CN106029698B9 - 具有促凋亡活性的抗gd2-o-乙酰化神经节苷脂的抗体 - Google Patents

具有促凋亡活性的抗gd2-o-乙酰化神经节苷脂的抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的抗体或其功能片段及其在治疗中的用途，所述抗体包括：a)包括具有以下氨基酸序列的三个轻链互补区(CDR)的轻链：轻链CDR1：QSLLKNNGNTFL(SEQ id n°1)、轻链CDR2：KVS、轻链CDR3：SQSTHIPYT(SEQ id n°2)；和来自免疫球蛋白轻链的轻链框架序列，其中所述框架序列包含人κCL结构域；和b)包括具有以下氨基酸序列的三个重链互补区(CDR)的重链：重链CDR1：EFTFTDYY(SEQ id n°3)、重链CDR2：IRNRANGYTT(SEQ id n°4)、重链CDR3：ARVSNWAFDY(SEQ id n°5)；和来自免疫球蛋白重链的重链框架序列，其中所述框架序列包括来自人IgG1的CH2和CH3结构域和来自人IgG1的CH1结构域，所述CH1结构域经突变，以恢复在其他人IgG亚类中典型的CH1和轻链之间的配对，或所述CH1结构域由来自这样的非IgG1亚类如人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域替换。

Description

具有促凋亡活性的抗GD2-O-乙酰化神经节苷脂的抗体
本国际专利申请要求于2013年11月11日提交的欧洲专利申请EP 13005298.8的 优先权，其通过引用并入文本。
技术领域
本发明提供了新抗体及其在癌症治疗中的用途。
背景技术
先前已证实了神经外胚层起源的癌症特异性表达GD2-O-乙酰化神经节苷脂，以及 可以施用靶向GD2-O-乙酰化神经节苷脂的治疗性抗体(mAb 8B6)并且尤其由于健康细 胞特别是外周神经上不存在这种癌症抗原的表达，显示出有益效果，而没有神经毒性。
抗OAcGD2鼠IgG3，κmAb 8B6的有效活性已经在Alvarez-Rueda等人(PLoS One， vol.6(9)，p:e25220，2011)中描述。该抗体在体外具有有效的ADCC和CDC活性， 还显示出促凋亡活性(COCHONNEAU等，Cancer Lett.，vol.333(2)，p:194-204， 2013)。该抗体通过细胞凋亡途径诱导细胞死亡，该细胞凋亡途径对应于在体外经由细 胞周期停滞和细胞凋亡抑制培养的OAcGD2阳性肿瘤细胞增殖。
用mAb 8B6针对OAcGD2进行的被动免疫治疗有效地抑制三种动物模型中表达 OAcGD2的肿瘤的生长。证实了NK细胞的裂解功能对于mAb 8B6的体内活性不是必 要的(上面提到的COCHONNEAU等，2013)。
目前，为了开发人源化抗体，本发明人已生成了人-鼠嵌合抗体，命名为c8B6(IgG1， κ)。
虽然这种c8B6抗体显示出与在具有免疫能力的小鼠肿瘤模型中相当的体内活性， 但是在体外观察到与鼠mAb 8B6相比完全丧失的促凋亡活性。因此设想，mAb c8B6 的促凋亡活性的丧失是由鼠IgG3和人IgG1之间不同的特定结构的损失造成的。
因此，得出的结论是为了获得有价值的治疗不能进行人IgG1嵌合。
发明内容
现在，本发明人惊讶地发现c8B6的CH1γ1的特定突变或其由CH1γ3的替换使得 恢复了促凋亡活性。因此，在c8B6中，似乎由于在人CH1γ1结构域的第133位附近 缺少半胱氨酸，人IgG1的轻链和重链之间非典型的配对与这种抗体的促凋亡活性的丧 失相关。
因此，所获得的抗体包括IgG1特性，即ADCC活性和长半衰期以及促凋亡活性 的良好组合。
因此，本发明涉及识别O-乙酰化-GD2神经节苷脂的抗体或其功能片段，所述抗 体包括：
a)轻链，其包括具有以下氨基酸序列的三个轻链互补区(CDR)：
i)轻链CDR1：QSLLKNNGNTFL(SEQ id n°1)；
ii)轻链CDR2：KVS；
iii)轻链CDR3：SQSTHIPYT(SEQ id n°2)；和
来自免疫球蛋白轻链的轻链框架序列，其中所述框架序列包含人κCL结构域； 和
b)重链，其包含具有以下氨基酸序列的三个重链互补区(CDR)：
i)重链CDR1：EFTFTDYY(SEQ id n°3)；
ii)重链CDR2：IRNRANGYTT(SEQ id n°4)；
iii)重链CDR3：ARVSNWAFDY(SEQ id n°5)；和
来自免疫球蛋白重链的重链框架序列，其中所述框架序列包括：
1)来自人IgG1的CH2和CH3结构域，和
2)来自人IgG1的CH1结构域，所述CH1结构域经突变以恢复在其他IgG亚类 中典型的CH1和轻链之间的配对，或所述CH1结构域由来自非IgG1亚类如人IgG2、 IgG3或IgG4的CH1结构域替换。
本发明还涉及包括至少一种这样的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
另外，本发明涉及用于治疗癌症的方法，包括向有需要的患者提供这样的药物组 合物，所述药物组合物包含至少一种所述抗体或至少一种其功能片段。
另外，本发明涉及至少一种这样的抗体或至少一种其功能片段在用于制备治疗和/ 或预防癌症的药物中的用途。
最后，本发明涉及一种用于提高特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1 抗体、其衍生物或功能片段的疗效的方法，其包括使来自所述抗体的人CH1γ1结构域 突变的步骤，以恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和CL结构域之间的配对，或通过 由来自人IgG2(CH1γ2)、IgG3(CH1γ3)或IgG4(CH1γ4)的CH1结构域替换所述人CH1γ1 结构域。
附图说明
图1显示了c8B6抗体的轻链和重链序列。
图2显示了301.14a抗体的CH1和铰链结构域的序列。
图3显示了301.14b抗体的CH1和铰链结构域的序列。
图4显示了301.15抗体的CH1和铰链结构域的序列。
图5显示了301.16抗体的CH1和铰链结构域的序列。
图6显示了301.17抗体的CH1和铰链结构域的序列。
图7显示了301.18抗体的CH1和铰链结构域的序列。
图8显示了301.19抗体的CH1和铰链结构域的序列。
图9显示了301.15b抗体的CH1和铰链结构域的序列。
图10显示了301.20抗体的CH1和铰链结构域的序列。
图11显示了301.21抗体的CH1和铰链结构域的序列。
图12显示了通过碘化丙啶的抗OacGD2抗体的直接细胞毒性。
发明详述
在第一方面中，本发明涉及特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的抗体或其功 能片段，所述抗体包括：
a)轻链，其包括具有以下氨基酸序列的三个轻链互补区(CDR)：
i)轻链CDR1：QSLLKNNGNTFL(SEQ id n°1)；
ii)轻链CDR2：KVS；
iii)轻链CDR3：SQSTHIPYT(SEQ id n°2)；和
来自免疫球蛋白轻链的轻链框架序列，其中所述框架序列包含人κCL结构域； 和
b)重链，其包含具有以下氨基酸序列的三个重链互补区(CDR)：
i)重链CDR1：EFTFTDYY(SEQ id n°3)；
ii)重链CDR2：IRNRANGYTT(SEQ id n°4)；
iii)重链CDR3：ARVSNWAFDY(SEQ id n°5)；和
来自免疫球蛋白重链的重链框架序列，其中所述框架序列包括：
1)来自人IgG1的CH2和CH3结构域，和
2)来自人IgG1的CH1结构域，所述CH1结构域经突变以恢复在其他IgG亚类 中典型的CH1和轻链之间的IgG配对，或所述CH1结构域由来自非IgG1亚类如人 IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域替换。
所述抗体具有恢复的针对表达GD2-O-乙酰化神经节苷脂的细胞的促凋亡活性，同 时还表现出IgG1特性，如ADCC活性和半衰期。
抗体是对应于四聚体的免疫球蛋白分子，其包含四条多肽链，两条同样的重(H) 链(全长约50-70kDa)和两条同样的轻(L)链(全长约25kDa)由二硫键相互连接。轻链分 类为κ和λ。
重链分类为IgG的γ。每条重链由N-端重链可变区(在本文中缩写为HCVR)和重 链恒定区组成。重链恒定区由IgG的三个结构域(CH1、CH2和CH3)，以及CH1和 CH2结构域之间的铰链结构域组成。
每条轻链由N-端轻链可变区(在本文中缩写为LCVR)和轻链恒定区组成。轻链恒 定区由一个结构域CL组成。HCVR和LCVR区可以进一步细分成高可变区，称为互 补决定区(CDR)，其夹杂着更保守的称为框架区(FR)的区域。每个HCVR和LCVR由 从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每个结构域的氨基酸分配是依照公知的惯例(IMGT， The International Immunogenetics Information
Figure BDA0001032831490000041
LEFRANC等，Nucleic Acids Research，vol.27，p:209-212，1999)。抗体结合特定抗原的功能性能力取决于每个轻 /重链对的可变区，并且在很大程度上由CDR确定。
如本文所用的术语“功能片段”是指特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂并包 含CH1结构域的抗体片段。这样的片段可由本领域技术人员简单地识别，并且包括例 如Fab片段(例如通过木瓜蛋白酶消化)、Fab'片段(例如通过胃蛋白酶消化和部分还原)、 F(ab')2片段(例如，通过胃蛋白酶消化)、Facb(例如，通过纤溶酶消化)和Fd片段(例如， 通过胃蛋白酶消化，部分还原和再聚集)包括于本发明中。
这样的片段可通过如本领域中已知的和/或如本文所述的酶解、合成或重组技术来 制备。也可使用已将一个或多个终止密码子导入天然终止位点上游的抗体基因制备各 种截短形式的抗体。例如，编码F(ab')2重链部分的组合基因可设计为包括编码重链的 CH1结构域和/或铰链结构域的DNA序列。抗体的各个部分可通过常规技术化学连接 在一起，或可以使用基因工程技术制备成连续的蛋白。
“特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂”的表述指的是KD小于2×10-7M。
如本文中所使用的术语“抗体”是指单克隆抗体本身。单克隆抗体可以是人抗体、 嵌合抗体和/或人源化抗体。
重组产生本发明中有用的抗体，因为需要操纵具有适当特异性的典型的鼠或其他 非人的抗体以便将它们转换成人源化形式。抗体可以为糖基化的或非糖基化的，但是 糖基化的抗体是优选的。如公知的，抗体通过二硫键适当交联。
根据优选的实施方式，本发明的抗体是嵌合抗体。表述“嵌合抗体”是指由来自 鼠免疫球蛋白的可变区和人免疫球蛋白的恒定区组成的抗体。这种改变简单地由用人 恒定区替换小鼠恒定区构成，从而产生这样的人/鼠嵌合体，其可能对于药物用途具有 可接受的足够低的免疫原性。对于本发明，所述嵌合抗体包括来自人轻链和重链的恒 定区。已经报道了许多用于制造这样的嵌合抗体的方法，由此形成本领域技术人员的 常识的一部分(参见，例如美国专利号5,225,539)。
根据另一个优选的实施方式，本发明的抗体是人源化抗体。
“人源化抗体”是指通过改变具有非人互补决定区(CDR)的抗体的序列而部分或 全部由来自人抗体种系的氨基酸序列组成的抗体。由现在本领域公知的技术进行抗体 的可变区的这种人源化并最终制备CDR。
例如，英国专利申请GB 2188638A和美国专利号5,585,089公开了产生重组抗体 的过程，其中被替换的抗体的唯一部分是互补决定区或“CDR”。CDR移植技术已用 于产生由鼠CDR和人可变区框架和恒定区组成的抗体(参见，例如Riechmann等， Nature，vol.332，p:323-327，1988)。这些抗体保留了Fc依赖性效应子功能所必需 的人恒定区，但不太可能诱发针对抗体的免疫应答。
例如，可变区的框架区由相应的人框架区替换，而保留基本上完整的非人CDR， 或甚至用来源于人基因组的序列替换CDR。在免疫系统改变为相当于人的免疫系统的 转基因小鼠中产生全人抗体。如上所述，对在本发明的方法中使用，采用抗体的免疫 特异性片段，包括表示单链形式的片段，是足够的。
人源化抗体还指这样的抗体：其包含人框架、至少一个来自非人抗体的CDR，并 且其中存在的任何恒定区与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即，至少约85或90％， 优选至少95％相同。因此，人源化抗体的所有部分，可能除了CDR，与一个或多个天 然人免疫球蛋白序列的相应部分基本上相同。例如，人源化的免疫球蛋白通常不包括 嵌合小鼠可变区/人恒定区抗体。
人源化或嵌合抗体相对于非人抗体对于人类治疗的用途具有至少三个潜在的优 点：
1)由于效应部分是人的，它可以与人免疫系统的其他部分更好地相互作用(例如， 通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)更有效地破坏靶细胞)。
2)人免疫系统不会将人源化抗体的框架区或C区识别为外源的，因此针对这种注 射抗体的抗体反应应小于针对完全外源的非人抗体或部分外源嵌合抗体。
3)已报道在人体循环中注射的非人抗体的半衰期比人抗体的半衰期短得多。注射 的人源化抗体的半衰期与天然存在的人抗体基本上相同，允许给予较小且较不频繁的 剂量。
例如，可如下进行人源化免疫球蛋白的设计：当氨基酸落入下列类别时，待使用 的人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白)的框架氨基酸由来自提供CDR的非人免疫球蛋白 (供体免疫球蛋白)的框架氨基酸替换：(a)在该位置受体免疫球蛋白的人框架区的氨基 酸对人免疫球蛋白是罕见的，而在该位置供体免疫球蛋白中相应的氨基酸对人免疫球 蛋白是常见的；(b)该氨基酸的位置紧邻CDR之一；或(c)在三维免疫球蛋白模型中框 架氨基酸的任何侧链原子在CDR氨基酸的任何原子的约5-6埃(中心至中心)之内 (Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.88，p:2869，1991)。当在此位置受体 免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸和供体免疫球蛋白中的相应氨基酸对于人免疫球蛋 白都是罕见的时候，这样的氨基酸被在该位置对于人免疫球蛋白常见的氨基酸替换。
有利的是，所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ id n°:6的轻链可变区(LCVR)和/或 具有氨基酸序列SEQ id n°:7的重链可变区(HCVR)。
Figure BDA0001032831490000061
人κCL结构域是本领域技术人员公知的并且对应于例如SEQ id n°8。
Figure BDA0001032831490000062
优选地，本发明的抗体具有轻链，该轻链具有氨基酸序列SEQ id n°9。
Figure BDA0001032831490000063
来自人IgG1的CH2和CH3结构域是本领域技术人员公知的并且对应于例如SEQ id n°10。
Figure BDA0001032831490000064
Figure BDA0001032831490000071
来自人IgG1的CH1结构域是本领域技术人员公知的。如本文所用的“经突变以 恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和轻链之间的配对的CH1结构域”是指来自人IgG1 的人CH1结构域，其中氨基酸被半胱氨酸残基替换，优选以便在CH1序列的第133 或134位出现半胱氨酸残基。恒定区的编号为Kabat等人(1991，NIH Publication n°91-3242，National technical Information Service Springfield，VA)所述的EU索引的 编号。例如，来自人IgG1的CH1结构域对应于SEQ id n°:29。当突变以恢复在其他 IgG亚类中典型的CH1和轻链之间的典型的IgG配对时，所述CH1结构域对应于氨 基酸序列SEQ id n°11，其中第133位上的丝氨酸残基被半胱氨酸替换，或对应于SEQ id n°:30的氨基酸序列，其中第134位上的丝氨酸残基被半胱氨酸替换。CH1序列的 第133或134位上的半胱氨酸残基恢复了本发明的抗体的轻链和重链之间的二硫键。
Figure BDA0001032831490000072
来自人IgG2、IgG3和IgG4的CH1结构域是本领域技术人员公知的。例如，来自 人IgG2的CH1结构域对应于SEQ id n°31，来自人IgG3的CH1结构域对应于SEQ id n°12，来自人IgG4的CH1结构域对应于SEQ id n°32。
Figure BDA0001032831490000073
根据第一优选的实施方式，本发明的抗体包含来自人IgG1的突变CH1结构域， 在其序列的第133或134位呈现半胱氨酸残基，优选所述结构域具有序列SEQ id n°11。
仍然优选地，所述抗体选自包括301.14a、301.14b、301.16和301.18的组。
根据第二个优选的实施方式，本发明的嵌合抗体包含来自人IgG2、IgG3或IgG4 的CH1结构域，优选所述结构域是来自IgG3的CH1结构域，如序列SEQ id n°12。
仍然优选地，所述抗体选自包括301.15、301.15b、301.17和301.19的组。
本发明的嵌合抗体还包括来自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的铰链结构域或其衍 生物。
来自人IgG1的铰链结构域是本领域技术人员公知的，并且对应于例如SEQ id n°13。
来自人IgG1铰链结构域的衍生物典型地对应于这样的铰链结构域，其中铰链序列 的第五位的半胱氨酸残基已经被另一个残基替换。事实上，所述的突变使得恢复在其 他IgG亚类中典型的结构。作为这种衍生物的例子，可以参考SEQ id n°14。
SEQ id n°:13 EPKSCDKTHTCPPCP
SEQ id n°:14 EPKSSDKTHTCPPCP
对于IgG3，来自人IgG2、IgG3或IgG4的铰链结构域是本领域技术人员公知的， 并且对应于例如SEQ id n°15。人IgG3的衍生物也是本领域技术人员公知的，对应于 例如SEQ id n°16至19，优选SEQ id n°19。
Figure BDA0001032831490000081
根据第三个优选的实施方式，本发明的抗体包含来自人IgG1的铰链结构域或其衍 生物，优选所述结构域具有序列SEQ id n°13或SEQ id n°14。
仍然优选地，所述抗体选自包括301.14a、301.14b、301.15、301.15b、301.20和 301.21的组。
根据第四个优选的实施方式，本发明的抗体包含来自人IgG2、IgG3、IgG4的铰 链结构域或其衍生物，优选所述结构域来自人IgG3，并且具有选自由如下所组成的组 中的序列：SEQ id n°15至SEQ id n°19，并且最优选SEQ id n°15或SEQ id n°19。
仍然优选地，所述抗体选自包括301.16、301.17、301.18和301.19的组。
根据第五个优选的实施方式，本发明的抗体包括：
1)具有氨基酸序列SEQ id n°9的轻链，
2)由如下组成的重链：
●具有序列SEQ id n°10的来自人IgG1的CH2和CH3结构域，
●对应于人CH1的氨基酸序列及选自包含如下的组或由如下所组成的组的铰链 结构域：
Figure BDA0001032831490000082
Figure BDA0001032831490000091
根据仍优选的实施方式，本发明的抗体选自301.15、301.18和301.19抗体中。
事实上，这些抗体出乎意料地显示比原始抗体的促凋亡活性更高的促凋亡活性。
仍然优选地，本发明的抗体是301.15抗体。
事实上，这种抗体是相对于原始抗体显示出协同结合的唯一的一个。
优选地，通过在其序列的第133或134位呈现半胱氨酸残基的来自人IgG1的突变 的CH1结构域，或通过来自人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域，在本发明的抗体 中引入半胱氨酸残基未释放先前与另一个半胱氨酸残基相连的任何游离巯基。
本发明的抗体包括免疫缀合物。
如本文所用的术语“免疫缀合物”是指包括结合第二分子，优选细胞毒性剂或放 射性同位素的至少一种嵌合抗体或其功能片段的缀合分子。优选地，所述抗体或其功 能片段通过共价键结合所述第二分子。
在一个实施方式中，本发明的抗体是免疫缀合物。
在一个具体的实施方式中，本发明的抗体是免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包 含本发明的抗体或其功能片段和细胞毒性剂。
在另一个具体的实施方式中，本发明的抗体是免疫缀合物，其中所述免疫缀合物 包含本发明的抗体或其功能片段和放射性同位素。
根据第二方面，本发明涉及包含如本文所述的至少一种抗体或至少一种其功能片 段和药学上可接受的载体的用于治疗的药物组合物。
所述组合物特别用于治疗表达GD2-O-乙酰化神经节苷脂的癌症。
所述组合物可以为适于给予患者的任何药物形式，包括但不限于溶液、悬浮液、 冻干粉剂、胶囊和片剂。
本发明的药物组合物还可以包含任何药学上可接受的稀释剂、赋形剂或助剂。
可以配制本发明的药物组合物用于注射，例如局部注射、经粘膜给药、吸入、口 服给药、更普遍地用于本领域技术人员发现适合于实现所期望的治疗的任何剂型。
本发明的抗体以有效实现预期目的的量且适于所选择的给药途径的剂量包含在所 述的药物组合物中。
更具体而言，治疗有效剂量是指有效预防、缓解或改善患有癌症的受试者的症状 的化合物的量。
取决于预期的应用，本发明的嵌合抗体可以进一步包含另外的成分。例如，本发 明的嵌合抗体可以对应于免疫缀合物。
本发明的第三方面涉及用于治疗表达GD2-O-乙酰化神经节苷脂的癌症的方法，该 方法包括向有需要的患者提供如本文所述的药物组合物，所述药物组合物包含如本文 所述的至少一种嵌合抗体或至少一种其功能片段。
如本文中所使用的术语“患者”指哺乳动物，优选至人类。
优选地，有需要的患者指患有表达GD2-O-乙酰化神经节苷脂的癌症的患者。
所述表达GD2-O-乙酰化神经节苷脂的癌症选自包括成神经细胞瘤、黑素瘤、成胶 质细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌和癌干细胞癌症的组。
本发明的第四方面涉及用于提高特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1 抗体、其衍生物或功能片段的疗效的方法，该方法包括如下步骤：使来自所述抗体的 人CH1γ1结构域突变，以恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和CL结构域之间的配对， 或通过用来自人IgG2(CH1γ2)、IgG3(CH1γ3)或IgG4(CH1γ4)的CH1结构域替换人 CH1γ1结构域。
所述提高疗效的方法包括提高所述抗体的促凋亡活性。
在第一优选的实施方式中，本发明的方法包括如下步骤：使来自特异性结合O-乙 酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的CH1结构域突变，以恢复在其他IgG亚类中典 型的CH1和CL结构域之间的配对。
来自人IgG1的CH1结构域是本领域技术人员公知的。
来自特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的CH1结构域可在图1 中显示。
有利地，使特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的CH1结构域 突变，以恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和CL结构域之间的配对的步骤通过如下 进行：
a)分离包含特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的CH1结构域的 核酸序列，所述核酸序列优选编码抗体的重链；
b)使密码子突变，优选使编码所述CH1结构域的第133或134位的密码子突变为 编码氨基酸残基半胱氨酸(C)，以提供突变的核酸序列；
c)为突变核酸序列提供可操作的表达元件；
d)在合适的宿主中共表达突变的核酸与编码抗体轻链的核酸序列，从而提供特异 性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的突变的人IgG1抗体、其衍生物或功能片段；和
e)任选地，分离突变的抗体、其衍生物或片段。
在第二个优选实施方式中，本发明的方法包括如下步骤：由来自人IgG2、IgG3 或IgG4的CH1结构域替换来自人IgG1的CH1结构域。
来自人IgG2、IgG3和IgG4的CH1结构域是本领域技术人员公知的。例如，来自 人IgG3的CH1结构域对应于SEQ id n°12。
有利地，由来自人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域替换特异性结合O-乙酰化 -GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的CH1结构域的步骤可以通过如下进行：
a)分离包含特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的CH1结构域的 核酸序列，所述核酸序列优选编码抗体的重链；
b)由编码来自人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域的核酸序列替换特异性结合 O-乙酰化-GD2神经节苷脂核酸的人IgG1抗体的CH1结构域，以提供突变的核酸序列；
c)为突变的核酸序列提供可操作的表达元件；
d)在合适的宿主中共表达突变的核酸与编码抗体轻链的核酸序列，从而提供特异 性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的突变的人IgG1抗体、其衍生物或功能片段；和
e)任选地，分离突变的抗体、其衍生物或片段。
在仍然优选的实施方式中，本发明的方法还包括如下步骤：使特异性结合O-乙酰 化-GD2神经节苷脂的来自人IgG1抗体的IgG1铰链结构域突变，以恢复在其他IgG 亚类中典型的铰链和CH2结构域之间的配对，或由来自人IgG2、IgG3或IgG4的铰链 结构域或其衍生物替换所述抗体的人IgG1铰链结构域。
来自人IgG1的铰链结构域是本领域技术人员公知的，对应于例如SEQ id n°13。
如本文所用的“使特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的来自人IgG1抗体的 IgG1铰链结构域突变，以恢复在其他IgG亚类中典型的铰链和CH2结构域之间的配 对”的步骤是指所述抗体的人IgG1铰链结构域，其中铰链蛋白序列的第五位的半胱氨 酸残基已被另一个残基替换，优选被丝氨酸替换。事实上，所述突变使得恢复了典型 的IgG结构。作为这种衍生物的例子，可以参考SEQ id n°14。
有利地，使来自所述抗体的人铰链突变，以恢复在其他IgG亚类中典型的铰链和 CH2之间的配对的步骤通过如下进行：
a)分离包含特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的铰链结构域的 核酸序列，所述核酸序列优选编码抗体的重链；
b)使编码所述铰链结构域的第5位的氨基酸残基半胱氨酸(C)的密码子突变为编码 其他氨基酸残基，优选丝氨酸残基，以提供突变的核酸序列；
c)为突变的核酸序列提供可操作的表达元件；
d)在合适的宿主中共表达突变的核酸与编码抗体轻链的核酸序列，从而提供特异 性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的突变的人IgG1抗体、其衍生物或功能片段；和
e)任选地，分离突变的抗体、其衍生物或片段。
来自人IgG2、IgG3或IgG4的铰链结构域是本领域技术人员公知的，并且对于IgG3 对应于例如SEQ id n°15。人IgG3的衍生物也是本领域技术人员公知的，并且对应于 例如SEQ id n°16至19，优选SEQ id n°19。
仍然有利地，由来自人IgG2、IgG3或IgG4的铰链结构域或其衍生物替换所述抗 体的人IgG1铰链结构的步骤通过如下进行：
a)分离包含特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的铰链结构域的 核酸序列，所述核酸序列优选编码抗体的重链；
b)由编码来自人IgG2、IgG3或IgG4的铰链结构域或其衍生物的核酸序列替换特 异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂核酸的人IgG1抗体的铰链结构域，以提供突变的 核酸序列；
c)为突变的核酸序列提供可操作的表达元件；
d)在合适的宿主中共表达突变的核酸与编码抗体轻链的核酸序列，从而提供特异 性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的突变的人IgG1抗体、其衍生物或功能片段；和
e)任选地，分离突变的抗体、其衍生物或片段。
其他实施方式和本发明的优点在下面的非限制性实施例中示出。
实施例
1抗OAcGD2抗体的体外促凋亡活性
在第一步中，通过一种人IgG1，κ替换8B6的恒定区，由8B6设计嵌合抗OAcGD2 抗体，c8B6。其序列表示于图1中(SEQ id n°27和SEQ id n°28)。
该抗体的结构包括轻链中的2个分子内二硫键(Cys23-Cys93和Cys139-Cys199)和 重链中的4个分子内二硫键(Cys22-Cys98、Cys146-Cys202、Cys263-Cys323和 Cys369-Cys427)。参与链内二硫键的半胱氨酸残基用星号(*)指示。整个结构由3个分 子间二硫键稳定：通过轻链的最后一个半胱氨酸残基和上游铰链结构域的半胱氨酸残 基之间的一个二硫键(Cys219-Cys222)，轻链与重链连接，并且重链由2个连接中间铰 链中的半胱氨酸的二硫键相连(Cys228-Cys228和Cys231-Cys231)。参与链间二硫键的 半胱氨酸残基由箭头(↑)指示。
8B6LCVR经NotI-KasI克隆于pEvi载体中，以便与人IgG1的CL结构域融合。
8B6HCVR经NotI-NheI克隆于pEvi载体中，以便与人IgG1的重链的恒定区融合。
然后，由两种载体共转染CHO K1细胞。
转染后，在无血清培养基中培养CHO K1细胞数天。
每天收集培养基并在-80℃下冷冻。将新培养基添加到转染的细胞中，直至细胞存 活率小于70％-80％。
将收集的培养基汇集，并且使用固定在琼脂糖基质上的蛋白A纯化抗体。
在还原和非还原条件下通过电泳分析CHO中c8B6的生产。结果表明，在非还原 条件下，c8B6抗体在150kD显示出对应于完整抗体的一条带。但是，在还原条件下， 观察到在50kD的HC带，在25kD的LC带。在Superdex柱上的凝胶过滤显示出具 有对应于150kD的12.3ml的主峰的色谱图(纯度99.0％)。最后，在蛋白A柱上纯化后 的嵌合c8B6的产率为约315mg/L上清液。
通过对表达GD2-O-乙酰化神经节苷脂的IMR5细胞进行流式细胞术确认了抗体与 其靶的结合。通过缀合异硫氰酸荧光素(FITC)的山羊抗-人IgG显示了结合。这些实验 已证实这种抗体结合GD2-O-乙酰化的功能。
然后，通过MTT法对c8B6抗体的直接细胞毒性进行评估。
在这些分析中，在96孔微孔板中在37℃下孵育1×104IMR5、SUM159PT或H187 细胞24小时。加入80-0.15μg/mL抗体并在37℃下孵育24小时。然后将50μg的MTT 加入到各个孔中并在37℃下孵育至少4小时，之后用10％SDS溶解细胞并在37℃下 孵育过夜。然后在570nm和650nm处读取吸光度。产物570nm处的吸光度中减去650nm 处的吸光度(Abs570-Abs650)，以计算染料的总转化率。四个具有用20μg依托泊苷处 理的细胞的对照孔提供了指示0％存活率的空白吸光度。存活率(％)的抑制表示为相对 于未处理的细胞的百分比，并且每个值表示为一式四份的平均值±SEM。
结果表明，通过由鼠IgG3恒定区变成人IgG1恒定区的嵌合步骤之后抗体c8B6 已经丧失了8B6的直接细胞毒性。此外，该抗体还丧失了亲本IgG3 8B6的协同特性。
最后，尝试不同方式的嵌合的许多实验只恢复了较少的促凋亡活性，并且未观察 到结合协同性。
出人意料地，为了嵌合的CH1恒定区的特定修饰使得促凋亡活性变化很大。
用基于以前的构建而设计的抗体301.14a、301.14b、301.15、301.15b、301.16、301.17、 301.18、301.19、301.20和301.21获得了这些结果。
抗体301.14a对应于具有如图2所示的人铰链γ1结构域(SEQ id n°20)的突变的人 CH1γ1(加下划线的突变S133C)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQ id n°9)和κCL结构域(SEQ id n°8)。
抗体301.14b对应于具有如图3所示的突变的人铰链γ1结构域(SEQ id n°21)(加下 划线的突变，对应于由丝氨酸残基替换半胱氨酸222，C222S)的突变的人CH1γ1(加下 划线的突变S133C)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQ id n°9)和κCL 结构域(SEQ id n°8)。
抗体301.15对应于具有如图4所示的人铰链γ1结构域(SEQ id n°22)的人CH1γ3(替 换其表亲CH11)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQ id n°9)和κCL 结构域(SEQ id n°8)。
抗体301.15b对应于具有如图9所示的突变的人铰链γ1结构域(SEQ id n°34)(加下 划线的突变，对应于由丝氨酸残基替换半胱氨酸222，C222S)的人CH1γ3(替换其表亲 CH1γ1)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQ id n°9)和κCL结构域(SEQ id n°8)。
抗体301.16对应于具有如图5所示的人铰链γ3结构域(SEQ id n°23)(替换其表亲 铰链γ1)的突变的人CH1γ1(加下划线的突变S133C)。其他恒定区对应于IgG1的CH2 和CH3结构域(SEQ id n°9)和κCL结构域(SEQ id n°8)。
抗体301.17对应于具有如图6所示的人铰链γ3结构域(SEQ id n°24)(替换其表亲 铰链γ1)的人CH1γ3(替换其表亲CH1γ1)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结 构域(SEQ id n°9)和κCL结构域(SEQ id n°8)。
抗体301.18对应于具有如图7所示的变短的(17个氨基酸)人铰链γ3结构域(SEQ id n°25)的突变的人CH1γ1(加下划线的突变S133C)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和 CH3结构域(SEQ id n°9)和κCL结构域(SEQ id n°8)。
抗体301.19对应于具有如图8所示的变短的(17个氨基酸)人铰链γ3结构域(SEQ id n°26)的人CH1γ3(替换其表亲CH11)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域 (SEQ id n°9)和κCL结构域(SEQ id n°8)。
抗体301.20对应于具有如图10所示的人铰链γ1结构域(SEQ id n°31)的人 CH1γ2(替换其表亲CH1γ1)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQ id n°9) 和κCL结构域(SEQ id n°8)。
抗体301.21对应于具有如图11所示的人铰γ链1结构域(SEQ id n°32)的人 CH1γ4(替换其表亲CH1γ1)。其他恒定区对应于IgG1的CH2和CH3结构域(SEQ id n°9) 和κCL结构域(SEQ id n°8)。
muIgG3对照对应于鼠8B6IgG3，其中CH1IgG3对应于SEQ id n°:33，其中第134 位的半胱氨酸残基由丝氨酸残基替换，并且第224位的丝氨酸残基由半胱氨酸残基替 换。
Figure BDA0001032831490000151
如前确认了上述抗体与GD2-O-乙酰化神经节苷脂的结合。
然后，如上所述测定所述抗体的潜在的促细胞凋亡活性。
结果总结于下面的表中，其中裂解的百分比为抗体浓度为80μg/ml时获得的。
抗OacGD2 301.14a、301.14b、301.15、301.16、301.17、301.18和301.19抗体对 IMR5细胞的直接细胞毒性：
Figure BDA0001032831490000152
出乎意料地，结果表明包括突变的人CH1γ1或人CH1γ3的嵌合抗体具有促凋亡 活性，意味着直接细胞毒性的丧失可能是由于人IgG1的结构。此外，所有这些抗体都 显示出比初始抗体8B6之一更大的EC50。
结果还表明，在最大％裂解方面产生更高的细胞毒性作用的构建体对应于()人 CH1γ3和人铰链γ1的融合(301.15构建体)或(ii)人CH1γ1(S133C的突变)或人CH1γ3 和变短的人铰链γ3的融合(301.18和301.19构建体)。对于最后的这2个，观察到与原 始c8B6相比提高的亲和力。
最后，并且仍出人意料地，在对应于恢复结合协同性的竞争曲线中301.15抗体是 呈现出聚集特征的唯一抗体。
抗OacGD2 301.15b、301.20和301.21抗体对IMR5、SUM159PT和H187细胞的 直接细胞毒性：
Figure BDA0001032831490000161
出乎意料地，结果表明包括人CH1γ2或人CH1γ4的嵌合抗体对IMR5细胞具有促 凋亡活性，意味着直接细胞毒性的丧失可能是由于人IgG1的结构。此外，包括人CH1γ3 和突变的人铰链γ1结构域的嵌合抗体(加划线的突变对应于由丝氨酸残基替换半胱氨 酸222，C222S)对IMR5细胞具有促凋亡活性。
结果还表明对应于人CH1γ1(突变的在S133C上)和突变的人铰链1γ结构域(划线 的突变，对应于由丝氨酸残基替换半胱氨酸222，C222S)的融合(301.14b构建体)，或 对应于人CHγ13和人铰γ链1的融合(301.15构建体)对SUM159PT和H187细胞都具 有促凋亡活性。
也通过碘化丙啶分析评价不同抗体的直接细胞毒性。
在该分析中，在37℃下将150000个IMR5细胞铺板在24孔板上24小时，并且然 后在37℃下用40μg/ml每个抗体处理24小时。此后，通过碘化丙啶(12.5μg/ml)标记死 细胞。在LSRII FACS(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)中通过流式细胞术分析所 有样品。
结果总结于下表中并由图12示出。
Figure BDA0001032831490000162
Figure BDA0001032831490000171
结果证实了对应于人CH1γ1(S133C突变)和突变的人铰链γ1结构域(加划线的突 变，对应于由丝氨酸残基替换半胱氨酸222，C222S)的融合(301.14b构建体)，或对应 于人CH1γ3和人铰链γ1的融合(301.15构建体)对IMR5细胞具有促凋亡活性。同时， 结果证实了为模仿IgG1结构的鼠IgG3 8B6的突变使得促凋亡活性丧失。
重构非IgG1抗体的典型的CH1和轻链之间的配对可以恢复促凋亡活性。这种重 构可以通过恢复非IgG1亚类典型的CH1半胱氨酸或通过替换非IgG1CH1结构域而 获得。
最后，本发明人成功地嵌合了保持促凋亡活性的8B6抗体，对于两种抗体，促凋 亡活性甚至提高了，其中一个还表现出像原始抗体的结合协同性。
2抗OAcGD2抗体的体内功效
小鼠成神经细胞瘤模型
5周龄的NOD/SCID小鼠购自CHARLES RIVER。
人成神经细胞瘤IMR5肿瘤生长于免疫缺陷NOD-SCID小鼠中。简言之，用肿瘤 细胞(1×106IMR5细胞)在右肋部皮下注射小鼠。然后使用公式[体积mm3＝(长度)×(宽 度2)×0.5]测量肿瘤植入后皮下肿瘤的生长。在携带IMR5人成神经细胞瘤的NOD/SCID 小鼠中，当肿瘤体积等于0.1cm3时，静脉施用抗体(500μ/小鼠)。
小鼠接受8B6(muIgG3)mAb或c.8B6(huIgG1)mAb或双突变的huIgG1mAb或由 huIgG3CH1替换的huIgG1CH1。
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Claims (21)

1.一种特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的抗体，所述抗体包括：
a)轻链，其包括具有以下氨基酸序列的三个轻链互补区(CDR)：
i)轻链CDR1：QSLLKNNGNTFL(SEQ ID No.:1)；
ii)轻链CDR2：KVS；
iii)轻链CDR3：SQSTHIPYT(SEQ ID No.:2)；和
来自免疫球蛋白轻链的轻链框架序列，其中所述框架序列包含人κCL结构域； 和
b)重链，其包含具有以下氨基酸序列的三个重链互补区(CDR)：
i)重链CDR1：EFTFTDYY(SEQ ID No.:3)；
ii)重链CDR2：IRNRANGYTT(SEQ ID No.:4)；
iii)重链CDR3：ARVSNWAFDY(SEQ ID No.:5)；和
来自免疫球蛋白重链的重链框架序列，其中所述框架序列包括：
1)来自人IgG1的CH2结构域和CH3结构域，和
2-1)来自人IgG1的具有氨基酸序列SEQ ID No.:29的CH1结构域，其中所述 SEQ ID No.:29的根据Kabat等人中所叙述的EU索引的第133或134位的氨基酸已经 由半胱氨酸残基替换，从而恢复在人IgG2、IgG3或IgG4亚类中典型的CH1和轻链之 间的配对，或
2-2)来自人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域，
其中恢复在CH1和轻链之间的配对未释放先前与另一个半胱氨酸残基相连的任 何游离巯基。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述特异性结合所述O-乙酰化-GD2神经节苷脂 的抗体显示出对于所述神经节苷脂的KD小于2×10-7M。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID No.: 6的轻链可变区(LCVR)和/或具有氨基酸序列SEQ ID No.:7的重链可变区(HCVR)。
4.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ ID No.: 8的人κCL结构域。
5.如权利要求4所述的抗体，其中所述抗体具有轻链，所述轻链具有氨基酸序列 SEQ ID No.:9。
6.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包括具有氨基酸序列SEQ ID No.: 10的来自人IgG1的CH2结构域和CH3结构域。
7.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包括来自人IgG1的具有氨基酸序 列SEQ ID No.:29的CH1结构域，其中所述SEQ ID No.:29的根据Kabat等人中所叙 述的EU索引的第133或134位的氨基酸已经由半胱氨酸残基替换，从而恢复在人 IgG2、IgG3或IgG4亚类中典型的CH1和轻链之间的配对。
8.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体包括具有氨基酸SEQ ID No.:12 的来自人IgG3的CH1结构域。
9.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体还包括来自人IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4的铰链结构域，或其中在铰链序列的第5位已经被丝氨酸残基替换的来自人IgG1 的铰链结构域，或由选自SEQ ID No.:16、SEQ ID No.:17、SEQ ID No.:18和SEQ ID No.:19的组成的组中的来自人IgG3的截短的铰链结构域。
10.如权利要求9所述的抗体，其中所述铰链结构域选自包括SEQ ID No.:13至 SEQ ID No.:19的组。
11.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包括：
1)具有氨基酸序列SEQ ID No.:9的轻链，
2)具有如下的重链：
·具有氨基酸序列SEQ ID No.:10的来自人IgG1的CH2结构域和CH3结构域，
·对应于选自包含如下的组或由如下所组成的组的人CH1及铰链结构域的氨基 酸序列：
序列 抗体 图 SEQ ID No.:20 301.14a 2 SEQ ID No.:21 301.14b 3 SEQ ID No.:22 301.15 4 SEQ ID No.:34 301.15b 9 SEQ ID No.:23 301.16 5 SEQ ID No.:24 301.17 6 SEQ ID No.:25 301.18 7 SEQ ID No.:26 301.19 8 SEQ ID No.:31 301.20 10 SEQ ID No.:32 301.21 11
。
12.如权利要求11所述的抗体，其中所述抗体是301.14b、301.15、301.18或301.19。
13.如权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体是免疫缀合物。
14.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至13中任一项所述的至少一种抗体 和药学上可接受的载体。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述组合物用于治疗表达GD2-O-乙酰 化神经节苷脂的癌症，所述癌症选自由下述组成的组中：成神经细胞瘤、黑素瘤、成 胶质细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌和癌干细胞癌症。
16.一种用于提高特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的抗体的促凋亡活性的体 外方法，所述抗体包括：
a)轻链，其包括具有以下氨基酸序列的三个轻链互补区(CDR)：
i)轻链CDR1：QSLLKNNGNTFL(SEQ ID No.:1)；
ii)轻链CDR2：KVS；
iii)轻链CDR3：SQSTHIPYT(SEQ ID No.:2)；和
来自免疫球蛋白轻链的轻链框架序列，其中所述框架序列包含人κCL结构域； 和
b)重链，其包含具有以下氨基酸序列的三个重链互补区(CDR)：
i)重链CDR1：EFTFTDYY(SEQ ID No.:3)；
ii)重链CDR2：IRNRANGYTT(SEQ ID No.:4)；
iii)重链CDR3：ARVSNWAFDY(SEQ ID No.:5)；和
来自免疫球蛋白重链的重链框架序列，其中所述框架序列包括：
1)来自人IgG1的CH2结构域和CH3结构域，和
2)来自人IgG1的具有氨基酸序列SEQ ID No.:29的CH1结构域(CH1γ1)，
所述方法包括如下步骤：
(2-1)通过半胱氨酸残基替换来自所述抗体的所述人CH1γ1的SEQ ID No.:29的根 据Kabat等人中所叙述的EU索引的第133或134位的氨基酸，从而恢复人IgG2、IgG3 或IgG4亚类中典型的CH1结构域和CL结构域之间的配对，或
(2-2)通过由来自人IgG2的CH1结构域(CH1γ2)、IgG3的CH1结构域(CH1γ3)或 IgG4的CH1结构域(CH1γ4)替换所述人CH1γ1结构域，
其中在CH1和CL结构域之间的配对未释放先前与另一个半胱氨酸残基相连的任 何游离巯基。
17.如权利要求16所述的方法，其中通过半胱氨酸残基替换来自所述抗体的所述 人IgG1的CH1γ1的SEQ ID No.:29的根据Kabat等人中所叙述的EU索引的第133 或134位的氨基酸，从而恢复在人IgG2、IgG3或IgG4亚类中典型的CH1结构域和 CL结构域之间的配对的步骤通过如下进行：
a)分离包含特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的CH1结构域的 核酸序列，所述核酸序列编码所述抗体的重链；
b)使编码所述CH1结构域的第133或134位的密码子突变为编码氨基酸残基半胱 氨酸(C)，以提供突变的核酸序列；
c)为所述突变的核酸序列提供可操作的表达元件；
d)在合适的宿主中共表达所述突变的核酸序列与编码所述抗体的轻链的核酸序 列，从而提供特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的突变的人IgG1抗体；和
e)任选地，分离所述突变的抗体。
18.如权利要求16所述的方法，其中由来自人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域 替换特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的所述CH1结构域的步骤 可以通过如下进行：
a)分离包括特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的CH1结构域的 核酸序列，所述核酸序列编码所述抗体的所述重链；
b)由编码来自人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域的核酸序列替换编码特异性结 合O-乙酰化-GD2神经节苷脂核酸的人IgG1抗体的所述CH1结构域的核酸序列，以 提供突变的核酸序列；
c)为所述突变的核酸序列提供可操作的表达元件；
d)在合适的宿主中共表达所述突变的核酸与编码所述抗体的所述轻链的核酸序 列，从而提供特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的突变的人IgG1抗体；和
e)任选地，分离所述突变的抗体。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，所述方法还包括如下步骤：(i)使来自 特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的IgG1铰链结构域突变，其中 在SEQ ID No.:13的所述铰链序列的第5位的半胱氨酸残基已经被另一残基替换，从 而恢复在IgG2、IgG3或IgG4亚类中典型的铰链结构域和CH2结构域之间的配对，或 (ii)由来自人IgG2、IgG3或IgG4的铰链结构域，或由选自SEQ ID No.:16、SEQ ID No.: 17、SEQ ID No.:18和SEQ ID No.:19的组成的组中的来自人IgG3的截短的铰链结构 域替换所述抗体的人IgG1铰链结构域。
20.如权利要求19所述的方法，其中使来自所述抗体的人铰链结构域突变，以恢 复在人IgG2、IgG3或IgG4亚类中典型的铰链结构域和CH2结构域之间的配对的步骤 通过如下进行：
a)分离包含特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的所述铰链结构 域的核酸序列，所述核酸序列编码所述抗体的所述重链；
b)使编码所述铰链结构域的第5位的氨基酸残基半胱氨酸(C)的密码子突变为编码 其他氨基酸残基，以提供突变的核酸序列；
c)为所述突变的核酸序列提供可操作的表达元件；
d)在合适的宿主中共表达所述突变的核酸与编码所述抗体的所述轻链的核酸序 列，从而提供特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的突变的人IgG1抗体id n°；和
e)任选地，分离所述突变的抗体。
21.如权利要求19所述的方法，其中由来自人IgG2、IgG3或IgG4的铰链结构域 或由选自SEQ ID No.:16、SEQ ID No.:17、SEQ ID No.:18和SEQ ID No.:19的组成 的组中的来自人IgG3的截短的铰链结构域替换所述抗体的人IgG1铰链结构的步骤通 过如下进行：
a)分离包含特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体的铰链结构域的 核酸序列，所述核酸序列编码所述抗体的所述重链；
b)由编码来自人IgG2、IgG3或IgG4的铰链结构域或由选自SEQ ID No.:16、SEQ ID No.:17、SEQ ID No.:18和SEQ ID No.:19的组成的组中的来自人IgG3的截短的铰 链结构域的核酸序列替换编码特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂核酸的人IgG1抗 体的所述铰链结构域的核酸序列，以提供突变的核酸序列；
c)为所述突变的核酸序列提供可操作的表达元件；
d)在合适的宿主中共表达所述突变的核酸与编码所述抗体的轻链的核酸序列，从 而提供特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的突变的人IgG1抗体；和
e)任选地，分离所述突变的抗体。
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