JP2017211373A - 肺癌を検出する方法及び検出用キット - Google Patents

Abstract

【課題】 膵臓リボヌクレアーゼ１（ＲＮａｓｅ １とも略す）のＮ型糖鎖修飾可能部位を測定することにより、肺癌を検出する。【解決手段】 以下に記載のＡ，Ｂにおいて、ＡとＢとを測定し、その比を求め、それにより、肺癌を検出する。Ａ＝膵臓リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量Ｂ＝膵臓リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位の量【選択図】 図１

Description

本発明は、肺癌の検出方法及び検出用キットに関する。より詳しくは、膵臓リボヌクレアーゼ１（以下、膵臓リボヌクレアーゼ１を「ＲＮａｓｅ １」と称する）のＮ型糖鎖修飾可能部位における糖鎖の結合の有無を測定することによる肺癌の検出方法及びその検出用キットに関する。

肺癌は、罹患者数の多い癌である。非特許文献１および非特許文献２によると、日本国内の２０１１年の罹患者数は約１１万人であり胃癌に次いで第２位、死亡者数は約７万人で第１位となっている。肺癌は、レントゲンなどに代表される画像診断方法で検出・診断されることが多いが、検出限界や感度などは読影者の技量や画像撮影装置に依存し、早期癌のような小さい腫瘍組織は検出が困難であるとされている。肺癌の診療で利用される血液腫瘍マーカーは、陽性率が低いため、肺癌を検出するという目的には使われず、専ら治療効果のモニタリングに利用されている。
血中のＲＮａｓｅ １は、主に膵臓で生産され血流に分泌されるタンパク質と考えられているが、膵臓以外の組織での発現を示唆する報告がある。しかしながら、肺組織におけるＲＮａｓｅ １の発現については、これまでに詳しく調べられていない。特許文献１には、膵臓癌の患者から得られた血液中のＲＮａｓｅ １の特定のアスパラギン残基において、健常者には見られない糖鎖修飾が増加していることが示され、膵臓癌の検出ができる方法が示されている。特許文献２には、前述のＲＮａｓｅ １の８８番目のアスパラギン残基（以下、「Ａｓｎ８８」と称することもある）における糖鎖付加量を正確に測定するための測定方法が記載され、膵臓癌、胃癌、胆管癌での測定結果が記載されている。しかしながら、これらの特許文献には、肺癌でのＲＮａｓｅ １の発現、さらにいえば、肺癌でのＲＮａｓｅ １のＡｓｎ８８における糖鎖付加の検出については記載されていない。以上のことから、これまでに肺癌を検出する目的で、血液中のＲＮａｓｅ １の測定や、特定のアスパラギン残基においての糖鎖付加変化を測定することはなかった。

また肺に発生する癌は、組織型別に４種類の癌（腺癌、非小細胞癌、小細胞癌、扁平上皮癌）がある。肺癌の検出に使用される侵襲性の低い血液検査は、組織型別に利用されるマーカーがある。しかしながら、それらは陽性率が低いためにスクリーニング等には利用されず、日本肺癌学会による「肺癌診療ガイドライン２０１６年度」でも、腫瘍マーカーの測定は「肺癌の検出を目的として最初に行うこと」は推奨されていない。肺癌の検出を目的として最初に行う検査」として推奨されているのは、胸部Ｘ線写真であるが、日本国内では普及した検出技法であるものの、放射線を浴びるリスクがあり、血液検査等と比べて侵襲性の高い検査方法である。肺癌を克服するためには、組織型に偏りがなく検出されるマーカーが必要でとされている。

国際公開第２０１３／１８７３７１号パンフレット 特開２０１６−０４２０８３号公報

人口動態統計（厚生労働省大臣官房統計情報部編）平成２４年９月６日発行 Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， ４４（４）： ３８８−３９６， ２０１３、国立がん研究センターがん情報サービス「がん登録・統計」

本発明は、ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位に着目し、肺癌を検出する方法を提供することを目的とする。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、肺癌患者ではＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位において糖鎖が結合している場合が健常人と比べて増加していることを見いだし、本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下のとおりである。

（１）ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を測定することを特徴とする、肺癌を検出する方法。
（２）健常者に比べてＮ型糖鎖が結合している部位の量が増加する、（１）に記載の方法。
（３）下記Ａ，Ｂにおいて、ＡとＢとの比を求めることを特徴とする、肺癌を検出する方法。
Ａ＝ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量
Ｂ＝ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位の量
（４）（３）に記載の方法において、Ａ＝Ｎ型糖鎖が結合していない部位の量、であり、健常者と比べて、Ａ／Ｂの値が小さくなる方法。
（５）（３）に記載の方法において、Ａ＝Ｎ型糖鎖が結合している部位の量、であり、健常者と比べて、Ａ／Ｂの値が大きくなる方法。
（６）（３）〜（５）いずれかに記載の方法において、ＲＮａｓｅ １の量を求め、その値を換算してＢの値とする方法。
（７）Ｎ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１に示された配列の８８番目のアスパラギン残基である、（１）〜（６）いずれか１項に記載の方法。
（８）ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片を含有することを特徴とする、肺癌の検出用キット。

以下に本発明を更に詳細に説明する。本発明は、ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を測定することにより、肺癌を検出するものである。このとき、ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している「部位」の量、またはＮ型糖鎖が結合していない「部位」の量を測定するものであって、Ｎ型糖鎖修飾可能部位に対して結合している「糖鎖」の量を測定するものではない。

測定対象となるＲＮａｓｅ １はヒト生体試料由来であることが好ましい。これらを測定対象とすることにより、ヒトの肺癌を検出することができる。このとき、肺癌患者では、健常人と比べてＮ型糖鎖修飾可能部位にＮ型糖鎖が結合している場合が多く、Ｎ型糖鎖修飾可能部位の中でＮ型糖鎖が結合している部位が増加するため、これを指標として肺癌を検出することができる。

また本発明は、下記Ａ，Ｂにおいて、ＡとＢとの比を求めることを特徴とする、肺癌の検出方法である。
Ａ＝ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量
Ｂ＝ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位の量
また、Ａ＝Ｎ型糖鎖が結合していない部位の量、であり、健常人と比べて、Ａ／Ｂの値が小さくなる方法であることが好ましい。またＡ＝Ｎ型糖鎖が結合している部位の量、であり、健常人と比べて、Ａ／Ｂの値が大きくなる方法であることも好ましい。

Ｂ＝ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位の量、において、その求め方には特に限定はなく、例えばＲＮａｓｅ １の量を求め、その値を換算してＢの値とすることができる。具体的には、ＲＮａｓｅ １は３つのＮ型糖鎖修飾可能部位（配列番号１の３４，７６，８８番目のアスパラギン残基）を有するので、測定対象としてそのいずれか１つ、もしくは２つの部位、またはすべての部位の量としたときには、それに応じてＢ＝ＲＮａｓｅ １のＮ型糖鎖修飾可能部位の量も、ＲＮａｓｅ １の量のそれぞれ１倍、２倍または３倍と換算することができる。なお、ＲＮａｓｅ １の量は、例えば免疫学的測定法や質量分析を使用した方法により求めることができる。

なお、ＲＮａｓｅ １は、前述のように３つのＮ型糖鎖修飾可能部位（配列番号１の３４，７６，８８番目のアスパラギン残基）を有する。特にＮ型糖鎖修飾可能部位として、配列番号１の８８番目のアスパラギン残基に対して上述の量を測定すると、肺癌の患者と健常人とでは、その値に顕著な差がみられるため、肺癌の検出方法として好ましいものである。

また本発明による方法、キットは、後述の実施例に示すように、肺癌の４種類の組織型（腺癌、非小細胞癌、小細胞癌、扁平上皮癌）すべてを検出することができ、肺癌を組織型によらずに幅広く検出することができる。

本発明により肺癌が検出された場合には、その治療を適宜行うことが好ましい。治療方法としては特に限定はなく、肺癌の治療方法の中から適宜選択して行えばよい。

本発明により、肺癌を検出することができ、さらに４つすべての組織型の肺癌を検出することができる。

健常者と肺癌患者のＧ３／ｔ比の分布 をプロットしたグラフである。 正常ヒト組織抽出物中の総ＲＮａｓｅ １量を測定した結果を示した図である。 肺癌組織型別のＧ３／ｔ比の分布を示す図である。

実施例１ 肺癌患者由来血清検体の、Ｎ型糖鎖が付加しているＡｓｎ８８の量、Ａｓｎ８８の量及びその割合
測定対象のＮ型糖鎖修飾可能部位をＡｓｎ８８とし、Ｎ型糖鎖が付加しているＡｓｎ８８量（Ｇ３）の測定と、Ａｓｎ８８量（ｔ）の測定を特許文献２の実施例３および４に記載の免疫学的測定試薬および方法で実施した。上述の免疫学的測定試薬を使用して、健常人から得られた血清３５検体と、肺癌患者から得られた血清４０検体を測定した。なお、本実施例においては、Ｎ型糖鎖修飾可能部位であるＡｓｎ８８量は、総ＲＮａｓｅ １量の１倍と換算することができる。結果を表１、図１に示す。

表１、図１に示したように、肺癌患者血清のＧ３及びＧ３／ｔ比は、健常者群に比べて有意に高くなっている（どちらもｐ＜０．０５）ことが分かる。以上の結果から、Ｇ３又はＧ３／ｔ比を測定することにより肺癌を検出することが可能であることが示された。

実施例２ 正常ヒト肺組織におけるＲＮａｓｅ １発現の確認
正常ヒト肺組織のホモジネートと、正常ヒト膵臓組織の組織抽出物、正常ヒト胃組織の組織抽出物をＢｉｏＣｈａｉｎ社から入手して、前述の免疫学的測定法により、それらの抽出物中の総ＲＮａｓｅ １量を測定した。図２に示した通り、正常ヒト肺組織においても、ＲＮａｓｅ １が発現していることが確認できた。よって、肺組織の癌性変化によって血流中のＲＮａｓｅ １のＡｓｎ８８におけるＮ型糖鎖の付加程度が変化する理由は、肺癌細胞で発現するＲＮａｓｅ １の新規生合成過程で、Ａｓｎ８８におけるＮ型糖鎖の付加が亢進している結果であると考えられる。

実施例３ 肺癌組織型別のＧ３／ｔ比分布の解析
実施例１に記載の免疫学的測定試薬及び方法を使用して、肺癌患者から得られた血清４０検体（組織学的に診断がついたもの）を測定し、組織型別にプロットした。結果を図３に示す。図３から明らかなように、４つの組織型はいずれもカットオフ値０．１８４を超える値を示している。この結果は、図１の結果と併せて、上述の免疫学的測定試薬及び方法による肺癌の検出は、４つの組織型に偏りがなく全ての組織型の肺癌を検出できることを示し、肺癌を幅広く検出するという意味では、優れた肺癌検出試薬及び方法であることを示している。

Claims (8)

1. 膵臓リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量を測定することを特徴とする、肺癌を検出する方法。
2. 健常者に比べてＮ型糖鎖が結合している部位の量が増加する、請求項１に記載の方法。
3. 下記Ａ，Ｂにおいて、ＡとＢとの比を求めることを特徴とする、肺癌を検出する方法。
   Ａ＝膵臓リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位であって、Ｎ型糖鎖が結合している部位又は結合していない部位の量
   Ｂ＝膵臓リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位の量
4. 請求項３に記載の方法において、Ａ＝Ｎ型糖鎖が結合していない部位の量、であり、健常者と比べて、Ａ／Ｂの値が小さくなる方法。
5. 請求項３に記載の方法において、Ａ＝Ｎ型糖鎖が結合している部位の量、であり、健常者と比べて、Ａ／Ｂの値が大きくなる方法。
6. 請求項３〜５いずれかに記載の方法において、膵臓リボヌクレアーゼ１の量を求め、その値を換算してＢの値とする方法。
7. Ｎ型糖鎖修飾可能部位が、配列番号１に示された配列の８８番目のアスパラギン残基である、請求項１〜６に記載の方法。
8. 膵臓リボヌクレアーゼ１のＮ型糖鎖修飾可能部位を抗原認識部位の一部とするモノクローナル抗体またはその断片を含有することを特徴とする、肺癌の検出用キット。

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