより分析した。

この結果を以下の表にまとめ、図１２により例示する。

この結果により、ヒトＣＨ１γ１（Ｓ１３３Ｃでの変異）および変異ヒトヒンジγ１ドメイン（システイン２２２のセリン残基による置換（Ｃ２２２Ｓ）に対応する下線を引いた変異）の融合物（３０１．１４ｂ構築物）またはヒトＣＨ１γ３およびヒトヒンジγ１の融合物（３０１．１５構築物）に対応する構築物がＩＭＲ５細胞に対してプロアポトーシス活性を有することが確認された。同時に、この結果により、ＩｇＧ１構造を模倣するようなマウスＩｇＧ３ ８Ｂ６における変異がプロアポトーシス活性の損失を生じることが確認された。

ＣＨ１と、非ＩｇＧ１抗体に特有の軽鎖との間の対合を再構成することにより、プロアポトーシス活性を修復できる。このような再構成は、非ＩｇＧ１サブクラスに特有のＣＨ１システインを修復することによって、または非ＩｇＧ１ドメインに置換することによって得られ得る。

まとめると、本発明者らは、維持されたプロアポトーシス活性を有する８Ｂ６抗体のキメラ化に成功し、そのプロアポトーシス活性は２つの抗体に対して均一に増加し、その１つはまた、元の抗体のような協同的結合を示す。

２−インビボでの抗ＯＡｃＧＤ２抗体効率
マウス神経芽細胞腫モデル
５週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスはＣＨＡＲＬＥＳ ＲＩＶＥＲから購入した。

ヒト神経芽細胞腫ＩＭＲ５腫瘍を免疫欠損ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて増殖させた。簡潔に述べると、マウスの右脇腹に腫瘍細胞（１×１０^６ＩＭＲ５細胞）を皮下注射した。次いで腫瘍移植後、皮下腫瘍増殖を式［体積ｍｍ^３＝（長さ）×（幅^２）×０．５］を使用して測定した。ＩＭＲ５ヒト神経芽細胞腫保有ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、腫瘍体積が０．１ｃｍ^３に等しくなったとき、抗体（５００μ／マウス）をｉ．ｖ．で与えた。

マウスは８Ｂ６（ｍｕＩｇＧ３）ｍＡｂもしくはｃ．８Ｂ６（ｈｕＩｇＧ１）ｍＡｂ、または二重変異ｈｕＩｇＧ１ ｍＡｂもしくはｈｕＩｇＧ３ ＣＨ１に置換されたｈｕＩｇＧ１ ＣＨ１を受けた。

Claims (22)

1. Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合する抗体またはその機能的断片であって、前記抗体は、
   ａ）以下のアミノ酸配列：
   ｉ）軽鎖ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＫＮＮＧＮＴＦＬ（配列番号１）、
   ｉｉ）軽鎖ＣＤＲ２：ＫＶＳ、
   ｉｉｉ）軽鎖ＣＤＲ３：ＳＱＳＴＨＩＰＹＴ（配列番号２）
   を有する３つの軽鎖相補領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖と、
   ヒトカッパ（κ）ＣＬドメインを含む、免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖フレームワーク配列と、
   ｂ）以下のアミノ酸配列：
   ｉ）重鎖ＣＤＲ１：ＥＦＴＦＴＤＹＹ（配列番号３）、
   ｉｉ）重鎖ＣＤＲ２：ＩＲＮＲＡＮＧＹＴＴ（配列番号４）、
   ｉｉｉ）重鎖ＣＤＲ３：ＡＲＶＳＮＷＡＦＤＹ（配列番号５）
   を有する３つの重鎖相補領域（ＣＤＲ）を含む重鎖と、
   免疫グロブリン重鎖由来の重鎖フレームワーク配列であって、
   １）ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、ならびに
   ２）ＣＨ１と、他のＩｇＧサブクラスに特有の軽鎖との間の対合を修復するように変異されるか、またはヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４などの非ＩｇＧ１サブクラス由来のＣＨ１ドメインによって置換される、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインを含む、重鎖フレームワーク配列と
   を含む、抗体。
2. Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合する前記抗体またはその機能的断片が、前記ガングリオシドに対して２×１０^−７Ｍ未満のＫ_Ｄを示す、請求項１に記載の抗体。
3. 前記抗体が、配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および／または配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む、請求項１または２に記載の抗体。
4. 前記抗体が、配列番号８の配列を有するヒトカッパ（κ）ＣＬドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
5. 前記抗体が、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する、請求項４に記載の抗体。
6. 前記抗体が、配列番号１０の配列を有するヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
7. 前記抗体が、ＣＨ１と、他のＩｇＧサブクラスに特有の軽鎖との間の対合を修復するように変異され、配列番号１１の配列などのその配列の１３３または１３４位においてシステイン残基を提示するヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインに対応する、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
8. 前記抗体が、配列番号１２などのヒトＩｇＧ３由来のＣＨ１ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
9. 前記抗体が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらの誘導体由来のヒンジドメインも含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
10. 前記ヒンジドメインが、配列番号１３〜１９を含む群から選択される、請求項９に記載の抗体。
11. 前記抗体が、
    １）配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖と、
    ２）以下：
    ・配列番号１０の配列を有するヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、
    ・
    

    

    を含むまたはからなる群から選択されるヒトＣＨ１およびヒンジドメインに対応するアミノ酸配列
    からなる重鎖と
    を含む、請求項１に記載の抗体。
12. 前記抗体が、３０１．１４ｂ、３０１．１５、３０１．１８または３０１．１９、好ましくは３０１．１５である、請求項１１に記載の抗体。
13. 前記抗体が免疫複合体である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
15. 前記組成物が、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドを発現するがん、例えば神経芽細胞腫、黒色腫、膠芽腫、小細胞肺がん、乳がんおよびがん幹細胞がんを治療するためのものである、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 請求項１〜１０に記載されるＯ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合する抗体、その誘導体または機能的断片の治療効果を増加させる方法であって、ＣＨ１ドメインと、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＬドメインとの間の対合を修復するように前記抗体由来のヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させる工程、または前記ヒトＣＨ１γ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）もしくはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）由来のＣＨ１ドメインに置換する工程、を含む、方法。
17. 前記治療効果を増加させることが、前記抗体のプロアポトーシス活性を増加させることを含む、請求項１６に記載の方法。
18. ＣＨ１ドメインと、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＬドメインとの間の対合を修復するように前記抗体由来の前記ヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させる工程が、
    ａ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインを含む核酸配列であって、好ましくは前記抗体の重鎖をコードする、核酸配列を単離することと、
    ｂ）コドンを変異させること、好ましくは、変異核酸配列を提供するためにアミノ酸残基システイン（Ｃ）をコードするように前記ＣＨ１ドメインの１３３または１３４位をコードするコドンを変異させることと、
    ｃ）前記変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供することと、
    ｄ）適切な宿主中で前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列と前記変異核酸を同時発現し、それによりＯ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド、誘導体または機能的断片に特異的に結合する変異ヒトＩｇＧ１抗体を提供することと、
    ｅ）任意に、前記変異抗体、その誘導体または断片を単離することと
    によって行われる、請求項１６または１７に記載の方法。
19. Ｏ−アセチル化−ＧＤ２−ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体の前記ＣＨ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインに置換する工程が、
    ａ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインを含む核酸配列であって、好ましくは前記抗体の重鎖をコードする核酸配列を単離することと、
    ｂ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド核酸に特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体の前記ＣＨ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインをコードする核酸配列に置換して、変異核酸配列を提供することと、
    ｃ）前記変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供することと、
    ｄ）適切な宿主中で前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列と前記変異核酸を同時発現し、それによりＯ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド、誘導体または機能的断片に特異的に結合する変異ヒトＩｇＧ１抗体を提供することと、
    ｅ）任意に、変異抗体、その誘導体または断片を単離することと
    によって行われる、請求項１６または１７に記載の方法。
20. 前記方法が、ヒンジドメインと、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ２ドメインとの間の対合を修復するようにＯ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体由来のヒンジＩｇＧ１ドメインを変異させる工程、または前記抗体のヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、またはそれらの誘導体由来のヒンジドメインに置換する工程をさらに含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. ヒンジと、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ２との間の対合を修復するように、前記抗体由来の前記ヒトヒンジを変異させる工程が、
    ａ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のヒンジドメインを含む核酸配列であって、好ましくは前記抗体の重鎖をコードする核酸配列を単離することと、
    ｂ）別のアミノ酸残基、好ましくはセリン残基をコードするように前記ヒンジドメインの５位においてアミノ酸残基システイン（Ｃ）をコードするコドンを変異させて、変異核酸配列を提供することと、
    ｃ）変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供することと、
    ｄ）適切な宿主中で前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列と前記変異核酸を同時発現し、それによりＯ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド、誘導体または機能的断片に特異的に結合する変異ヒトＩｇＧ１抗体を提供することと、
    ｅ）任意に、変異抗体、その誘導体または断片を単離することと
    によって行われる、請求項２０に記載の方法。
22. 前記抗体のヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４またはそれらの誘導体由来のヒンジドメインに置換する工程が、
    ａ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のヒンジドメインを含む核酸配列であって、好ましくは前記抗体の重鎖をコードする核酸配列を単離することと、
    ｂ）Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド核酸配列に特異的に結合するヒトＩｇＧ１抗体のヒンジドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４または誘導体由来のヒンジドメインをコードする核酸配列に置換して、変異核酸配列を提供することと、
    ｃ）前記変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供することと、
    ｄ）適切な宿主中で前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列と前記変異核酸を同時発現し、それによりＯ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシド、誘導体または機能的断片に特異的に結合する変異ヒトＩｇＧ１抗体を提供することと、
    ｅ）任意に、前記変異抗体、その誘導体または断片を単離することと
    によって行われる、請求項２０に記載の方法。

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