JP2017142221A - 酵素含有凍結水溶液 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、体外診断用検査薬のバイオマーカーに用いられる酵素抗原を含有する水溶液を安定的に凍結させることが出来る水溶液を提供することにある。
【解決手段】体外診断用検査薬のバイオマーカー（クレアチンホスホキナーゼ−ＭＢアイソザイム、神経特異エノラーゼ及びレニンなど）の較正物質として用いられる酵素抗原を含有する水溶液に、糖類、好ましくは二糖類と塩化マグネシウムを含有させ、ｐＨを５．０〜９．０の間で調整することにより、凍結時の安定性及び長期間凍結安定性を維持させる。糖類は、スクロース及びラクトースが好ましい。
【選択図】図１

Description

本発明は体外診断用検査薬のバイオマーカーに用いられる酵素抗原を凍結保存する際に、凍結時の安定性及び長期間凍結安定性を維持させるための酵素含有水溶液に関する。

免疫測定は、高い特異性及び感度のために医療診断目的で血清又は尿試料中のタンパク質を検出するのにしばしば使用される。そのような免疫測定には、測定試薬のほかに、患者の試料を定量化するための参照標準として使用される較正物質が必要である。通常この較正物質中に含まれる抗原は希薄であるため、抗原種によっては溶液中で著しく失活する場合がある。特にホルモンや酵素、不溶性タンパク質等の抗原溶液は失活が激しく、水溶液状の校正物質として用いるには困難な場合が多い。このような場合には、凍結乾燥等の方法で水分を除去した形態で保存し、使用時に水を加えて溶解する方法や、牛血清アルブミンや動物血清等のタンパク質を添加して水溶液を凍結し、安定性を確保する方法、さらに５０％グリセロール存在下−２０℃で液状保管して凍結変性を防ぐ方法がとられてきた（例えば、非特許文献１及び２参照）。
しかしながら、凍結乾燥により乾燥した試料は、使用前に緩衝液などで必要な濃度に溶解させる必要があり、溶解させる液量などの誤差により校正物質の濃度への誤差が生じ、患者の試料の定量化の正確性に影響を与える問題があった。また、クレアチンホスホキナーゼ−ＭＢアイソザイムや神経特異エノラーゼのような酵素抗原は、従来の方法では凍結時の安定性を確保することが困難であるという問題があった。また、５０％グリセロール存在下−２０℃で液状保管する方法では、粘度が高くサンプリング精度が低いため校正物質としてそのまま免疫測定に用いることができない問題点があった。

佐々木 實、免疫化学的同定法（第３版）、東京化学同人、１９９３年 水岡 慶二、免疫血清検査マニュアル、講談社サイエンティフィク、１９８６年

本発明の目的は、体外診断用検査薬のバイオマーカーに用いられる酵素抗原を含有する水溶液を安定的に凍結させることが出来る水溶液を提供することにある。

本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、酵素（Ａ０）、糖類（Ｃ）及び塩化マグネシウムを含有し、かつｐＨが５．０〜９．０である凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）；凍結された該酵素含有水溶液を校正物質として測定することを特徴とする免疫測定方法；該酵素（Ａ０）の保存方法 である。

本発明の凍結された酵素含有水溶液により、活性が低下しやすい酵素抗原、特にＣＫ−ＭＢ又はＮＳＥなどの体外診断薬の診断マーカーに用いられる酵素抗原の凍結時の保存安定性が向上し、長期間その活性を持続させることができる。また、使用前に所定濃度の溶解させる操作がないため、較正物質の濃度誤差がなくなり、患者の試料の定量化の正確性を担保できる。

凍結された酵素含有水溶液の安定性と再現性

本発明における酵素（Ａ０）は、通常この分野で用いられる酵素であれば、特に限定はないが、国際生化学連合の酵素委員会によって６つに分類された酵素が挙げられる。酸化還元酵素としては、ペルオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、りんご酸デヒドロゲナーゼ及びスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）などが挙げられる。転移酵素としては、トランスアミナーゼ、リン酸転移酵素、γ−ＧＴＰ及びプロテインキナーゼなどが挙げられる。加水分解酵素としてはアミラーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、キモトリプシン、トリプシン及びアデノシン三リン酸加水分解酵素などが挙げられ。脱離酵素としては、脱炭酸酵素及びアルドラーゼなどが挙げられる。異性化酵素としてはラセマーゼなどが挙げられる。合成酵素としてはリガーゼ、クエン酸合成酵素及びデキストリン合成酵素などが挙げられる。
酵素（Ａ０）を含有する本発明の凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）は酵素保存液等として使用することが出来る。

本発明における酵素抗原（Ａ）は、上記酵素（Ａ０）の中で体外診断用検査薬に用いられるバイオマーカーに用いられる酵素抗原であれば、特に限定されないが、例えば クレアチンホスホキナーゼ−ＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）、癌関連ガラクトース転移酵素（ＧＡＴ）、５’-ＮＰＤ-Ｖ、膵分泌性トリプシンインヒビター（ＰＳＴＩ）、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、マトリックスメタロプロティナーゼ−３（ＭＭＰ−３）、エラスターゼ１、神経特異エノラーゼ（ＮＳＥ）、アルカリ性ホスファターゼ、アミラーゼ、酸性ホスファターゼ，γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）、リパーゼ、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、レニン、プロテインキナーゼ（ＰＫ）、チロシンキナーゼ等の酵素が挙げられる。免疫測定法で測定が可能なＣＫ−ＭＢ、ＭＭＰ−３、エラスターゼ１、レニン及びＮＳＥが好ましく、凍結による酵素の保存安定性が悪く本発明による効果が高いことからＣＫ−ＭＢ及びＮＳＥがさらに好ましい。

本発明の凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）のｐＨは、５．０〜９．０である。
ｐＨが５．０未満またはｐＨが９．０を超える場合は、酵素抗原の最適ｐＨを外れ保存安定性が悪くなる。

本発明における凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）に含有する酵素抗原（Ａ）は１種類を単独に用いても２種類以上を併用することも出来る。

本発明における糖類（Ｃ）としては、単糖類及び二糖類等が挙げられる。単糖類としてはグルコース、ガラクトース、マンノース及びフルクトースが好ましく、二糖類としてはラクトース、スクロース、及びマルトースが好ましい。その中でも、凍結時の酵素の安定性の観点から、二糖類が好ましく、特にスクロース及び／又はラクトースが好ましい。

本発明における凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）に含有させる糖類（Ｃ）は、１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。

本発明における凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）に含有させる糖類（Ｃ）の含有量として、酵素含有水溶液（Ｂ）（２５℃）の重量に対して、好ましくは３〜２５重量％、更に好ましくは４〜２０重量％、特に好ましくは５〜１５重量％である。３重量％以上では凍結時に酵素を安定させる効果があり、２５重量以下であると水溶液の液粘度が高くなく、体外診断用検査薬で測定する際に、サンプリング精度が低下することがない。

本発明における塩化マグネシウムの含有量として、酵素含有水溶液（Ｂ）（２５℃）の重量に対して、好ましくは０．０２〜２．０重量％、更に好ましくは０．０５〜１．０重量％、特に好ましくは０．１〜０．５重量％である。０．０２重量％以上では凍結時に酵素を安定させる効果があり、２．０重量％以下であると体外診断用検査薬で測定する際に、測定値への影響を及ぼさない。

本発明における体外診断薬用検査薬（Ｄ）は、通常この分野で測定されるものであれば特に限定はされず、例えば化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、蛍光酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、ラッテックス光学免疫測定法（ＬＰＩＡ）及びラッテックス粒子計数免疫凝集測定法（ＣＩＡ）に用いられる検査薬が挙げられる。
これらの測定法において、本発明の酵素抗原（Ａ）を含有する酵素含有水溶液（Ｂ）は、解凍して参照標準として使用される較正物質として使用されることが好ましい。

さらに該体外診断薬用検査薬（Ｄ）が化学発光酵素免疫測定法に用いられる検査薬の場合、固相担体としては、通常この分野で測定されるものであれば特に限定はされず、例えばガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性シリカ粒子、マイクロプレート、ラテックス等が代表的なものとして挙げられる。具体的には、例えば特開２０１４−２１０６８０号公報及び特開２０１３−０１９８８９号公報等に記載の公知の磁性シリカ粒子が好ましい。

該体外診断薬用検査薬（Ｄ）における磁性シリカ粒子は、シリカのマトリックス中に平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を有する金属酸化物を分散されているものである。超常磁性とは、外部磁場の存在下で物質の個々の原子磁気モーメントが整列し誘発された一時的な磁場を示し、外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ磁場を示さなくなることをいう。

平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を示す超常磁性金属酸化物としては、鉄、コバルト、ニッケル及びこれらの合金等の酸化物が挙げられるが、磁界に対する感応性が優れていることから、酸化鉄が特に好ましい。超常磁性金属酸化物は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。

磁性シリカ粒子中の超常磁性金属酸化物の含有量の下限は、通常６０重量％、好ましくは６５重量％であり、上限は通常９５重量％、好ましくは８０重量％である。超常磁性金属酸化物の含有量が６０重量％未満の場合、得られた磁性シリカ粒子の磁性が十分でないため、実際の用途面における分離操作に時間がかかり、９５重量％を超えるものは合成が困難である。

凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）の保存方法としては、通常この分野で用いられる方法であれば、特に限定はないが、凍結温度としてはタンパク質分解酵素の作用が停止する−４０℃以下が好ましく、保存機器として一般的に購入可能な超低温フリーザーの庫内温度制御範囲である−５０℃以下がさらに好ましい。凍結容器としては、−４０℃以下の温度でも耐久性のある保管容器であれば、特に限定はないが、例えばクライオチューブ(サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製)、遠沈管（コーニングインターナショナル（株）製）、マイクロチューブ（エッペンドルフ（株）製）、スクリュー管（（株）マルエム製）、ＰＣＲチューブ（日本ジェネティクス（株）製）が挙げられる。凍結期間としては、特に限定はないが、酵素安定性の観点から２年以内が好ましい。
凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）の解凍方法としては、通常この分野で解凍する方法であれば、特に限定はないが、酵素安定性の観点から、氷水または流水で素早く解凍する方法が好ましい。

以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１
酵素含有水溶液の作製
０．１重量％の牛血清アルブミン、０．８５重量％の塩化ナトリウム（和光純薬工業（株）製）、０．５重量％の塩化マグネシウム（和光純薬工業（株）製）及び１０重量％のスクロース（和光純薬工業（株）製）を含有させた０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を調製し、その後ＮＳＥ（ＨＹＴＥＳＴ社製）を１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加、攪拌して水溶液を得た。さらに、得られた水溶液を１．５ｍＬクライオチューブ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）に１ｍＬ移し変えて、超低温フリーザー（型番：ＭＤＦ−Ｕ７００ＶＸＳ６−ＰＪ パナソニックヘルスケアホールディングス（株）製）をもちいて、−８０℃で凍結して１年間保管し酵素含有水溶液（Ｂ１）を得た。また、同操作を繰り返し、酵素含有水溶液（Ｂ１）を１０サンプル得た。

磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製：
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリスチレン瓶に製造した磁性シリカ粒子（商品名：マグラピッド、三洋化成工業（株）製）４０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を５回行った。次いで、この洗浄後の磁性シリカ粒子を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリスチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を１０回行った。更にこの洗浄後の磁性シリカ粒子を抗ＮＳＥモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ社製）１０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）１２０ｍＬの入った蓋付きポリスチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、抗ＮＳＥモノクローナル抗体含有リン酸緩衝液を除去した。次いで、磁性シリカ粒子を１重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１２時間浸漬させたのち、ネオジウム磁石でシリカ粒子を集磁後、１重量％の牛血清アルブミン含有のリン酸緩衝液を除去した。抗ＮＳＥ抗体結合磁性シリカ粒子濃度として０．５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、磁性シリカ粒子を含有する試薬を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。

標識試薬の作製：
抗ＮＳＥモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ社製）、西洋ワサビ由来ＰＯＤ（東洋紡製）を用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ＮＳＥ抗体を調製した。これを０．５重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、ＰＯＤ標識抗ＮＳＥ体濃度として２０ｎＭの濃度に希釈し、標識試薬を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。

化学発光試薬第１液の調製：
ルミノールのナトリウム塩［シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製］０．７ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して化学発光試薬第１液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。

化学発光試薬第２液の調製：
１，０００ｍＬ及び過酸化水素［和光純薬工業（株）製、試薬特級、濃度３０重量％］６．６ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。脱イオン水を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して化学発光試薬第２液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。

実施例２
酵素含有水溶液の作製における１０重量％のスクロースを２０重量％に変更し、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に変更した以外は、実施例１と同様にして酵素含有水溶液（Ｂ２）を得た。

実施例３
酵素含有水溶液の作製における０．５重量％の塩化マグネシウムを０．０２重量％に変更し、０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）に変更した以外は、実施例１と同様にして酵素含有水溶液（Ｂ３）を得た。

実施例４
酵素含有水溶液の作製における０．５重量％の塩化マグネシウムを２．０重量％に変更した以外は、実施例１と同様にして酵素含有水溶液（Ｂ４）を得た。

実施例５
酵素含有水溶液の作製における１０重量％のスクロースを３重量％のスクロース（和光純薬工業（株）製）に変更した以外は、実施例１と同様にして酵素含有水溶液（Ｂ５）を得た。

実施例６
酵素含有水溶液の作製における１０重量％のスクロースを２５重量％のラクトース（和光純薬工業（株）製）に変更した以外は、実施例１と同様にして酵素含有水溶液（Ｂ６）を得た。

実施例７
酵素含有水溶液の作製におけるＮＳＥを１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加をＣＫ−ＭＢを１０ｎｇ／ｍＬに変更した以外は、実施例１と同様にして酵素含有水溶液（Ｂ７）を得た。
また、磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製において、抗ＮＳＥモノクローナル抗体を抗ＣＫ−ＭＢモノクローナル抗体に変更した以外は、実施例１と同様に磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬を得た。
さらに、標識試薬の作製において、抗ＮＳＥモノクローナル抗体を抗ＣＫ−ＭＢモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉｘ社製）に変更した以外は、実施例１と同様に標識試薬を得た。

比較例１
酵素含有水溶液の作製における１０重量％のスクロースからスクロースを抜いた以外は、実施例１と同様にして酵素含有水溶液（Ｈ１）を得た。

比較例２
酵素含有水溶液の作製における０．５重量％の塩化マグネシウムから塩化マグネシウムを抜いた以外は、実施例１と同様にして酵素含有水溶液（Ｈ２）を得た。

比較例３
酵素含有水溶液の作製における０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に変更した以外は、実施例１と同様にして酵素含有水溶液（Ｈ３）を得た。

比較例４
酵素含有水溶液作製における超低温フリーザーをもちいて、−８０℃で凍結して１年間保管を、冷蔵庫を用いて４℃で１年間保管に変更する以外は、実施例１と同様にして酵素含有水溶液（Ｈ４）を得た。

比較例５
酵素含有水溶液作製における水溶液を凍結乾燥用５ｍＬバイアル瓶（ＥＹＥＬＡ東京理化器械（株）製）に２ｍＬ移し変え、凍結乾燥機を用いて凍結乾燥を行いゴム栓及びアルミキャップして１年間４℃保管し、酵素含有凍結乾燥サンプル（Ｈ５）を得た。

得られた試薬（Ｂ１）〜（Ｂ６）、及び（Ｈ１）〜（Ｈ４）を用いて、以下の方法により免疫測定における酵素の凍結安定性を評価した。凍結安定性の結果を表１、図１に示す。

＜本発明の酵素含有水溶液の酵素凍結安定性評価方法＞
（１）実施例１〜６で得られた凍結された酵素含有水溶液（Ｂ１）〜（Ｂ６）、比較例１〜４で得られた比較酵素含有水溶液（Ｈ１）〜（Ｈ４）
凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）を氷水中で解凍し、転倒攪拌にて混合して水溶液を得た。ただし、比較例４ではこの操作は不要である。
得られた水溶液０．０２５ｍＬと磁性シリカ粒子を含有する試薬０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＮＳＥ抗体結合磁性シリカ粒子／ＮＳＥ複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。

続いて、０．５重量％の牛血清アルブミン含有した標識試薬０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＮＳＥ抗体結合磁性シリカ粒子／ＮＳＥ／ＰＯＤ標識抗ＮＳＥ抗体複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、化学発光試薬第１液０．０７ｍＬと化学発光試薬第２液０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、化学発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン社製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。

（２）実施例７で得られた凍結された酵素含有水溶液（Ｂ７）

酵素含有水溶液（Ｂ７）０．０２５ｍＬと磁性シリカ粒子を含有する試薬０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＫ−ＭＢ抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＫ−ＭＢ複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。

続いて、０．５重量％の牛血清アルブミン含有した標識試薬０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＫ−ＭＢ抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＫ−ＭＢ／ＰＯＤ標識抗ＣＫ−ＭＢ抗体複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、化学発光試薬第１液０．０７ｍＬと化学発光試薬第２液０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、化学発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン社製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。

（３）比較例５で得られた比較酵素含有水溶液（Ｈ５）
酵素含有凍結乾燥サンプル（Ｈ７）のアルミキャップ及びゴム栓を外し、イオン交換水２ｍＬをバイアル瓶に加えて、室温で１５分静置保管し、その後転倒攪拌を１０回繰り返して水溶液とした。得られた水溶液は酵素含有水溶液（Ｂ１）と同様に測定した。
安定性の結果を表１、図１に示す。

安定性については、ＮＳＥ及びＣＫ−ＭＢの標準品を用いて免疫測定を行い、得られた測定結果を検量線として、濃度値を算出した。得られた濃度値（Ｘ１）と理論値（Ｘ２）から以下の計算式で安定率を算出した。濃度値（Ｘ１）は実際に測定によって算出された濃度値を示し、理論値（Ｘ２）は酵素含有水溶液を作製したときのＮＳＥ及びＣＫ-ＭＢそれぞれの濃度を示す。具体的にはＮＳＥの場合は１０ｎｇ／ｍＬ、ＣＫ−ＭＢの場合は１０ｎｇ／ｍＬを示す。
安定率（％）＝（Ｘ１／Ｘ２）×１００

＜本発明の酵素含有水溶液の再現性評価方法＞
得られた試薬（Ｂ１）〜（Ｂ７）、及び（Ｈ１）〜（Ｈ５）を用いて、以下の方法により免疫測定における酵素含有水溶液の再現性を評価した。再現性の結果を表１、図１に示す。
酵素含有水溶液作製における酵素含有水溶液１０サンプルを酵素凍結安定性評価方法と同じ方法で免疫測定を行い、１０サンプルの平均濃度値（Ｘ３）と標準偏差（Ｘ４）から以下の計算式で変動係数（ＣＶ）を算出した。
ＣＶ（％）＝（Ｘ４／Ｘ３）×１００

表１及び図１より本発明の酵素含有水溶液は、比較用の酵素含有水溶液を用いた場合に比べて、安定率が９０％以上を示し、本発明の酵素含有水溶液は凍結時の安定性が向上していることを示す。
また、本発明の酵素含有水溶液は、比較用の酵素含有水溶液を用いた場合に比べて、ＣＶが３．０％以下を示し、再現性が優れていることから、本発明の酵素含有水溶液を用いた測定における正確性が向上していることを示す。

本発明の酵素含有水溶液は、酵素抗原の凍結時の安定性が優れ、測定値の正確性且つ操作簡便性が向上できることから、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法及び化学発光免疫測定法等の臨床検査の較正物質や、酵素の凍結保管水溶液として幅広く適用できる。また、長期にわたり酵素を安定的に凍結保管することかできる。

Claims (10)

1. 酵素（Ａ０）、糖類（Ｃ）及び塩化マグネシウムを含有し、かつｐＨが５．０〜９．０である凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）。
2. 糖類（Ｃ）が、二糖類（Ｃ１）である請求項１に記載の酵素含有水溶液（Ｂ）。
3. 二糖類（Ｃ１）が、スクロース及び／又はラクトースである請求項２に記載の酵素含有水溶液（Ｂ）。
4. 糖類（Ｃ）の含有量が、凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）の重量に対して３〜２５重量％である請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵素含有水溶液（Ｂ）。
5. 塩化マグネシウムの含有量が、凍結された酵素含有水溶液（Ｂ）の重量に対して０．０２〜２．０重量％である請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵素含有水溶液（Ｂ）。
6. 酵素（Ａ０）が酵素抗原（Ａ）であって、体外診断用検査薬（Ｄ）に用いられる請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵素含有水溶液（Ｂ）。
7. 酵素抗原（Ａ）が、クレアチンホスホキナーゼ−ＭＢアイソザイム、マトリックスメタロプロティナーゼ−３、エラスターゼ１、レニン及び神経特異エノラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種のタンパクである請求項６に記載の酵素含有水溶液（Ｂ）。
8. 請求項６又は７に記載の凍結された酵素含有水溶液を校正物質として測定することを特徴とする免疫測定方法。
9. 酵素（Ａ０）を、糖類（Ｃ）及び塩化マグネシウムを含有し、かつｐＨが５．０〜９．０である凍結された水溶液（Ｅ）中で保存する、酵素（Ａ０）の保存方法。
10. −４０℃以下で保存する、請求項９に記載の保存方法。