JP2007269757A - 脂肪細胞分化阻害剤ならびにこれを含有する医薬品、医薬部外品、化粧品および食品 - Google Patents

Abstract

【課題】副作用がなく優れた前駆脂肪細胞分化誘導阻害作用を有する脂肪細胞分化阻害剤、ならびに肥満および肥満が関与する疾病の予防、改善または治療に優れた効果を奏する医薬品、医薬部外品、化粧品および食品を提供することにある。
【解決手段】下記一般式
【化１】

（式中、Ｒ^１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、アセトキシ基または糖残基を表し、Ｒ^２は、酸素原子または水酸基を表し、Ｒ^３は、メチル基または水酸基を表し、Ｒ^４は、水素原子またはアセチル基を表し、
【化２】

は、単結合または二重結合を表す）で示されるククルビタシン化合物を有効成分とする脂肪細胞分化阻害剤ならびにこれを含有する医薬品、医薬部外品、化粧品および食品である。
【選択図】なし

Description

本発明は、脂肪細胞分化阻害剤ならびにこれを含有する医薬品、医薬部外品、化粧品および食品に関する。

肥満は、先進国の国民の健康を脅かす存在である。わが国の近未来像ともいえるアメリカでは、実に半数以上の人が肥満の範疇に分類され、肥満そのものの治療やダイエット関連の費用、肥満が引き起こす糖尿病・高血圧・心臓病の治療費は、しめて年間１，０００億ドルに達するとされる。しかし、その甲斐もなくこれまで何百万人という人が肥満により寿命を縮めたと考えられている。

また、肥満は糖尿病および生活習慣病等、様々な細胞障害を引き起こす原因として注目されており、特に２型糖尿病患者の大部分は、主として肥満等の要因によって、インスリンの効きが悪い「インスリン抵抗性」の状態にあることが知られている。

基本的な肥満改善方法としては、運動療法と食事療法があるが、どちらも継続的な実施が困難である。薬物療法では、マジンドールやフェンフルラミン等の食欲抑制剤が開発されているが、口渇や抑鬱等の副作用があることが知られている。また、消化吸収阻害作用を示す健康食品も販売されているが、基本的には食前に摂取する必要があり利便性が悪い。

また、糖尿病の治療に用いられる医薬品としては、膵インシュリン分泌の促進作用を有するスルホニル尿素剤、肝の糖新生の抑制および末梢の筋肉や脂肪組織でのインシュリン感受性の亢進作用を有するビグアナイド系薬剤、チアゾリジン系血糖上昇抑制剤、消化管粘膜に存在するα−グルコシターゼ（二糖類加水分解酵素）の活性を阻害しデンプンやショ糖からブドウ糖の生成を抑制して血糖値上昇を抑制するα−グルコシダーゼ阻害薬等があり、経口投与用の糖尿病治療剤として使用されている。しかし、α−グルコシダーゼ阻害剤をはじめとする糖尿病治療剤は、一般に合成品である。また、最近になって重篤な肝障害の発生が報告される等その使用にあたっては医師の厳格な管理・指導が必要とされ、容易に入手、使用できないのが現状である。したがって、効果が高く、安全な抗肥満剤および抗糖尿病剤の提供が望まれていた。

一方、肥満を細胞レベルで見ると、体脂肪の蓄積は脂肪細胞中への脂肪の取り込みによるものであり、この脂肪細胞の減少および増加が調節可能であれば脂肪の取り込み量も調節することができる。脂肪細胞は、線維芽細胞類似の脂肪芽細胞から、前駆脂肪細胞、未成熟脂肪細胞を経て最終的に成熟脂肪細胞へと分化する。従って前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化誘導を阻害することができれば、脂肪細胞の形成を抑制できると考えることができる。

また、化粧品分野においても、脂肪細胞への分化および細胞内への脂肪の蓄積を抑えることができれば、皮脂を抑える等の効果が期待できる。

したがって、本発明の目的は、副作用がなく優れた前駆脂肪細胞分化誘導阻害作用を有する脂肪細胞分化阻害剤を提供することにある。

本発明の他の目的は、肥満および肥満が関与する疾病の予防、改善または治療に優れた効果を奏する医薬品、医薬部外品、化粧品および食品を提供することにある。

本発明者らは、新規な脂肪細胞分化阻害剤について鋭意研究を重ねた結果、ウリ科植物であるマクワウリの蔕部（瓜蒂）の抽出物中に含まれるククルビタシン化合物が、マウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の分化誘導を強力に阻害することを見出し本発明を完成した。

（１）本発明は、下記一般式

（式中、Ｒ^１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、アセトキシ基または糖残基を表し、Ｒ^２は、酸素原子または水酸基を表し、Ｒ^３は、メチル基または水酸基を表し、Ｒ^４は、水素原子またはアセチル基を表し、

は、単結合または二重結合を表す）で示されるククルビタシン化合物を有効成分とする脂肪細胞分化阻害剤である。

（２）本発明はまた、前記ククルビタシン化合物は、ククルビタシンＢまたは２３，２４−ジヒドロククルビタシンＩである、前記脂肪細胞分化阻害剤である。

（３）本発明はさらに、（１）または（２）に記載の脂肪細胞分化阻害剤を含有する医薬品である。

（４）本発明はまた、肥満または肥満が関与する疾病の予防、改善または治療薬である（３）に記載の医薬品である。

（５）本発明はまた、前記疾病は、心臓病、血管障害、糖尿病、痛風、高脂血症、脂肪肝、胆石、すい臓炎、変形性関節症、またはヘルニアである、（４）に記載の医薬品である。

（６）本発明はさらに、（１）または（２）に記載の脂肪細胞分化阻害剤を含有する医薬部外品である。

（７）本発明はさらに、（１）または（２）に記載の脂肪細胞分化阻害剤を含有する化粧品である。

（８）本発明はさらに、（１）または（２）に記載の脂肪細胞分化阻害剤を含有する食品である。

本発明の脂肪細胞分化阻害剤は、ククルビタシン化合物を有効成分とするので、極めて優れた前駆脂肪細胞分化誘導阻害作用を有し、かつ副作用が低い。

また、本発明の医薬品、医薬部外品、化粧品および食品は、前記脂肪細胞分化阻害剤を含有するので、肥満および肥満が関与する疾病の予防、改善または治療に優れた効果を奏するものである。

本発明の脂肪細胞分化阻害剤は、ククルビタシン化合物を有効成分とするものである。本発明で利用されるククルビタシン化合物は、主としてウリ科植物に含まれる四環式トリテルペノイド化合物であり、下記一般式

（式中、Ｒ^１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、アセトキシ基または糖残基を表し、Ｒ^２は、酸素原子または水酸基を表し、Ｒ^３は、メチル基または水酸基を表し、Ｒ^４は、水素原子またはアセチル基を表し、

は、単結合または二重結合を表す）で示されるものである。ここで、Ｒ^１の糖残基としては、グルコース等が挙げられる。

本発明で利用されるククルビタシン化合物の具体例は以下のとおりである。

（１）ククルビタシンＡ

（２）ククルビタシンＢ

（３）ジヒドロククルビタシンＢ

（４）ククルビタシンＤ

（５）２３，２４−ジヒドロククルビタシンＤ

（６）ヘキサノルククルビタシンＤ

（７）ククルビタシンＥ

（８）ジヒドロククルビタシンＥ

（９）ククルビタシンＦ

（１０）２５−Ｏ−アセチルククルビタシンＦ

（１１）２３，２４−ジヒドロククルビタシンＦ

（１２）ククルビタシンＩ

（１３）２３，２４−ジヒドロククルビタシンＩ

（１４）ククルビタシンＲ

（１５）ククルビタシンＵ

これらの中では、ククルビタシンＢおよび２３，２４−ジヒドロククルビタシンＩが好適に利用できる。

本発明で利用されるククルビタシン化合物は、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）に属する植物から、抽出、精製することにより製造することができる。原料となるウリ科の植物としては、例えば、カラタチウリ「Ａｃａｎｔｈｏｓｉｃｙｏｓ ｈｏｒｒｉｄｕｓ」等のアカントシキオス属（Ａｃａｎｔｈｏｓｉｃｙｏｓ）の植物、トウガン「Ｂｅｎｉｎｃａｓａ ｈｉｓｐｉｄａ Ｃｏｇｎ」等のトウガン属（Ｂｅｎｉｎｃａｓａ）の植物、スイカ「Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ」等のスイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）の植物、マクワウリ「Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ Ｌｉｎｎ． ｖａｒ． ｍａｋｕｗａ Ｍａｋｉｎｏ」等のキュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）の植物、カボチャ「Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ」等のカボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）の植物、テッポウウリ「Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ ｅｌａｔｅｒｉｕｍ」等のテッポウウリ属（Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ）の植物、ユウガオ「Ｌａｇｅｎａｒｉａ ｓｉｃｅｒａｒｉａ ｖａｒ」等のユウガオ属（Ｌａｇｅｎａｒｉａ）の植物、ヘチマ「Ｌｕｆｆａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ」等のヘチマ属（Ｌｕｆｆａ）の植物、ラカンカ「Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ Ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉ」等のモモルディカ属（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ）の植物、カラスウリ「Ｔｈｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｃｕｃｕｍｅｒｏｉｄｅｓ」等のカラスウリ属（Ｔｈｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ）の植物、ダンギュイー「Ｘｅｒｏｓｉｃｙｏｓ ｄａｎｇｕｙｉ」等のクセロシキオス属（Ｘｅｒｏｓｉｃｙｏｓ）の植物、ソノラエ「Ｉｂｅｒｖｉｌｌｅａ ｓｏｎｏｒａｅ」等のイベルヴィレア属（Ｉｂｅｒｖｉｌｌｅａ）の植物、カペンシス「Ｋｅｄｒｏｓｔｉｓ ｃａｐｅｎｓｉｓ」等のケドロスティス属（Ｋｅｄｒｏｓｔｉｓ）の植物、ボッセリー「Ｓｅｙｒｉｇｉａ ｂｏｓｓｅｒｉ」等のセイリギア属（Ｓｅｙｒｉｇｉａ）の植物、エキローサ「Ｃｅｐｈａｌｏｐｅｎｔａｎｄｒａ ｅｃｉｒｒｈｏｓａ」等のケファロペンタンドラ属（Ｃｅｐｈａｌｏｐｅｎｔａｎｄｒａ）の植物、ハヤトウリ「Ｓｅｃｈｉｕｍ ｅｄｕｌｅ」等のハヤトウリ属（Ｓｅｃｈｉｕｍ）の植物、ゴキズル「Ａｃｔｉｎｏｓｔｅｍｍａ ｌｏｂａｔｕｍ」等のコキズル属（Ａｃｔｉｎｏｓｔｅｍｍａ）の植物、オキナワスズメウリ「Ｄｉｐｌｏｃｙｌｏｓ ｐａｌｍａｔｕｓ」等のオキナワスズメウリ属（Ｄｉｐｌｏｃｙｌｏｓ）の植物、アマチャズル「Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌａ」等のアマチャズル属（Ｇｙｎｏｓｔｅｍｍａ）の植物、スズメウリ「Ｍｅｌｏｔｈｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ」等のスズメウリ属（Ｍｅｌｏｔｈｒｉａ） の植物、アレチウリ「Ｓｉｃｙｏｓ ａｎｇｕｌａｔｕｓ Ｌｉｎｎ．」等のアレチウリ属（Ｓｉｃｙｏｓ）の植物、ミヤマニガウリ「Ｓｃｈｉｚｏｐｅｐｏｎ ｂｒｙｏｎｉａｅｆｏｌｉｕｓ」等のミヤマニガウリ属（Ｓｃｈｉｚｏｐｅｐｏｎ）の植物、オオスズメウリ「Ｔｈｌａｄｉａｎｔｈａ ｄｕｂｉａ Ｂｕｎｇｅ」等のオオスズメウリ属（Ｔｈｌａｄｉａｎｔｈａ）の植物、キクランテラ属（Ｃｙｃｌａｎｔｈｅｒａ）の植物、ジェラーダンツス属（Ｇｅｒｒａｒｄａｎｔｈｕｓ）の植物等があげられる。

また、ウリ科の植物の他にも、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）、ホルトノキ科（Ｅｌａｅｏｃａｒｐａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、アオギリ科（Ｓｔｅｒｃｕｌｉａｃｅａｅ）、ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）、ダティスカ科（Ｄａｔｉｓｃａｃｅａｅ）に属する植物から、抽出、精製することにより製造することも可能である。

なお、前記ウリ科、アブラナ科、シュウカイドウ科、ホルトノキ科、バラ科、ゴマノハグサ科、アオギリ科、ハナシノブ科、ダティスカ科の植物の利用する部位も特に限定されるものではなく、ヘタ、果実、果皮、花、花穂、茎、葉、枝、枝葉、幹、樹皮、根茎、根皮、根、種子、全草等の各部位を利用することができる。

本発明で利用されるククルビタシン化合物は、各々の植物体の各部位をそのまままたは粉砕後搾取し、または、そのままもしくは粉砕後溶媒で抽出することにより得ることができる。

抽出溶媒としては、水、メタノール、無水エタノール、エタノール等の低級アルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、アセトン等のケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル等のエステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルム等の有機溶媒を、単独または２種類以上組み合わせて使用することができる。

抽出方法も特に制限されるものはないが、通常、常温、常圧下での溶媒の沸点の範囲であればよく、抽出後は濾過またはイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすることができる。

得られた抽出物をシリカゲルクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー等既知の手法に供することにより、ククロビタシン化合物を単離することができる。

なお、本発明で利用されるククルビタシン化合物は、植物からの抽出によらずに有機合成の手法を用いて製造したものであってもよい。

また、本発明の医薬品は、前記脂肪細胞分化阻害剤を含有するものである。本発明の医薬品は、肥満、または心臓病、血管障害、糖尿病、痛風、高脂血症、脂肪肝、胆石、すい臓炎、変形性関節症、ヘルニア等の肥満が関与する疾病の予防、改善または治療薬として利用することができる。

本発明の医薬品は、錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤等として患者に経口投与できる。さらに、軟膏、クリーム、粉状もしくは液状塗布剤、貼付剤等の外用剤として経皮的に投与してもよい。上述したうち、好ましい製剤形態や投与形態等は、患者の年齢、性別、体質、症状、処置時期等に応じて、医師によって適宜選択される。

本発明の医薬品を錠剤、丸剤、散剤、粉剤、顆粒剤等の固形製剤とする場合には、前記ククルビタシン化合物を、常法に従って適当な添加剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成もしくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の充填剤または希釈剤等適宜混合して製造することができる。錠剤等は、必要に応じて適当な被覆用基剤を用いて、糖衣、ゼラチン、腸溶被覆、フィルムコーティング等を施してもよい。

本発明の医薬品を、ローション剤、クリーム剤、軟膏等の半固形製剤とするには、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グリコール類、高級アルコール、グリセリン、水、乳化剤、懸濁化剤等と適宜混和することにより製造することができる。

本発明の医薬品に含まれる前記ククルビタシン化合物の含有量は、投与形態、重篤度や目的とする投与量などによって様々であるが、一般的には、製剤の全質量に対して０．００１〜１００質量％、好ましくは０．０１〜１００質量％である。
また、本発明の医薬品の投与量は、患者の年齢、体重および症状、目的とする投与形態や方法、治療効果、および処置期間等によって異なり、正確な量は医師により決定されるものであるが、通常、本発明の医薬品が経口投与される場合には、前記ククルビタシン化合物の投与量換算で、成人に対し１日当り０．０１〜２０００ｍｇを１回または数回に分けて投与する。

本発明の医薬部外品は、前記脂肪細胞分化阻害剤を含有するものである。本発明の医薬部外品の具体例としては、薬用歯磨き剤、制汗スプレー、薬用クリーム、ベビーパウダー、育毛剤、染毛剤、入浴剤、薬用化粧品、薬用石けん等が挙げられ、前記医薬品の製造方法に準じて製造することができる。

本発明の化粧品は、前記脂肪細胞分化阻害剤を含有するものである。本発明の化粧料の具体例としては、化粧水、ミルクローション、クリーム、パック、洗浄料、ファンデーション、口紅、ヘアローション、ヘアクリーム、シャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント等が挙げられる。

本発明の化粧品は、前記ククルビタシン化合物と他の公知の化粧品成分とを用いて、常法により調製することができる。具体的には、前記ククルビタシン化合物の適量に、流動パラフィン、イソパラフィン、ワセリン、スクワラン、ミツロウ、カルナウバロウ、ラノリン、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソパルミチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、イソオクチル酸セチル、トリイソオクチル酸グリセリル、トリカプリル酸グリセリル、カプリル酸及びカプリン酸の混合脂肪酸のトリグリセリド、ジイソオクチル酸ネオペンチルグリコールエステル、リンゴ酸ジイソステアリル、イソノナン酸イソノニル、１２−ヒドロキシステアリン酸コレステリル、イソステアリン酸ジペンタエリスリトールエステル、オリーブ油、ホホバ油、月見草油、ユーカリ油、大豆油、菜種油、サフラワー油、パーム油、ゴマ油、米胚芽油、タートル油、ミンク油、ステアリン酸、オレイン酸、ベヘニン酸、ステアリルアルコール、セタノール、ベヘニルアルコール等の油性成分、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトールテトラオレエート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリステアレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、レシチン、リゾレシチン、ポリグリセリンやショ糖と前記脂肪酸とのモノ、ジ、トリまたはテトラエステル等の界面活性剤、多価アルコール類、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、天然保湿因子（ＮＭＦ）、ピロリドンカルボン酸ソーダ、スフィンゴ脂質、リン脂質、コレステロール等の保湿剤、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、カラギーナン等の増粘剤、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸ナトリウム等の防腐剤、タルク、カオリン、マイカ、ベントナイト、雲母、雲母チタン、酸化チタン、ベンガラ、酸化鉄等の顔料、クエン酸−クエン酸ナトリウム等のｐＨ調節剤、ＢＨＴ、ＢＨＡ、ビタミンＡ類およびそれらの誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＣ類およびそれらの誘導体並びにそれらの塩、ビタミンＥ類およびそれらの誘導体並びにそれらの塩等の抗酸化剤、ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、メトキシケイ皮酸誘導体、ウロカニン酸等の紫外線吸収剤の適量を適宜組み合わせ、加温もしくは非加温状態で、混合、分散、乳化あるいは溶解させ、液状、ペースト状、ゲル状、クリーム状（半固形状を含む）または固形状となし、本発明の化粧品を得る。本発明の化粧品は肌に直接または間接に塗布して使用する。

本発明の食品は、前記脂肪細胞分化阻害剤を含有するものである。本発明の食品の具体的としては、飴、チューインガム、牛乳、ヨーグルト、乳清飲料、乳酸菌飲料、ジュース、お茶、飲料、アイスクリーム、プディング、水ようかん等が挙げられる。本発明の食品は、前記ククルビタシン化合物の適量に、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤等通常食品原料として使用されているものの適量を適宜配合することにより製造することができる。

なお、本発明の脂肪細胞分化阻害剤、医薬品、医薬部外品、化粧品および食品は上記した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加えることができる。

つぎに、本発明の脂肪細胞分化阻害剤を、実施例によりさらに詳細に説明する。

［実施例１］
活性成分の単離

瓜蒂（乾燥重量２５０ｇ）を高速粉砕機で粉砕後、５ｌのナス型フラスコに入れ、アセトン３ｌで８時間還流抽出を行った。空冷後、濾紙で濾過し、アセトン抽出液を得た。アセトン抽出液をエバポレーターを用い減圧濃縮し、アセトン抽出エキスを調整した。上記抽出、濾過および濃縮工程を３回繰り返すことにより、最終的に７．０ｇのアセトン抽出エキスを得た。

得られたアセトン抽出エキス（７．０ｇ）をメタノールに溶解後、５０ｇのシリカゲルを加え、エバポレーターで減圧乾燥し、試料層を調整した。シリカゲル（５００ｇ）をクロマト管（５０ｍｍφ×７００ｍｍ）に詰め、先に調整した試料層を積層し、乾式カラムクロマトを作成した。クロロホルム：メタノール混合溶媒（混合比率、５０：１）で溶出を開始し、１画分当り５００ｍｌずつ溶出液を捕集した。逐次溶媒の極性を上げていき、１６個の画分に分離した（Ｆｒ．１−Ｆｒ．６（５０：１画分）、Ｆｒ．７−Ｆｒ．１０（２０：１画分）、Ｆｒ．１１−Ｆｒ．１４（１０：１画分）、Ｆｒ．１５−Ｆｒ．１６（メタノール画分））。薄層クロマト（以下、ＴＬＣと称す）により各分画の成分分析を行ったところ、Ｆｒ．４−Ｆｒ．５およびＦｒ．７−Ｆｒ．１０にそれぞれ低極性および高極性活性物質に由来するスポットが認められた。

そこでＦｒ．４を減圧下で濃縮し、得られた粗精製画分（１５０ｍｇ）について、分取薄層クロマト（以下、ＰＴＬＣと称す）を試みた。ＰＴＬＣには、シリカゲルプレート（０．２５ｍｍ厚、２０ｃｍ×２０ｃｍ、メルク）を４枚用い、クロロホルム：メタノール＝５０：１で３回繰り返し展開することにより、目標とする活性物質の分離精製を行った。Ｒ_ｆ値０．４付近に展開された活性物質による吸収帯をマイクロスパーテルで掻爬したものを、クロロホルム：メタノール（１：１）混合溶媒で抽出し、濾紙で濾過後、減圧濃縮することで、化合物１（７０ｍｇ）を単離した。

化合物１を同様に含むＦｒ．５については、吸引液体クロマト法（以下、ＶＬＣと称す）により化合物の精製を行った。即ち、ガラスフィルター付き濾過器（２５ｍｍφ×５０ｍｍ）を吸引鐘に装着し、水流減圧下で濾過器にシリカゲルを３５ｍｍ高まで詰め、精製用カラムとした。展開溶媒（クロロホルム：メタノール＝１００：１）で懸濁させた試料をカラムに付した後、適宜展開溶媒を加えて成分の溶出を行った。溶出液は吸引鐘内に置いた三角フラスコで捕集し、１画分当り５０ｍｌずつ分画した。逐次溶出液についてＴＬＣ分析を行い、化合物１を含む画分のみを集め、エバポレーターで減圧濃縮することにより、新たに２５ｍｇの化合物１を得た。

次に、極性の高い方の活性物質を単離するために、クロロホルム：メタノール混合溶媒（２０：１）でシリカゲル（１００ｇ）をスラリーにし、クロマト管（２５ｍｍφ×５００ｍｍ）に充填して湿式カラムクロマトを調製した。そこに同溶媒で溶解したＦｒ．７−Ｆｒ．１０（濃縮後重量２６０ｍｇ）を添加後、１画分１００ｍｌとなるように順次溶出を行った。各溶出液について、ＴＬＣ分析を試み、活性物質を多く含む分画のみを集め、エバポレーターで濃縮し粗精製画分（１１０ｍｇ）を得た。引き続き化合物１の精製と同じ装置を用い、ここに記す条件（展開溶媒クロロホルム：メタノール（１００：１から５０：１）、３０ｍｌ／画分）でＶＬＣを行った。ＴＬＣ分析の結果、活性物質は３番目の画分に認められたので、エバポレーターで減圧濃縮することで二次粗精製画分（５０ｍｇ）を得た。この画分について、シクロヘキサン：酢酸エチル：エタノール（１０：２：１）混合溶媒を展開溶媒としたＰＴＬＣを行い、化合物２を８ｍｇの収量で単離した。

［実施例２］
単離成分の構造解析

化合物１および２の構造は^１Ｈおよび^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータおよび２次元ＮＭＲスペクトルデータを解析することにより、構造を決定した。^１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルデータを表１に示す。

表１の結果より、化合物１および２は、それぞれククルビタシンＢ、および２３，２４−ジヒドロククルビタシンＩであることが同定された。

［実施例３］
単離した化合物の脂肪細胞分化誘導阻害活性評価

マウス前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）は、通常培養条件下においては線維芽細胞様の形態を示す。しかし、インスリン刺激を与えることにより、細胞内に脂肪粒を形成し脂肪細胞に分化する。そこで、細胞内の脂肪の取り込み量を評価することで、脂肪細胞への分化誘導阻害効果を評価することができる。

３Ｔ３−Ｌ１細胞の脂肪細胞への分化誘導は以下の方法で行った。培養細胞をトリプシン処理により回収し、４℃、１０００ｒｐｍ、３分間遠心分離を行った後、ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍで各細胞濃度に調製し、これをプレートに分注し検定プレートとした。検定プレートは７２時間、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養後、各ウェルに試料を添加し、３０分間、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で静置、その後デキサメタゾン（Ｗａｋｏ社）、イソブチルメチルキサンチン（Ｗａｋｏ社）及びインスリン（Ｒｏｃｈｅ社）をそれぞれ最終濃度２０μＭ、１０μＭ、１．７μＭになるように添加した。４８時間後、ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍを交換し、試料を再度同濃度添加した。さらにインスリンを最終濃度１．７μＭとなるように加えた。その後、３日間隔で、培地交換、試料添加およびインスリンの添加を行い、９日間培養を行った。細胞をＰＢＳ（−）０．５ｍｌを用いて２回洗浄した後、１０％中性緩衝ホルマリン液０．５ｍｌを静かに加え、３０分間静置により固定した。その後、ＰＢＳ（−）０．５ｍｌを用いて１回洗浄し、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色液（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ ６０％イソプロパノール飽和溶液）０．５ｍｌを静かに加え、９０分間静置した。さらにＰＢＳ（−）０．５ｍｌを用いて１回洗浄し、光学顕微鏡下観察を行った。結果を表２に示す。

なお、試料の調製および添加は以下の通り行った。すなわち、実施例１で得られた化合物１、２および３をジメチルスルオキシドに溶解し、それぞれにつき最終濃度１２．５および６．２５ｍｇ／ｍｌに調製した。調製した溶液を、培地１ｍｌに対して１μｌ添加し、培地中における濃度が、１２．５および６．２５μｇ／ｍｌとなるよう添加した。

表２の結果より、本発明のククルビタシン化合物は、優れた脂肪細胞分化誘導阻害活性を有することがわかった。

［実施例４］
グリセロール３リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ：グリセロール・３−フォスフェート・デヒドロゲナーゼ）活性

脂肪細胞分化誘導に従い上昇が認められるグリセロール３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）活性について検討を行った。

６ｗｅｌｌ マルチ−ウェル・プレートに３Ｔ３−Ｌ１細胞を２１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（３ｍｌ／ｗｅｌｌ）の密度でまき、実施例３に従い試料存在下において、脂肪細胞へと分化誘導を行った。以下の実験工程は全て氷冷下で行った。細胞抽出液の調製は次のように行った。培地を除き、氷冷ＰＢＳ（−）２ｍｌを用いて２回洗浄した後、トリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭ β−メルカプトエタノール）６００μｌを加え、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離し、１．５ｍｌプラスチックチューブに回収し、細胞懸濁液を得た。超音波処理（５秒間、４０Ｗ）により細胞膜を破壊した後、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離を行うことにより、この上清を得、細胞抽出液とした。Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素結合法により細胞抽出液に含まれるタンパク定量を行い、タンパク質濃度を一定にした。ＧＰＤＨ活性測定は次のように行った。細胞抽出液に、氷冷した反応液（１００ｍＭ トリエタノールアミン−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１２ｍＭ ＮＡＤＨ、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール）を加え、全量を９５０μｌとした。２５℃、５分間静置した後、これに反応開始液（４ｍＭジヒドロキシアセトンフォスフェート）を５０μｌ添加し、全量を１ｍｌとした。そして、２５℃、１分間、３４０ｎｍにおける吸光度測定の変化を測定した。尚、ＧＰＤＨ活性は１分間に１ ｎｍｏｌのＮＡＤＨを酸化する酵素量を１ユニットとして次式により算出した。

結果を図１に示す。図１より、本発明のククルビタシン化合物は、強い脂肪細胞分化誘導阻害活性を示すことで知られているＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗｏｒｔｍａｎｉが生産するワートマニンよりも低濃度でＧＰＤＨ活性を抑えることがわかった。

本発明の脂肪細胞分化阻害剤は、ククルビタシン化合物を有効成分とするので、極めて優れた前駆脂肪細胞分化誘導阻害作用を有し、かつ副作用が低いので、医薬品、医薬部外品、化粧品または食品に用いた場合、肥満および肥満が関与する疾病の予防、改善または治療に優れた効果を奏するものである。

ＧＰＤＨ活性の試験の結果を示す図である。

Claims (8)

1. 下記一般式
   

   

   （式中、Ｒ^１は、水素原子、水酸基、メトキシ基、アセトキシ基または糖残基を表し、Ｒ^２は、酸素原子または水酸基を表し、Ｒ^３は、メチル基または水酸基を表し、Ｒ^４は、水素原子またはアセチル基を表し、
   

   

   は、単結合または二重結合を表す）で示されるククルビタシン化合物を有効成分とする脂肪細胞分化阻害剤。
2. 前記ククルビタシン化合物は、ククルビタシンＢまたは２３，２４−ジヒドロククルビタシンＩである、請求項１に記載の脂肪細胞分化阻害剤。
3. 請求項１または２に記載の脂肪細胞分化阻害剤を含有する医薬品。
4. 肥満または肥満が関与する疾病の予防、改善または治療薬である請求項３に記載の医薬品。
5. 前記疾病は、心臓病、血管障害、糖尿病、痛風、高脂血症、脂肪肝、胆石、すい臓炎、変形性関節症、またはヘルニアである、請求項４に記載の医薬品。
6. 請求項１または２に記載の脂肪細胞分化阻害剤を含有する医薬部外品。
7. 請求項１または２に記載の脂肪細胞分化阻害剤を含有する化粧品。
8. 請求項１または２に記載の脂肪細胞分化阻害剤を含有する食品。

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