JP2020111540A - 植物由来の抽出物によるカリクレイン７前駆体産生促進剤、カリクレイン７活性促進剤、表皮角化細胞増殖剤、角層重層改善剤、ターンオーバー改善剤、皮膚弾力性改善剤又は過角化改善剤 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、表皮のターンオーバーの過程である角層剥離において重要な役割を担うＫＬＫ７に着目し、自然由来で過剰な活性変動を生じる可能性が少ない植物の抽出物を用いてＫＬＫ７前駆体の遺伝子発現量とＫＬＫ７活性を適度に高めて、過角化が改善されるとともに、表皮角化細胞の増殖を促すことで正常な表皮のターンオーバーに資する植物の抽出物を含有する製剤を提供することを目的とする。【解決手段】上記課題を解決するため、本発明のカリクレイン前駆体産生促進剤は、ローズマリーの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。【選択図】 図１

Description

本発明は、カリクレイン７（以下、ＫＬＫ７と呼ぶ）の細胞遺伝子の発現を高め、加えて、ヒト角層ＫＬＫ７活性を高める有効な植物由来の抽出物（エキス）を含む製剤に関する。

表皮は、その最下層の基底層から、有棘層、顆粒層、そして、最外層の角層に分類でき、各層で分化、機能を発揮することで皮膚の恒常性を維持している。特に、最外層の角層は、角層細胞同士がコルネオデスモゾームという構造体によって互いを強く接着しており、接着部位に囲まれた細胞間領域には細胞間脂質が存在し、角層構造全体でバリア機能を発揮している。そのコルネオデスモゾームは皮膚内のプロテアーゼ等の働きによって徐々に分解され、細胞間接着が弱くなり、最終的に角質細胞は自然に剥離し、脱落する。上記の過程を経る新陳代謝のことを皮膚（表皮）ターンオーバーという。

しかしながら、乾燥、紫外線、化学物質等の外的要因、生活習慣の乱れ、ストレス及び加齢などの内的要因により表皮のターンオーバーが乱れ、それによって、肌のくすみやごわつき、シミ等が出現することが知られている。また、角層は、ヒトの見た目にも大きな影響を示すことが知られている。例えば、角層のバリア機能が低下すると、皮膚が乾燥しやすく、そのため小じわが目立つようになり、角層のバリア機能が保持された皮膚と比較すると外観が老化したように見えることがある。

角層が機能を維持するためには一定の厚さが必要であり、そのためにはコルネオデスモゾームの分解過程が精密に制御される必要がある。例えば、その分解の過程が遅延した場合には、角層が肥厚して皮膚の質感の低下、くすみ等の皮膚色に関連した要素が変化して皮膚の老化が進んだような外観となる。一方で、分解が亢進した場合には、皮膚バリア機能が低下して乾燥しやすくなるだけでなく、外来因子の侵入等を介した炎症を引き起こしやすくなる。

コルネオデスモソームの分解には、セリンプロテアーゼであるカリクレイン５（以下、ＫＬＫ５と呼ぶ。）、ＫＬＫ７、又は、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７両方の働きを補助する作用を有するとともに、これら２つのＫＬＫと同様の作用を示すカリクレイン１４（以下、ＫＬＫ１４と呼ぶ。）が関与することがＩｏａｎｎｉｓ Ｐｒａｓｓａｓの論文（非特許文献１）により報告されている。これらのセリンプロテアーゼが、コルネオデスモソームの構成成分であるデスモグレイン１、コルネオデスモシンおよびデスモコリン１を分解し、角層を剥離させる。

これらのＫＬＫ５やＫＬＫ７、ＫＬＫ１４の産生量やその活性が低下すると角層剥離が円滑に進まず角層が肥厚すると考えられている。このため、ＫＬＫ５をはじめ、ＫＬＫ７に加えて、これら２つのＫＬＫの活性を補助しつつ同様の役割を担うＫＬＫ１４の産生を促進することは、角層肥厚に伴う見た目の皮膚老化等を軽減できる可能性がある。

本発明者らは、これまでに肌のくすみとＫＬＫ５の活性との間に有意な負の関係があることを明らかにした（非特許文献２）。すなわち、肌くすみが強い場合では肌のＫＬＫ５活性が低く、肌のくすみが弱い場合には肌のＫＬＫ５活性が高いことを新規に見出した。さらに、所定の化粧品製剤を連用使用することでＫＬＫ５活性を高め、肌くすみが低下することも報告した（非特許文献２）。しかしながら、ＫＬＫ７およびＫＬＫ１４の各活性の促進に関しては確認することができなかった。

ＫＬＫ５、ＫＬＫ７又はＫＬＫ１４の作用経路は以下の通りであることがＩｏａｎｎｉｓ Ｐｒａｓｓａｓらの論文（非特許文献１）により報告されている。
ＫＬＫ５遺伝子の発現によりＫＬＫ５前駆体が産生され、そのＫＬＫ５前駆体が自己活性化によりＫＬＫ５となる。続いて、ＫＬＫ７遺伝子の発現により産生されたＫＬＫ７前駆体、及び、ＫＬＫ１４遺伝子の発現により産生されたＫＬＫ１４前駆体が、ＫＬＫ５によって活性化されて、活性型のＫＬＫ７及びＫＬＫ１４に変化するとされている。さらに、ＫＬＫ１４は、ＫＬＫ７と同様にコルネオデスモソーム分解作用に関わるとともに、正のフィードバックにより、ＫＬＫ５前駆体を活性型のＫＬＫ５へと促進させる作用を有するとされている。

しかし、非特許文献１に記載されたこのメカニズムは、人工的に作製されたＫＬＫ５、ＫＬＫ７、ＫＬＫ１４を試験管の中において最適条件下で検討した結果に基づいたものである。さらに、ヒト皮膚においては、これらの酵素活性を抑制するインヒビターが共存するとともに、カルシウム濃度やｐＨ等も試験管の最適条件下とは異なるため、ヒト皮膚内において実際にどのようなメカニズムで作用しているのかについては、十分には明らかになっていない。

従って、ＫＬＫ５の活性促進剤を用いることによってＫＬＫ５の活性が促進されることは既に知られている（非特許文献２）ものの、ヒト皮膚において、ＫＬＫ５の活性促進が、ＫＬＫ７およびＫＬＫ１４の活性を促進し、デスモグレイン１、コルネオデスモシンおよびデスモコリン１などの分解を促進し、過角化を改善させるのか否かは定かではない。

ところで、ＫＬＫ７は、カスパーゼ１４の前駆体を活性型に変換促進する作用があり、これによりフィラグリンの一部分解が進み天然保湿因子であるＮＭＦ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）が増加し、皮膚の保湿能が高まる可能性が示唆されている（非特許文献３）。

すなわち、ＫＬＫ５、ＫＬＫ７及びＫＬＫ１４の産生及び活性が低下すると角質細胞の重層化が進み、その脱落が円滑に進まないため角層が肥厚して皮膚の質感の低下、くすみ等の皮膚色に関連した要素が変化して皮膚の老化が進んだような外観となるだけでなく、角層の水分量が低下する可能性がある。このため、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７、加えてＫＬＫ５の活性を補助する役割を担い、コルネオデスモゾームの分解にも関与するＫＬＫ１４の産生及び活性を促進することは、表皮の正常なターンオーバーを補助促進させるとともに、角層水分量を増加させるためにも重要と考えられる。

特開２０１７−１６０１８６号公報 特開２０１５−１４３２０５号公報

Ｐｒａｓｓａｓ Ｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ. １４（３）：１８３−２０２，２０１５ ＩＦＳＣＣ２０１６国際大会ポスターＮｏ．２００ Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８７（３９）：３２８２５−３４，２０１２

しかしながら、先行研究によりＫＬＫ５の活性には変化が見られたが、上記非特許文献１のメカニズム通りに作用した場合、ＫＬＫ５の増加によって活性が変動することを見込まれているＫＬＫ７及びＫＬＫ１４に活性の変動が見られなかった。

特許文献１には、エイジツ、ヨモギ、紅茶より選ばれる１種又は２種以上の抽出物を有効成分とすることによって、カリクレイン関連ペプチターゼ、ＬＥＫＴＩ、ＳＬＰＩの産生を促進し、コルネオデスモソーム分解を正常化し、ひいては角化を正常化する製剤を得ることが記載されている。しかしながら、当該文献には、ＫＬＫ５及びＫＬＫ７に加えてそのインヒビターであるＬＥＫＴＩ、ＳＬＰＩの遺伝子発現量についても促進効果が記述されている。そのため、そもそもコルネオデスモソーム分解の正常化が可能か否かは定かではない。また、これらのエキスを配合した製剤でヒト連用試験等を実施しておらず、それらの酵素活性の程度やコルネオデスモソームの分解が正常化されたのか否かも定かではない。また、当該抽出物のＫＬＫ７に対する作用は比較的強いものであり、皮膚の剥離が過剰に促進されることによる悪影響が懸念される。

特許文献２には、ボタン科ボタン属に属する植物の抽出物、バラ科サクラ属に属する植物の抽出物、及びシソ科シソ属に属する植物の抽出物を含有する皮膚外用剤が開示されている。具体的にはボタン属では芍薬、山芍薬、紅花山芍薬、牡丹等であり、サクラ属では桃、梅、李等であり、シソ属では青紫蘇、赤紫蘇、縮緬紫蘇、斑紫蘇等を原料植物として全草、各部位、種子等を用いて、各種溶媒により浸漬法又は超臨界抽出法等で抽出した抽出物を含有する皮膚外用剤である。これらのエキスによりＫＬＫ７の活性促進効果を示しているが、その活性程度はかなり低く、かつ、その遺伝子発現量やタンパク発現量については示されていない。加えて、ヒト連用試験等を介した実際のヒト角層におけるＫＬＫ７活性促進は定かではない。

上記をはじめとして、当該分野において、従来植物の抽出物を用いてＫＬＫ５又はＫＬＫ７の遺伝子発現量や酵素活性を増加させることに関する多くの成果報告がなされてきた。しかし、ＫＬＫ５又はＫＬＫ７の遺伝子発現量や酵素活性の両方を促進する、特に、酵素活性に関しては、実際のヒト皮膚角層におけるＫＬＫ５又はＫＬＫ７活性増加を示しているものは無い。

本発明は、表皮ターンオーバーの過程である角層細胞の剥離において重要な役割を担うＫＬＫ７に着目し、上記先行技術とは異なる自然由来で過剰な活性変動を生じさせる可能性が少ない植物の抽出物を用いて、ＫＬＫ７前駆体の遺伝子発現およびＫＬＫ７酵素活性の両方を過剰ではなく適度に高めることで、角層細胞同士の重層度や角層細胞の面積を低下させて正常な表皮ターンオーバーへと資する植物の抽出物を含有する製剤を提供することを目的とする。加えて、ＫＬＫ７前駆体の遺伝子発現およびＫＬＫ７酵素活性の促進だけでなく、表皮基底層での表皮角化細胞の細胞増殖を促すことも、継続使用の可能性がある化粧品、医薬部外品においては、特に重要であると考え、表皮角化細胞の増殖作用を有する植物由来の抽出物を含む製剤を提供することも目的とした。

上記課題を解決するため、本発明のカリクレイン７前駆体産生促進剤は、ローズマリーの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明のカリクレイン７酵素（セリンプロテアーゼ）活性促進剤は、ローズマリーの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明の表皮角化細胞増殖剤は、ローズマリーの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明の角層剥離促進剤は、ローズマリーの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明の皮膚弾力性改善剤は、ローズマリーの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。

また、本発明の過角化改善剤は、ローズマリーの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。

本発明の製剤によれば、ローズマリー抽出物が表皮角化細胞のＫＬＫ７遺伝子発現量とその細胞増殖作用を有意に高める効果を奏する。

また、本発明の所定量のローズマリー抽出物を含有する製剤を配合した化粧品や医薬部外品、医薬品などを連続使用すれば、ローズマリー抽出物がヒト角層におけるＫＬＫ７の酵素活性が適度に促されて角層細胞同士の重層度や角層細胞面積がそれぞれ低下することで、ターンオーバーの乱れおよび過角化が改善されて正常な表皮ターンオーバーが行なわれる効果を奏する。

さらに、本発明の所定量のローズマリー抽出物を含有する製剤を配合した化粧品や医薬品などによれば、適度なＫＬＫ７の酵素活性促進に伴って角層水分量がゆるやかに増加して適度な保湿効果を奏するとともに、それを受けて皮膚弾力性を高める効果を奏する。

ローズマリー抽出物による表皮角化細胞のＫＬＫ７遺伝子発現量促進作用を示すグラフである。 ローズマリー抽出物による表皮角化細胞の増殖作用を示すグラフである。 ローズマリー抽出物を配合した化粧水連用後のヒト角層におけるＫＬＫ７酵素活性促進作用を示すグラフである。 ローズマリー抽出物配合化粧水とローズマリー抽出物無配合の化粧水を連用した前後の角層重層状態を１００倍に拡大した顕微鏡写真である。 ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後の角層重層度の比率を比較したグラフである。 ローズマリー抽出物配合化粧水を連用した前後の角層細胞の写真である。 ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後の角層細胞１個の大きさを比較したグラフである。 ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後の角層水分量の増減比率を比較したグラフである。 ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後の経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の増減比率を比較したグラフである。 ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後の皮膚弾力性（Ｒ２）の増加比率を比較したグラフである。 ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後の皮膚回復弾力性（Ｒ７）の増加比率を比較したグラフである。 ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後の被験者全員のアンケート結果「肌厚み感」を比較したグラフである。 ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後の被験者を女性に限定した場合のアンケート結果「肌厚み感」を比較したグラフである。 ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後の被験者全員のアンケート結果「しっとり感」を比較したグラフである。 ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後の被験者を女性に限定した場合のアンケート結果「しっとり感」を比較したグラフである。

ローズマリーは、シソ科マンネンロウ属に属する常緑性低木である。従来から、生葉又は乾燥葉が香辛料、薬（ハーブ）として用いられている。花は食用としても利用される。
ＫＬＫ７に作用して表皮ターンオーバーを促進して正常化に整えるとした植物の抽出物（植物エキス）はローズマリーの他にもあるが（特許文献１）、ＫＬＫ７促進が過剰であると皮膚角層やそのバリア機能に悪影響を及ぼすことが懸念される。

本発明者らは、表皮ターンオーバーに関与するＫＬＫ５の活性に関する研究に続いて、ＫＬＫ７に着目し、その遺伝子および酵素活性を高める有用な植物由来の抽出物（エキス）を探索した。その際に、ローズマリーの精油がロスマリン油の名で、皮膚病の治療に用いられていたことに着目し、ローズマリー抽出物にＫＬＫ７遺伝子の発現を高める作用があるか否かについて確認した。

本発明を実施するための形態において使用するローズマリー抽出物の調製方法の一例を以下に示す。自然由来の原料としてローズマリーの葉を使用し必要に応じて切断、粉砕する。茎、根、花、実又は種子などを用いてもよい。抽出溶媒には、低級アルコール類、多価アルコール又はその誘電体、ケトン類、エステル類、エーテル類などでもよく、これに限定されない。また、これらの混合溶媒でもよい。

抽出は、抽出溶媒にローズマリーの原料を含浸させることで行う浸漬法などの常法によって行うことができる。その他の例として蒸留法、圧搾法や超臨界抽出法を挙げることができる。抽出の際の温度や圧力は各々の抽出方法によって設定された最適な条件を選択することができる。

今回の試験には、化粧品や医薬部外品などへの速やかな適用及びヒト連用試験実施の際の被験者の安全性を考慮して、抽出溶媒及び調製溶媒として皮膚刺激性が低い多価アルコール類である１，３−ブチレングリコール溶液を用いたローズマリー抽出液ＢＧ−Ｊ（丸善製薬株式会社）を使用した。当該ローズマリー抽出液は、抽出工程の後、熟成工程、１，３−ブチレングリコール溶液を加える調整工程を行い、各々の工程間には、ろ過工程を実施したものである。ローズマリー抽出液ＢＧ−Ｊは、１，３−ブチレングリコールと精製水との容量比が１：１の混合液で、ローズマリー抽出物の実配合量は１．７０%である。上記は試験における配合の一例を示した。

（表皮角化細胞遺伝子発現量の変動確認試験）
（試験方法）
（１）増殖培地（ＥｐｉＬｉｆｅにＥＧＦをはじめ各種細胞増殖因子を添加して一定濃度にしたもの）で懸濁した一定数の表皮角化細胞（ＰＳＶＫ１細胞）を１２ウェル培養プレートに播種した。（２）７２時間後、表皮角化細胞が約９５％程度のコンフルエントになったことを確認して、表皮角化細胞の増殖を低下させ分化（角化）状態に切り替えていくために表皮角化細胞の培地を基礎培地（各種増殖因子が入っていないＥｐｉＬｉｆｅ）に置換した。（３）２４時間後、前述のローズマリー抽出液ＢＧ−Ｊに基礎培地を加えて作製した０．２％溶液及び０．３％溶液を表皮角化細胞に添加した。（４）添加４８時間後に表皮角化細胞の遺伝子を回収し、ＲＴ−ｑＰＣＲ（半定量的逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応）によってＫＬＫ７の遺伝子発現量を測定した。発現量の補正をするため、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの発現量も同様に測定した。

（試験結果）
ローズマリー抽出物による表皮角化細胞のＫＬＫ７遺伝子発現量の変動確認試験の結果を図１に示す。ｔ検定を用いて統計処理を行った結果、ＫＬＫ７遺伝子発現量は、ローズマリー抽出物０．２％溶液を添加した細胞では、ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（非添加）と比較して有意な増加（ｐ＝０．０００４＜０．０５）が認められ、０．３％溶液添加においても、有意な増加（ｐ＝０．００１２９＜０．０５）が認められた。したがって、ローズマリー抽出物による有意なＫＬＫ７遺伝子発現量の増加作用が認められ、ＫＬＫ７前駆体の産生を促進する効果が確認できた。

（表皮角化細胞の増殖確認試験）
角層においてＫＬＫ７の酵素活性がゆるやかであっても増加した状態が長期間続くと、表皮下層からの角層へ移行する細胞供給が追い付かず、表皮の正常なターンオーバーが乱れてくる可能性が考えられる。そのため、皮膚の正常なターンオーバーが行なわれるためには、表皮角化細胞の増殖による細胞の供給も必要である。そこで、ローズマリー抽出物が表皮角化細胞の増殖に関与しているか否かに関して確認試験を行った。以下、試験方法の例を示す。

（試験方法）
（１）前記の増殖培地で懸濁した一定数の表皮角化細胞（ＰＳＶＫ１細胞）を９６ウェル培養プレートに播種した。（２）２４時間後にローズマリー抽出液ＢＧ−Ｊにアッセイ培地を加えて作製した０．００７８％溶液、０．０１５６％溶液、０．０３１３％溶液、０．０６２５％溶液、０．１２５％溶液、０．２５％溶液、０．５％溶液及び１％溶液を播種した細胞に添加した。なお、前記アッセイ培地は前記基礎培地に前記増殖培地を１０％添加したものである。この細胞増殖試験時においては播種細胞のコンフルエント程度が低く、細胞状態が低下して増殖を示さなくなるためアッセイ培地を使用した。（３）添加２４時間後、添加４８時間後の表皮角化細胞への増殖作用をＷＳＴ−８法で確認した。なお、表皮角化細胞の増殖確認試験では、遺伝子発現変動確認試験及び角層ＫＬＫ７酵素活性測定と比較してさらに濃度を低くしている。増殖作用のターゲットである表皮最下層の基底層の細胞に届くローズマリー抽出物の量が減少することを考慮したものである。

（試験結果）
ローズマリー抽出物による表皮角化細胞の増殖確認試験の結果を図２に示す。ｔ検定を用いて統計処理を行った結果、表皮角化細胞の増殖は、添加４８時間後において、０．０１５６％溶液添加の細胞においてｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（非添加）と比較して２５％の有意な増加（ｐ＝０．０４９６＜０．０５）が認められた。したがって、ローズマリー抽出物による有意な表皮角化細胞の増殖作用が確認できた。

ローズマリー抽出液ＢＧ−Ｊの添加濃度が０．２５％以下では、ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔを１００％とした時の細胞生存率が９０％以上であり細胞毒性が無いことが確認できた。細胞試験においては、一般的に細胞生存率８０〜９０％を基準として、細胞毒性の有無が判断される。本願発明においては、その最大値である９０％を細胞毒性の有無の判断基準とした。なお、ローズマリー抽出液ＢＧ−Ｊの添加濃度が０．５％以上では、細胞生存率が９０％以下であり細胞毒性が確認できた。

遺伝子発現変動確認試験および細胞増殖確認試験の結果に基づいて、ローズマリー抽出物を配合した製剤が、ヒト顔面皮膚の角層に対してどのような影響を示すかについて連用試験を行った。

（ヒト連用試験）
ヒト連用試験は、（ａ）角層ＫＬＫ７酵素活性の測定、（ｂ）角層表面の重層状態および角層細胞面積の各観察と測定、（ｃ）角層水分量と経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ：ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｗａｔｅｒ ｌｏｓｓ）の測定、（ｄ）皮膚弾力性の測定、（ｅ）官能試験、の計五項目について行った。以下、試験方法の例を示す。

（試験方法）
（１）試験用製剤（化粧水）
試験用製剤は、ローズマリー抽出液ＢＧ−Ｊを２．５％配合した化粧水及びローズマリー抽出物無配合化粧水を使用した。無配合の化粧水は、グリセリン：５．０質量％、１，３−ブチレングリコール：４．９質量％、ジプロピレングリコール：２．０質量％、ポリエチレングリコールエーテル６０水添ヒマシ油：０．３質量％、フェノキシエタノール：０．３質量％、エチルヘキシルグリセリン：０．２質量％、クエン酸ナトリウム：０．０５質量％、クエン酸：０．０２質量％、精製水：残量で全量１００とする量が配合されたものを使用した。ローズマリー抽出物配合化粧水は、無配合の化粧水にローズマリー抽出液ＢＧ−Ｊを２．５％配合して精製水を調製し全量１００とした。
（２）対象者
年齢２０歳代から６０歳までの男性５名、女性５名合計１０名を対象とした。ローズマリー抽出液ＢＧ−Ｊ２．５％配合化粧水と無配合化粧水を半顔使用した。
（３）化粧水の使用方法と期間
各化粧水は、１日２回、それぞれ定めた左右半顔に毎日塗布した。なお、当該化粧水は、通常被験者が使用している化粧品を使用する前に塗布した。使用期間は４週間とした。

（ａ）角層ＫＬＫ７酵素活性の測定
ヒト連用試験を開始してから２週間後、４週間後にテープストリッピングによって顔面頬部の角層を回収した後、角層タンパクを抽出してＫＬＫ７の酵素活性を測定した。測定は、活性化した酵素に切断されて蛍光する蛍光基質を使用した。

角層ＫＬＫ７酵素活性測定の結果を図３に示した。ｔ検定を用いて統計処理を行った結果、角層ＫＬＫ７酵素活性は、連用４週間後において、ローズマリー抽出物配合化粧水群で無配合化粧水群と比較して有意でないものの３８％の活性増加傾向（ｐ＝０．０７４）を示した。

（ｂ）角層表面の重層状態および角層細胞面積の各観察と測定
（試験方法）
ヒト連用試験を開始してから２週間後、４週間後にテープストリッピングによって顔面頬部の角層を回収し、その角層をスライドグラスに転写した後に染色し、明視野にて角層表面の重層状態及び角層細胞面積をそれぞれ顕微鏡観察した。また、それらを撮影した写真を用いて画像解析を行い、一定の視野内における角層重層度および角層細胞１個あたりの面積を測定し、ローズマリー抽出物配合化粧水群と無配合化粧水群で比較した。上記は、試験方法の一例である。

（ｂ−１）角層表面の重層状態の観察および測定
（試験結果）
ヒト連用試験を行った角層の状態を図４に示した。図４は顕微鏡明視野１００倍の顕微鏡写真であり、角層が黒色で染色されている。角層剥離酵素の活性が低いと重層度が高くなり重なった部分が濃い黒色を示すが、活性が一定以上高いと重層度が低くなり、濃い黒色の部分は少なくなる。ローズマリー抽出物配合化粧水を使用した群の使用前後では、黒色の濃い部分が緩やかに減少している様子が観察できた。一方で、ローズマリー抽出物無配合化粧水を使用した群の使用前後において、重層の状態を観察すると、角層が染色された黒色の濃い部分が若干増加した又は変化が観察できなかった。
また、角層重層度の測定結果を図５に示した。図５のグラフでは使用前を基準１．０として変化の度合いを比率で示した。ｔ検定を用いて統計処理を行った結果、角層重層度は、連用４週間後において、ローズマリー抽出物配合化粧水群でローズマリー無配合化粧水群と比較して３２．１％（ｐ＝０．０９２）低かった。

（ｂ−２）角層細胞面積の観察および測定
（試験結果）
ローズマリー抽出物配合化粧水を連用した前後の角層細胞の状態を５００倍に拡大した顕微鏡写真を図６、角層細胞面積の測定結果を図７に示した。図７のグラフにおいては使用前を基準１．０として変化の度合いを比率で示した。
ローズマリー抽出物配合化粧水の連用前後の角層細胞面積は、４週間後において、ローズマリー抽出物配合化粧水群はローズマリー無配合化粧水群と比較して、角層細胞１個あたりの大きさが小さくなっていることが観察でき、また、ｔ検定を用いて統計処理を行った結果、角層細胞１個あたりの平均面積が有意に１３．０％（ｐ＝０．０１５＜０．０５）低かった。

角層剥離酵素の活性が低いと重層度が高く細胞面積も大きくなり、活性が一定以上高いと重層度が低く細胞面積も適当であるという点で、角層ＫＬＫ７の酵素活性と角層重層度および角層細胞面積とは相関が高い項目である。

前述した試験結果から、活性増加と角層の重層度および面積の低下という相関結果が得られ、表皮ターンオーバーがローズマリー抽出物配合化粧水によって促進されたことが確認できた。

（ｃ）角層水分量と経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の測定
（試験方法）
ヒト連用試験を開始してから２週間後及び４週間後に顔面頬部を角層水分量測定装置（ＳＫＩＣＯＮ−２００ＥＸ−ＵＳＢ：株式会社ヤヨイ製）で角層水分量、Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ ＭＰＡ５８０：Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ（ドイツ）社製）で経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。上記は、試験方法の一例である。

（ｃ−１）角層水分量の測定
（試験結果）
ヒト連用試験による角層水分量の変化を図８に示した。角層水分量は、ローズマリー抽出物配合化粧水群及びローズマリー抽出物無配合化粧水群ともに使用前と比較してそれぞれ増加した。連用４週間後では２週間後と比較して若干低下したが増加した状態をともに維持した。ｔ検定を用いて統計処理を行った結果、ローズマリー抽出物配合化粧水群はローズマリー抽出物無配合化粧水群と比較して１３．９％高く（ｐ＝０．４０）、増加傾向を示すことが確認できた。

（ｃ−２）経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の測定
（試験結果）
ヒト連用試験による経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の変化を図９に示した。ＴＥＷＬは、ローズマリー抽出物配合化粧水群及びローズマリー抽出物無配合化粧水群ともに使用前と比較して連用４週間後まではほとんど変化が見られなかった。

これらの結果から、前述した角層ＫＬＫ７の酵素活性の増加と角層重層度および角層細胞面積の低下に伴う表皮バリア機能低下がみられないこと、さらに、角層水分量が低下せず、むしろ一定量増加したことが確認できた。

（ｄ）皮膚弾力性の測定
（試験方法）
皮膚弾力性は、皮膚粘弾性測定装置（ＣＵＴＯＭＥＴＥＲ ＤＵＡＬ ＭＰＡ５８０：Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ（ドイツ）社製）を使用して、皮膚弾力性（Ｒ２）及び皮膚回復弾力性（Ｒ７）について評価を行った。

（試験結果）
ヒト連用試験による皮膚弾力性の変化を図１０に示した。図１０ａで示す皮膚弾力性（Ｒ２）は、ローズマリー抽出物配合化粧水群が使用前と比較して４週間後まで継続的に増加し、さらに、ｔ検定を用いて統計処理を行った結果、４週間後において無配合化粧水群と比較して有意に１５．１％（ｐ＝０．０１２＜０．０５）高かった。図１０ｂで示す皮膚回復弾力性（Ｒ７）は、ローズマリー抽出物配合化粧水群が使用前と比較して４週間後まで継続的に増加し、さらに、４週間後において無配合化粧水群と比較して有意ではないが１３．０％（ｐ＝０．１５）高かった。

ローズマリー抽出物配合化粧水の連用により皮膚弾力性が増加したことは、角層重層度および角層細胞面積の低下に伴う角層厚み、ごわつき等が減少し、また、角層と比較してより柔軟な表皮基底層の細胞の増殖が促されたことが寄与した結果である。

（ｅ）官能試験
（ｅ−１）「肌厚み感」の官能試験
当該連用試験の２週間後および４週間後に得られた「肌厚み感」に関する被験者の感想をアンケート収集し評価した。

（試験方法）
被験者には、どちら側の顔にローズマリー抽出物配合化粧水、又は、無配合化粧水を塗布したかは伝えず、使用前と比較して「肌厚み感」をどの程度感じるかについて感覚スコアを用いたアンケートを行った。回答においては、「肌厚み感」の感覚スコアは五段階評価とし、厚み感が特に低いと感じている場合は「０」、特に高いと感じている場合は「５」とした。各群の感覚スコア評価平均点を算出し、使用前の平均点を１．０として使用後の感覚スコアを示した。上記は、試験方法の一例である。

（試験結果）
ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後における被験者が感じる「肌厚み感」の感覚スコアを比較したものを図１１ａに示した。連用４週間後では、ローズマリー抽出物配合化粧水群で被験者の「肌厚み感」がより低下しており、無配合化粧水群と差が生じた。

肌に対する感覚に関しては、普段から化粧品を使用する機会が多い女性の方が男性と比較してより敏感であると考えられるため、女性のみ（５名）の官能試験の結果を改めてまとめ、図１１ｂに示した。図１１ｂで示すように、「肌厚み感」は女性のみの被験者においては連用４週間後にローズマリー抽出物配合化粧水群が無配合化粧水群と比較してより顕著に低下することが判明した。

このことから、ローズマリー抽出物配合化粧水群では、ローズマリー抽出物が角層ＫＬＫ７の酵素活性を促進することで、余分に存在し重層化等の状態を示していた角層細胞を一定量除去することで、ヒトの「肌厚み感」が低下したものと考えられ、角層の重層度や細胞面積の測定結果と一致する。

（ｅ−２）「肌しっとり感」官能試験
上記同様に、当該連用試験の２週間後および４週間後に得られた「肌しっとり感」に関する被験者の感想をアンケート収集し評価した。

（試験方法）
上記同様の方法にて実施した。「肌しっとり感」の感覚スコアは五段階評価とし、肌しっとり感が特に低いと感じている場合は「０」、特に高いと感じている場合は「５」とした。各群の感覚スコア評価平均点を算出し、使用前の平均点を１．０として使用後の感覚スコアを示した。上記は、試験方法の一例である。

（試験結果）
ローズマリー抽出物配合化粧水群とローズマリー抽出物無配合化粧水群の連用前後における被験者が感じる「肌しっとり感」の感覚スコアを比較したものを図１２ａに示した。連用２週間後、４週間後において、ローズマリー抽出物配合化粧水群では、「肌しっとり感」を高く感じている被験者が、無配合群と比較してより多いことが判明した。この結果は、角層水分量測定結果と一致した。

上記同様に、肌に対する感覚に関しては、普段から化粧品を使用する機会が多い女性の方がより敏感であると考えられるため、女性のみ（５名）の官能試験の結果を図１２ｂに示した。
連用２週間後、４週間後において、ローズマリー抽出物配合化粧水群では、無配合化粧水群と比較して「肌しっとり感」をより高く感じていることが判明した。

以上より、ローズマリー抽出物を含む化粧水などの皮膚用製剤は、ＫＬＫ７酵素活性作用を適度に増加させて角層剥離を進め、重層化などの状態を示していた角層細胞を一定量除去することで、角層厚み、細胞面積、ヒトの「肌厚み感」を減少させて、かつ、角層と比較してより柔軟な表皮基底層の細胞の増殖を促すことから表皮ターンオーバーを補助して整える有用な製剤であることが確認された。

また、ローズマリー抽出物を含む化粧水などの皮膚用製剤は、角層水分量および皮膚弾力性を増加させ、ヒトの「肌しっとり感」を増加させる効果を有する。さらに、ＫＬＫ７酵素活性増加に伴い、角層剥離作用が進み角層重層度と角層細胞面積が低下しているが、経皮水分蒸散の悪影響は見られないことから、保湿能を改善し、表皮のバリア機能を保持する有用な製剤であることが確認された。

したがって、ローズマリー抽出物を含む製剤は、ＫＬＫ７前駆体産生促進剤、ＫＬＫ７活性促進剤、表皮角化細胞増殖剤、角層剥離促進剤、ターンオーバー改善剤、皮膚弾力性改善剤又は過角化改善剤が挙げられる。

皮膚に使用されるＫＬＫ７前駆体産生促進剤、ＫＬＫ７活性促進剤、表皮角化細胞増殖剤、角層剥離促進剤、ターンオーバー改善剤、皮膚弾力性改善剤又は過角化改善剤の具体例として、乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、口紅、ファンデーション、リクイドファンデーション、メイクアッププレスパウダー、ほほ紅、白粉、洗顔料、ボディシャンプー、毛髪用シャンプー、石けん等の清浄用化粧料、育毛剤、さらには浴剤等の製剤が例示される。しかし、これらに限定されるものではない。
本発明の製剤には、植物抽出物であるローズマリーエキスのほかに、スキンケア用製剤であれば、例えば、油性成分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、乳化剤又は乳化助剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、色素、香料、その他の生理活性成分等を必要に応じて適宜配合することができる。さらに、本発明のローズマリーエキスの製剤の有効性、特長を損なわない限り、他の生理活性成分と組み合わせて化粧料に配合することもできる。

製剤としてローションを選択した場合では、例えば、水、グリセリン、ブチレングリコール（ＢＧ）、ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）、ＰＥＧ−６０水添ヒマシ油、フェノキシエタノール、エチルヘキシルグリセリン、クエン酸ナトリウム、クエン酸などを配合したものをベースとして、ローズマリー葉エキスを適量加えて作製できる。ベースとなる製剤の配合率の一例を表１に示した。

製剤として乳液、クリームを選択した場合では、例えば、油性成分としてはセチルアルコール、ステアリン酸、ワセリン、スクワラン、グリセロールトリ２−エチルヘキサン酸エステル、界面活性剤としてはポリソルベート６０、ステアリン酸グリセリル、プロピレングリコールモノステアリン酸エステル、保湿剤としてグリセリン、ジプロピレングリコール、防腐剤としてフェノキシエタノール、パラヒドロキシ安息香酸エステル、酸化防止剤としてはビタミンＥ（ｄｌ−α―酢酸トコフェノール）などを配合することができ、これらに水とローズマリー葉エキスを適量加えて製剤を作製する。ベースとなる製剤の配合率の一例を表２及び表３に示した。

本発明に係る植物由来の抽出物によるＫＬＫ７前駆体産生促進剤、ＫＬＫ７活性促進剤、表皮角化細胞増殖剤、角層剥離促進剤、ターンオーバー改善剤、皮膚弾力性改善剤又は過角化改善剤によれば、過角化が改善され正常な皮膚のターンオーバーに資する植物の抽出物を含有する各種製剤の提供が可能である。

Claims (6)

1. ローズマリーの抽出物を有効成分として含有するカリクレイン７前駆体産生促進剤。
2. ローズマリーの抽出物を有効成分として含有するカリクレイン７酵素（セリンプロテアーゼ）活性促進剤。
3. ローズマリーの抽出物を有効成分として含有する表皮角化細胞増殖剤。
4. ローズマリーの抽出物を有効成分として含有する角層剥離促進剤。
5. ローズマリーの抽出物を有効成分として含有する皮膚弾力性改善剤。
6. ローズマリーの抽出物を有効成分として含有する過角化改善剤。