JP2017212952A - 細胞集合体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) 細胞を細胞培養容器に播種して細胞集合体を製造する方法であって、
前記細胞培養容器が、前記細胞に対して低接着性を有する培養面を有し、
細胞充填率が100%以上となるように前記細胞を前記培養面上に播種する工程、及び播種した前記細胞を培養して前記細胞集合体を形成する工程を含む、細胞集合体の製造方法。
(2) 複数の細胞を含むスフェロイドを細胞培養容器に播種して細胞集合体を製造する方法であって、
前記細胞培養容器が、前記細胞に対して低接着性を有する培養面を有し、
スフェロイド充填率が100%以上となるように前記スフェロイドを前記培養面上に播種する工程、及び播種した前記スフェロイドを培養して前記細胞集合体を形成する工程を含む、細胞集合体の製造方法。
(3) 前記培養面を構成する基材が、ポリジメチルシロキサンである、(1)又は(2)に記載の細胞集合体の製造方法。
(4) 前記培養面の表面が、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート又はMPCポリマーで修飾されている、(1)乃至(3)のいずれか1つに記載の細胞集合体の製造方法。
(5) 形成された前記細胞集合体が、前記培養面から自然に剥離している、(1)乃至(4)のいずれか1つに記載の細胞集合体の製造方法。
ポリマーで化学修飾することにより、低細胞接着性を有する培養面を形成することができる。
により測定することができる。同一種類の各細胞は、液中においてほぼ同じ径を有するため、複数の細胞の径を測定する必要はないが、好ましくは10〜100個の細胞の平均径を用いて細胞断面積を算出する。以下の表に、例として、細胞の直径と細胞充填率が100%となる細胞播種密度との関係を示す。
うち面積が最大となる断面の断面積)である。用いるスフェロイドの形状は特に制限されるものではないが、球状であることが好ましい。球状のスフェロイドは、例えば、特許第4332653号明細書及び特許第4576539号明細書に記載の方法に従って作製することができる。スフェロイド充填率の測定において使用する液は、好ましくは細胞集合体の製造(培養工程)に用いる培養液である。スフェロイドの直径は、液中のスフェロイドを顕微鏡で観察することにより測定することができる。複数のスフェロイドの最大断面積を求め、その平均値を上記式のスフェロイド断面積として用いることが好ましく、例えば、10〜100個のスフェロイドの平均最大断面積を上記式のスフェロイド断面積として用いることができる。
できる利点以外にも、細胞又はスフェロイドの細胞充填率を増やすことで、厚みの増した及び/又は大きいサイズの細胞集合体及び/又は強度に優れた細胞集合体を容易に作製することができる利点を有する。そのため、従来のように、使用前に複数の細胞シートを重ね合わせて積層体を作製する作業も不要となる。
を付与されている。図1(B)に示される細胞培養容器は、プラスチックなどの基材から構成されるディッシュ型の容器2の底面上に、培養面1を構成する培養面構成基材3が配置されている。図1(C)に示される細胞培養容器は、プラスチックなどの基材から構成される側壁(円筒状部材)に、培養面1を構成する培養面構成基材3が配置されている。培養面構成基材は、その材料自体が低細胞接着性を有してもよく、または、化学的表面処理により低細胞接着性が付与されていてもよい。材料自体が低細胞接着性を有する材料としては、例えば、PDMSが挙げられる。容器の形状は、特に制限されるものではないが、例えば、シャーレ、フラスコ、ビーカー、ウェルプレートなどの形状であり得る。図1において、容器2は外壁の側壁及び底壁を構成している。容器の内部空間(培養部)には培養液が配置される。また、図1には図示していないが、細胞培養容器は、適切な大きさの蓋を有することができる。細胞培養容器は、該蓋で閉じられた際に、液密になることが好ましい。なお、本発明はこの実施形態に限定されるものではない。培養面1以外の細胞培養容器の内壁も、低細胞接着性(より好ましくは非細胞接着性)を有することが好ましい。
PMMA(ポリメチルメタクリレート)の平板プレート(24×24mm、厚さ1.5mm)に微細加工機を用いて直径4mmの円柱状の貫通ウェル(直径4.0mm、深さ1.5mm)を形成した(図4(A))。次に、このウェルを有するPMMAプレートを別のPMMA平板プレート(24×24mm、厚さ1.0mm)の上に配置し、熱圧着(106℃、2時間)することにより、有底ウェルを有するPMMAモールドを作製した(図4(B))。次に、ウェルを含むモールド表面全体にPt薄膜層(厚さ5nm)をスパッタリングにより形成した(図4(C))。次に、末端にチオール基(SH)を有するポリエチレングリコール(PEG−SH、分子量20000、日油社製)を2mMの濃度で含むエタノール溶液をウェル内に添加し、チオール基をPtに化学結合させ、PEG修飾PMMAモールドを作製した(図4(D))。次に、PEG修飾PMMAモールドを、ペトリディッシュ(ポリスチレン製、直径35mm、商品名:Falconプラスチックディッシュ351008、コーニング社製)の底面に設置し、細胞培養容器Aを作製した。この細胞培養容器Aにおいては、モールドのウェル内に細胞を播種した後、ウェルを含むペトリディッシュの内部空間に培地を配置し、培養を行う。PEG修飾PMMAモールドのウェルの底面が培養面となる。
PMMA(ポリメチルメタクリレート)の平板プレート(24×24mm、厚さ1.5mm)に微細加工機を用いて直径4mmの円柱状の貫通ウェル(直径4.0mm、深さ1.5mm)を形成した。次に、このウェルを有するPMMAプレートを別のPMMA平板プレート(24×24mm、厚さ1.0mm)の上に配置し、熱圧着(106℃、2時間)することにより、有底ウェルを有するPMMAモールドを作製した。次に、PMMAモールドをペトリディッシュ(ポリスチレン製、直径35mm、商品名:Falconプラスチックディッシュ351008、コーニング社製)の底面に設置することにより、比較例用の細胞培養容器X1を作製した。この細胞培養容器X1においては、細胞培養容器Aと同様に、モールドのウェル内に細胞を播種し、ペトリディッシュ内に培地を配置し、培養を行う。PMMAモールドのウェルの底面が培養面となる。
PMMA(ポリメチルメタクリレート)の平板プレート(24×24mm、厚さ1.5mm)に微細加工機を用いて直径4mmの円柱状の貫通ウェル(直径4.0mm、深さ1
.5mm)を形成した。次に、このウェルを有するPMMAプレートを組織培養表面処理が施された細胞培養ディッシュ(TCPS(ポリスチレン製)、直径35mm、商品名:Falconセルカルチャーディッシュ353001、コーニング社製)の底面に貼り付けることにより、有底ウェルを形成させた。次に、ウェルを含むディッシュ表面全体にPt薄膜層(厚さ5nm)をスパッタリングにより形成した。次に、末端にチオール基(SH)を有するポリエチレングリコール(PEG−SH、分子量20000、日油社製)を2mMの濃度で含むエタノール溶液をウェル内に添加し、チオール基をPtに化学結合させることにより、PEG修飾TCPS表面を有する細胞培養容器Bを作製した。この細胞培養容器Bにおいては、ウェル内に細胞を播種した後、ウェルを含むディッシュの内部空間に培地を配置し、培養を行う。この場合、ウェル底面を形成するPEG修飾TCPS表面が培養面となる。
PMMA(ポリメチルメタクリレート)の平板プレート(24×24mm、厚さ1.5mm)に微細加工機を用いて直径4mmの円柱状の貫通ウェル(直径4.0mm、深さ1.5mm)を形成した。次に、このウェルを有するPMMAプレートを組織培養表面処理が施された細胞培養ディッシュ(TCPS(ポリスチレン製)、直径35mm、商品名:Falconセルカルチャーディッシュ353001、コーニング社製)の底面に貼り付ける(有底ウェルの形成)ことにより、比較例用の細胞培養容器X2を作製した。この細胞培養容器X2においては、細胞培養容器Bと同様に、ウェル内に細胞を播種した後、ウェルを含むディッシュの内部空間に培地を配置し、培養を行う。この場合、ウェル底面を形成するTCPS表面が培養面となる。
PMMA(ポリメチルメタクリレート)の平板プレート(24×24mm、厚さ1.5mm)に微細加工機を用いて直径4mmの円柱状の貫通ウェル(直径4.0mm、深さ1.5mm)を形成した。次に、このウェルを有するPMMAプレートをペトリディッシュ(ポリスチレン製、直径35mm、商品名:Falconプラスチックディッシュ351008、コーニング社製)の底面に貼り付けることにより、有底ウェルを形成させた。次に、MPC(Lipidure−CM5206、日油社製)を0.5wt%の濃度で含むエタノール溶液をウェル内に添加してコートすることにより、MPC修飾ポリスチレン表面を有する細胞培養容器Cを作製した。この細胞培養容器Cにおいては、ウェル内に細胞を播種した後、ウェルを含むディッシュの内部空間に培地を配置し、培養を行う。この場合、ウェル底面を形成するMPC修飾ポリスチレン表面が培養面となる。
PMMA(ポリメチルメタクリレート)の平板プレート(24×24mm、厚さ1.5mm)に微細加工機を用いて直径4mmの円柱状の貫通ウェル(直径4.0mm、深さ1.5mm)を形成した。次に、このウェルを有するPMMAプレートをペトリディッシュ(ポリスチレン製、直径35mm、商品名:Falconプラスチックディッシュ351008、コーニング社製)の底面に貼り付ける(有底ウェルの形成)ことにより、比較例用の細胞培養容器X3を作製した。この細胞培養容器X3においては、細胞培養容器Cと同様に、ウェル内に細胞を播種した後、ウェルを含むディッシュの内部空間に培地を配置し、培養を行う。この場合、ウェル底面を形成するポリスチレン表面が培養面となる。
図5に示すような渦巻きパターンの凹部を有するモールドを作製した。まず、微細加工機を用いて、PMMAの平板プレート(24×24mm、厚さ0.8mm)に幅400μm、深さ500μmの渦巻きパターンの切削加工を施した。切削加工した渦巻きパターンの全長は43mmで、底面積は17.2mm2であった。次に、凹部を形成したPMMA
プレートの表面にPt薄膜層(厚さ5nm)を形成した。次に、PMMAプレートにPDMS製のリング(内径7mm、厚さ2.4mm)を、渦巻きパターンがリングの内側に配置されるように貼り合わせた。次に、末端にチオール基(SH)を有するポリエチレングリコール(PEG−SH、分子量20000、日油製)を2mMの濃度で含むエタノール溶液をリングにより形成されるウェル内に添加し、チオール基をPtに化学結合させ、PEG修飾モールドを作製した。次に、作製したモールドを、ペトリディッシュ(ポリスチレン製、直径35mm、商品名:Falconプラスチックディッシュ351008、コーニング社製)の底面に設置することにより、細胞培養容器Dを作製した。この細胞培養容器Dにおいては、モールドのウェル内に細胞を播種し、ペトリディッシュ内に培地を配置し、培養を行う。また、ウェルの底面に形成される渦巻きパターンの凹部の底面を培養面として利用する。なお、ウェル内に播種した細胞について、渦巻きパターンの凹部の底面に沈降しなかった細胞は、播種後に除去することができる。下記実施例又は比較例で示される細胞充填量は、培養面(渦巻きパターンの凹部の底面)の上に配置された細胞数及び培養面面積に基づいて算出される。
PDMS(ポリジメチルシロキサン、SYLGARD184、ダウコーニング社製)製の平板プレート(24×24mm、厚さ2.5mm)の中央部分に円柱状のウェル構造(直径4.0mm、深さ1.5mm)を有するPDMSモールドを作製した。次に、MPC(Lipidure−CM5206、日油社製)を0.5wt%の濃度で含むエタノール溶液をウェル内に添加してコートすることにより、MPC修飾PDMSモールドを作製した。次に、MPC修飾PDMSモールドを、ペトリディッシュ(ポリスチレン製、直径35mm、商品名:Falconプラスチックディッシュ351008、コーニング社製)の底面に貼り付けることにより、細胞培養容器Eを作製した。この細胞培養容器Eにおいては、モールドのウェル内に細胞を播種した後、ウェルを含むペトリディッシュの内部空間に培地を配置し、培養を行う。MPC修飾PDMSモールドのウェルの底面が培養面となる。
PDMS(ポリジメチルシロキサン、SYLGARD184、ダウコーニング社製)製の平板プレート(24×24mm、厚さ2.5mm)の中央部分に円柱状のウェル構造(直径4.0mm、深さ1.5mm)を有するPDMSモールドを作製した。次に、MPC(Lipidure−CM5206、日油社製)を0.5wt%の濃度で含むエタノール溶液をウェル内に添加してコートすることにより、MPC修飾PDMSモールドを作製した。次に、MPC修飾PDMSモールドを、底面中央部に直径15mmの穴が開いたペトリディッシュ(ポリスチレン製、直径35mm、商品名:Falconプラスチックディッシュ351008、コーニング社製)の底面に貼り付けることにより、細胞培養容器Fを作製した(図2参照)。この細胞培養容器Fにおいては、細胞培養容器Eと同様に、モールドのウェル内に細胞を播種した後、ウェルを含むペトリディッシュの内部空間に培地を配置し、培養を行う。培養の際、ペトリディッシュの底面に空いた開口からPDMSを介して酸素を供給することができる。また、MPC修飾PDMSモールドのウェルの底面が培養面となる。
RTVシリコーンゴム(信越化学工業社製)の主剤KE−106と副剤CAT−RGを重量比10:1で混ぜ合わせて真空脱泡した後、ガラス板上に流し、150℃で30分硬化させてシリコーン樹脂シートを作製した。得られたシリコーン樹脂シートを直径22mmにポンチで打ち抜いた。そして、得られた円形状のシリコーン樹脂シートをポリカーボネート製パイプ(外径22mm、内径18mm)に接着剤(Momentive Performance Materials社製、RTV118)で貼り付け、PDMS(ポ
リジメチルシロキサン)から構成される培養面を有する細胞培養容器Gを作製した。
細胞培養ペトリディッシュ(TCPS(ポリスチレン製)、商品名:Nunc細胞培養ディッシュ、Thermo Fisher Scientific社製、直径35mm)を比較例用の細胞培養容器X4として用いた。
細胞培養容器A〜FおよびX1〜X3と同じ培養面を有する35mmディッシュを用いて、下記方法により対象細胞に対する細胞接着率を測定した。
まず、細胞培養容器の培養面上に、播種密度1.0×104cells/cm2で対象細胞(ヒト肝ガン由来細胞株(HepG2))を播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ社製)を用いた。細胞を播種した細胞培養容器をCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて5時間保持した。次に、細胞培養容器をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄した後、培養面に接着している細胞をトリプシン処理により培養面から剥離した。剥離した細胞を遠心分離により回収し、培地に懸濁させた。培地中の細胞の数を血球計算盤を用いてカウントし、接着細胞数を得た。式:[(接着細胞数/細胞播種数)×100]によって細胞接着率を算出した。細胞接着率(3回の平均)の結果を、後述の表2に示す。
細胞培養容器Aに、細胞充填率165%(播種密度1.0×106cells/cm2)でヒト肝ガン由来細胞株(HepG2)(理化学研究所から入手、10%FBS含有DMEM培地中の直径14.5μm)を播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ社製)を用いた。培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて2日間行った。培養後、目視で観察したところ、シート状の細胞集合体が形成されており、該細胞集合体が培養面から自然に剥離していることを確認した(図6)。
細胞充填率200%(播種密度1.5×106cells/cm2)で細胞を播種したこと以外は、実施例1と同じ方法で細胞集合体を作製した。培養後、目視で観察したところ、シート状の細胞集合体が形成されており、該細胞集合体が培養面から自然に剥離していることを確認した。
細胞充填率41%(播種密度2.5×105cells/cm2)で細胞を播種したこと以外は、実施例1と同じ方法で細胞集合体を作製した。培養後、目視で観察したところ、細胞の凝集塊が培養容器中に散在しており、シート状の細胞集合体は形成されなかった(図7)。
細胞培養容器X1に、細胞充填率200%(播種密度1.5×106cells/cm2)でヒト肝ガン由来細胞株(HepG2)を播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ社製)を用いた。培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて2日間行った。培養後、目視で観察したところ、シート内に隙間が存在するシート状の細胞集合体が形成された。また、該細胞集合体は培養面に強く接着しており、ピンセットで端を摘まんでも容易に剥離できなかった。
細胞培養容器Bに、細胞充填率200%(播種密度1.5×106cells/cm2)でヒト肝ガン由来細胞株(HepG2)を播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ社製)を用いた。培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて2日間行った。培養後、目視で観察したところ、シート状の細胞集合体が形成されており、該細胞集合体が培養面から自然に剥離していることを確認した。
細胞培養容器X2に、細胞充填率200%(播種密度1.5×106cells/cm2)でヒト肝ガン由来細胞株(HepG2)を播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ製)を用いた。培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて2日間行った。培養後、目視で観察したところ、シート内に隙間が存在するシート状の細胞集合体が形成された。また、該細胞集合体は培養面に強く接着しており、ピンセットで端を摘まんでも容易に剥離できなかった。
細胞培養容器Cに、細胞充填率200%(播種密度1.5×106cells/cm2)でヒト肝ガン由来細胞株(HepG2)を播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ社製)を用いた。培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて2日間行った。培養後、目視で観察したところ、シート状の細胞集合体が形成されており、該細胞集合体が培養面から自然に剥離していることを確認した。
細胞培養容器X3に、細胞充填率200%(播種密度1.5×106cells/cm2)でヒト肝ガン由来細胞株(HepG2)を播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ製)を用いた。培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて2日間行った。培養後、目視で観察したところ、シート内に隙間が存在するシート状の細胞集合体が形成された。また、該細胞集合体は培養面に強く接着しており、ピンセットで端を摘まんでも容易に剥離できなかった。
細胞培養容器Dに、播種胞密度4.7×105cells/moldでヒト肝ガン由来細胞株(HepG2)を播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ製)を用い、培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件で行った。1日間培養した後、培地を用いて洗浄することで培養面上に沈降しなかった細胞を除去した結果、モールド内への細胞充填率は150%(細胞密度9.1×105cells/cm2)であった。洗浄後、新しい培地を添加してさらに2日間培養した。培養後、目視で観察したところ、培養面上に連続するファイバー状の細胞集合体が形成されており、該ファイバー状細胞集合体が培養面から自然に剥離していることを確認した(図8)。
細胞充填率70%(細胞密度4.2×105cells/cm2)で細胞を充填したこと以外は、実施例5と同じ方法で細胞集合体を作製した。培養後、目視で観察したところ、断片的な細胞凝集物が培養面上に散在しており、培養面上に連続するファイバー状の細胞集合体は得られなかった(図9)。
細胞培養容器Eに、細胞充填率300%(播種密度1.8×106cells/cm2)でヒト肝ガン由来細胞株(HepG2)を播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ社製)を用いた。培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて2日間行った。培養後、目視で観察したところ、シート状の細胞集合体が形成されており、該細胞集合体が培養面から自然に剥離していることを確認した。
細胞培養容器Fに、細胞充填率300%(播種密度1.8×106cells/cm2)でヒト肝ガン由来細胞株(HepG2)を播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ社製)を用いた。培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて2日間行った。培養後、目視で観察したところ、シート状の細胞集合体が形成されており、該細胞集合体が培養面から自然に剥離していることを確認した。また、2日間培養した培地を回収し、HepG2細胞が産生するアルブミン(タンパク質)量を測定した結果、酸素供給能が高い細胞培養容器F(実施例7)の細胞組織体は、細胞培養容器E(実施例6)の細胞集合体よりも高いアルブミン産生能をもつことが示された(図10)。これより、細胞培養容器Fは、より好ましい容器形態であることが見出された。
細胞培養容器Gに、細胞充填率225%(播種密度3.0×106cells/cm2)でマウス筋芽細胞(JCRBから入手、10%FBS含有DMEM培地中の直径15.5μm)を播種した。使用培地は、10%FBS含有DMEM(シグマ社製)を用いた。培養は、CO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて24時間行った。培養後、目視で観察したところ、シート状の細胞集合体が形成されており、該細胞集合体が培養面から自然に剥離していることを確認した。
細胞充填率135%(播種密度1.8×106cells/cm2)で細胞を播種したこと以外は、実施例8と同じ方法で細胞集合体を作製した。培養後、目視で観察したところ、シート状の細胞集合体が形成されており、該細胞集合体が培養面から自然に剥離していることを確認した。
細胞充填率75%(播種密度1.0×106cells/cm2)で細胞を播種したこと以外は、実施例8と同じ方法で細胞集合体を作製した。培養後、目視で観察したところ、細胞の凝集塊が培養容器中に散在しており、シート状の細胞集合体は形成されなかった。
細胞培養容器Gの代わりに細胞培養容器X4を用いたこと以外は、実施例8と同じ方法で細胞集合体を作製した。培養後、シート状の細胞集合体が形成されたが、該細胞集合体は培養面に強く接着しており、ピンセットで端を摘まんでも容易に剥離できなかった。
PMMA平板プレート(24×24mm、厚さ0.5mm)に、微細加工機を用いて、直径300μm、深さ300μmの円筒形マイクロウェルを1020個形成した。次に、ウェルが形成された表面全体にPt薄膜層(厚さ5nm)をスパッタリングにより形成した。次に、末端にチオール基(SH)を有するポリエチレングリコール(PEG−SH、分子量20000、日油製)を2mMの濃度で含むエタノール溶液をウェル内に添加し、Ptとチオール基を化学結合させることにより、ウェルの表面をPEGで修飾した。得られたプレートをペトリディッシュ(ポリスチレン製、直径35mm、商品名:Falconプラスチックディッシュ351008、コーニング社製)の底面に設置し、スフェロイ
ド培養用容器として利用した。なお、このスフェロイド培養用容器において、ウェル内に細胞を播種した後、ウェルを含むペトリディッシュの内部空間に培地を配置し、培養を行う。
作製したスフェロイド培養用容器に播種密度100cells/well(1.4×105cells/cm2)でヒト肝ガン由来細胞株(HepG2)(理化学研究所から入手)を播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ製)を用い、培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて2日間行った。培養後、各ウェルで形成されたスフェロイドを顕微鏡により撮影し(30サンプル)、得られた顕微鏡写真からスフェロイドの平均粒径を算出した。スフェロイドの平均粒径は120μmであった。スフェロイド培養用容器で形成されたスフェロイドは、ピペッティングによって容器から取り出し、回収した。
上述のHepG2スフェロイド(平均粒径120μm)をスフェロイド充填率135%(播種密度1.2×104spheroids/cm2)で細胞培養容器Aのウェルに播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ製)を用い、培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて2日間行った。培養後、目視で観察したところ、シート状の細胞集合体が形成されており、該細胞集合体が培養面から自然に剥離していることを確認した。
細胞培養容器Aの代わりに細胞培養容器X1を用いたこと以外は、実施例Aと同様にして細胞集合体を作製した。培養後、顕微鏡で観察したところ、シート内に隙間があるシート状の細胞集合体が形成された。また、該細胞集合体は培養面に強く接着しており、ピンセットで端を摘まんでも容易に剥離できなかった。
上述のHepG2スフェロイド(平均粒径120μm)をスフェロイド充填率135%(播種密度1.2×104spheroids/cm2)で細胞培養容器Bのウェルに播種した。培地としては、10%FBS含有DMEM(ギブコ製)を用い、培養はCO2インキュベーターで37℃、5%CO2の条件にて2日間行った。培養後、目視で観察したところ、シート状の細胞集合体が形成されており、該細胞集合体が培養面から自然に剥離していることを確認した。
細胞培養容器Bの代わりに細胞培養容器X2を用いたこと以外は、実施例Bと同様にして細胞集合体を作製した。培養後、顕微鏡で観察したところ、シート内に隙間があるシート状の細胞集合体が形成された。また、該細胞集合体は培養面に強く接着しており、ピンセットで端を摘まんでも容易に剥離できなかった。
2 容器
3 培養面構成基材
4 開口
11 容器
12 対象細胞
13 培養液
14 細胞集合体
Claims (5)
- 細胞を細胞培養容器に播種して細胞集合体を製造する方法であって、
前記細胞培養容器が、前記細胞に対して低接着性を有する培養面を有し、
細胞充填率が100%以上となるように前記細胞を前記培養面上に播種する工程、及び播種した前記細胞を培養して前記細胞集合体を形成する工程を含む、細胞集合体の製造方法。 - 複数の細胞を含むスフェロイドを細胞培養容器に播種して細胞集合体を製造する方法であって、
前記細胞培養容器が、前記細胞に対して低接着性を有する培養面を有し、
スフェロイド充填率が100%以上となるように前記スフェロイドを前記培養面上に播種する工程、及び播種した前記スフェロイドを培養して前記細胞集合体を形成する工程を含む、細胞集合体の製造方法。 - 前記培養面を構成する基材が、ポリジメチルシロキサンである、請求項1又は2に記載の細胞集合体の製造方法。
- 前記培養面の表面が、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート又はMPCポリマーで修飾されている、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の細胞集合体の製造方法。
- 形成された前記細胞集合体が、前記培養面から自然に剥離している、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の細胞集合体の製造方法。
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