JP2017141209A

JP2017141209A - 皮膚外用剤

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Publication number: JP2017141209A
Application number: JP2016024824A
Authority: JP
Inventors: 勝規久下; Katsunori Kuge; 聖加畑中; Kiyoka Hatanaka; 詩理萬本; Utari Manmoto; 誠治篠原; Seiji Shinohara; 茂久藤原; Shigehisa Fujiwara; 濱田　和彦; Kazuhiko Hamada; 和彦濱田
Original assignee: Pias Corp
Current assignee: Pias Corp
Priority date: 2016-02-12
Filing date: 2016-02-12
Publication date: 2017-08-17
Anticipated expiration: 2036-02-12
Also published as: JP6908968B2

Abstract

【課題】糖化による老化を防ぎ、皮膚のしわやくすみをより有効に改善する皮膚外用剤を提供する。【解決手段】本発明の皮膚外用剤は、ＡＧＥｓ（Ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃａｔｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）の架橋形成を抑制する成分を含む。ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分は、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅である。【選択図】なし

Description

本発明は、皮膚外用剤に関し、特に、皮膚の老化を防ぐ成分を含む皮膚外用剤に関する。

近年、糖化が、糖尿病をはじめとする様々な疾患の原因であると言われている。糖化とは、身体の中でタンパク質と余分な糖が結合してタンパク質が変性、劣化する現象のことをいい、糖化反応が進むと、最終的にＡＧＥｓ（Ａｄｖａｎｃｅｄｇｌｙｃａｔｉｏｎｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ）という老化物質が生成される（ＡＧＥｓの生成）。

また、ＡＧＥｓは、ＡＧＥｓ同士、或いはＡＧＥｓと生体タンパク質との間に、架橋を形成する（ＡＧＥｓの架橋形成）。そして、架橋形成されたＡＧＥｓは凝集し、分解されにくくなる（ＡＧＥｓの分解抑制）。

特に、皮膚への影響として、皮膚組織を構成するタンパク質であるケラチン、コラーゲン、エラスチン等の糖化が、皮膚の老化（しわ、くすみ等）の原因となっている。したがって、糖化による皮膚の老化を防ぐための成分（抗糖化成分）を含む皮膚外用剤を開発することが重要である。

抗糖化成分を含む皮膚外用剤が、広く使用されている。そのような皮膚外用剤は、例えば、特開２００３‐２１２７４９号明細書（特許文献１）及び特開２０１１‐２４６３５３号明細書（特許文献２）に開示されている。

特許文献１には、ＡＧＥｓ生成抑制剤及びそれを含有する皮膚外用剤が開示されている。より具体的には、特許文献１では、ボタン属植物抽出物、タツナミソウ属植物抽出物、セイヨウヤマハッカ属植物抽出物等の１種又は２種以上の成分からなるＡＧＥｓ生成抑制剤が開示されている。

また、ボタン属（ＰａｅｏｎｉａＬ．）植物として、ボタン（ＰａｅｏｎｉａｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａＡｎｄｒ．）及びシャクヤク（ＰａｅｏｎｉａｌａｃｔｉｆｌｏｒａＰａｌｌ．）が、好ましい例として例示されている。

また、特許文献２には、美白用化粧料などの皮膚外用剤に好適なＡＧＥｓ分解剤が開示されている。より具体的には、特許文献２では、ＡＧＥｓ分解剤には、生成されたＡＧＥｓを分解する作用を有する成分に加え、ＡＧＥｓの生成を抑制する作用を有する成分も包含される。ＡＧＥｓ分解剤は、例えば、ＡＧＥｓのα−ジケトンのＣ−Ｃ結合（架橋形成）を切断する成分として記載されている。ＡＧＥｓ分解剤として、モクセイ科オリ−ブ属、ユキノシタ科ユキノシタ属、バラ科ポテンチラ属等の植物が例示されている。

特開２００３‐２１２７４９号公報特開２０１１‐２４６３５３号公報

上記特許文献１及び特許文献２では、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分、ＡＧＥｓの架橋を切断する成分について記載されている。しかしながら、上記特許文献１及び特許文献２では、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分についての開示乃至示唆が全くない。したがって、上記特許文献１及び特許文献２では、糖化による老化を防ぐための成分（抗糖化成分）としては不十分であり、ＡＧＥｓの架橋形成の抑制を可能とする成分の開発が望まれる。

そこで、発明者らは、斯かる実情に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、ＡＧＥｓの架橋形成の抑制を可能とする成分に関する新たな知見を得た。本発明は、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分を含むことで、糖化による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善する皮膚外用剤を提供することを目的とする。

本発明の皮膚外用剤は、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分を含むことを特徴とする。

上記構成の皮膚外用剤によれば、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分を含むため、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分が、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制することにより、ＡＧＥｓを分解されやすくし、糖化（ＡＧＥｓの架橋形成）による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善することができる。

本発明の一態様として、前記ＡＧＥｓの前記架橋形成を抑制する成分は、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅、が好ましい。

上記構成の皮膚外用剤によれば、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分は、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅であるため、これらの成分がＡＧＥｓの架橋形成を抑制することにより、ＡＧＥｓが分解されやすくなり、糖化（ＡＧＥｓの架橋形成）による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善することができる。

本発明の他態様として、前記ＡＧＥｓの生成を抑制する成分をさらに含む、のが好ましい。

上記構成の皮膚外用剤によれば、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分をさらに含むため、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分が、ＡＧＥｓの生成の増加による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善することができる。

本発明のさらに他の態様として、前記ＡＧＥｓの前記架橋を切断する成分をさらに含む、のが好ましい。

上記構成の皮膚外用剤によれば、ＡＧＥｓの架橋を切断する成分をさらに含むため、ＡＧＥｓの架橋が形成された場合でも、ＡＧＥｓの架橋を切断する成分によってＡＧＥｓの架橋が切断され、ＡＧＥｓが分解されやすくなることで、ＡＧＥｓの架橋形成の増加（ＡＧＥｓの分解抑制）による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善することができる。

本発明のさらに別の態様として、前記ＡＧＥｓの前記生成を抑制する成分は、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つである、のが好ましい。

上記構成の皮膚外用剤によれば、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分は、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つであるため、これらの成分の何れか一つが、ＡＧＥｓの生成を抑制することにより、ＡＧＥｓの生成の増加による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善することができる。

本発明のさらに別の態様として、前記ＡＧＥｓの前記架橋を切断する成分は、シャクヤク根エキスを含む、のが好ましい。

上記構成の皮膚外用剤によれば、ＡＧＥｓの前記架橋を切断する成分は、シャクヤク根エキスを含むため、ＡＧＥｓの架橋が形成された場合でも、シャクヤク根エキスによってＡＧＥｓの架橋が切断され、ＡＧＥｓが分解されやすくなり、ＡＧＥｓの架橋形成の増加（ＡＧＥｓの分解抑制）による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善することができる。

本発明のさらに別の態様として、前記ＡＧＥｓの前記架橋形成を抑制する成分として、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅、前記ＡＧＥｓの前記生成を抑制する成分として、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つと、を含む、のが好ましい。

上記構成の皮膚外用剤によれば、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅によって、ＡＧＥｓの架橋形成が抑制されるとともに、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つによって、ＡＧＥｓの生成が抑制され、糖化（ＡＧＥｓの架橋形成及びＡＧＥｓの生成）による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善することができる。

本発明のさらに別の態様として、前記ＡＧＥｓの前記架橋形成を抑制する成分として、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅、前記ＡＧＥｓの前記生成を抑制する成分として、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つと、前記ＡＧＥｓの前記架橋を切断する成分として、シャクヤク根エキスと、を含む、のが好ましい。

上記構成の皮膚外用剤によれば、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅によって、ＡＧＥｓの架橋形成が抑制されるとともに、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つによって、ＡＧＥｓの生成が抑制され、かつシャクヤク根エキスによってＡＧＥｓの架橋が切断されることで、糖化（ＡＧＥｓの架橋形成、ＡＧＥｓの生成及びＡＧＥｓの分解抑制）による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをさらにより有効に改善することができる。

以上のように、本発明によれば、糖化による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善する皮膚外用剤を提供することができる、といった優れた効果を奏し得る。

以下、本発明の一実施形態に係る皮膚外用剤について、詳細に説明する。

本実施形態に係る皮膚外用剤は、糖化による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善するためのものである。

発明者らは、上述のように、ＡＧＥｓの架橋形成の抑制を可能とする成分に関する新たな知見を得た。そこで、発明者らは、抗糖化のメカニズムについて、新規の抗糖化理論を構築した。より具体的には、発明者らは、抗糖化のメカニズムを、大きく３つのステップに分類し、各ステップにおける成分の考察を行った。すなわち、抗糖化のメカニズムは、以下のステップに分類される。

ステップ（Ａ）…ＡＧＥｓの生成を抑制する。

ステップ（Ｂ）…ＡＧＥｓ同士、又はＡＧＥｓとタンパク質との間の架橋形成を抑制する。

ステップ（Ｃ）…生成したＡＧＥｓ同士、又はＡＧＥｓとタンパク質との間の架橋を切断する。

そして、皮膚の抗糖化における３つのステップに関連する成分（ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分、ＡＧＥｓの架橋を切断する成分）を含むことで、糖化による老化を防ぎ、皮膚のしわやくすみが、より一層有効に改善されるようになる。

本実施形態に係る皮膚外用剤は、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分を含む（ステップ（Ｂ））。

本実施形態において、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分は、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅である。

より具体的には、本実施形態に係る皮膚外用剤において、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分として、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅を有効成分として含むＳＥＰＩＴＯＮＩＣＭ３（ＳＥＰＰＩＣ社製）、が用いられる。製品のメーカー名及び成分を、以下の表１に示す。なお、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分のスクリーニング実験の結果については、後述する。

ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分を有効成分として含む製品の中で、ＳＥＰＩＴＯＮＩＣＭ３が、細胞死や炎症、異常なコラーゲン・エラスチンの蓄積を引き起こすＲＡＧＥ（ＡＧＥｓのレセプター）を、無害的に、ＡＧＥｓと結合可能なｓＲＡＧＥ（ｓｏｌｕｂｌｅＲＡＧＥ）へと変換し、ｓＲＡＧＥの産生を促進することを見出した。

ＲＡＧＥは、種々の細胞に存在し、細胞膜の表面に存在する膜貫通型レセプターである。ＡＧＥｓは、細胞膜の表面に存在するＲＡＧＥの膜外領域に結合し、ＲＡＧＥを介して細胞内に様々な情報を伝達する。

ＳＥＰＩＴＯＮＩＣＭ３が、ＲＡＧＥの膜外領域を切断することで、ｓＲＡＧＥが生成される。そして、生成されたｓＲＡＧＥが、ＡＧＥｓに結合することで、ＡＧＥｓ同士又はＡＧＥｓとタンパク質との間の架橋形成が抑制されると考えられる。

本実施形態に係る皮膚外用剤は、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分をさらに含む（ステップ（Ａ））。

本実施形態において、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分は、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つである。

より具体的には、本実施形態に係る皮膚外用剤において、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分を含むものとして、ペカン殻エキスを有効成分として含むピーカンナッツエキスＢＧ（日油社製）及びラッカセイ種皮エキスを有効成分として含むナッツピールエキス（片倉チッカリン社製）が用いられる。各製品のメーカー名及び成分を、以下の表２に示す。なお、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分のスクリーニング実験の結果については、後述する。

本実施形態に係る皮膚外用剤は、ＡＧＥｓの架橋を切断する成分をさらに含む（ステップ（Ｃ））。

本実施形態において、ＡＧＥｓの架橋を切断する成分は、シャクヤク根エキスを含む。

より具体的には、本実施形態に係る皮膚外用剤において、ＡＧＥｓの架橋を切断する成分を含むものとして、シャクヤク根エキスを有効成分として含むシャクヤクリキッド（一丸ファルコス社製）が用いられる。製品のメーカー名及び成分を、以下の表３に示す。なお、ＡＧＥｓの架橋を切断する成分のスクリーニング実験の結果については、後述する。

本実施形態において、シャクヤクリキッドは、生成したＡＧＥｓ同士、又はＡＧＥｓとタンパク質との間の架橋を切断すると考えられる。

或いは、本実施形態において、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分として、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅、ＡＧＥｓの架橋を切断する成分として、シャクヤク根エキス、を含むことも可能である。

次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜（１）ＡＧＥｓの生成を抑制する成分について＞

［ＡＧＥｓの生成を抑制する成分のスクリーニング］
（スクリーニング方法）
まず、以下のようにして、スクリーニング対象のそれぞれについて、グルコース添加溶液を作製した。より具体的には、４ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（和光純薬工業社製）１００μｌ、１００μＭリン酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）２５０μｌ、精製水９０μｌの混合溶液中に、スクリーニング対象を、それぞれ、終濃度が２％になるように添加後、２Ｍグルコース（和光純薬工業社製）５０μｌを加えた。次に、作製したグルコース添加溶液を６０℃で２４時間反応させることで糖化処理を施した。各反応液１００μｌに、トリクロロ酢酸（和光純薬工業社製）を１０μｌ加えて撹拌し、生じた沈殿を分取した後、アルカリ性リン酸緩衝液（和光純薬工業社製）にて溶解させ、溶解液の蛍光強度を、ＰｏｗｅｒＳｃａｎＨＴ（大日本住友製薬社製）を用いて、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍの波長で測定した。

なお、本スクリーニングでは、ＡＧＥｓ量の指標として、蛍光ＡＧＥｓであるＦＦＩ（２‐（２‐ｆｕｒｏｙｌ）‐４（５）‐（２‐ｆｕｒａｎｙｌ）‐１Ｈ‐ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）量を評価した。ＰｏｗｅｒＳｃａｎＨＴによって得られたＦＦＩの蛍光強度から、ＦＦＩ生成阻害率を算出した（糖化阻害率）。糖化阻害率はスクリーニング対象を添加せずに糖化反応を行った検体（陽性対照）を０％とする。また、スクリーニング対象そのものによる蛍光吸収（クエンチング効果）の影響を除くため、陽性対照の糖化反応溶液９８μｌにスクリーニング対象２μｌを添加したクエンチング評価用検体のＦＦＩ量を測定することで、クエンチング率を算出した。そして、ＦＦＩ生成阻害率からクエンチング率を減算することにより、これを真のグリケーション阻害率とした。

（スクリーニング結果（ＡＧＥｓ生成抑制率））
上述の方法を用いて、スクリーニング実験を行った。結果を表４に示す。

鋭意検討の結果、スクリーニング対象の中で、ピーカンナッツエキスＢＧ（日油社製）、ナッツピールエキス（片倉チッカリン社製）が、５０％以上の抑制率（それぞれ、約６９％、約５０％）を示した。

また、上述の５０％以上のＡＧＥｓ生成抑制率を示す２つの成分中の有効成分について、共通する成分がないか、考察を行ったところ、ピーカンナッツエキスＢＧ（日油社製）：有効成分（ペカン殻エキス）及びナッツピールエキス（片倉チッカリン社製）：有効成分（ラッカセイ種皮エキス）の間に、共通する成分はなかった。

したがって、ペカン殻エキス又はラッカセイ種皮エキスのそれぞれが、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分としての作用を有するものと考えられる。
＜（２）ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分について＞

［ｓＲＡＧＥのＡＧＥｓ架橋形成抑制作用評価試験（コラーゲンゲル収縮活性実験）］
（コラーゲンゲルの作製）
具体的には、コラーゲンゲル培養キット（新田ゼラチン社製）を用いて、１２ウェルマイクロプレートに、コラーゲンゲルを作製した。次に、作製した各コラーゲンゲルに、１００ｍＭグルコース６リン酸（Ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ社製）７００μｌと、２００μｇ／ｍｌｓＲＡＧＥ６３μｌを添加し、３７℃で１０〜１４日間、反応させた。
（コラーゲンゲルの面積の測定）
反応後、作製したコラーゲンゲルをＰＢＳ（−）で洗浄し、コラーゲンゲルに正常ヒト胎児皮膚由来線維芽細胞を４．５×１０^４個／ｗｅｌｌで播種した。１時間後に、コラーゲンゲルを各ウェルから切り離し、さらに２時間後に各コラーゲンゲルの面積を測定した。対照群（グルコース６リン酸無添加）のコラーゲンゲルの収縮活性を１００％として、各コラーゲンゲルの収縮活性を得た。結果を表５に示す。

（コラーゲンゲルの面積の測定結果）
表５に示すように、対照群に比し、グルコース６リン酸を添加したコラーゲンゲルでは、収縮活性が、約７８％にまで低下した。一方、グルコース６リン酸及びｓＲＡＧＥを添加したコラーゲンゲルでは、対照群に比し、約９５％までの低下に抑えた。

以上の結果から、ｓＲＡＧＥを添加したコラーゲンゲルにおいて、添加されたｓＲＡＧＥが、ＡＧＥｓに結合することで、ＡＧＥｓによるコラーゲンの架橋形成及び構造異常をブロックし、良好なコラーゲンゲル収縮活性が得られたものと考えられる。

［ＡＧＥｓ化エラスチンに対するｓＲＡＧＥのリゾチーム結合抑制実験］
エラスチン中でＡＧＥｓが生成されると、ＡＧＥｓ化したエラスチンがリゾチームと結合しやすくなり、エラスチン分解酵素の影響を受けにくくなる。その結果、エラスチンは異常凝集して皮膚に沈着することが知られている（ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ．２０１２Ｆｅｂ；１３２（２）：３１５−２３）。発明者らは、ＡＧＥｓ化したエラスチンにｓＲＡＧＥを作用させることによって、ＡＧＥｓとリゾチームの結合が抑制されるのではないかと考察した。そこで、以下の実験方法に従って、ＡＧＥｓ化エラスチンに対するｓＲＡＧＥのリゾチーム結合抑制効果について検証した。結果を表６に示す。

（実験方法）
ＡＧＥｓ化エラスチンに対するｓＲＡＧＥのリゾチーム結合抑制実験の実験プロトコールは、以下の通りである。

２ｍｇ／ｍｌ可溶性エラスチン（和光純薬工業社製）を９６ｗｅｌｌＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に１００μｌ添加し、４℃で一晩反応させ、プレートにエラスチンを固定化させた。余分な溶液を除去後、０．２Ｍリボース（東京化成工業社製）を１００μｌ添加し、３７℃で２週間反応させることでＡＧＥｓ化エラスチンを作製した。２週間後にリボースを除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、ｓＲＡＧＥを１０μｇ、もしくは２０μｇ添加し、室温で１時間反応させた。ｓＲＡＧＥを除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄後にリゾチーム１０μｇを室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、リゾチーム抗体（ＡｂＤＳｅｒｏｔｅｃ社製）を室温で１時間、一次抗体反応を行った。ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＧｏａｔａｎｔｉｍｏｕｓｅＩｇＧを室温で１時間、二次抗体反応を行った。さらに、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、発色試薬であるＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ社製）を３０分間反応させ、２Ｎ硫酸（和光純薬工業社製）で反応を停止させた。Ａ４５０／Ａ６３０で吸光度を測定し、評価した。

（実験結果）
ｓＲＡＧＥ無添加（対照群）に比し、ｓＲＡＧＥを１０μｇ添加したものでは、リゾチーム結合量が８３％に抑制された。さらに、ｓＲＡＧＥを２０μｇ添加したものでは、７５％に抑制された。

以上の結果から、ｓＲＡＧＥがＡＧＥｓに結合することで、エラスチン中のＡＧＥｓとリゾチームの結合が抑制されることが示された。ＡＧＥｓ化エラスチンは、ｓＲＡＧＥによってリゾチームの影響を受けることなく、分解酵素によって正常に代謝され、その結果として、エラスチンの異常凝集による皮膚の弾力低下が抑制されると考えられる。

［ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分（ｓＲＡＧＥ産生促進成分）のスクリーニング］
（スクリーニング方法）
１．マウス胎仔由来線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）の培養
マウス胎仔由来線維芽細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）をＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて培養した。
２．培養上清中のｓＲＡＧＥ量の測定
上述のＤＭＥＭ培地中の培養細胞を、トリプシン処理により回収した後、９６ウェルマイクロプレートに３×１０^３個／ｗｅｌｌで播種し、ＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。続いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）及びＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ＲＡＧＥプラスミド（ＨＭＧＢｉｏｔｅｃｈ社製）とｐｍａｘＧＦＰプラスミド（Ｌｏｎｚａ社製）を同時にトランスフェクションし、５時間インキュベートした。その後、培地をＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。各スクリーニング対象を、所定の濃度０．０５〜０．１％で添加し、２４時間培養した後、培養上清を回収し、上記で得られた培養上清中のｓＲＡＧＥ量を、ＨｕｍａｎＲＡＧＥＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡＫｉｔ（Ｒ＆Ｄ社製）を用いて、測定した。なお、ｓＲＡＧＥ量は、細胞内のＧＦＰ量で補正した値を示した。結果を表７に示す。

（ｓＲＡＧＥ産生促進成分のスクリーニング結果（ｓＲＡＧＥ産生促進効果））
鋭意検討した結果、スクリーニング対象の中で、ＳＥＰＩＴＯＮＩＣＭ３（ＳＥＰＰＩＣ社製）（約１７５％）において、顕著なｓＲＡＧＥ産生促進効果が認められた。
＜（３）ＡＧＥｓの架橋を切断する成分について＞

［ＡＧＥｓの架橋を切断する成分のスクリーニング］
（コラーゲンゲルの作製）
まず、コラーゲンゲル培養キット（新田ゼラチン社製）を用いて、１２ウェルマイクロプレートにコラーゲンゲルを作製した。次に、作製したコラーゲンゲルに１００ｍＭグルコース６リン酸（Ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ社製）７００μｌを添加し、３７℃で３０日間、反応させ、糖化コラーゲンゲルを作製した。

（コラーゲンゲルの面積の測定）
３０日後、作製したコラーゲンゲルをＰＢＳ（−）で洗浄した。そして、スクリーニング対象を所定の濃度１％添加し、３７℃で３日間、反応させた。３日後、スクリーニング対象を除去し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、正常ヒト胎児皮膚由来線維芽細胞を４．５×１０^４個／ｗｅｌｌで播種した。１時間後に、コラーゲンゲルを各ウェルから切り離し、さらに２時間後に各コラーゲンゲルの面積を測定した。対照群（グルコース６リン酸無添加）のコラーゲンゲルの収縮活性を１００％として、各コラーゲンゲル収縮活性を得た。結果を表８に示す。

（コラーゲンゲルの面積の測定結果）
表８に示すように、鋭意検討した結果、シャクヤクリキッド（一丸ファルコス社製）（約９６％）に顕著なコラーゲンゲル収縮活性改善効果が認められた。対照群に比し、グルコース６リン酸を添加したコラーゲンゲルでは、収縮活性が、約７９％にまで低下した。それに対して、さらにシャクヤクリキッドを添加したコラーゲンゲルでは、対照群に比し、約９６％までの低下に抑えた。

以上の結果から、表８に示すように、グルコース６リン酸で糖化したコラーゲンゲルにシャクヤクリキッドを添加すると、添加されたシャクヤクリキッドが、生成したＡＧＥｓ同士、又はＡＧＥｓとタンパク質との間の架橋を切断し、良好なコラーゲンゲル収縮活性が得られたものと考えられる。

［シャクヤクリキッドとｓＲＡＧＥ（ＳＥＰＩＴＯＮＩＣＭ３）の併用効果実験］
上述のように、ＳＥＰＩＴＯＮＩＣＭ３（ＳＥＰＰＩＣ社製）において、顕著なｓＲＡＧＥ産生促進効果が認められた。すなわち、この成分が、ＲＡＧＥをｓＲＡＧＥへと変換し、ｓＲＡＧＥの産生を促進することで、産生されたｓＲＡＧＥが、ＡＧＥｓに結合して、ＡＧＥｓ同士又はＡＧＥｓとタンパク質との架橋形成を抑制することが分かった。

また、上述のように、シャクヤクリキッドが、生成したＡＧＥｓ同士、又はＡＧＥｓとタンパク質との架橋を切断し、良好なコラーゲンゲル収縮活性が認められた。

そこで、発明者らは、シャクヤクリキッドがＡＧＥｓの架橋を切断するとともに、ＳＥＰＩＴＯＮＩＣＭ３がＲＡＧＥからｓＲＡＧＥの産生を促進することで、ＡＧＥｓの再架橋を防止できるかを確かめるために、シャクヤクリキッドとｓＲＡＧＥの併用効果を、コラーゲンゲル収縮活性実験により行った。

（コラーゲンゲル収縮活性実験）
より具体的には、上記と同様の方法によって、コラーゲンゲルを作製し、シャクヤクリキッドとｓＲＡＧＥの併用効果実験に用いた。各コラーゲンゲルに、表９の下に記載の（１）〜（６）の処理を行った。結果を表９に示す。

（１）ＰＢＳ（−）処理（対照群）
（２）グルコース６リン酸で処理（糖化処理）
（３）糖化処理した（２）のゲルをシャクヤクリキッドで処理
（４）（３）のゲルからシャクヤクリキッドを除去後、ＰＢＳで処理
（５）（３）のゲルからシャクヤクリキッドを除去後、再度、グルコース６リン酸で処理（再糖化処理）
（６）（３）のゲルからシャクヤクリキッドを除去後、ｓＲＡＧＥ及びグルコース６リン酸で処理
（コラーゲンゲル収縮活性実験結果）
表９に示すように、（１）の処理を施した対照群に比し、（２）のように糖化処理を行うと、収縮活性が５４％にまで低下した。さらに、（３）のように糖化処理したゲルをシャクヤクリキッドで処理することにより、収縮活性が約６８％までの低下に抑えられた。

また、（４）のように、シャクヤクリキッドを添加したコラーゲンゲルからシャクヤクリキッドを除去し、ＰＢＳ（−）で置換した場合、置換４日後においてもコラーゲンゲル収縮活性が維持された。

（５）のように、シャクヤクリキッドによりＡＧＥｓ架橋を切断後、グルコース６リン酸によって再糖化処理を施すと、コラーゲンゲル収縮活性が約６８％から５２％に低下した。一方で、（６）のように、再糖化処理の際にｓＲＡＧＥを添加しておくことによって、コラーゲンゲル収縮活性は約６０％の低下までに抑えられた。

以上の結果から、表９に示すように、前記シャクヤクリキッドのＡＧＥｓの架橋切断作用とｓＲＡＧＥを併用することによって、ＡＧＥｓの再架橋を防止することができ、良好なコラーゲン収縮活性を得ることが認められた。このことから、シャクヤクリキッドと前記ｓＲＡＧＥの産生を促進するＳＥＰＩＴＯＮＩＣＭ３を併用することで、生体タンパク質中のＡＧＥｓ架橋を切断し、ｓＲＡＧＥの効果によってＡＧＥｓ同士、もしくはＡＧＥｓとタンパク質が再架橋することを防ぐことができると考えられる。

以上のように、本実施形態に係る皮膚外用剤によれば、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅が、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制することにより、ＡＧＥｓが分解されやすくなり、ＡＧＥｓの架橋形成による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善することができる。

また、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つが、ＡＧＥｓの生成を抑制することにより、ＡＧＥｓの生成の増加による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善することができる。

また、ＡＧＥｓの架橋が形成された場合でも、シャクヤク根エキスによってＡＧＥｓの架橋が切断されるが、老化した皮膚内では余分な糖が常に存在している状態であり、ＡＧＥｓの再架橋が起こる。シャクヤク根エキスとアスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅の併用により、ＡＧＥｓの架橋を切断するとともに、ＡＧＥｓの再架橋を防止し、ＡＧＥｓが分解されやすくなり、ＡＧＥｓの架橋形成の増加（ＡＧＥｓの分解抑制）による皮膚の老化を防ぎ、しわやくすみをより有効に改善することができる。

尚、本発明の皮膚外用剤は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で適宜変更し得ることは勿論のことである。

上記実施形態において、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分として、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分として、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つと、を含むことも可能である。

或いは、上記実施形態において、ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分として、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅、ＡＧＥｓの生成を抑制する成分として、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つと、ＡＧＥｓの架橋を切断する成分として、シャクヤク根エキスと、を含むことも可能である。

なお、本実施形態に係る皮膚外用剤の形態は、特に限定されるものではなく、一般の皮膚外用剤及び化粧品等において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。

例えば、皮膚外用剤の形態は、液状、ジェル状、乳液状、クリーム状、軟膏状、半固形状、オイルジェル状、及びシート状等の剤型とすることができる。また、本実施形態に係る皮膚外用剤の剤型に応じて、例えば、オイル、色素、防腐剤、界面活性剤、香料、顔料等を適宜配合することができる。

本発明の皮膚外用剤は、糖化による皮膚のしわやくすみをより有効に改善する皮膚外用剤に有効に利用される。

Claims

ＡＧＥｓの架橋形成を抑制する成分を含むことを特徴とする、皮膚外用剤。
前記ＡＧＥｓの前記架橋形成を抑制する成分は、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅である、請求項１に記載の皮膚外用剤。
前記ＡＧＥｓの生成を抑制する成分をさらに含む、請求項１又は２に記載の皮膚外用剤。
前記ＡＧＥｓの前記架橋を切断する成分をさらに含む、請求項１〜３の何れかに記載の皮膚外用剤。
前記ＡＧＥｓの前記生成を抑制する成分は、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つである、請求項３に記載の皮膚外用剤。
前記ＡＧＥｓの前記架橋を切断する成分は、シャクヤク根エキスを含む、請求項４に記載の皮膚外用剤。
前記ＡＧＥｓの前記架橋形成を抑制する成分として、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅、前記ＡＧＥｓの前記生成を抑制する成分として、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つと、を含む、請求項１〜６の何れかに記載の皮膚外用剤。
前記ＡＧＥｓの前記架橋形成を抑制する成分として、アスパラギン酸マグネシウム、グルコン酸亜鉛、グルコン酸銅、前記ＡＧＥｓの前記生成を抑制する成分として、ペカン殻エキス及びラッカセイ種皮エキスからなる群より選択される少なくとも何れか一つと、前記ＡＧＥｓの前記架橋を切断する成分として、シャクヤク根エキスと、を含む、請求項１〜７の何れかに記載の皮膚外用剤。