JP2017128560A - 角栓分解促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】肌荒れを起こしにくい、生薬成分含有のより効果のある角栓分解促進剤を提供する。【解決手段】ユウガオエキスを含有することを特徴とする角栓分解促進剤である。角栓のタンパク質解析より角栓中に局在することが明らかとなったシステインプロテアーゼであるカテプシンＶは角栓分解酵素であり、ユウガオエキスによるこの酵素の活性促進作用は、角栓分解促進、角栓形成抑制、毛穴の目立ちの改善などの効果を発揮する。本発明は、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等へ応用することが可能である。【選択図】なし

Description

本発明は、ユウガオエキスを含有することを特徴とする角栓分解促進剤に関する。

角栓とは、周囲の角質や皮脂腺から分泌された皮脂が、毛孔内で凝固、発達したものと考えられており、毛穴の目立ちの原因の一つと考えられている。そのため、角栓を物理的に取り除くなどの施術が提案されており、洗顔などにより取り除く方法（特許文献１）、粘着シートなどに角栓を張り付けて除去する方法（特許文献２）や、角栓除去器具（特許文献３）などが考案されている。また、代替方法として、高濃度の有機酸に界面活性剤を添加した角栓再生を抑制する方法や製剤（特許文献４）が示されるようになった。

ユウガオは、カンピョウとして食用に利用されているが、化粧品原料としても利用されており、その主要な特許文献としては、抗酸化作用を有する化粧品（特許文献５）、美白作用を有する化粧品（特許文献６、７）、コラーゲン産生促進作用を有する化粧品（特許文献８）、育毛剤（特許文献９）、乾燥肌を改善して肌のツヤ・ハリを与える効果を有する化粧品（特許文献１０）が挙げられる。

ザクロには、エラグ酸等の抗酸化成分が含まれ、抗老化作用が期待できること、また、女性ホルモン様成分が含まれ、美容と健康に対する効果が期待できることから、その花、果実、種子等が健康食品や化粧品原料として利用されている。また、ザクロの乳酸発酵液は、角栓形成に関与する内毛根鞘の形成抑制や男性ホルモンの活性化抑制作用を示し、角栓や毛穴の目立ちを予防的に抑制する作用を示すことが報告されている（特許文献１１）。

特開２００７−１１９３９４ 特開２００７−５５９３３ 特開２００９−８２３７６ 特開２０１３−４９６６７ 特開２００２−１３８０２８ 特開２０１４−５５１２１ 特開２０１４−２２４０８１ 特開２００５−２５５５２７ 特開平６−２４７８３２ 特開２００１−２２６２４９ 特開２０１５−１６８６２８

これまで開発されてきた粘着シートや器具により角栓を除去する方法では、表皮の角質も失われてしまうため、肌荒れを起こす懸念があった。また、高濃度の有機酸に界面活性剤を添加した角栓再生を抑制する方法においても角栓を化学的に溶解することに基づいたものであり、肌荒れを起こす懸念は未だ払拭されたとは言えない。この背景には、角栓の形成や分解に関与するメカニズムの詳細が不明であり、また角栓構成成分に注目した研究はほとんどないなど、角栓に関して不明な点が多いことに起因する。最近、角栓の約７０％はタンパク質で構成されていることが明らかとなり（水越興冶ら、Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．Ｊｐｎ． ４１， ２６２−２６８（２００７））、タンパク質が角栓形成に対して重要な要因と考えられた。さらに、角栓のタンパク質解析により、ケラチン１７が角栓中に存在することが報告されたが（山崎浩子ら、第７３回ＳＣＣＪ研究討論会要旨集 ｐ１４−１５ ２０１３年１１月２９日開催）、角栓を構成するタンパク質がすべて明らかになったわけではなく、依然として角栓形成メカニズム、角栓分解メカニズムや構成タンパク質については不明な点が多い。以上の背景から、肌荒れを起こさずに角栓を除去するために、角栓中の構成タンパク質に基づいた新たな角栓分解促進剤の開発が望まれていた。

かかる状況に鑑み、本発明の課題は、角栓分解メカニズムに基づいた生薬成分含有の角栓分解促進剤、カテプシンＶ活性促進剤を提供することにある。

本発明者らは、毛包中のタンパク質解析から、角栓内部にはタンパク質分解酵素であるカテプシンＶが局在していることを明らかにした。また、角栓中のカテプシンＶ酵素活性は小さい角栓ほど高かった。さらに、角栓中の細胞接着因子であるコルネオデスモシン量とカテプシンＶ量は逆相関の関係にあり、毛穴や角栓が目立つほどコルネオデスモシン量が多い一方でカテプシンＶ量が少ないが、目立たない場合はこの関係が逆転していた。このような事情により、カテプシンＶが角栓分解酵素であり、カテプシンＶの活性促進が角栓の分解を促進する手段になりうると考え鋭意研究を重ねた結果、ユウガオエキスが、カテプシンＶの活性促進作用、及び角栓の分解を促進する作用を有することを見出した。さらに、ユウガオエキスとザクロエキスを併用することで、毛穴の目立ちの改善に対して相乗効果が発揮されることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下のとおりである。

ユウガオエキスを含有することを特徴とするカテプシンＶ活性促進剤。

ユウガオエキスを含有することを特徴とする角栓分解促進剤。

ユウガオエキスを含有することを特徴とする毛穴の目立ちの改善剤。

ユウガオエキス及びザクロエキスを含有することを特徴とする毛穴の目立ちの改善剤。

本発明のユウガオエキスは、天然で安全性の高い素材であり、優れたカテプシンＶ活性促進効果を認めたことから、角栓中のタンパク質を分解することによる毛穴の目立ちの改善効果が期待でき、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等への応用が可能である。本発明のユウガオエキスは、角栓分解促進作用を有しており、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品の分野において利用できるものである。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明に用いるユウガオエキスとは、ユウガオの果実の抽出物である。ユウガオは、ウリ科、ユウガオ属、ユウガオで、学名がＬａｇｅｎａｒｉａ ｓｉｃｅｒａｒｉａ（Ｌ． ｓｉｃｅｒａｒｉａ Ｓｔａｎｄｌｅ．、Ｌ． ｓｉｃｅｒａｒｉａ ｖａｒ． ｈｉｓｐｉｄａ．、Ｌａｇｅｎａｒｉａ ｌｅｕｃａｎｔｈａ ｖａｒ． ｃｌａｖａｔａ Ｍａｋｉｎｏ等を含む）であり、例えば栽培品を用いることができ、その果実は、果肉、果皮、種子を含めても良く、絞りかすを含めても良い。本発明で使用できるユウガオの果実の抽出物では、抽出する溶媒としては例えば、水、アルコール類、アセトンの使用が挙げられる。これら水溶性溶媒の１種又は２種以上の混合溶媒を用いて抽出したものであっても良い。また、加熱抽出したものであっても良いし、常温抽出したものであっても良い。

ユウガオエキスは、そのまま用いても良く、必要に応じて抽出、濃縮、希釈、濾過等の処理及び活性炭等による脱色、脱臭処理をして化粧品原料として用いることができる。

本発明に用いるザクロエキスとは、ザクロ（Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ）の花、実、種子、茎、葉、根等の植物体の一部又は全草からの抽出物、果汁、又は抽出物や果汁の発酵液である。その抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出したものであっても良いし、常温抽出したものであっても良い。好ましくは果汁であり、これは果肉、果皮、種子を含めてもよく、絞りかすを含めてもよい。果汁は、そのまま未調整、又は濃縮果汁を用いてもよく、希釈して用いても良い。また、水酸化ナトリウム等のアルカリでｐＨを３〜８に調整して用いても良い。さらに、より好ましくは、乳酸桿菌の生育促進を目的として、酵母エキスや大豆ペプチド等の有機物、硫酸マグネシウム等のミネラルを添加しても良い。また、本発明の果汁には、水やエタノールなどの溶媒を用いて抽出した、ザクロの溶媒抽出物も含めるものとする。

発酵液では、例えば乳酸菌を用いることができ、使用する乳酸菌としては、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、又はペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）に属する乳酸菌が挙げられる。特に好ましくは、発酵による有効性向上の点でラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属する乳酸菌であって、特に植物又はその発酵食品である漬け物などから分離した菌株であっても、菌株保存機関に登録されたものであっても良い。また、特にザクロ果汁をｐＨ３〜５の範囲で効率よく発酵させ得るものが好ましい。培養条件は適宜設定でき、目安として２５〜４０℃で行うことが望ましい。

本発明の外用剤又は内用剤への応用は、上記抽出物をそのまま使用しても良く、抽出物の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬部外品、医薬品又は食品等に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤、賦形剤、皮膜剤、甘味料、酸味料等の成分を適宜含有することもできる。

本発明の剤型としては、例えば、化粧水、クリーム、マッサージクリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、散剤、丸剤、錠剤、注射剤、坐剤、乳剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤（チンキ剤、流エキス剤、酒精剤、懸濁剤、リモナーデ剤等を含む）、錠菓、飲料等が挙げられる。

本発明で用いる、ユウガオエキスを、溶液の状態で用いる場合の含有量は特に限定されないが、固形物に換算して０．００００１重量％以上、好ましくは０．００１〜５．０重量％が良い。０．００００１重量％未満であると本発明の効果が十分に発揮されにくい場合がある。添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。

本発明で用いる、ザクロエキスを、溶液の状態で用いる場合の含有量は特に限定されないが、固形物に換算して０．００１重量％以上、好ましくは０．００１〜５．０重量％が良い。０．００１重量％未満であると本発明の効果が十分に発揮されにくい場合がある。添加の方法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。

本発明におけるカテプシンＶとは、システインプロテアーゼに属するタンパク質分解酵素であり、別名としてカテプシンＬ２と表記される場合がある。皮膚表皮細胞、毛包中の内毛根鞘などで発現しており、角質の落屑に関与する酵素として同定されたことから、角質細胞間の接着分子を切断する作用があると考えられている（Ｄ．Ｂｅｒｎａｒｄ，ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２０， ５９２−６００（２００３）、及びＰａｔｒｉｃｋ Ｌ．Ｊ．Ｍ．Ｚｅｅｕｗｅｎ，ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２７，５９２−６００（２００７））。また、細胞内のリソソーム中にも局在し、タンパク質分解に関与していることが示されている（Ｙ．Ｍｉｗａ，ｅｔ ａｌ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８６，３６０１−３６０７（２０１２））。皮膚色とカテプシンＶとの関連性についての指摘がされており、美白化粧品などへの応用が期待されている（Ｎ．Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２６，２３４５−２３４７（２００６））。さらに、カテプシンＶは、がん細胞にて発現しており（Ｉ．Ｓａｎｔａｍａｒｉａ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８， １６２４−１６３０ （１９９８））、がんの転移などがんの病態進行に関与すると考えられることから、がんの診断や処置など医療への応用が期待されている。

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いるユウガオエキスの製造例、処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。例中の含有量は、全て重量％とする。
以下に、ユウガオエキス、及びザクロエキスの製造例を示す。

製造例１
ユウガオの果実５００ｇを細断し、水５００ｍｌで２時間ずつ２回加熱抽出、さらに真空凍結乾燥により濃縮することにより抽出物１ｇ（９９％以上の固形物を含む）を得た。

製造例２
カンピョウ（市販品）１００ｇを十分水洗した後、水１０００ｍｌで２時間ずつ２回加熱抽出した。残渣を濾過後、濾液を減圧下で濃縮し、さらに、真空凍結乾燥し、抽出物６ｇ（９９％以上の固形物を含む）を得た。

製造例３
乾燥したユウガオの果実６０ｇを粉砕し、水−エタノール混液（１：１）６００ｍｌで５時間加熱抽出して、さらに濃縮することにより抽出物２ｇ（５０％の固形物を含む）を得た。

製造例４
乾燥したユウガオの果実６０ｇを粉砕し、エタノール３００ｍｌを加え、常温で１ヶ月放置した。さらに濃縮することにより１ｇ（９９％以上の固形物を含む）を得た。

製造例５
乾燥したユウガオの果実６０ｇを粉砕し、プロパノール６００ｍｌで２時間ずつ常温で２回抽出し、さらに濃縮することにより抽出物１ｇ（７０％の固形物を含む）を得た。

製造例６ ザクロ果汁
圧搾法にて調製された市販の濃縮ザクロ果汁（Ｂｒｉｘ６５）を用いた。

製造例７ ザクロ果汁の発酵液
市販の濃縮ザクロ果汁（Ｂｒｉｘ６５）を、水で希釈してＢｒｉｘ１５に濃度調整し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た。

製造例８ ザクロ果汁の発酵液
市販の濃縮ザクロ果汁（Ｂｒｉｘ６５）を、水で希釈してＢｒｉｘ１１に濃度調整し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４．５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た。

製造例９ ザクロ果汁の発酵液
市販の濃縮ザクロ果汁（Ｂｒｉｘ６５）を、水で希釈してＢｒｉｘ８に濃度調整し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４．５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た。

製造例１０ ザクロ果汁の発酵液
市販の濃縮ザクロ果汁（Ｂｒｉｘ６５）を、水で希釈してＢｒｉｘ５に濃度調整し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４．５に調整した。調整液５００ｇにラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（漬物由来）の種菌を加えた。３０℃にて２日間発酵してろ過し、ザクロ果汁の発酵物４５０ｇを得た。

製造例１１ ザクロ果汁の発酵液
製造例８のザクロ果汁の発酵物２１０ｇに１，３−ブチレングリコール９０ｇを加えてろ過し、ザクロ果汁の発酵物２８０ｇを得た。

以下に、ユウガオエキス、及びザクロエキスを用いた処方例を示す。

処方例１ 化粧水
（成分） （重量％）
１．ユウガオエキス（製造例２） ０．５
２．１，３−ブチレングリコール ８．０
３．グリセリン ２．０
４．キサンタンガム ０．０２
５．クエン酸 ０．０１
６．クエン酸ナトリウム ０．１
７．エタノール ５．０
８．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
９．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１０．香料 適量
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜６及び１１と、成分７〜１０をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。

比較例１ 従来の化粧水
処方例１において、ユウガオエキス（製造例２）を精製水に置き換えたものを従来の化粧水とした。

処方例２ 乳液Ａ
（成分） （重量％）
１．ユウガオエキス（製造例４） ０．５
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

比較例２ 従来の乳液
処方例２において、ユウガオエキス（製造例４）を精製水に置き換えたものを従来の乳液とした。

処方例３ クリーム
（成分） （重量％）
１．ユウガオエキス（製造例１） ０．５
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１２．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１３．１，３−ブチレングリコール ８．５
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

比較例３ 従来のクリーム
処方例３において、ユウガオエキス（製造例１）を精製水に置き換えたものを従来のクリームとした。

処方例４ ゲル剤
（成分） （重量％）
１．ユウガオエキス（製造例５） ０．５
２．エタノール ５．０
３．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
４．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（６０Ｅ．Ｏ．） ０．１
５．香料 適量
６．１，３−ブチレングリコール ５．０
７．グリセリン ５．０
８．キサンタンガム ０．１
９．カルボキシビニルポリマー ０．２
１０．水酸化カリウム ０．２
１１．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜５と、成分１及び６〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合して製品とする。

処方例５ 浴用剤
（成分） （重量％）
１．ユウガオエキス（製造例２） １．０
２．炭酸水素ナトリウム ５０．０
３．黄色２０２号（１） 適量
４．香料 適量
５．硫酸ナトリウムにて全量を１００とする
［製造方法］成分１〜５を均一に混合し製品とする。

処方例６ 錠剤
（成分） （重量％）
１．ユウガオエキス（製造例１） ５．０
２．乾燥コーンスターチ ２５．０
３．カルボキシメチルセルロースカルシウム ２０．０
４．微結晶セルロース ４０．０
５．ポリビニルピロリドン ７．０
６．タルク ３．０
［製造方法］成分１〜４を混合し、次いで成分５の水溶液を結合剤として加えて顆粒成型する。成型した顆粒に成分６を加えて打錠する。１錠０．５２ｇとする。

処方例７ 錠菓
（成分） （重量％）
１．ユウガオエキス（製造例２） ２．０
２．乾燥コーンスターチ ４９．８
３．エリスリトール ４０．０
４．クエン酸 ５．０
５．ショ糖脂肪酸エステル ３．０
６．香料 ０．１
７．精製水 ０．１
［製造方法］成分１〜４及び７を混合し、顆粒成型する。成型した顆粒に成分５及び６を加えて打錠する。１粒１．０ｇとする。

処方例８ 乳液Ｂ
（成分） （重量％）
１．ユウガオエキス（製造例４） ０．５
２．ザクロ発酵液（製造例１１） ０．５
３．スクワラン ５．０
４．オリーブ油 ５．０
５．ホホバ油 ５．０
６．セタノール １．５
７．モノステアリン酸グリセリン ２．０
８．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
９．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
１０．香料 ０．１
１１．プロピレングリコール １．０
１２．グリセリン ２．０
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分３〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１〜２、及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

処方例９ 乳液Ｃ
（成分） （重量％）
１．ザクロ果汁の発酵液（製造例１１） ０．５
２．スクワラン ５．０
３．オリーブ油 ５．０
４．ホホバ油 ５．０
５．セタノール １．５
６．モノステアリン酸グリセリン ２．０
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
９．香料 ０．１
１０．プロピレングリコール １．０
１１．グリセリン ２．０
１２．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１３．精製水にて全量を１００とする
［製造方法］成分２〜８を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、及び１０〜１３を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分９を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。

以下、本発明を効果的に説明するために、実験例を挙げる。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。

実験例１ カテプシンＶ活性測定１
カテプシンＶの酵素活性促進効果を下記の条件にて測定した。

カテプシンＶの酵素反応は、５０ｎｇヒト組み換えカテプシンＶタンパク質（Ｒ＆Ｄ社）、基質として９μＭ（最終濃度）Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−７−Ａｍｉｎｏ， ４−Ｍｅｔｈｙｌ Ｃｏｕｍａｒｉｎ（Ｒ＆Ｄ社）、及び１０μｇ／ｍｌ（最終濃度）のユウガオエキスの試料を含む１１０μｌの反応緩衝液（２５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ｐＨ５．５）中、３７℃の条件で行った。蛍光プレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）にて酵素反応中における反応生成物（７−Ａｍｉｎｏ， ４−Ｍｅｔｈｙｌ Ｃｏｕｍａｒｉｎ）量を測定した。

試験結果を表１に示した。未添加条件におけるカテプシンＶ酵素活性は５７．６ｐｍｏｌ／ｍｉｎ・μｇ酵素であった。一方、ユウガオエキス添加条件におけるカテプシンＶ酵素活性は８０．６ｐｍｏｌ／ｍｉｎ・μｇ酵素であり、未添加条件に比べ１４０％となり、ユウガオエキスにカテプシンＶの酵素活性を促進させる作用があることが示された。

ユウガオエキスのカテプシンＶ活性促進効果

実験例２ カテプシンＶ活性測定２
カテプシンＶの酵素活性促進効果を下記の条件にて測定した。

カテプシンＶの酵素反応は、被験者の頬部より毛穴除去シートにて採取した角栓の超音波破砕物を酵素源とした。１４０μｇの角栓超音波破砕物、基質として９μＭ（最終濃度）Ｚ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−７−Ａｍｉｎｏ， ４−Ｍｅｔｈｙｌ Ｃｏｕｍａｒｉｎ（Ｒ＆Ｄ社）、及びユウガオエキス、又はキュウリエキスを含む１１０μｌの反応緩衝液（２５ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ、ｐＨ５．５）中、３７℃の条件で行った。蛍光プレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＥＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）にて酵素反応中における反応生成物（７−Ａｍｉｎｏ， ４−Ｍｅｔｈｙｌ Ｃｏｕｍａｒｉｎ）量を測定した。尚、キュウリエキスは、キュウリエキスを０．２％含む一丸ファルコス社製のキューカンバーオーガニックを目的の濃度に希釈して用いた。

試験結果を表２に示した。未添加条件におけるカテプシンＶ酵素活性は０．１０５ｐｍｏｌ／ｍｉｎ・μｇタンパク質であった。一方、ユウガオエキス添加条件におけるカテプシンＶ酵素活性はユウガオエキスを１．０μｇ／ｍｌ添加した場合０．１１７ｐｍｏｌ／ｍｉｎ・μｇタンパク質、１０．０μｇ／ｍｌ添加した場合０．１３８ｐｍｏｌ／ｍｉｎ・μｇタンパク質、１００．０μｇ／ｍｌ添加した場合０．１４２ｐｍｏｌ／ｍｉｎ・μｇタンパク質であり、未添加条件に比べそれぞれ、１１２、１３２、１３５％となり、ユウガオエキスには角栓中に含まれるカテプシンＶの酵素活性を促進させる作用を有することが示された。また、キュウリエキス添加条件におけるカテプシンＶ酵素活性は、０．０９６ｐｍｏｌ／ｍｉｎ・μｇタンパク質であり、未添加条件に比べ９１％、同濃度のユウガオエキス添加条件に比べ６８％となり、ユウガオエキスによるカテプシンＶ活性促進作用の特異性が確認された。

ユウガオエキス、及びキュウリエキスの角栓中のカテプシンＶ活性に対する影響

実験例３ 連用試験１
ユウガオエキスを含有した乳液Ａの処方例２及び比較例２を用いて、２０代〜５０代の男性、及び女性被験者８名を対象に１ヵ月間の連用試験を行った。被験者には有効成分の有無を告知しない、ブラインドテストとし、被験者の一方の半顔頬部に有効成分含有の処方例２を、他方の半顔頬部に比較例２を連用させるハーフサイドテストとし、１日２回、朝、晩、１ヶ月間連用させた。連用前と連用１ヶ月後のそれぞれにおいて頬部を対象に、角栓形成の指標であるポルフィリン蛍光を測定した。また、同時に頬部のレプリカをレプリカ剤ＳＩＬＦＬＯ（ＦＬＥＸＩＣＯ社）にて採取し、レプリカを用いた毛穴面積率の算出を行った。

角栓の指標であるポルフィリン量は、角栓スコープＣｈａｒｍ Ｖｉｅｗ（モリテックス社）を用いて頬部の紫外線画像を取得し、画像をガウスフィルターにて平滑化後、二値化を行い、白画素として検出される蛍光部位のピクセル数を定量することで得た。有効成分であるユウガオエキスを含む処方例２を連用させた側では、比較例２を連用させた側よりもポルフィリン蛍光（ピクセル数）が減少し、群間差が認められたことから（ｐ＜０．０５）、ユウガオエキスによる角栓分解作用が示された（表３）。

頬部のポルフィリン蛍光の変化量（ピクセル数）

頬部より採取したレプリカは実体顕微鏡下において、光源入射角を３０度に設定して撮影した。得られた画像に対し、気泡等によるノイズの軽減処理を加え、二値化により得られた毛孔について、面積率を計測し、使用前に対する変化量を算出した。その結果、有効成分であるユウガオエキスを含む処方例２を連用させた側では、比較例２を連用させた側よりも毛穴面積率が減少し、群間差が認められたことから（ｐ＜０．０５）、ユウガオエキスによる毛穴の目立ちの改善効果が示された（表４）。

頬部の毛穴面積率の変化

実験例４ 連用試験２
ユウガオエキスを含有した処方例２（乳液Ａ）、処方例２に０．５％のザクロ果汁の発酵液を加えた処方例８（乳液Ｂ）、及びザクロ果汁の発酵液を含有した処方例９（乳液Ｃ）を用いて、２０代〜４０代の女性被験者１８名を対象に１ヶ月間の連用試験を行った。被験者には有効成分の有無を告知しない、ブラインドテストとし、被験者の全顔にいずれかの処方を連用させ、１日２回、朝、晩、１ヶ月間連用させた。連用前と連用１ヶ月後のそれぞれで、全顔撮影診断装置ＶＩＳＩＡ（Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて撮影し測定した頬部における毛穴の目立ちを示す毛穴スコアを用いて評価した。

ＶＩＳＩＡにて算出された毛穴スコアは、ユウガオエキスとザクロ果汁の発酵液を両方とも含有した処方例８を連用させた場合では、ユウガオエキスを含有した処方例２やザクロ果汁の発酵液を含有した処方例９を連用させた場合よりも毛穴スコアの顕著な減少が見られたことから（ｐ＜０．０５）、ユウガオエキスだけ、又はザクロ果汁の発酵液だけよりもユウガオエキスとザクロ発酵液を使用した方がより毛穴の目立ちが著しく改善される効果が示された（表５）。

頬部の毛穴スコアの変化

本発明は、角栓構成タンパク質の局在に基づき明らかとなった、角栓内部に局在するカテプシンＶの活性を促進させることで角栓の分解を促進できる、角栓分解促進剤、カテプシンＶ活性促進剤、及び毛穴の目立ちの改善剤を提供できる。

Claims (4)

1. ユウガオエキスを含有することを特徴とするカテプシンＶ活性促進剤。
2. ユウガオエキスを含有することを特徴とする角栓分解促進剤。
3. ユウガオエキスを含有することを特徴とする毛穴の目立ちの改善剤。
4. ユウガオエキス及びザクロエキスを含有することを特徴とする毛穴の目立ちの改善剤。