JP2017166862A - 尿中プロスタグランジンe主要代謝物の測定方法及びキット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】PGE−MUMを測定する方法は、a)尿検体をアルカリ水溶液と混和する工程と、b)a)の混和液を、ビシクロ体PGE−MUM又は抗ビシクロ体PGE−MUM抗体を固定化した固相を用いた免疫測定に供して前記尿検体中のPGE−MUMを測定する工程を含み、免疫測定を、弱酸性のベース緩衝液中、塩基性領域で緩衝能を発揮する、ベース緩衝液を構成するpH緩衝剤とは異なる第2のpH緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤との存在下で行う。
【選択図】図6
Description
a)尿検体をアルカリ水溶液と混和する工程と、
b)a)の混和液を、ビシクロ体PGE−MUM又は抗ビシクロ体PGE−MUM抗体を固定化した固相を用いた免疫測定に供して前記尿検体中のPGE−MUMを測定する工程を含み、
前記免疫測定を、弱酸性のベース緩衝液中、塩基性領域で緩衝能を発揮する、前記ベース緩衝液を構成するpH緩衝剤とは異なる第2のpH緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤との存在下で行う、方法、を提供する。
第1の実施形態は、ビシクロ体PGE−MUM抗原を固相化した磁性粒子を含む磁性粒子液と、標識抗ビシクロ体PGE−MUM抗体を使用する、ワンステップの競合法である。図1は、第1の実施形態の抗原抗体反応系の模式図である。ビシクロ体PGE−MUM抗原11を介して固相化した磁性粒子12と、検体中に含まれるビシクロ体PGE−MUM抗原13と、標識抗ビシクロ体PGE−MUM抗体14とを共存させ、反応させた後に洗浄し、磁性粒子12と抗原11を介して結合した抗体14を検出する。検体中の抗原13の濃度が高いほど、磁性粒子12に固相化された抗原11と反応する標識抗体14が少なくなるため、得られるシグナルは低くなる。
アルカリ処理は、上記の通りである。
磁性粒子液は、第2のpH緩衝剤、ビシクロ体PGE−MUM抗原を固相化した磁性粒子、陽イオン性界面活性剤を少なくとも含む。工程b)においては、反応液のpHを適正な範囲に維持し、かつ、十分な測定感度を得るため、尿混和液と磁性粒子液とを1:0.1〜1:10、特に1:0.2〜1:5、さらに1:0.5〜1:2の比率で混和することが好ましい。混和後の磁性粒子液は、5〜40℃で静置してもよい。
磁性粒子は、その表面にビシクロ体PGE−MUMを固相化したものを使用する。抗原は、直接磁性粒子に結合させてもよく、また、KLG(マウスモノクローナルIgG)、血清アルブミン、KLH等の結合タンパクを介して結合させてもよい。磁性粒子としては、例えばカルボキシル化磁性粒子、ゼラチン粒子等を使用することができる。
粒子懸濁液、第2のpH緩衝剤、陽イオン性界面活性剤及び両性界面活性剤は上記の通りである。
標識液は、標識抗ビシクロ体PGE−MUM抗体を少なくとも含む。標識抗体は、尿混和液と磁性粒子液が混和後、混和直後に添加されてもよく、尿混和液と磁性粒子液を混和後、静置した後に添加されてもよい。磁性粒子液(尿混和液分を含まず)と標識液の比率は、体積比で1:0.1〜1:10、特に1:0.2〜1:5、さらに1:0.5〜1:2とすることが好ましい。検体、磁性粒子及び標識抗体との反応は、5〜40℃、好ましくは25〜40℃で3〜60分、好ましくは5〜10分静置することによって行う。
標識液を構成する標識抗体希釈液は、緩衝液をベースとすることが好ましい。標識抗体希釈液の組成、pH等の条件は、標識抗体を安定的に保持できる条件であれば特に限定されず、免疫測定に汎用される緩衝液をいずれも使用可能である。標識液のpHは、生体内に近い条件である、6〜8、特に6.5〜7.5程度とすることが好ましい。
標識抗体として使用する抗体は、ビシクロ体PGE−MUMと特異的に結合できるものであれば特に限定されるものではなく、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、同性能の抗体を安定的に製造可能なモノクローナル抗体を用いることがより好ましい。
磁性粒子を集磁し、洗浄することで、粒子に未結合の成分を除去する。洗浄液としては、免疫測定に汎用される洗浄液を使用でき、例えば、ルミパルス(登録商標)(富士レビオ株式会社製)を使用することができる。
磁性粒子に結合した標識抗体を、使用する標識に適した方法、例えば酵素標識を用いた場合は酵素の基質を添加することによって、検出する。例えば、アルカリホスファターゼ(ALP)を標識抗体として用いた場合は、3−(2’−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3’−ホスホリルオキシ)フェニル−1,2−ジオキセタン・2ナトリウム塩(AMPPD)を酵素基質として用いた化学発光酵素免疫測定法(CLEIA)の系とすることができる。
第2の実施形態は、抗ビシクロ体PGE−MUM抗体を固相化した磁性粒子と、標識ビシクロ体PGE−MUM抗原とを用いるワンステップの競合法である。第2の実施形態の抗原抗体反応系を図2に示す。抗ビシクロ体PGE−MUM抗体21を固相化した磁性粒子22と、検体中に含まれるビシクロ体PGE−MUM抗原23と、標識ビシクロ体PGE−MUM抗原24とを共存させ、反応させた後に洗浄し、磁性粒子22と抗体21を介して結合した標識抗原24を検出する。検体中の抗原23の濃度が高いほど、磁性粒子22と抗体21を介して結合する標識抗原24が少なくなるため、得られるシグナルは低くなる。
第3の実施形態は、抗ビシクロ体PGE−MUM抗体を固相化した磁性粒子と、標識抗ビシクロ体PGE−MUM抗体とを用いる2ステップのサンドイッチ法である。第3の実施形態の抗原抗体反応系を図3示す。抗ビシクロ体PGE−MUM抗体31を固相化した磁性粒子32と、検体中に含まれるビシクロ体PGE−MUM抗原33とを反応させ、洗浄した後、標識抗ビシクロ体PGE−MUM抗体34を反応させ、反応させた後に洗浄し、磁性粒子32と抗体31及び抗原33を介して結合した標識抗体34を検出する。検体中の抗原33の濃度が高いほど、磁性粒子32と結合する標識抗体34が多くなるため、得られるシグナルは高くなる。
第4の実施形態は、ビシクロ体PGE−MUM抗原を固相化したマイクロウェルプレートと、標識抗ビシクロ体PGE−MUM抗体とを用いるワンステップの競合ELISA法である。第4の実施形態の抗原抗体反応系を図4に示す。ビシクロ体PGE−MUM抗原41を固相化したマイクロウェルプレート42にpH緩衝剤及び陽イオン性界面活性剤を含む検体処理液45を満たし(図4A)、次いで尿混和液(検体)を添加する(図4B)。さらに、標識抗ビシクロ体PGE−MUM抗体44を含む標識液を添加する(図4C)。標識抗体44を、固相化抗原41と検体中に含まれる抗原43に反応させ、洗浄した後、固相化抗原41に結合した標識抗体44を検出する(図4D)。検体に含まれる抗原43の濃度が高いほど、固相化抗原41と結合する標識抗体44は少なくなるため、得られるシグナルは低くなる。
第5の実施形態は、抗ビシクロ体PGE−MUM抗体を固相化したマイクロウェルプレートと、標識抗ビシクロ体PGE−MUM抗体とを用いる2ステップのサンドイッチELISA法である。第5の実施形態の抗原抗体反応系を図5に示す。抗ビシクロ体PGE−MUM抗体51を固相化したマイクロウェルプレート52にpH緩衝剤及び陽イオン性界面活性剤を含む検体処理液55を満たし(図5A)、次いで尿混和液(検体)を添加し、検体中のビシクロ体PGE抗原53と抗体51とを反応させる(図5B)。マイクロウェルプレート52を洗浄後、標識抗ビシクロ体PGE−MUM抗体54を含む標識液を添加して反応させる(図5C)。マイクロウェルプレートを洗浄し、抗体51と抗原53を介して結合した標識抗体54を検出する(図5D)。検体に含まれる抗原53の濃度が高いほど、抗体51と結合する標識抗体54は多くなるため、得られるシグナルは高くなる。
本実施形態の詳細な条件は、マイクロウェルプレートに抗原ではなく抗体を固相化したこと、競合法ではなくサンドイッチ法を適用したこと以外は、第4の実施形態と同様である。
本発明は、前記第1〜第5の実施形態に限られず、抗原または抗体を結合させる固相の材質・形状、固相化抗原/抗体と標識抗体/抗原の組み合わせ、1ステップ/2ステップ、競合法/サンドイッチ法の条件設定を適宜変更して実施することが可能である。
本発明のキットは、ビシクロ体PGE−MUM又は抗ビシクロ体PGE−MUM抗体を固定化した固相と、弱酸性のベース緩衝液中、塩基性領域で緩衝能を発揮する、前記ベース緩衝液を構成するpH緩衝剤とは異なる第2のpH緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む。これらに加えて、上記した標識抗体液、アルカリ処理用のアルカリ水溶液、検量線作成用の標準液が備えられていてもよい。固相としては、上記した粒子、好ましくは磁性粒子やマイクロプレートを挙げることができる。
従来法(ラジオイムノアッセイ(RIA))での測定
ボランティア尿検体8例について、従来法でのPGE−MUMの測定を行った。
尿試料50μLと1N NaOH 100μLとを混和し、室温にて30分静置した。前記混和液に1N塩酸 100μLを添加して中和し、これにさらにアッセイバッファー(組成:50mM リン酸緩衝液(pH7.2)、0.1%ゼラチン、0.1%アジ化ナトリウム)1000μLを添加して希釈した。希釈後の混和液1250μLから100μLを分取し、125Iで標識した既知濃度のビシクロ体PGE−MUMを含むトレーサー溶液(組成:125I標識ビシクロ体PGE−MUM、アッセイバッファー)100μLと混和した。さらに、抗ビシクロ体PGE−MUMウサギ血清溶液(組成:抗血清、アッセイバッファー)100μLを添加し、室温にて2時間静置した。その後、ここに抗ウサギIgG抗体を結合した磁性粒子を含む分離液(組成:0.02%(w/v)抗体結合磁性粒子、アッセイバッファー)を添加し、室温にて15分間静置した。磁性粒子を集磁・洗浄して、磁性粒子に未結合の成分を除去し、残存した(磁性粒子に結合した)125Iをカウントした。検量線を用いて、前記カウントから尿試料中のPGE−MUM値を算出した。検量線は、希釈前の量に換算したとき0、2.05,6.25、18.5、55.5、166.5、500ng/mLのPGE−MUM量に相当するビシクロ体PGE−MUMをそれぞれ含む標準液を、検体と同様に測定し、各標準液について得られたカウントに基づいて作成した。
参考例1と同じボランティア尿検体8例について、下記の方法にてPGE−MUMの測定を行った。尿試料50μLと1N NaOH 100μLとを混和し、室温にて30分静置した。前記混和液に1N塩酸 100μLを添加、混合して中和し、これにさらにRIAアッセイバッファー(組成:9.5mM リン酸水素ナトリウム二水和物、40.5mM リン酸水素二ナトリウム12水和物、ゼラチン、pH7.4)1000μLを添加して希釈した。希釈後の混和液1250μLから10μLを分取し、アルカリホスファターゼ(ALP)標識抗ビシクロ体PGE−MUMマウスモノクローナル抗体を含む標識抗体溶液(組成:ALP標識抗体、50mM Tris、1mM 塩化マグネシウム、0.1mM 塩化亜鉛、スクロース、ゼラチン、pH7.4)50μLと混和し、37℃で8分間反応させた。ここに、ビシクロ体PGE−MUM抗原を結合した磁性粒子を含む磁性粒子液(組成:0.02%(w/v)抗原結合磁性粒子、9.5mM リン酸水素ナトリウム二水和物、40.5mM リン酸水素二ナトリウム12水和物、ゼラチン、pH7.4)50μLを添加し、37℃で8分間反応させた。磁性粒子を集磁・洗浄して、磁性粒子に未結合の成分を除去し、AMPPDを含む基質液(ルミパルス(登録商標)基質液、富士レビオ社製)200μLを添加した。酵素反応による波長417nmの発光量をカウントし、検量線を用いて、前記カウントから尿試料中のPGE−MUM値を算出した。検量線は、0、3、10、50、200ng/mLのPGE−MUM量に相当するビシクロ体PGE−MUMをそれぞれ含む標準液を、検体と同様に測定し、各標準液について得られた発光量に基づいて作成した。本比較例の中和処理より後の工程は、自動分析機器ルミパルスプレストII(登録商標、富士レビオ社製)を用いて行った。
参考例1と同じボランティア尿検体8例について、下記の方法にてPGE−MUMの測定を行った。尿試料10μLと0.3N NaOH 30μLとを混和し、37℃で6.5分間反応させた。ここに、ビシクロ体PGE−MUMを結合した磁性粒子を含む磁性粒子液(組成:0.02%(w/v)抗原結合磁性粒子、219.25mM リン酸水素ナトリウム二水和物、30.75mM リン酸水素二ナトリウム12水和物、50mMトリシン、300mM塩化ナトリウム、ゼラチン、pH5.5)50μLを添加し、さらにALP標識抗ビシクロ体PGE−MUMマウスモノクローナル抗体を含む標識抗体液(組成:ALP標識抗体、50mM Tris、1mM 塩化マグネシウム、0.1mM 塩化亜鉛、スクロース、ゼラチン、pH7.4)50μLを添加し、37℃で16分間反応させた。磁性粒子を集磁・洗浄して、磁性粒子に未結合の成分を除去し、AMPPDを含む基質液(ルミパルス(登録商標)基質液、富士レビオ社製)200μLを添加した。酵素反応による発光量をカウントし、検量線を用いて、前記カウントから尿試料中のPGE−MUM値を算出した。検量線は、0、3、10、50、200ng/mLのPGE−MUM量に相当するビシクロ体PGE−MUMをそれぞれ含む標準液を、検体と同様に測定し、各標準液について得られた発光量に基づいて作成した。本比較例のアルカリ処理以降の工程は、すべて自動分析機器ルミパルスプレストII(登録商標、富士レビオ社製)を用いて行った。
参考例1にて用いたボランティア尿8例と同じ検体について、下記の方法でPGE−MUMを測定した。尿試料10μLと0.3N NaOH 30μLとを混和し、37℃で6.5分間反応させた。ここに、ビシクロ体PGE−MUMを結合した磁性粒子を含む磁性粒子液(組成:0.02%(w/v)抗原結合磁性粒子、219.25mM リン酸水素ナトリウム二水和物、30.75mM リン酸水素二ナトリウム12水和物、50mMトリシン、300mM塩化ナトリウム、5mM 臭化C16アルキルトリメチルアンモニウム(C16TAB)、2mM CHAPS、ゼラチン、pH5.5)50μLを添加し、さらにALP標識抗ビシクロ体PGE−MUMマウスモノクローナル抗体を含む標識抗体液(組成:ALP標識抗体、50mM Tris、1mM 塩化マグネシウム、0.1mM 塩化亜鉛、スクロース、ゼラチン、pH7.4)50μLを添加し、37℃で16分間反応させた。磁性粒子を集磁・洗浄して、磁性粒子に未結合の成分を除去し、AMPPDを含む基質液(ルミパルス(登録商標)基質液、富士レビオ社製)200μLを添加した。酵素反応による発光量をカウントし、検量線を用いて、前記カウントから尿試料中のPGE−MUM値を算出した。
磁性粒子液に、臭化アルキルトリメチルアンモニウム(C12TAB、C14TABまたはC16TAB)、または塩化アルキルトリメチルアンモニウム(C14TAC、C16TACまたはC18TAC)をそれぞれ1mM添加した以外は、比較例2と同様の条件にて、4例の尿検体についてPGE−MUMの測定を行った。各カチオン性物質を添加した磁性粒子液を用いたPGE−MUM測定結果を、表4に示す。いずれもカチオン性物質を添加しない比較例2と比して測定値が低くなる傾向が見られたが、特に、C16TAB、C14TAB、C18TACを用いた場合に、測定値が従来法に近くなる傾向が見られた。
なお、上記カチオン性物質の他に、金属イオン等の無機カチオン性物質や、低分子のカチオン性物質を同程度の濃度で添加して検討を行ったが、C16TABのようにPGE−MUM測定値を低減させる効果は見られなかった(データ示さず)。
尿中夾雑物の影響を回避するためには、有機性のカチオン性物質、特に一定以上の炭素数を有するカチオン性界面活性剤の添加が有効であることが示唆された。
表2の結果において、最も尿中夾雑物の影響回避の効果の大きかったC16TABを用いて、その至適濃度の検討を行った。
表1の尿検体8例について、磁性粒子液にC16TABを1.0、2.0、3.0mMそれぞれ添加した以外は、比較例2と同様にしてPGE−MUMの測定を行った。各測定値を表3に示す。磁性粒子液に添加するC16TABの濃度を高くするほど、測定値が低くなり、従来法に近い値が得られる傾向があることが判明した。一方で、C16TAB濃度を3.0mM超とすることで、溶解しづらく、また、磁性粒子液調製後の時間経過とともにC16TABが析出し、測定系における発光量が低下しやすい、という傾向がみられた(データ示さず)。
磁性粒子液中の陽イオン性界面活性剤(C16TAB)の析出を抑え、より安定的に測定値上昇抑制効果を奏するようにするため、磁性粒子液に他の界面活性剤をさらに添加する検討を行った。
Claims (15)
- 尿中プロスタグランジンE主要代謝物(PGE−MUM)を測定する方法であって、
a)尿検体をアルカリ水溶液と混和する工程と、
b)a)の混和液を、ビシクロ体PGE−MUM又は抗ビシクロ体PGE−MUM抗体を固定化した固相を用いた免疫測定に供して前記尿検体中のPGE−MUMを測定する工程を含み、
前記免疫測定を、弱酸性のベース緩衝液中、塩基性領域で緩衝能を発揮する、前記ベース緩衝液を構成するpH緩衝剤とは異なる第2のpH緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤との存在下で行う、方法。 - 前記ベース緩衝液のpHが4.5〜6.5である請求項1記載の方法。
- 前記第2のpH緩衝剤のpKaが7.0〜10.0である、請求項1又は2記載の方法。
- 前記陽イオン性界面活性剤が、ハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウムである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ハロゲン化アルキルトリメチルアンモニウム中のアルキル基の炭素数が12〜20である請求項4記載の方法。
- 前記固相が粒子であり、該粒子は、前記ベース緩衝液中に浮遊する粒子液の形態にあり、該粒子液が上記陽イオン性界面活性剤及び上記第2のpH緩衝剤を含み、該粒子液と前記a)の混和液とを混和する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記粒子が磁性粒子である請求項6記載の方法。
- 前記粒子液が両性界面活性剤をさらに含む請求項6又は7記載の方法。
- 前記両性界面活性剤のモル濃度が、前記陽イオン界面活性剤のモル濃度を100として10〜90である請求項8記載の方法。
- 前記固相には、ビシクロ体PGE−MUMが固定化され、前記b)工程は、該固相と前記a)の混和液を反応させた後、得られた反応液と、標識抗ビシクロ体PGE−MUM抗体を含む標識液を反応させ、固相を洗浄後、固相に固定化された標識を定量することを含む請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記a)の混和液を中和及び/又は希釈するさらなる工程を含まない請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- ビシクロ体PGE−MUM又は抗ビシクロ体PGE−MUM抗体を固定化した固相と、弱酸性のベース緩衝液中、塩基性領域で緩衝能を発揮する、前記ベース緩衝液を構成するpH緩衝剤とは異なる第2のpH緩衝剤と、陽イオン性界面活性剤とを含む、尿中PGE−MUMの測定キット。
- 前記固相が粒子であり、該粒子は、前記ベース緩衝液中に浮遊する粒子液の形態にあり、該粒子液が上記陽イオン性界面活性剤及び上記第2のpH緩衝剤を含む請求項12記載のキット。
- 前記粒子が磁性粒子である請求項13記載のキット。
- 前記粒子液が両性界面活性剤をさらに含む請求項13又は14記載のキット。
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